يؤثر حذف خمسة أحماض أمينية في NKCC2 من C57BL / 6 الفئران على تحليل الفسفرة NKCC2 ولكنه لا يؤثر على وظائف الكلى

edmund.chen@wecistanche.com

المقدمة

الطرف الصاعد السميك (TAL) للثديياتالكلىضروري للتحكم في حجم السائل خارج الخلية ، وتركيز البول ، والكالسيوم (Ca 2 plus) ، والتوازن المغنيسيوم (Mg 2 plus) ، وكذلك توازن الأس الهيدروجيني. 1 إن مسار النقل الرئيسي Na plus في TAL هو Na plus - K plus - 2 Cl - cotransporter (NKCC2) ، والذي يتم تثبيته على وجه التحديد بواسطة مدرات البول العروية. 1 يكون النقل المشترك لأيونات Na plus و K plus و 2Cl عبر NKCC2 محايدًا إلكترونياً ولكنه يعتمد على إفراز K plus الكهروضوئي عبر قمي كلويالنخاع الخارجي K بالإضافة إلى قناة ROMK. 2 إن تفاعل NKCC2 مع ROMK يخلق تدرجًا كهروكيميائيًا إيجابيًا للتجويف ، مما يعزز إعادة امتصاص Na زائد ويقود النقل الخلوي لـ Ca 2 plus و Mg 2 plus. 3 أهمية NKCC2 بالنسبة لـ TAL ووظائف الكلىيتجلى في متلازمة بارتر من النوع الأول ، وهو اضطراب وراثي ناتج عن طفرات فقدان الوظيفة في NKCC2 ، والتي تظهر بشكل حادكلويإهدار الملح والسوائل ، قلاء بوليولي نقص بوتاسيوم الدم وفرط كالسيوم البول. 3

NKCC2 هو عضو في العائلة الحاملة الذائبة 12 (Slc12) لبروتينات نقل الغشاء التي تتضمن أيضًا NKCC1 المعبر عنها في كل مكان والنبيب الملتوي البعيد (DCT) المحدد Na plus - Cl - cotransporter (NCC). 2 يرتبط نشاط NKCC2 بشكل إيجابي مع فسفرة الناقل المشترك في العديد من بقايا السيرين والثريونين على الذيل الطرفي N السيتوبلازمي. 4 يتم حفظ تسلسل الأحماض الأمينية المحيطة بمواقع الفسفرة بدرجة عالية وتظهر درجة عالية من التشابه بين NKCC2 و NKCC1 و NCC. 2 يتم تحفيز فسفرة NKCC2 بواسطة عدة مسارات هرمونية وغير هرمونية. تعمل الهرمونات مثل أرجينين فاسوبريسين (AVP) وأنجيوتنسين 2 (ANGII) على تحفيز NKCC2 عن طريق زيادة إنتاج cAMP وتنشيط بروتين كيناز A (PKA). يُعتقد أن 5 PKA يفسفوريلات NKCC2 مباشرة في Ser126 ، مما يعزز إفراز الحويصلات المحتوية على NKCC2 وبالتالي وفرة الناقل في غشاء البلازما القمي. 6 وبالمثل ، فإن التغييرات في تراكيز الكلوريد داخل الخلايا تنظم الفسفرة NKCC2. يحفز التركيز المنخفض في Cl tracellular Cl - كيناز بدون ليسين (K) WNK1 و WNK4 على الفسفوريلات وتنشيط كينازات الكينازات النهائية 20- ذات الصلة بالبرولين ألانين الغني بالكيناز (SPAK) أو كيناز 1 المستجيب للإجهاد التأكسدي (OXSR1) ). 7- 9 بعد الارتباط بعنصر "RFxV" في NKCC2 ، تقوم هذه الكينازات بعد ذلك بفسفوريلات NKCC2 في بقايا ثريونين (T96 و T101). 2 يتم التوسط في إزالة الفسفرة من هذه البقايا بواسطة فوسفاتيز كالسينيورين ، مما يؤكد أن NKCC2 هو هدف للعديد من مسارات الإشارات. 10

لدراسة وظيفة NKCC2 ، طورت عدة مجموعات بما في ذلك مجموعتنا أجسامًا مضادة محددة للفوسفوفورم ضد Thr96 و / أو Thr101. 11- 17 تم استخدام الأجسام المضادة لتقييم الفسفرة NKCC2 في أنظمة التعبير غير المتجانسة 7،11،17،18،19،20 والنماذج الحيوانية بما في ذلك الفئران 10،21،22،23،24،25 والفئران. 14،15،16،17،19،26،27 ومع ذلك ، عند استخدام الجسم المضاد pT96 / 101 NKCC2 لدينا ، حصلنا على نتائج غير متسقة في نماذج الفئران المختلفة لدينا. بينما اكتشفنا إشارات pNKCC2 القوية في الكلى من الفئران في خلفية وراثية 129Sv ، لم نحصل على إشارات pNKCC2 موثوقة في الكلى من الفئران C57BL / 6 لكننا لاحظنا تفاعلًا متصالبًا للأجسام المضادة pNKCC2 مع pNCC. قدمت مختبرات أخرى ، بما في ذلك المختبرات من JA McCormick و AA McDonough (الاتصالات الشخصية) ملاحظات مماثلة. علاوة على ذلك ، تم وصف اختلافات إجهاد ملفتة في الفئران لـكلويالوظيفة 30 بما في ذلك انخفاض كبير في إفراز الكالسيوم في البول في C57BL / 6 مقارنة بالفئران 129Sv. 31 لذلك ، افترضنا أن الفئران C57BL / 6 تعبر عن متغير جيني لـ NKCC2 الذي يؤثر على الفسفرة NKCC2 وربماوظائف الكلىالتي تفسر اختلافات الإجهاد الملحوظة. تم تصميم الدراسة التالية لاختبار هذه الفرضية بشكل منهجي.

الكلمات الدالة:التوازن الأيوني ، الكلى ، NKCC2 ، الفسفرة ، اختلافات الإجهاد

النتائج

2.1|الفئران C57BL / 6 لديها حذف خمسة أحماض أمينية في NKCC2 الذي يتداخل مع اكتشاف NKCC2 الفسفوريأولاً ، قمنا بمحاذاة تتابعات الأحماض الأمينية N- الطرفية المنشورة للعديد من الأنواع (معرفات النسخ في الجدول S1) لـ NKCC2 و NCC (الشكل 1A ، B ، على التوالي) التي تتوافق مع الحلقات المعترف بها بواسطة الأجسام المضادة المضادة لـ pNCC و anti- pNKCC (الشكل 1 ج). أكدت المحاذاة الدرجة العالية من الحفاظ على مواقع الفسفرة في NKCC2 و NCC 7 والتي من المحتمل أن تفسر التفاعل التبادلي للأجسام المضادة pNKCC2 و pNCC التي لاحظناها نحن والآخرون. 18،28،29 ومن المثير للاهتمام والمتسق مع فرضيتنا ، أن المحاذاة أيضًا أعادت إلغاء حذف خمسة أحماض أمينية لم يتم تقديرها حتى الآن في تسلسل NKCC2 من الفئران C57BL / 6 (ΔF 97- T101) (الشكل 1 أ) . أكد تسلسل الحمض النووي من مستعمرتين مختلفتين من الفئران C57BL / 6 محفوظة في مختبر جاكسون بالولايات المتحدة الأمريكية أو مختبرات جانفيير في فرنسا حذف النوكليوتيدات في إكسون 2 من C57BL / 6 NKCC2 الذي يتوافق مع حذف الأحماض الأمينية المذكورة أعلاه (الشكل S1 ، الجدول S2).

لتوصيف تأثير إزالة الأحماض الأمينية الخمسة على الكشف المناعي لـ NKCC2 الكلي والفوسفوري ، درسنا بشكل منهجي كليتي C57BL / 6 و 129Sv الفئران عن طريق الكيمياء المناعية والتكتل المناعي. أظهر التألق المناعي مع جسم مضاد ضد إجمالي NKCC2 إشارة فلورية قوية في غشاء البلازما القمي لـ TALs من 129Sv و C57BL / 6 الفئران. ومع ذلك ، أظهر الجسم المضاد pT96 / T101 NKCC2 الذي تم تطويره سابقًا وسمًا قميًا قويًا لـ TALs فقط في الفئران 129Sv ، في حين أن TALs للفئران C57BL / 6 كان لها تلطيخ مناعي ضعيف جدًا (الشكل 1 د). تمشيا مع هذا ، كشف تحليل اللطخة الغربية عن نطاق قوي لإجمالي NKCC2 في كلتا سلالتي الفئران ، بينما اكتشف الجسم المضاد pT96 / T101 NKCC2 نطاقًا قويًا بالحجم المتوقع (170 كيلو دالتون) فقط في 129Sv الفئران (الشكل 1E). بدلاً من ذلك ، كشفت كليتا الفئران C57BL / 6 عن نطاق عند 130 كيلو دالتون يتوافق مع الحجم المتوقع لـ NCC (الشكل 1E). تم الحصول على نتائج مماثلة مع الأجسام المضادة الأخرى المستخدمة سابقًا لدراسة الفسفرة NKCC2 (الشكل S2). أظهر الجسم المضاد pT212 / T217 NKCC1 R5 11 بالإضافة إلى إشارة pNCC إشارة خافتة بالحجم المتوقع لـ pNKCC2 (الشكل S2). أصبحت الفرقة المناعية لـ pNKCC2 أكثر كثافة عندما تكون طازجةالكلىتم استخدام المحللين. لم يتحسن استخدام المخزن المؤقت للتحلل مع المنظفات (المخزن المؤقت RIPA) ولكنه قلل من شدة الإشارة (الشكل S3).

الشكل 1 لا يكتشف الجسم المضاد pT96 / T101 NKCC2 إشارة pNKCC2 المرئية في الفئران C57BL / 6. أ ، محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية NKCC2 لأنواع مختلفة وسلالتين من الماوس 129Sv و C57BL / 6. يتم سرد معرفات تسلسل NKCC2 للأنواع المختلفة في الجدول S1. يتم تمييز المنطقة المحفوظة للغاية والتي تتوافق مع الفئران Thr96 إلى الفئران Thr101 باللون الرمادي. ب ، محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية لـ NCC في الأنواع المختلفة. يتم سرد معرفات تسلسل NCC للأنواع المختلفة في الجدول S1. C ، قائمة الحواتم للأجسام المضادة شائعة الاستخدام والمنشورة التي تتعرف على pT53 أو pT58NCC ، وكذلك pNKCC2 في الموقع المحفوظ حول Thr96 إلى Thr101. D ، مناعي إجمالي و pT96 / T101 NKCC2 في أقسام التبريد المتتالية من الفئران بخلفية 129Sv و C57BL / 6. شريط المقياس=50 ميكرومتر. E ، Immunoblot من المجموع و pT96 / T101 NKCC2 من الفئران بخلفية 129Sv و C57BL / 6. القيم تعني ± SEM ، n=5 فأرة لكل مجموعة ، تشير الأسهم الخضراء إلى نطاقات معينة بينما تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى النطاقات غير المحددة. علامات الوزن الجزيئي متضمنة. من المتوقع أن يصل مجموع نطاقات NKCC2 و pT96 / T101 إلى 170 كيلو دالتون. F ، Immunoblots للمجموع و pT96 / T101 NKCC2 ، المجموع و pT53 و pT58 NCC في الفئران NCC WT و NCC بالضربة القاضية (KO) من خلفيات مختلفة. تشير الأسهم الخضراء إلى النطاقات المحددة بينما تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى العصابات غير المحددة. علامات الوزن الجزيئي متضمنة. من المتوقع أن يبلغ إجمالي نطاقات NCC و pT58 و pT53 130 كيلو دالتون ، ومن المتوقع أن يصل إجمالي نطاقات pT96 / T101 NKCC2 إلى 170 كيلو دالتون

لاختبار ما إذا كان الجسم المضاد pT96 / T101 NKCC2 الخاص بنا يتفاعل بالفعل مع NCC الفسفوري في الفئران C57BL / 6 ، قمنا بالتحقيقالكلىlysates من 129Sv و C57BL / 6 الفئران من النوع البري وفئران خروج المغلوب C57BL / 6 NCC مع الأجسام المضادة مقابل إجمالي NKCC2 و pT96 / T101 NKCC2 وإجمالي NCC و NCC الفسفوري (pT53 و pT58 NCC) (الشكل 1F). لم يكتشف الجسم المضاد والأجسام المضادة pT96 / T101 NKCC2 ضد إجمالي NCC و pNCC نطاقات عند 130- 170 كيلو دالتون في الفئران بالضربة القاضية C57BL / 6 NCC (الشكل 1F). ومن المثير للاهتمام ، أن التجارب المناعية بالإضافة إلى تجارب الكيمياء المناعية الإضافية (الشكل S4) تشير إلى أن الأجسام المضادة pNKCC2 لا تتفاعل فقط مع NCC في الفئران C57BL / 6 ولكن أجسامنا المضادة pNCC (pT53 NCC و pT58 NCC) تتفاعل مع NKCC2 في 129Sv الفئران بالتركيزات المستخدمة.

يختلف إفراز الكالسيوم والمغنيسيوم في البول بين 129Sv و C57BL / 6 الفئران

لتحديد ما إذا كان الحذف (F {0}} T101) في NKCC2 قد يرتبط بالاختلافات الفسيولوجية بين الفئران 129Sv و C57BL / 6 ، قمنا بمقارنة تناول الماء ومستويات أيونات البلازما والسوائل البولية وإفراز الأيونات بين سلالتي الماوس. كما تم تلخيصه في الجدول 1 ، لم تختلف معظم المعلمات التي تم تقييمها بين السلالات. ومع ذلك ، أظهرت الفئران C57BL / 6 انخفاض في البول Ca 2 زائد وأعلى في البول Mg 2 بالإضافة إلى إفراز من الفئران 129Sv. كانت مستويات الكالسيوم Ca 2 plus و Mg 2 plus في البلازما متشابهة في كلا المجموعتين ، مما يشير إلى أن الفئران كانت في حالة مستقرة حيث يكون هناك توازن استتباب لإعادة امتصاص الأمعاء ، وتعبئة الأنسجة (على سبيل المثال من العظام) ، وكلويتم الوصول إلى إفراز أيونات Ca 2 plus و Mg 2 plus. لاختبار ما إذا كانت معدلات الإفراز البولية المختلفة Ca 2 plus و Mg 2 plus ناتجة عن الاختلافات في الامتصاص المعوي لهذه الأيونات ، قمنا بمقارنة تناول الطعام اليومي ، والناتج البراز ، والبراز Ca 2 plus و Mg 2 plus إفراز الاثنين سلالات الفأر. كما هو مبين في الشكل S5 ، كان تناول الطعام وإخراج البراز Ca 2 زائدًا متشابهين ، لكن الإفراز اليومي للبراز Mg 2 زائد كان أقل في C57BL / 6 الفئران مقارنة بالفئران 129Sv مما يشير إلى أن C57BL / 6 الفئران لديها أعلى معوي Mg 2 بالإضافة إلى إعادة الامتصاص من الفئران 129Sv. تمشيا مع هذا الافتراض ، كان لدى الفئران C57BL / 6 تعبير قولوني أقوى لقناة المغنيسيوم TRPM6 (الشكل S6) ، بالإضافة إلى اتجاه إلى مستويات أعلى من Mg 2 في البلازما مقارنة بالفئران 129Sv ، على الرغم من أن الاختلافات لم تصل إلى دلالة إحصائية. لتقييم المساهمة المحتملة للعظم ، قمنا بتحليل الكثافة المعدنية للعظام في كلا السلالتين بواسطة التصوير المقطعي المحوسب. على غرار التقارير السابقة ، كان لدى الفئران 32 C57BL / 6 كثافة معادن عظمية منخفضة نوعًا ما (الشكل S7) ، وهو ما قد يفسر سبب ميل هذه الفئران إلى الحفاظ على أيونات الكالسيوم 2 بالإضافة إلى أيونات منخفضة.كلويCa 2 بالإضافة إلى إفراز. تمشيا مع معدل إعادة امتصاص أنبوبي Ca 2 بالإضافة إلى معدل إعادة الامتصاص ، فإن كليتي C57BL / 6 الفئران

عبّر عن قناة TRPV5 Ca 2 plus أكثر في مستويات البروتين من كليتي الفئران 129Sv (الشكل 2). كان لدى الفئران C57BL / 6 أيضًا تعبير مرنا NCC وبروتين أكبر بكثير من الفئران 129Sv (الشكل 2A). وبالمثل ، كانت وفرة البروتين من إجمالي NKCC2 ، وإجمالي NCC الفسفوري والإجمالي - ENaC أعلى في C57BL / 6 مقارنة بالفئران 129Sv (الشكل 2B ، C). لم تكن وفرة الأشكال المشقوقة بروتينيًا وبالتالي الأشكال النشطة لـ - و - ENaC مختلفة مما يشير إلى أنكلويكان نشاط ENaC مشابهًا لكل من السلالات (الشكل 2 ب ، ج).

لا يوجد دليل على تغيير وظيفة الطرف الصاعد السميك في الفئران C57BL / 6 مقارنة بالفئران 129Sv

قد تكون الوفرة الأعلى من إجمالي NKCC2 وإجمالي NCC و NCC الفسفوري في كليتي C57BL / 6 الفئران استجابة تعويضية لخفض الفسفرة NKCC2. لاختبار ما إذا كان نشاط NKCC2 و NCC يختلف بين سلالات الماوس ، أجرينا اختبار bumetanide- و thiazide- على التوالي. تسبب حقنة واحدة من بوميتانيد أو هيدروكلوروثيازيد في حدوث تبول قوي للبطانة والذي كان أكثر وضوحًا للبوميتانيد منه في حالة هيدروكلوروثيازيد. ومع ذلك ، كانت استجابات مدر للبول متشابهة تمامًا في كلتا السلالتين مما يشير إلى أن الأنشطة الوظيفية لـ NKCC2 و NCC لم تكن مختلفة بين الفئران C57BL / 6 و 129Sv (الشكل 3 أ- د). على ما يبدو ، وفرة البروتين ومستويات الفسفرة لا تتطابق بالضرورة مع الأنشطة الوظيفية لـكلويبروتينات النقل الأيوني كما أشار إليه هنتر وزملاؤه مؤخرًا. 33 لمزيد من التقييم لوظيفة TAL ، أجرينا اختبار تقييد المياه حيث تمكنت الفئران من الوصول إلى طعام مبلل لمدة 24 ساعة ، ولكن ليس مياه الصنبور. في ظل هذه الظروف ، زادت سلالات الماوس من الأسمولية في البول إلى قيم مماثلة (الجدول 1). علاوة على ذلك ، أظهرت الفئران C57BL / 6 وفئران 129Sv نفس إفراز البول من uromodulin (بروتين Tamm- Horsfall) (الجدول 1) ، والذي يتم إنتاجه وإفرازه في البول اعتمادًا على النشاط الوظيفي لخلايا TAL. 3

يشير تهجين الفئران 129Sv و C57BL / 6 إلى أن حذف الأحماض الأمينية الخمسة في NKCC2 لا يفصل بين النمط الظاهري المحدد

تشير البيانات المقدمة إلى أن فروق الإجهاد في إفرازات أيونات المسالك البولية وكلويلا ترتبط وفرة البروتين بحذف خمسة أحماض أمينية في C57BL / 6 NKCC2 ، ولكنها مرتبطة بالاختلافات الجينية الأخرى بين سلالتي الفأر. لاختبار ذلك بشكل أكبر ، قمنا بتهجين 129Sv و C57BL / 6 الفئران إلى الجيل F2 حيث يجب أن تكون اختلافات السلالة الجينية (بما في ذلك تلك الموجودة في NKCC2) عشوائية

وزعت على الفئران. قمنا بعد ذلك بمقارنة الفئران F2 التي كانت إما متماثلة اللواقح من أجل NKCC2 كامل الطول (f / f) ، أو متجانسة لحذف NKCC2 (/ Δ) ، أو متغايرة الزيجوت لحذف NKCC2 (f / Δ). باستثناء أنماط الارتباط المختلفة المتوقعة للأجسام المضادة الخاصة بالفوسفوفورم ضد NKCC2 و NCC (واختلاف غير واضح في تعبير ROMK في mRNA ، ولكن ليس مستوى البروتين) ، لم يكن أي من الاختلافات المحددة سابقًا بين السلالتين واضحًا في f / f أو Δ / أو f / الفئران من الجيل F2 (الشكل 4 والجدول 2). على وجه الخصوص ، لم تكن هناك اختلافات في إفراز المسالك البولية Ca 2 plus أو Mg 2 plus ، بالإضافة إلى عدم وجود فروق في مستويات البلازما Ca 2 plus أو Mg 2 plus ، مما يشير إلى أن اختلافات الإجهاد بين الفئران 129Sv و C57BL / 6 مستقلة عن حذف الأحماض الأمينية الخمسة في NKCC2.

يكتشف الجسم المضاد الجديد pT96 NKCC2 pNKCC2 في كلا السلالتين

نظرًا لأن حذف الأحماض الأمينية الخمسة في NKCC2 يعوق الكشف الموثوق عن الفسفرة NKCC2 في الفئران C57BL / 6 عند استخدام الأجسام المضادة المتاحة ، فقد أنشأنا جسمًا مضادًا جديدًا موجهًا ضد موقع T96 الفسفوري في C57BL / 6 الفئران. تم تحصين الأرانب باستخدام ببتيد فوسفوري يتوافق مع تسلسل الأحماض الأمينية لـ C57BL / 6 NKCC2 المحيط بـ T96 (YYLQ (p) TMDA). تم تنقية antisera وتقارب وتتميز عن طريق التكتل المناعي والكيمياء المناعية (الشكل 5). اكتشف الجسم المضاد نطاقًا واحدًا بالحجم المتوقع 170 كيلو دالتون في كليتي 129Sv و C57BL / 6 wild- type و C57BL / 6 NCC.

الفئران (الشكل 5 أ). كان النطاق مختلفًا بوضوح عن النطاق الذي تم اكتشافه لـ NCC عند 130 كيلو دالتون. نزع الفسفرة 129Svالكلىقضت العينات التي تحتوي على الفوسفاتاز القلوي في الأمعاء (CIAP) تمامًا على الإشارة التي تم الحصول عليها باستخدام الجسم المضاد الجديد pT96 NKCC2 ، في حين كانت الإشارة مع الجسم المضاد NKCC2 غير المحدد بالفوسفوفورم مرئية في عينات التحكم وعينات إزالة الفسفرة (الشكل 5 ب). ومن المثير للاهتمام ، أن الفسفرة NKCC2 تم التخلص منها إلى حد كبير عندماالكلىتم تحضين lysates عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة بدون CIAP (على الأرجح بسبب نشاط الفوسفاتيز القلوي الداخلي من الأنابيب القريبة). أكدت تجارب نزع الفسفرة باستخدام فوسفاتاز لامدا على أقسام كلية البارافين المتتالية للفئران C57BL / 6 أن الجسم المضاد الجديد يتعرف فقط على NKCC2 الفسفوري (الشكل 5 ج). علاوة على ذلك ، أظهر التألق المناعي على عمليات التجميد المتتالية أن بقع الجسم المضاد الجديدة تلطخ فقط غشاء البلازما القمي لـ NKCC 2- TALs الإيجابية ولكن ليس لـ NCC- إيجابي DCTs في الفئران 129Sv و C57BL / 6 (الشكل 5D) ، مما يشير إلى أن الجديد لا يتفاعل الجسم المضاد pNKCC2 مع pNCC. تم تأكيد هذا الاستنتاج أيضًا باستخدام محلول الخلية من خلايا MDCKI التي تعبر عن NKCC2 البشري (hNKCC2) و NCC البشري (hNCC). أظهرت اللطخات المناعية من التهابات المناعة (IP) ومحللات الخلية الكاملة أن الجسم المضاد pT96 NKCC2 الجديد يتعرف على NKCC2 البشري ولكن ليس NCC البشري (الشكل S8A). ومن المثير للاهتمام ، على الرغم من أن الجسم المضاد الجديد قد تم رفعه ضد pNKCC2 من الفئران C57BL / 6 ، اكتشف الجسم المضاد الجديد فسفرة NKCC2 بشكل مكافئ في كليتي سلالتي الماوس عن طريق كل من الكيمياء المناعية (الشكل 6 أ) والتخطيط المناعي (الشكل 6 ب).

يسمح الجسم المضاد pT96 NKCC2 الجديد بتحليل الفسفرة NKCC2 المنظمة

يتم تنظيم الفسفرة وبالتالي نشاط NKCC2 و NCC بواسطة تركيزات أيون خارج الخلية. يؤدي انخفاض [Cl -] ex إلى زيادة فسفرة NKCC2 عند Thr96 و Thr101 و NCC في Thr53 و Thr58 عن طريق تنشيط مسار WNK / SPAK / OSR1. 7،8،18،29،35 وبالمثل ، فإن ارتفاع [K plus] يقلل بشكل كبير من الفسفرة في NCC ، ولكن يُعتقد أن له تأثير ضئيل أو معدوم على الفسفرة NKCC2. 12،36،37،38 لاختبار ما إذا كان الجسم المضاد pT96 NKCC2 المطور حديثًا قادرًا على اكتشاف هذا النوع من التنظيم التفاضلي للفسفرة NKCC2 ،الكلىشرائح من الفئران C57BL / 6 تم طرحها خارج الجسم الحي إما 110 أو 5 ملي مولار [Cl -] ex و 3 أو 10 ملي مولار [K plus] على التوالي. كما هو متوقع ، أدى انخفاض [Cl -] ex إلى زيادة الفسفرة NCC و NKCC2 بشدة (الشكل 7 أ ، ب) ، بينما أدى ارتفاع [K plus] ex إلى تقليل الفسفرة في NCC فقط ولكنه لم يغير الفسفرة NKCC2 (الشكل 7C ، D). وبالمثل ، فإن الجسم المضاد الجديد المكتشف متغيرًا جيدًا

الشكل 4 لا توجد تغييرات كبيرة في mRNA والتعبير البروتيني الرئيسيكلويالناقلات والقنوات الأيونية في جيل F2 الهجين. A ، مخطط شريط لمستويات التعبير النسبي مرنا في المجموعات الثلاث من الفئران. تم تطبيع جميع القيم لفئران f / f. القيم تعني ± SEM. ب ، وفرة البروتين في الفأرالكلىlysates من حيوانات الجيل F2. تتوافق المجموعات الثلاث مع NKCC2 كامل الطول (f / f) أو NKCC2 متماثل الزيجوت للحذف (Δ / Δ) أو NKCC2 متغاير الزيجوت للحذف (f / Δ /). علامات الوزن الجزيئي متضمنة. من المتوقع أن تكون NKCC2 و pNKCC2 عند 170 كيلو دالتون ، و NCC و pNCC عند 130 كيلو دالتون ، و TRPM6 عند 260 كيلو دالتون ، - ENaC عند 95 كيلو دالتون و 34 كيلو دالتون (مشقوق) ، - ENaC عند 100 كيلو دالتون ، - ENaC عند 100 كيلو دالتون و 85 كيلو دالتون (مشقوق) و ROMK عند 55 كيلو دالتون (بالغليكوزيلات الناضج) و 43 كيلو دالتون (غليكوزيلاتي أساسي) و 34 كيلو دالتون (غير جليكوزيلاتي). تشير الأسهم الخضراء إلى النطاقات المحددة بينما تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى العصابات غير المحددة. C ، تحليل Densitometric لوفرة البروتين بمقارنة f / f و Δ / الفئران. يتم تطبيع شدة النطاق من الفئران Δ / إلى تلك الموجودة في f / f. (القيم تعني ± SEM ؛ n=5 الفئران / المجموعة ؛ * P <.05 ،="" †="" p=""><.01 ،="" ‡="" p=""><>

الفسفرة NKCC2 التي تم استفزازها في خلايا MDCKI التي تعبر عن NKCC2 البشري (hNKCC2) أو الماوس NKCC2 (mNKCC2 (C57BL / 6)) بواسطة ظروف الكلوريد خارج الخلية منخفضة التوتر (الشكل S8B). فيالكلىتم تحضين الشرائح عند 5 ملي مولار [Cl -] على سبيل المثال ، كما أن الأجسام المضادة الموصوفة سابقًا pT96 / T101 NKCC 2 39 والأجسام المضادة pT212 / T217 NKCC1 R 5 11 المضادة للفأر تكتشف الإشارات الخافتة لـ NKCC2 و NCC ، التي تصبح أكثر وضوحًا عند تحميل المزيد من البروتينات وتصوير الطقطقات المناعية في إعدادات محسّنة (الشكل S9).

نقاش

تعد الفئران C57BL / 6 و 129Sv من أكثر سلالات الماوس استخدامًا في البحوث الطبية الحيوية. كان جينوم الفئران C57BL / 6 هو الأول الذي تم تسلسله للفأر 40 وعمل منذ ذلك الحين كجينوم مرجعي لتحليل الاختلافات الجينية والظاهرية بين سلالات الفئران. 41- 44 لـالكلىالبحث ، أحد الاختلافات الأساسية بين الفئران C57BL / 6 و 129Sv يتعلق بالتعبير عن جين الرينين. مثل البشر ، تحتوي الفئران C57BL / 6 على جين رينين واحد فقط ، بينما تمتلك الفئران 129Sv نسختين ، مما قد يفسر القابلية العالية لسلالة الفئران لارتفاع ضغط الدم 45،46 والإصابة المرتبطة. 47 مع هذه الدراسة ، نضيف اختلافًا جينيًا مهمًا آخر يجب مراعاته. وصفنا حذفًا لخمسة أحماض أمينية لم يتم تقديره حتى الآن في NKCC2 (ΔF 97- T101) ، الموجود في C57BL / 6 ولكن ليس في الفئران 129Sv ، والذي يتداخل مع اكتشاف الفسفرة NKCC2 مع معظم الأجسام المضادة المتوفرة سابقًا ، ولكن ليس بشكل كبير تأثيروظائف الكلى.

يتم حفظ مواقع الفسفرة الطرفية NKCC2 N للفأر T96 و T101 بشكل كبير عبر الأنواع وبين NKCC2 و NKCC1 و NCC (الشكل 1). 48 لذلك ، ليس من المستغرب أن تتفاعل الأجسام المضادة الموجهة ضد مواقع الفسفرة هذه مع الناقلات الأخرى. أفادت الدراسات السابقة أن الأجسام المضادة ضد NCC الفسفرة تكتشف أيضًا NKCC الفسفوري 2 7 ، 18،28،29 وأن الجسم المضاد pNKCC1 يسمح بتحليل مستويات الفسفرة لكل من NKCC1 و NKCC2. تمشيا مع هذا ، لاحظنا التفاعل المتبادل للأجسام المضادة pNCC (pT53 و pT58) مع NKCC2 الفسفوري والجسم المضاد pT96 / pT101 NKCC2 مع NCC الفسفوري. ومع ذلك ، لوحظ أن التفاعل المتبادل للأجسام المضادة لـ PNCC مع NKCC2 شوهد فقط في كليتي فئران 129Sv ، ولكن ليس في كليتي C57BL / 6 الفئران. على العكس من ذلك ، أظهر الجسم المضاد الذي تم تطويره مسبقًا لـ NKCC2 pT96 / pT101 عدم وجود إشارة ضعيفة جدًا أو في أفضل الأحوال لـ pNKCC2 في كليتي الفئران C57BL / 6 واكتشاف NCC الفسفوري بشكل أساسي في هذه السلالة. الآن ، نربط هذه الملاحظات المربكة بحذف خمسة أحماض أمينية في NKCC2 لفئران C57BL6 (ΔF 97- T101). تم دراسة تنظيم الفسفرة NKCC2-

موجودة في بيئات تجريبية مختلفة وللمحفزات المختلفة بما في ذلك vasopressin و 14،21،24،25،49 uromodulin 19،20،50 and calcineurin inhibitors. 10،26 بينما أجريت معظم الدراسات في أنظمة التعبير غير المتجانسة 10،19،20،25،50 أو في الفئران 10،24 والفئران 19،26 معبرة عن الطول الكامل NKCC2 ، تم إجراء بعض الدراسات أيضًا في الفئران C57BL / 6. 7،18،27،28،29،51 كما أبلغنا هنا ، تعبر الفئران C57BL / 6 عن متغير NKCC2 مع حذف خمسة أحماض أمينية يتداخل مع الكشف المناسب عن الفسفرة NKCC2 والتي تحمل مخاطر أن المعيار pT96 / T101 NKCC2 تتفاعل الأجسام المضادة والجسم المضاد R5 المضاد للفوسفو- NKCC1 مع NCC الفسفوري على الأقل في ظل الظروف المستخدمة في عملنا. ليس من الممكن الحكم على تأثير هذا التفاعل المتبادل على الاستنتاجات التجريبية السابقة ، ولكن وفقًا لملاحظاتنا ، يجب إعادة النظر في البيانات من الفئران C57BL / 6 وتفسيرها بحذر. على الرغم من حقيقة أن حذف الأحماض الأمينية الخمسة كان له تأثير قوي على اكتشاف الفسفرة NKCC2 ، ليس لدينا دليل على أن الحذف يؤثر بشكل كبير على النشاط الوظيفي للناقل المشترك. كان لدى الفئران C57BL / 6 في الواقع إفراز بولي أعلى من Mg 2 بالإضافة إلى إفراز بولي أقل من Ca 2 بالإضافة إلى إفراز 31 من الفئران 129Sv ، لكننا وجدنا أن هذه الاختلافات ربما لا تتعلق بنقل مجاور خلوي لهذه الكاتيونات على طول TAL ، ولكنها كذلك نتيجة TRPM 6- المعتمد على Mg 2 بالإضافة إلى الامتصاص في الأمعاء وزيادة TRPV 5- المعتمد على Ca 2 بالإضافة إلى إعادة الامتصاص في DCT2 و CNT. هذا الأخير يسبب توازنًا إيجابيًا Ca 2 plus والذي قد يساعد في زيادة الكثافة المعدنية المنخفضة للعظام للفئران C57BL / 6. النتيجة أن الفئران C57BL / 6 و 129Sv تظهر نفس الشيءكلويتشير الاستجابات لمدرات البول الحلقية والثيازيدية وتقييد الماء كذلك إلى أن حذف الأحماض الأمينية الخمسة في NKCC2 لا يضعف بشكل كبير وظيفة TAL. الأهم من ذلك ، أن الفئران من الجيل F2 من الفئران المهجنة C57BL / 6 و 129Sv لها نفسكلويالنمط الظاهري بغض النظر عما إذا كانت الفئران تعبر عن الطول الكامل (f / f) NKCC2 أو NKCC2

متماثل (Δ / Δ) للحذف. تتوافق هذه الملاحظات في الفئران مع البيانات الوظيفية السابقة من أنظمة التعبير غير المتجانسة. في حين أن طفرات البقايا الفردية في NKCC1 (T217 في الإنسان ، T211 في الماوس) أو NCC (T60 في الإنسان ، T58 في الماوس) تلغي نشاط حمالين cotrans ، طفرات البقايا المقابلة في NKCC2 (T105 في الإنسان ، T101 في الماوس ) لها تأثير ضئيل أو معدوم إلى حد ما على نشاط NKCC2 المحفز وخط الأساس. 35،52،53 حتى عندما يتم تحور كل من بقايا ثريونين في NKCC2 إلى ألانين ، فإن النشاط الوظيفي لـ NKCC2 لا يزال يصل إلى 70 بالمائة من الحد الأقصى للنشاط ، 35 مما يشير إلى أن الفسفرة في هذه المواقع تدل على أنها ليست ضرورية لنشاط NKCC2.

غالبًا ما تكون مواقع الفسفرة متجانسة بين البروتينات. ومن ثم ، فإن مشكلة التفاعل التبادلي للأجسام المضادة الخاصة بالفوسفوفورم ليست فريدة بالنسبة للأجسام المضادة الموجهة ضد NCC و NKCC2 و NKCC1 الفسفوري ، ولكن تم الإبلاغ عنها أيضًا للبروتينات الأخرى مثل كينازات cyclin المعتمدة 1 و 2 54 وخارج الخلية الكينازات المنظمة بالإشارة 1 و 2. 55 بشكل ثابت ، كلما تم استخدام أجسام مضادة خاصة بحالة الفسفرة ، هناك حاجة إلى ضوابط تجريبية صارمة لتأكيد خصوصية الإشارات المكتشفة. قد يشمل ذلك (أ) التأكيد على أن الجسم المضاد المستخدم يكتشف البروتين بالوزن الجزيئي المتوقع (التكتل المناعي) و / أو في الموقع الخلوي وشبه الخلوي المتوقع (التألق المناعي) ، (ب) التحقق من أن الجسم المضاد يتفاعل بشكل خاص مع حاتمة الفسفرة بواسطة باستخدام فحوصات المنافسة مع الببتيدات الفسفورية وغير الفسفورية ، و (ج) إثبات أن

يكون الجسم المضاد محددًا للفوسفوفورم من خلال مقارنة عينات الأنسجة المُفسفرة والفسفرة. قد تُستكمل هذه الضوابط من خلال الضوابط الجينية التي تشمل اختبار الأنسجة من الحيوانات الضربة القاضية و / أو الخلايا التي تعبر بشكل غير متجانس عن البروتين المطلوب. في هذه الدراسة ، استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه لتوصيف دقيق جديد للجسم المضاد pT96 NKCC2 الذي يكتشف NKCC2 الفسفوري فيالكلىعينات من الفئران C57BL / 6 و 129Sv على قدم المساواة. يكون الجسم المضاد خاصًا بالفوسفوفورم ولا يظهر أي تفاعل تبادلي واضح مع NCC الفسفوري تحت أي من الظروف المختبرة. باستخدام هذا الجسم المضاد ، أكدنا أن تركيزات الكلوريد المنخفضة خارج الخلية تزيد من فسفرة NKCC2 في هذا الموقع ، بينما لا يكون لتركيزات البوتاسيوم المتغيرة خارج الخلية دور تنظيمي مهم. 24 في الختام ، يكشف عملنا عن اختلاف إجهاد حاسم في تسلسل الأحماض الأمينية للماوس NKCC2 والذي يؤثر على الكشف وبالتالي تحليل وتنظيم الفسفرة NKCC2. يتحايل جسم مضاد pT96 NKCC2 تم تطويره حديثًا على هذا التحذير الفني ويسمح بالكشف الموثوق به عن الفسفرة NKCC2 المعدلة بشكل مستقل عن الخلفية الجينية لنماذج الفئران. علاوة على ذلك ، تؤكد دراستنا مرة أخرى أنه يجب مراعاة الاختلافات في الخلفية الجينية عند تحليل نماذج الفئران.

المواد والأساليب

الحيوانات،كان عمر الذكور المتطابق ({0}} أسبوعًا) إما من سلالات فطرية 129S6 / SvEvTac ، C57BL / 6J ، يشار إليها فيما بعد باسم 129Sv و C57BL / 6 ، أو سلالة مختلطة 129S / B6 في الجيل F2. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقًا لقوانين الرفق بالحيوان السويسرية وتمت الموافقة عليها من قبل الإدارة البيطرية في كانتون زيورخ ، سويسرا (التراخيص: 141/2014 ، 185/2017 و 135/2018). تم التنميط الجيني للفئران لحذف 15 قاعدة باستخدام PCR القياسي مع البادئات المتوفرة في الجدول S3. الطول الكامل (f / f) يحتوي NKCC2 على منتج PCR متوقع يبلغ 87 نقطة أساس بينما من المتوقع أن يكون تسلسل NKCC2 المحذوف (Δ / Δ) عند 70 نقطة أساس.

معالجة الأنسجةتم تخدير الفئران بمزيج من الأيزوفلورين (2 بالمائة - 4 بالمائة ، 0. 5 لتر / دقيقة ؛ Provet ؛ CH) وتيمجسيك (Buprenorphine ؛ 0. 05- 0. 4 ملغم / كغم من وزن الجسم ؛ الفرد ؛ CH). للتحليل الكيميائي الحيوي ، تم تخدير الفئران وإرسائها عبر البطين الأيسر للقلب بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS). تم حصاد الكلى والقولون القاصي ، وتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في −8 0 درجة حتى مزيد من المعالجة. بالنسبة للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، تم إصلاح الكلى باستخدام بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 3 في المائة في 0. 1 M عازلة الفوسفات (الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 3 0 0 الميلي أسمول) عن طريق الإرواء الرجعي للفأر المخدر بعمق عبر الشريان الأورطي البطني متبوعًا بشطف قصير مع 0. 1 M phos phate buffer (0.2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O، 0.2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O، 0.1 M CaCl 2). بعد ذلك ، تمت إزالة الكلى وتقطيعها إلى قطع وتجميدها في البروبان السائل وتخزينها عند -80 درجة.

دراسات القفص الأيضيبعد التكيف مع الأقفاص الأيضية (Techniplast) ، تم الاحتفاظ بالفئران في أقفاص التمثيل الغذائي لمدة أربعة أيام متتالية مع حرية الوصول إلى مياه الصنبور وطعام المختبر القياسي (Ssniff ، Spezialdiäten GmbH). تم تسجيل وزن الجسم والغذاء والماء المتناول يوميا وتم جمع البول والبراز لمدة 24 ساعة.

بروتوكول تقييد المياهتم الاحتفاظ بالفئران لمدة 24 ساعة في أقفاص التمثيل الغذائي (Techniplast) دون الوصول إلى ماء الصنبور. تم خلط مسحوق تشاو المختبر القياسي (Ssniff ، Spezialdiäten GmbH) بالماء 1: 1 ، وتم جمع وتحليل البول والبراز على مدار 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، تم إعادة الفئران إلى أقفاص عادية (T 2L (IVC) ، LASC ، UZH).

القياسات البيوكيميائيةتم تحليل التركيزات البولية لـ Na plus و K plus و Ca 2 plus بواسطة قياس ضوء اللهب (EFOX 5053 ، Eppendorf). تم قياس تركيزات Mg 2 plus في البول والبلازما في مركز زيورخ لفسيولوجيا القوارض التكاملي باستخدام نظام (أنظمة) SYNCHRON LX® ونظام UniCel® DxC 800 Synchron® Clinical System و Synchron® System Multi Calibrator. تم قياس الكرياتينين البولي باتباع طريقة جاف. تم قياس تركيزات غازات الدم والأيونات في الدم الكامل الهيبارين باستخدام محلل غازات الدم ABL825Flex (مقياس الإشعاع) مباشرة بعد جمع الدم من الوريد الأجوف. تم قياس مستويات الألدوستيرون في البلازما والتركيز البولي للأورومودولين (UMOD) باستخدام مجموعات ELISA المتاحة تجاريًا (مجموعة Aldosterone ELISA بواسطة كايمان ؛ # 501090 ومجموعة Mouse Uromodulin ELISA بواسطة Abcam ؛ ab245726 على التوالي).

تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT- qPCR)

تم عزل RNA من الكلى والقولون البعيد باستخدام مجموعة عزل RNA الكلية SV (PROMEGA). تم نسخ تركيزات متساوية من الحمض النووي الريبي المعزول (250 نانوغرام في 129Sv مقابل C57BL / 6 أو 500 نانوغرام في f / f و Δ / Δ و f /) إلى cDNAs باستخدام مجموعة GoScript ™ Reverse Transcriptase (PROMEGA). تم تخفيف cDNAs المتولدة بشكل إضافي مع الماء الخالي من DNAse / RNAse (1: 5). تم تصميم الاشعال لتقدير إجمالي Slc12a1 و Slc12a3 و Trpm6 و Trpv5 و Scnn1a و Scnn1b و Scnn1g و Kcnj1 (الجدول S3). تم إجراء تحليل PCR الكمي باستخدام LightCycler ® 480 (Roche) لقياس مستويات التعبير عن الجينات ذات الأهمية. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة delta Ct باستخدام -actin كجينة مرجعية.

تحليل لطخة غربيةتم تجانس الكلى في محلول تحلل خالٍ من المنظفات (DFLB) يحتوي على مانيتول 2 0 0 ملي مولار ، HEPES [4- (2- هيدرو إكسيلثيل) - 1 بيبرازازين إيثان سلفونيك الأحماض] 80 ملي مولار ، هيدروكسيد سيوم البوتاسيوم 41 ملي مولار ، مثبطات البروتياز (Complete Ultra ، Roche) ومثبطات الفوسفاتيز (PhosSTOP ، Roche) باستخدام 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) في مجانس الأنسجة Precellys 24 (Bertin Instruments ، Montigny- le- بريتونوكس). تم ترسيب الحبيبات بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق (1987 rcf) وتم تخزين البروتين المحتوي على المادة الطافية في قسامات أحادية الاستخدام عند درجة 80-. بالنسبة إلى اللطخة الغربية ، تم تغيير طبيعة 50 ميكروغرام من البروتين في Laemmli Buffer ، وتم فصلها بواسطة SDS- PAGE باستخدام 8 بالمائة - 12 بالمائة من المواد الهلامية وتم نقلها لاحقًا إلى أغشية النيتروسليلوز. تم حظر مواقع الربط غير المحددة باستخدام 1x Odyssey Blocking Solution (Li-COR Biosciences) قبل حضانة الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (الجدول S4) المخففة في 0.2x Odyssey Blocking Solution عند 4 درجات لمدة 12 ساعة. بعد الغسيل في PBS - 0. 1٪ توين ، تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة ثانوية (ماعز - مضاد للأرنب IRDye 800 أو ماعز - صبغة الأشعة تحت الحمراء المضادة للفأر 680 ، 1:10 '000 ، LI - COR Biosciences) مخفف في محلول عازلة 0.1x الكازين (Sigma). تم تصور النطاقات المكتشفة باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey (Li- COR Biosciences). لضمان تحميل متساوي للبروتين ، كانت الأغشية إما ملطخة بجسم مضاد ضد - أكتين أو تم تلوين البروتين الكلي باستخدام REVERT Total Protein Stain (Li- COR Biosciences) قبل اكتشاف الأجسام المضادة. تم قياس كمية العصابات المناعية في فيجي (ImageJ) وتم تطبيعها ضد إشارة الأكتين أو صبغة البروتين الكلي REVERT على التوالي.

المناعيةتم حظر مقاطع Cryostat (سمك 4 ميكرومتر) بسبب ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بمصل الماعز الطبيعي بنسبة 10 بالمائة ثم تم تحضينها لاحقًا بالأجسام المضادة الأولية (الجدول S4)

بين عشية وضحاها في 4 درجات. بعد الغسل باستخدام 1X PBS ، تم تحضين الشرائح بأجسام مضادة ثانوية (Cy3 - ماعز مترافق - مضاد للأرنب IgG ، رقم المنتج 111- 165- 144 ، 1: 1 0 00 و FITC - ماعز مترافق - مضاد للفأر IgG ، رقم المنتج 115- 095- 068 ، 1: 100 على التوالي ، كلاهما من مختبرات جاكسون إمونو للأبحاث) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تم تخفيف جميع الأجسام المضادة في 1 بالمائة BSA / 1xPBS. كانت نوى الخلية ملطخة بـ DAPI (4 ′، 6- Diamidino - 2- phentyl- indole، Sigma- Aldrich، Co.) بتركيز 0.1 ميكروغرام / مل. تم إجراء التصوير باستخدام مجهر مضان Leica DM6000 B (Leica Microsystems ، 35578) باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون من نوع Leica DFC350 FX مضان (Leica Microsystems ، 35578). تمت معالجة الصور في فيجي (إيماجيج).

جيل من تقارب أرنب منقى - مضاد للفأر pT96 NKCC2 الأجسام المضادةتم إجراء إنتاج الجسم المضاد بواسطة خدمة Pineda للأجسام المضادة (برلين ، ألمانيا). تم تحصين الأرانب باستخدام ببتيد فوسفوري يشتمل على الأحماض الأمينية 105- 114 من سلسلة C57BL / 6 الماوس NKCC2 (NH 2- YYLQ (p) TMDAV- COOH). تمت تنقية التقارب أحادي النوع IgG ضد الببتيد الفوسفوري وبعد ذلك تمتصه مسبقًا ببتيد dephospho- الببتيد مما أدى إلى جزء معين من الجسم المضاد الفسفوري. تم اختبار خصوصية الجسم المضاد لهذا الجزء عن طريق الكيمياء المناعية وتحليل اللطخة الغربية (الشكل 5 والشكل S4).

علاج الفوسفاتيزتم تحضين محللات البروتين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مع الفوسفاتاز القلوي المعوي (CIAP) (1 وحدة / 1 ميكروغرام بروتين) للحث على التحلل المائي لمجموعات 5-فوسفات من البروتينات المحتوية على الفوسفات ، مما أدى إلى تثبيط الارتباط النوعي لـ pT96 الأجسام المضادة NKCC2 للبروتينات الموجودة على غشاء لطخة غربية النيتروسليلوز (الشكل 5 ب). تم استخدام الكلى المؤرشفة المضمنة بالبرافين من الفئران C57BL6. تم إجراء معالجة المقاطع باستخدام الفوسفاتيز القلوي المعوي (Sigma Aldrich) كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة. 56 بعد حجب مجموعات الألدهيد الحرة ، تم شطف المقاطع خمس مرات في محلول الفوسفاتاز القلوي (1 0 0 ملم تريس ، 50 ميكرومتر CaCl 2 ، 0.1 ملم MgCl 2 ، 8.4 ميكرومتر ليوبتين ، 4 ملم Pefablock ، 9.0 الرقم الهيدروجيني). في وقت لاحق ، تم تحضين المقاطع في محلول الفوسفاتيز القلوي مع أو بدون الفوسفاتيز القلوي المعوي (حوالي 130 وحدة / مل) في حاضنة عند 35 درجة لمدة ساعتين. تم إجراء الكيمياء المناعية والمجهري الضوئي لاحقًا على النحو المفصل. 57

محاذاة تسلسل الأحماض الأمينيةتم الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية لمختلف الأنواع وسلالات الفئران من قاعدة البيانات المفتوحة "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org، Sanger Institute). 42 يتم سرد مصادر معرفات النص في الجدول S1. تمت محاذاة التسلسلات باستخدام Qiagen © CLC Main Workbench 20.

شرائح الكلىالكلىتم استخدام شرائح C57BL / 6 الفئران للتجارب خارج الجسم الحي كما هو موضح سابقًا. 12 لفترة وجيزة ، تم صيام الفئران طوال الليل مع حرية الوصول إلى الماء لتجنب أي آثار محتملة لتناول الأيونات الغذائية على مستويات الفسفرة في NKCC2 و NCC. تمت إزالة الكلى من الحيوانات المخدرة ، وتقطيعها إلى شرائح بسمك 280 ميكرومتر باستخدام آلة تقطيع دقيقة تهتز (Vibratome ، Microm ؛ Thermo Scientific) ، ووضعها في محلول Ringer (بالمللي مول): 98.5 NaCl ، 25 NaHCO 3 ، 3 KCl ، 1 Na 2 HPO 4 و 2.5 CaCl 2 و 1.8 MgCl 2 و 25 جلوكوز لمدة 30 دقيقة عند 30.5 درجة مع فقاعات ثابتة مع 95 بالمائة من O 2 و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، تم استبدال محلول Ringer بحلول مماثلة ولكن مع Cl- (5 ملي مولار منخفض Cl- ، 110 ملي مولار لـ Cl العادي) وتركيزات K plus (3 ملي مولار طبيعي زائد ، 10 ملي مولار عالي K زائد) من أجل 30 دقيقة إضافية. أخيرًا ، تم تجميد الشرائح في نيتروجين سائل.

إحصائياتتم استخدام اختبار t للطلاب غير المقيدين واختبار ويلش في حالة التباينات غير المتكافئة لمقارنة مجموعتين (GraphPad Prism ، الإصدار 8. 0. 2). للمقارنة المتعددة ، تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق للمقارنة المتعددة (GraphPad Prism ، الإصدار 8. 0. 2). يتم عرض البيانات كوسائل ± SEM (في الجداول والأشكال). اعتبرت الفروق كبيرة عند P <>

شكر وتقدير  يشكر المؤلفون الدكتور جاري شول (جامعة سينسيناتي ، سينسيناتي ، أوهايو) على توفير الفئران NCC-KO ، والدكتور بيف فوربوش (كلية الطب بجامعة ييل ، نيو هافن ، CT) لجسمه المضاد "R5" pNKCC1 ، والدكتور هنريك ديمكي ( جامعة جنوب الدنمارك ، أودنسه ، الدنمارك) لجسمه المضاد NCC أحادي النسيلة. يقر المؤلفان أيضًا بمونيك كاريل وإنجر ميريت بولسن للمساعدة الفنية والدكتور إستر بانكي لتقديمهالكلىعينات. تم إجراء قياسات كثافة المعادن في العظام وجزء من تحليل البول والبلازما من قبل الدكتورة بترا سيبيك ونادين نجيلي (فسيولوجيا القوارض التكاملي في زيورخ ، جامعة زيورخ) على التوالي. وقد حظيت المداخلات المفيدة للغاية من الدكتورة أليسيا ماكدونو (جامعة جنوب كاليفورنيا) والدكتور أوليفييه ديفويست (جامعة زيورخ) بتقدير كبير.

تضارب المصالح تتلقى مجموعة JL إتاوات للأجسام المضادة المرخصة ضد NCC و Nedd الفسفوري 4- 2 من Milipore و Abcam على التوالي. لم يتم استخدام كلا الأجسام المضادة في الدراسة الحالية. علاوة على ذلك ، تلقت JL 2019 تكريمًا من VIFOR لعرض تقديمي شفهي في ندوة نظمتها VIFOR.