2.6. التعبير عن Caspase -3 و Caspase -6

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ولديه القدرة على البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر هنا لمعرفة Cistanche Tubulosa لمضادات الأكسدة

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】

أظهرت الفئران TgAPP زيادة في التعبير الجيني لـ caspase {0} (الشكل 8C1 ، H1) ، والتي كانت كبيرة وأكثر من 30 بالمائة مقارنة بحصين الفئران WT (الشكل 8H1 ؛ P <0.05). بالنسبة لتعبير caspase -6 ، لم يلاحظ أي اختلافات بين الفئران المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا (الشكل 8C2 ، H2).

تمكنت علاجات الكيرسيتين والروتين من خفض مستويات الكاسباس {0} mRNA في الحُصين بطريقة ذات دلالة إحصائية (الشكل 8H1 ؛ p <0. 05) ، بنسب تثبيط تبلغ حوالي 17 بالمائة و 27٪ للإناث والذكور على التوالي. في القشرة الدماغية ، لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية فقط في العلاج بالروتين في الذكور (الشكل 8C1 ؛ P <0.05).

حول caspase -6 ، لم تُحدث علاجات الكيرسيتين والروتين أي تأثير ذي دلالة إحصائية في القشرة أو الحصين (الشكل 8C2 ، H2) ، على الرغم من أن الكاسبيز في الأخير -6 في ذكور TgAPP أظهر ميلًا إلى انخفاض (الشكل 8H2).

2.7. علامات الالتهاب

النتائج التي تم الحصول عليها للتعبير الجيني للوسائط الالتهابية IL -1 و TNF- و IFN- موضحة في الشكل 9.

في TgAPP ، كانت هناك زيادة ملحوظة في التعبير الجيني IL {0} بحوالي 2 0 في المائة في القشرة والحصين في كلا الجنسين مقارنة بفئران WT (الشكل 9C1، H1؛ p <0.05). فيما يتعلق بـ TNF- ، على الرغم من ظهور مستويات أعلى من mRNA في TgAPP ، إلا أنها ليست ذات دلالة إحصائية في الفئران WT (الشكل 9C2 ، H2). فيما يتعلق بـ IFN- ، كانت هناك زيادة بحوالي 30 بالمائة في تعبيرها عند الذكور ، والتي كانت ذات دلالة إحصائية فقط في القشرة (الشكل 9C3 ؛ P <0.05).

تمكنت العلاجات باستخدام الكيرسيتين والروتين ، في كل من الإناث والذكور ، من تقليل تعبير IL {0}} في القشرة المخية والحصين مقارنةً بالتحكم في الفئران TgAPP (الشكل 9C1 ، H1 ؛ p <{{8) }}. 05) ، والحصول على قيم مماثلة لتلك الخاصة بفئران WT ، وخاصة أقل في الحصين لدى ذكور الفئران (الشكل 9H1 ؛ P <0.05).

لم يلاحظ التأثير الكلي لكل من علاجي الفلافونويد على تعبير IL {0} مع TNF- ولا مع INF-. وهكذا ، خضع الذكور TgAPP ، عند علاج كيرسيتين ، إلى انخفاض كبير في الحصين TNF- (الشكل 9H2 ؛ p <0. 05) وفي تعبير IFN القشري (الشكل 9C3 ؛ P <0.05).

2.8 تقييم انحطاط الخلايا العصبية وتوقعاتها

لم يلاحظ أي علامات مميزة للتنكس العصبي في العمر الذي تم فيه اختبار الفئران المعدلة وراثيا TgAPP ، مقارنة بفئران WT ، ولم تُظهر العلاجات باستخدام كيرسيتين وروتين أي تغيير لمدة 4 أسابيع مقارنة بـ TgAPP (الشكل S1 ، البيانات التكميلية).

2.9 التعبير عن مستقبلات الغلوتامات Ionotropic

لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير عن المستقبلات ، بمقارنة القيم التي تم الحصول عليها لفئران التحكم TgAPP مع تلك التي تم الحصول عليها لفئران WT. لم تكن هناك أيضًا تأثيرات ملحوظة على التعبير عن هذه المستقبلات المؤثرة في التقلص في وجود علاج كيرسيتين أو روتين (الجدول S5 ، البيانات التكميلية).

3. مناقشة

كان الغرض من دراستنا الحالية هو تقييم تأثير اثنين من مركبات الفلافونويد ، كيرسيتين ، وروتين ، في المراحل الأولى من التسبب في مرض الزهايمر ، بغض النظر عن تأثيرها على التنكس العصبي و / أو الوظيفة المعرفية. كانت القشرة والحصين هي مناطق الدماغ قيد التحليل ، حيث إنهما أكثر هياكل الدماغ تضررًا في مرض الزهايمر. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الكيرسيتين والروتين تم إعطاؤهما من خلال نظام غذائي مركب يحتوي على أي من الفلافونويدات ، لتقليد ، في نموذج حيواني ميلادي ، تناول نظام غذائي صحي للإنسان ، يحتوي على عنصر نشط.

على وجه الخصوص ، أثرت التطبيقات المعدلة وراثيًا في الماوس C57B6 تأثيرًا كبيرًا على نسبة GSH / GSSG ومستويات MDA وسعة إنزيم مضادات الأكسدة وتعبير APP ونشاط BACE1 وتعبير caspase -3 و IL -1. بينما تؤدي طفرات APP في البشر عمومًا إلى مرض الزهايمر النموذجي ، إلا أنها مرتبطة في الغالب بعلم أمراض الأميلويد فقط في الفئران المعدلة وراثيًا APP ولا يوجد تنكس عصبي ملحوظ [14،15] ، حيث لم تكن هناك علامات مميزة لوحظت في فئراننا المعدلة وراثيًا TgAPP ، على عكس الفئران WT (بيانات تكميلية ، الشكل S1). سمحت لنا مواجهة 40 -6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) من الخلايا العصبية الحُصينية بمراقبة التشكل النووي ، حيث أن هذا المركب عبارة عن صبغة فلورية للأحماض النووية. لم نلاحظ نوى مجزأة أو مفصصة ، عادة موت الخلايا المبرمج. ولم نلاحظ أي اختلافات ملحوظة في مقارنة المقاطع النسيجية للحصين لخط التحكم المعدل وراثيًا TgAPP فيما يتعلق بأقسام WT ؛ ولم نلاحظ أي اختلافات بين علاجات كيرسيتين وروتين فيما يتعلق بفئران TgAPP الضابطة.

في لوحة الخصائص البيوكيميائية AD التي سيتم تحليلها ، ركزنا بشكل أساسي على تحديد نسبة GSH / GSSG على أي من النظامين الغذائيين الفلافونويد ، حيث يمثل استنفاد مستويات GSH أحد أهم العلامات البيوكيميائية المبكرة في ميلادي [16،17 ] وقد لوحظ أثناء التسبب في المرض وتطور المرض. كان قياس مستويات GSH في الدماغ [18] ومؤخرًا مستويات GSH في الدم [19] واعدًا كواسمات تشخيصية للمراحل المبكرة من مرض الزهايمر. علاوة على ذلك ، بذلت جهود أيضًا لتكملة مخازن GSH الداخلية بأنفسهم أو من سلائفهم [20-22]. في دراستنا ، لوحظ انخفاض في قوة الاختزال الخلوي (GSH / GSSG) في فئران TgAPP المتعلقة بالحيوانات WT ، في كل من الذكور والإناث ، وفي كلا المنطقتين من الدماغ. في القشرة والحصين لكل من الفئران WT و TgAPP ، كانت نسبة GSH / GSSG أقل في الذكور منها في الإناث. زادت حمية الكيرسيتين والروتين بشكل كبير من نسبة GSH / GSSG مقارنةً بفئران TgAPP غير المعالجة ، وكانت هذه الزيادة أكثر وضوحًا في قرن آمون. كانت التغيرات في مستويات GSH و GSSG ونسبة GSH / GSSG عند علاج كيرسيتين أو روتين للذكور ، فيما يتعلق بزيادة قوة الأكسدة والاختزال ، أكثر وضوحًا من الإناث. قد تكشف نتائج قراراتنا عن أساس مهم يقوم عليه الفروق المرتبطة بالجنس في الفئران Tg2576 في القابلية للتلف التأكسدي للجزيئات الكبيرة من ناحية ، نظرًا لأن نظام الجلوتاثيون هو عامل اختزال متعدد الاستخدامات في وظائف بيولوجية متعددة ، وفي تأثير الوقاية. من ناحية أخرى ، تساعد الأنظمة الغذائية الفلافونويدية في استعادة حالتها الفسيولوجية. كما سنرى خلال هذه المناقشة ، قمنا بتعيين الزيادة في نسبة GSH / GSSG كمحور رئيسي قد يفسر مجموعة التأثيرات التي لوحظت في الفئران TgAPP.

لقد تم اقتراح مؤخرًا أن نسبة GSH / GSSG ، بدلاً من العمل ببساطة كمخزن مؤقت للأكسدة والاختزال ، ستعمل بدلاً من ذلك كآلية تنظيمية رئيسية ، مما يسمح للبروتينات بالحصول على تشكيلها ووظائفها الأصلية عن طريق التحكم بإحكام في توازن ثيول ثاني كبريتيد في الخلية الخلوية. بروتين. باختصار ، ينشأ نظام الجلوتاثيون باعتباره ضروريًا للحفاظ على البروتين الصحي ، مما يدل على أن اضطراب استتباب الجلوتاثيون واختزال الأكسدة (أي وراثيًا أو دوائيًا) يزيد من تراكم البروتين بسبب الاضطرابات في فعالية الالتهام الذاتي [23]. لذلك ، فإن الاستراتيجيات التي تهدف إلى الحفاظ على توازن الجلوتاثيون والاختزال قد يكون لها إمكانات علاجية في الأمراض المرتبطة بتجمع البروتين ، مثل الزهايمر. ترتبط آلية تحلل اليوبيكويتين والبروتوزوم ارتباطًا وثيقًا بالحفاظ على البروتين ، والتي تشارك في التسبب في مرض الزهايمر. يحلل البروتوزوم بشكل انتقائي ركائز متعددة ضرورية في الحفاظ على التوازن العصبي ، بما في ذلك تقويض البروتينات المؤكسدة والمجمعة. يخضع BACE1 للتوسع في كل مكان ، وقد ثبت أن حجب مسار يوبيكويتين - بروتيازوم سيمنع تدهور BACE1 وبالتالي يؤدي إلى زيادة إنتاج النشاط الأنزيمي BACE1 ، وزيادة الانقسام المنتج C99 ، وزيادة في كل من A 1-40 و A { {8}} في الخلايا العصبية وغير العصبية [10]. لقد وجدت دراساتنا السابقة أن كلاً من مركبات الفلافونويد والكيرسيتين والروتين تؤثر على مسارات الإشارات المختلفة والشبكات الجزيئية المرتبطة بتعديل وظيفة البروتوزوم في خلايا الورم الأرومي العصبي [9]. بالإضافة إلى ذلك ، فقد تم إثبات أن الخلايا العصبية المكملة بالجلوتاثيون المنخفض (GSH) استعادت نشاط البروتوزوم وقللت التكوين الكلي [11] نظرًا لأن وظيفة البروتوزوم خاضعة لتنظيم حالة الأكسدة [24]. لذلك ، فإن الزيادة في نسبة GSH / GSSG التي واجهتها الحيوانات عند اتباع نظام غذائي كيرسيتين أو روتين يتوافق مع تعديل البروتيازوم بواسطة كيرسيتين وروتين ، والذي تم إثباته سابقًا خارج الجسم الحي.

كما ذكرنا سابقًا ، يؤدي عدم توازن الأكسدة والاختزال إلى بروتينات معدلة بدرجة عالية من الأكسدة تميل إلى التراكم وإنشاء تكتلات مما يؤدي إلى ضعف البروتياز [25]. وبالتالي ، نظرًا للدور الحاسم للإجهاد التأكسدي في التسبب في مرض الزهايمر ، تم تقييم المؤشرات الحيوية للإجهاد التأكسدي ، بما في ذلك بيروكسيد الدهون (مستويات MDA) والإنزيمات المضادة للأكسدة ، في القشرة والحصين في الفئران TgAPP و WT. SOD و CAT و GR و GPx هي أهم الإنزيمات المضادة للأكسدة التي تعمل ضد الجذور الحرة للأكسجين وتنظم عملية التمثيل الغذائي للجذور الحرة في الجسم وتلعب دورًا في نظام إزالة الجذور الحرة ، مما يحمي خلايا الجسم من بيروكسيد الدهون. . في دراستنا ، نتيجة للإفراط في التعبير عن APP ، لوحظ انخفاض عام في أنشطة إنزيم مضادات الأكسدة في فئران TgAPP مقارنة بالفئران WT ، وهي ذات دلالة إحصائية بالنسبة لـ CAT. تمشيا مع انخفاض مستويات GSH ، تمت زيادة بيروكسيد الدهون بشكل كبير في الفئران TgAPP. في حين أن مصدر الإجهاد التأكسدي في مرض الزهايمر معقد للغاية ومتعدد العوامل ، يبدو أن علم أمراض الأميلويد الذي تم تطويره في الفئران كافٍ لبدء العملية المرضية التي تؤدي إلى زيادة الإجهاد التأكسدي في الدماغ [26]. شهدت الحيوانات المعالجة بالروتين زيادة في نشاط CAT في القشرة ونشاط GR في قرن آمون ، في كل من الذكور والإناث. فقط الحيوانات التي عولجت بالروتين شهدت تغيرات في التعبير الجيني لـ CAT و GR في القشرة والحصين في كل من الذكور والإناث و GPx في حصين الفئران الإناث. في هذا السياق ، ثبت أن العديد من المركبات الطبيعية تؤثر على الحديث المتبادل بين تنظيم البروتيازوم والاختزال. بتعبير أدق ، يعتبر الكيرسيتين منشط Nrf2 معروفًا [27] والذي يعرض خصائص مضادة للأكسدة من خلال تحفيز وظيفة البروتوزوم ، مما يعزز مقاومة الإجهاد التأكسدي ويعزز طول عمر الخلية [28].

يعد التعبير الخاص بالأنسجة عن BACE1 أمرًا بالغ الأهمية لمعالجة APP العادية ، وقد يلعب تعبير خلل التنظيم الخاص به دورًا في التسبب في مرض الزهايمر. يتم التعبير عن BACE1 في الغالب في الخلايا العصبية الحُصَينية والقشرة والطبقة الحبيبية المخيخية [10]. وتجدر الإشارة إلى أن الدراسات السابقة أظهرت أن الفئران السويدية المعدلة وراثيًا APP قد زادت بشكل ملحوظ من مستويات الدماغ A في حالة مستقرة [29] ، مما يشير إلى أن BACE1 يلعب دورًا أساسيًا في المسار النشواني في التسبب في مرض الزهايمر وهو هدف علاجي جيد لعلاج الزهايمر. في دراستنا ، لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في نشاط BACE1 عند علاجات كيرسيتين وروتين ، مما قد يساهم في تقليل ترسب A في الفئران. نجادل بأن أكثر من مجرد العمل كمثبطات BACE1 للإنزيم ، كيرسيتين ، وروتين قد يؤدي إلى تقليل نشاط BACE1 المرتبط بزيادة نسبة GSH / GSSG ، بناءً على فرضية تعزيز استعادة نشاط البروتياز. بهذا المعنى ، من المعروف أن استهداف مثبطات BACE1 إلى موقع انشقاق APPswe (الطفرة السويدية) يحدث قبل أن يصل إلى غشاء البلازما ، بينما تتم معالجة APPwt (النوع البري) في جسيم داخلي مبكر نشأ على سطح الخلية. لذلك ، فإن BACE1 الذي يشق APPwt يرتبط أحيانًا بمثبط BACE1 على سطح الخلية قبل معالجة APP ، ومع ذلك ، فإن الإنزيم الذي يعالج APP لا يكون [30]. ولهذا السبب ، فإن التوطين الشاذ لمعالجة APPswe قد يقلل بشكل كبير من فاعلية الكيرسيتين والروتين كمثبطات BACE1. وبالتالي ، فإننا نميل أكثر إلى دعم أن انخفاض نشاط BACE في هذا النموذج في الجسم الحي لا يرجع إلى حد كبير إلى تثبيط الإنزيم ولكن إلى الزيادة في نسبة GSH / GSSG. على أي حال ، يمكن تفسير انخفاض نشاط BACE1 على أنه محاولة مفترضة لتقليل إنتاج أميلويد في الفئران TgAPP. بالنسبة للتأثير الأكثر بروزًا للكيرسيتين والروتين في الحصين على توهين نشاط BACE1 ، تجدر الإشارة إلى أن القشرة لديها كثافة عصبية أعلى بكثير من الحصين [31] ، والضعف الانتقائي للبروتيازوم في النمط الظاهري المرضي لمرض الزهايمر يجعل قشرة الدماغ أكثر عرضة للإصابة والتأثر من قرن آمون [32].

بعد تحديد تأثير العلاجات على نشاط إنزيم BACE1 ، كنا مهتمين بتقييم تعبيره. من الغريب أنه لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في تعبير BACE1 بين الفئران TgAPP مقارنة بالفئران WT ، ولم يلاحظ أي تغييرات ملحوظة مع علاج كيرسيتين أو روتين. لذلك ، يبدو أن الزيادة في نشاط إنزيم BACE1 لا ترتبط بزيادة في التعبير. في هذا السياق ، من اللافت للنظر أن Apelt et al. [14] وجد زيادة في نشاط BACE1 القشري في Tg2576 الفئران التي تتراوح أعمارها بين 9 و 13 شهرًا بينما لم يتغير مستوى التعبير عن بروتين BACE1 و mRNA مع تقدم العمر. علاوة على ذلك ، تم العثور على أدلة تدعم أن الأميلويد الليفي A 1–42. ، بدلاً من الأميلويد القابل للذوبان A 1–42 ، يمكن أن ينظم التعبير البروتيني BACE1 ، وبالتالي فإن التعديلات الصغيرة في نسبة الأشكال الإسوية الأميلويد قد تعدل التوافق الكلي النشواني وتلف الخلايا [ 33]. وبالتالي ، فإن عدم وجود تغيير في تعبير BACE1 عند زيادة نشاطه الذي وجدناه قد يفسر انتشار الأميلويد القابل للذوبان A 1–42 على الشكل الإسوي الليفي أميلويد A 1–42 في نموذج الفأر TgAPP.

بعد تحديد التعبير الجيني للإنزيمات المشاركة في معالجة APP ، قمنا بتقييم تأثير كيرسيتين وروتين على إنزيم سيكريتاز المتضمن في المعالجة غير الأميلويدوجينية لـ APP. ركزنا على ADAM10 لأنه الشكل الإسوي الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لـ -secretase. يتصدى ADAM10 لتوليد لويحات قليلة القسيمات A السامة للأعصاب عبر شق APP داخل المجال A لإنتاج شظايا sAPP و C-terminal (-CTF) [34،35]. على الرغم من أن التغييرات في تعبير ADAM10 الموجودة في دراستنا لم تكن ذات دلالة إحصائية ، فقد لوحظ انخفاض طفيف في تعبير ADAM10 في الفئران TgAPP بالنسبة لفئران WT. في الغالب ، أظهر علاج الروتين ميلًا لزيادة التعبير الجيني ADAM10 في كل من مناطق الدماغ قيد الدراسة. Postina et al. [36] أظهر أن التنظيم الأعلى لنوع ADAM10 البري في قرن آمون لنموذج فأر AD توسط في إفراز العصارة ، مما أدى إلى تثبيط تكوين لويحات A. تمت دراسة تأثير الكيرسيتين في نموذج الجرذ المزمن الناجم عن كلوريد الألومنيوم والذي يُظهر تحسنًا كبيرًا في -Secretase (ADAM10 و ADAM17) في الحُصين مقارنةً بتلك غير المعالجة. يشير هذا إلى أن الكيرسيتين يمتلك القدرة على زيادة المسار غير النشواني من خلال تنشيط جينات -secretase [37]. تعزز البيانات قبل السريرية الفرضية القائلة بأن تحسين مستويات SAPP في الدماغ هي استراتيجية محتملة لتحسين الأعراض المرتبطة بمرض الزهايمر وتخفيف العجز التشابكي. يتنافس كل من ADAM10 و BACE1 على انقسام APP ، وبالتالي فإن تعزيز نشاط ADAM10 قد يثبط توليد الأميلويد السام للأعصاب. علاوة على ذلك ، يمكن أن يمنع sAPP تنشيط مسار إشارات JNK للضغط ، مما يؤدي إلى تنشيط نشاط الفسفرة الناجم عن NF- B ، مما يؤدي إلى تدهور البروتياز [38]. لذلك ، يتم تقليل تكوين وتراكم مجاميع البروتين المرتبطة بالأمراض بشكل كبير ، ويتم تعزيز نشاط البروتوزوم الخلوي ، مما يوفر دليلًا على وظيفة sAPP في تنظيم التكوّن البروتيني [39]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن sAPP ينظم على وجه التحديد تخليق مستقبلات الجلوتامات AMPA وتهريبه [40]. في دراستنا ، اكتشفنا ما إذا كانت الزيادة الطفيفة في تعبير ADAM10 عند علاج الروتين تمارس بعض التأثير على انتقال متشابك الجلوتامات. كما هو مبين في قسم البيانات التكميلية ، لم يلاحظ أي آثار كبيرة على التعبير عن هذا المستقبل المؤين للتأين على حمية كيرسيتين وروتين ، ربما بسبب زيادة ضعيفة في تعبير ADAM10 ، وهو ما لا يكفي لتنظيم مستقبلات AMPA (بيانات تكميلية) والشكل S2 والجدول S5).

يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الدراسات في المختبر أظهرت مجموعة متنوعة من ركائز ADAM10 [41] ، وبالتالي ، يمكن العثور على التأثيرات غير المرغوب فيها التي تم الحصول عليها من خلال استهداف ADAM غير المحدد 10- في انتشار السرطان ، والالتصاق بالخلايا ، والترويج من الخلايا التائية / سلائف الخلايا القاتلة الطبيعية والالتهابات ، وما إلى ذلك [42]. للتحايل على هذا القيد ، تقترح دراستنا استراتيجية تهدف إلى تعزيز إطلاق sAPP من الناحية الفسيولوجية. قد يعتمد هذا النهج على تناول طويل الأمد لمكون نشط (كيرسيتين أو روتين) ، والذي يتم استهلاكه من خلال نظام غذائي صحي للإنسان. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعرفة ما إذا كانت الزيادة في ADAM10 تعتمد على جرعة الفلافونويد وما إذا كانت الآثار المفيدة المحتملة تفوق الآثار الجانبية المفترضة.

بالنسبة للتعبير عن APPswe ، على الرغم من أن إدخال التحوير الجيني APP البشري في جينوم الفأر يضمن أن يتم التعبير عن APPswe بشكل مفرط منذ الولادة ، فقد تم الإبلاغ عن أن APP mRNA ومستويات البروتين الحصين تظهر تقلبات كبيرة أثناء نمو الحيوان ، حيث تكون قصوى عندما تكون الفئران بدون أعراض (1- شهر) ويتناقص عند حدوث الأعراض الكاملة [43]. على الرغم من هذه المشكلة ، كان تعبير APP في كل من القشرة والحصين أعلى بكثير مقارنة مع الفئران WT في دراستنا. كان العلاج الإضافي باستخدام الكيرسيتين أو الروتين قادرًا على تقليل هذا التعبير بشكل كبير لكل من الفئران الذكور والإناث ، في كلا منطقتي الدماغ. هذه النتائج تتماشى مع تلك التي أبلغ عنها أوغستين وآخرون. [44] الذين درسوا مستخلصًا موحدًا من الجنكة بيلوبا (Egb761) ، الغني بالفلافونول مثل الكيرسيتين ، في فئران TgAPP البالغة من العمر 4- شهرًا ، ووجدوا انخفاضًا في مستوى APP mRNA ومستويات البروتين. مع الأخذ في الاعتبار أن إعادة تنظيم APP متعدية في الفئران Tg2576 تحدث في المراحل البادرية والأعراض المبكرة [45] ، فمن المحتمل أن استعادة ترجمة APP بواسطة كيرسيتين أو روتين قد تكون قد حدثت في فئران TgAPP الخاصة بنا ، وعلى الأرجح ، في وقت مبكر مرحلة الأعراض ، مما يؤدي إلى انخفاض في المستويات القشرية والحصينية لـ APP ونشاط BACE1 وتنشيط caspase -3.

علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ في مكان آخر أنه في الفئران Tg2576 (في غياب فقدان الخلايا العصبية) هناك زيادة في تنشيط -3 caspase في الحُصين [46] ، كما وجد في دراستنا ، في بداية ضعف الذاكرة ، جنبًا إلى جنب مع انخفاض في العمود الفقري الشجيري قبل ترسب الأميلويد خارج الخلية [46]. هناك أدلة تدعم الأدوار غير المبرمجة للكاسبيز في الجهاز العصبي بدون موت الخلايا العصبية [47] ، وقد تم تحديد نشاط الكاسبيز -3 في العمود الفقري المتغصن حيث قد يرفع مستويات الكالسينيورين. في المقابل ، يُعتقد أن نزع الفسفرة عن الوحدة الفرعية GluR1 من المستقبلات الشبيهة بـ AMPA ، التي يتم تشغيلها بواسطة الكالسينيورين ، يؤدي إلى خلل وظيفي بعد المشبكي. تتوافق قيم تعبير caspase -3 ، كنتيجة لعملية التحوير ، مع تلك التي حصل عليها باحثون آخرون أبلغوا عن زيادة تعبير caspase -3 على مستوى العمود الفقري التغصني في قرن آمون من الفئران TgAPP [48]. نظرًا لأن APP يحتوي على ثلاثة مواقع انقسام مميزة لـ caspase -3 في تسلسل الأحماض الأمينية ، يوجد اثنان منها على مستوى المجال خارج الخلية وواحد في الجزء C داخل الخلايا من ذيل APP [49] ، التحلل المائي من APP بواسطة caspase -3 قد يغير المعالجة المحللة للبروتين لـ APP لصالح المسار النشواني المنشأ [50] ، مما يؤدي إلى إطلاق ببتيد مشتق من الطرف C السام للخلايا مكون من 31 من الأحماض الأمينية بطول (C31) ، من أجل المثال [51]. يشير هذا إلى أنه نظرًا لأن الكاسباس -3 يمكنه التوسط في تضخيم إطلاق الشظية السامة من APP ، فإن تقليل تعبير الكاسباس -3 بواسطة كيرسيتين أو روتين قد يسمح بإزالة البروتين المجمع. بالإضافة إلى ذلك ، كما ذكرنا سابقًا ، استكشفنا تأثير كل من الزيادة والنقصان في تعبير caspase -3 في انتقال متشابك glutamatergic ، استنادًا إلى قدرة caspase المنشط بالكالسينورين -3 على نزع فوسفوريلات الوحدة الفرعية GluR1 من مستقبلات AMPA على مستوى ما بعد المشبكي. تغير هذه التعديلات الجزيئية انتقال متشابك الجلوتامات واللدونة العصبية على مستوى العمود الفقري التغصني في قرن آمون [48]. نظريًا ، قد يؤدي التثبيط الدوائي لنشاط الكاسبيز -3 في فئران TgAPP إلى إنقاذ الأنماط الظاهرية الشبيهة بمرض AD من آلية تؤدي إلى حدوث فشل متشابك. ومع ذلك ، على الرغم من الزيادة في تعبير caspase -3 في الماوس TgAPP الخاص بنا ، لم نجد فروقًا ذات دلالة إحصائية في تعبير مستقبلات AMPA مقارنة بتلك الموجودة في الفئران WT ، كما ذكرنا سابقًا. قد تكون التغييرات في تعبير caspase -3 ليست بارزة بما يكفي لإنتاج تعديلات مهمة في تعبير مستقبل AMPA (البيانات التكميلية ، الشكل S2 والجدول S5).

بالنسبة لقيم تعبير caspase -6 ، لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين الفئران TgAPP و WT. تم تحديد تنشيط الكاسبيز -6 باعتباره وسيطًا مهمًا للضغط العصبي الذي يشق بروتينات الهيكل الخلوي المهمة (Tau و -tubulin) ، وبالتالي يعطل تحلل اليوبيكويتين - البروتيازوم للبروتينات غير المطوية ، والعديد من كثافة ما بعد التشابك العصبي. البروتينات [52]. يتوافق التعبير غير المتغير عن caspase -6 في دراستنا مع عدم وجود علامات مميزة للتنكس العصبي في العمر الذي تم فيه تقييم هذه الفئران المعدلة وراثيًا ، مقارنةً بفئران WT (البيانات التكميلية ، الشكل S1).

لوحظت زيادة ملحوظة في وسطاء الالتهاب العصبي في مرضى الزهايمر ، خاصة حول لويحات الشيخوخة [53-55]. الخلايا النجمية هي المورد الرئيسي لـ GSH للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. أثناء الالتهاب المزمن والإجهاد التأكسدي ، تطلق الخلايا النجمية وسطاء التهابات سامة وجذور حرة ، مما يسرع من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والتنكس العصبي [56]. تجدر الإشارة إلى أن انخفاض الجلوتاثيون داخل الخلايا يرتبط بتنشيط مسارات الالتهاب ، p38 MAP-kinase ، و Jun-N-terminal kinase (JNK) ، NF-B ، في الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية والخلايا النجمية [57]. في هذا الصدد ، قررنا تحديد مستويات IL -1 و IFN- و TNF- في نموذجنا الحيواني وتحديد تأثير الكيرسيتين والروتين عليها. كما هو معروف ، فإن الالتهاب يعزز المعالجة المعيبة للببتيد و APP ، مما يعزز تراكم الببتيد وبالتالي يعدل التفاعل A [58]. وهكذا ، في دراستنا ، لاحظنا أن فئران TgAPP قد زادت من مستويات الرنا المرسال للوسطاء المؤيدين للالتهابات IL -1 و TNF- و IFN- ، مقارنة بالفئران WT ، مما يدل على أن الإفراط في التعبير عن APP قد يحفز شلالات التهابية عصبية إطلاق سلسلة من المسارات الجزيئية في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية ، والتي من شأنها تنشيط الاستجابة الالتهابية. كان كل من الكيرسيتين والروتين قادرين على إضعاف التعبير الجيني لـ IL -1 في كل من الذكور والإناث ومناطق الدماغ التي تمت دراستها. تدعم العديد من الأدلة التأثير المضاد للالتهاب الذي يمارسه كيرسيتين على مستوى الجهاز العصبي المركزي ، لأنه قد يمنع تنشيط عوامل النسخ مثل العامل النووي كابا ب (NF-κB) [59] ، المتضمن في تحريض iNOS ، و لذلك ، قم بتقليل إصدار الوسطاء مثل IL -1 و TNF- و IFN- [60]. فيما يتعلق بتأثير GSH على الاستجابة الالتهابية ، تجدر الإشارة إلى أن GSH متورط في الحفاظ على مستويات السيتوكين المثلى بطريقة تجعل التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (TNF- و IL -1 و IL -6) بسبب استنفاد GSH ، في حين أن التعبير عن السيتوكينات المضادة للالتهابات (أي IL -10) ظل دون تغيير. يحدث هذا التغيير في توازن GSH بسبب الانتظام في مسارات إشارات NF-B و JNK والتي يمكن أن تكون مسار موت الخلايا المبرمج المجدي نحو موت الخلايا العصبية [61]. في دراستنا ، قد يكون التنظيم السفلي لـ NF-B بواسطة كيرسيتين وروتين آلية معقولة لاستعادة توازن GSH / GSSG وبالتالي سبب التوازن بين السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات. أخيرًا ، نظرًا لأن المروج BACE1 يحتوي على موقع ربط NF- B ، فإن التنشيط الناجم عن الالتهاب لـ NF-B يسهل تنظيم تعبير BACE1 ، وبالتالي يزيد من إنتاج A [62]. وبالتالي ، إذا حدث التنظيم السفلي لـ NF-B على حمية كيرسيتين وروتين ، فإن نشاط BACE1 سينخفض ​​نتيجة لتنظيم إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات وليس المضادة للالتهابات.

4. المواد والطرق

4.1 الحيوانات التجريبية

تم استخدام فأر معدل وراثيا (Tg2576، B6؛ SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) الذي يعبر عن الطفرة السويدية المزدوجة لبروتين طليعة الأميلويد البشري (hAPP) كنموذج حيواني للإعلان التجريبي [14]. الفأر عبارة عن خط متغاير الزيجوت يعبر عن الشكل الإسوي للإنسان A PP695 مع الطفرة السويدية المزدوجة (K670N / M671L ؛ Lys670 → Asn and Met671 → Leu) تحت سيطرة محفز بروتين البريون للهامستر [63]. نتيجة لذلك ، يُظهر هذا الفأر مستويات من بروتين الأميلويد البشري السلائف (A PP) ، ستة أضعاف مستويات البروتين A PP للفأر. بالإضافة إلى ذلك ، يُظهر هذا الفأر مستويات أعلى من A 40 و A 42. تبدأ الرواسب في عمر 9 أشهر [63]. داخل Tg2576 الحصين والقشرة ، APPswe التعبير الجيني هو في المقام الأول الخلايا العصبية [64].

كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام الفئران من النوع البري (WT) من نفس المستعمرة [65،66]. تم تطوير مستعمرة الفئران Tg2576 (B6؛ SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) في مختبرنا من Tg2576 ذكور متغايرة الزيجوت وإناث من النوع البري. تم التبرع بالوالدين المعدلين وراثيًا من قبل الدكتورة ديانا فريشيلا من قسم علم الأعصاب في مركز البحوث الطبية التطبيقية في جامعة نافارا (بامبلونا ، إسبانيا) [67].

تم إيواء الحيوانات في أقفاص مهواة بشكل فردي وتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة 22-24 درجة مئوية في 12- ساعة من الضوء / دورة مظلمة في 50-60٪ من الرطوبة. تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة كومبلوتنسي بمدريد وكانت متوافقة تمامًا مع التوجيه الأوروبي 2010/63 / بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية والتشريعات الإسبانية بشأن رعاية الحيوان ( المرسوم الملكي 53/2013 ، 1 فبراير 2013).

4.2 تحليلات التنميط الجيني للفئران

تم تحديد التعددية الجينية في غضون 3 0 أيام من الولادة عن طريق خزعة الذيل. تم إجراء تحليلات التنميط الجيني للحيوانات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالنظر إلى أن Tg2576 (TgAPP) عبارة عن خط متغاير الزيجوت ، فقد تم استخدام جين الإدراج (PrP ، من بروتين البريون) كعنصر تحكم في التفاعل الإيجابي. تم استخلاص الحمض النووي الجينومي من ذيول الفأر المهضومة ببروتينيز K (0. 1 ميكروغرام / ميكرولتر) في محلول NID (5 0 ملي مول كلوريد ، 5 0 ملي مولار Tris-HCl pH 8.3 ، 50 mM MgCl2 ، 0.05 بالمائة جيلاتين ، 0.45 بالمائة NP -40 و 0.4 بالمائة توين 20) عند 56 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ثم رجها. تم ترسيب شظايا الحمض النووي باستخدام الأيزوبروبانول وغسلها بنسبة 70 بالمائة من الإيثانول. تم إذابة رواسب الحمض النووي في 30 ميكرولتر من محلول TE (10 ملي تريس -1 ملي EDTA). تم تحديد نقاء وتركيز الحمض النووي عند 260 و 280 نانومتر.

تم تضخيم جينات PrP و APP بواسطة PCR. كانت متواليات الاشعال المستخدمة لفحص الفئران المعدلة وراثيا كما يلي: PrP إلى الأمام: CCTTTGTGACTATGTGGATGATGTCGG ؛ عكس PrP: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC ؛ عكس التطبيق: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. كانت خطوات تفاعل PCR كما يلي: تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، و 39 دورة عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، ثم التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.

في جميع الحالات ، تم النظر في الضوابط السلبية (بدون قالب الحمض النووي) والضوابط الإيجابية لجين APP. تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي تم الحصول عليها عن طريق الرحلان الكهربي في مواد هلامية بنسبة 1.5 في المائة في agarose في 0. 5X TBE (Tris-Borate-EDTA، Merck KGaA، Darmstadt، Germany) عازلة عند 70 فولت (جهد ثابت) ثم تم تصويرها بالتلوين باستخدام جل أحمر (ميليبور).

4.3 علاجات الحيوانات

تم اختيار فئران TgAPP وزملائها من النوع البري ، وكلاهما تتراوح أعمارهم بين 6-7 أسابيع بوزن أولي يبلغ 16.2 ± 0. 8 جم ، تم اختيارهم عشوائيًا في المجموعات الأربع التالية (ن=8 / مجموعة): ( أ) TgAPP غير المعالجة ؛ (ب) TgAPP المعالج بالكيرسيتين ؛ (ج) TgAPP المعالج بالروتين ؛ و (د) النوع البري غير المعالج. منذ دراسة كل من الفئران الذكور والإناث ، تم إنشاء مجموعتين من المجموعات. في عمر 45 أسبوعًا ، بدأت الفئران في العلاج باستخدام كيرسيتين أو روتين لمدة 4 أسابيع.

كانت مادة الكيرسيتين (3،30،40،5 ، 7- بنتاهيدروكسي فلافون) وروتين هيدرات (كيرسيتين -3- هيدرات O-rutinoside) أعلى من أو تساوي 95 بالمائة نقية وتم شراؤها من Sigma-Aldrich. تم دمج كل واحدة من مركبات الفلافونويد في نظام غذائي قياسي (Harlan Ibérica ، برشلونة ، إسبانيا) بتركيز 200 جزء في المليون ، وهو ما يعادل تناول 30 مجم من الفلافونويد / كجم من وزن الجسم / يوم. تلقت الفئران غير المعالجة حصريًا النظام الغذائي القياسي غير المكمل. تم توفير النظام الغذائي والمياه من أجل المدخول بالشهرة.

4.4. تحضير أنسجة المخ للمقايسات البيوكيميائية والنسيجية

في نهاية العلاج ، صُممت الفئران طوال الليل ، وتم قتلها رحيمًا باستخدام خلع عنق الرحم ، وتمت إزالة الدماغ بالكامل بسرعة. تم شطف المخ في محلول ملحي عند 4 درجات مئوية وإزالة الغشاء العنكبوتي بعناية. ثم تم عزل الحُصين والقشرة. تم تخزين العينات على الفور عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

تم استخدام أدمغة بعض الحيوانات بالكامل للحصول على أقسام نسيجية ، والتي بمجرد الموت الرحيم باستخدام خلع عنق الرحم ، تم تجميد الأدمغة عن طريق الغمر في الأيزوبنتان عند -80 درجة مئوية. بعد ذلك مباشرة ، تم عمل أقسام إكليلية من الدماغ (سمك 30 ميكرومتر) من البصلة الشمية إلى المخيخ ، على بعد 120 ميكرومتر في ناظم البرد (لايكا CM1850 ، نوسلوخ ، ألمانيا). تم تنفيذ الإجراء بأكمله عند -20 درجة مئوية. تم جمع المقاطع النسيجية على الشرائح وحفظها عند -80 درجة مئوية حتى التحليل (انظر الطرق التكميلية).

4.5 الجلوتاثيون

بالنسبة لاختبارات الجلوتاثيون ، تم تجانس عينات القشرة المخية والحصين في مخزن مؤقت لإخماد الأكسدة والاختزال -5 في المائة من حمض أسيتيك ثلاثي كلوريد (RQB -5 بالمائة من TCA) (سبق فقاعات مع N2 لمدة 15 دقيقة على الجليد) بتركيز 25 مجم / مل (وزن / حجم). تم إعادة تعليق العينات عن طريق الصوتنة لمدة 10 ثوانٍ ، ثم طردها بالطرد المركزي عند 12 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم جمع المواد الطافية.

بعد ذلك ، في المادة الطافية التي تم الحصول عليها ، تم اعتماد طرق قياس الفلور الطيفي لتحديد مستويات GSH و GSSG باستخدام طريقة o-phthalaldehyde ، التي وصفها Senft et al. [68]. تم تصحيح قيم GSH و GSSG للتفاعل التلقائي في حالة عدم وجود عينة بيولوجية. في كلتا الحالتين ، تم تحضين المواد الطافية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وبعد ذلك ، تم قياس التألق باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة FLUOSTAR (BMG LABTECH ، Ortenberg ، Baden-Württemberg ، ألمانيا) ، مع تعيين مرشح الإثارة عند 360 نانومتر (عرض النطاق الترددي 5 نانومتر) ومرشح الانبعاث عند 460 نانومتر (عرض النطاق الترددي 5 نانومتر). تم استيفاء تركيز GSH و GSSG في كل عينة من معايير GSH المعروفة. تم التعبير عن تركيزات كل من GSH و GSSG كبروتين nmol GSH / mg ، مما سمح بحساب نسبة الجلوتاثيون والاختزال GSH / GSSG.

تم تدوير الكريات المتبقية حتى تذوب تمامًا في 24 0 ميكرولتر من 0.1 مولار هيدروكسيد الصوديوم لقياس تركيز البروتين بواسطة طريقة حمض البيسينشونينيك (BCA) ، باستخدام ألبومين مصل البقر كمعيار.

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】