دراسة علم الصيدلة الشبكية للآليات الجزيئية لـ Hypericum Japonicum في علاج التهاب الكبد الصفراوي مع التحقق من صحة نموذج الجرذ Hepatotoxicity Alpha-Naphthylisothiocyanate (ANIT)
Mar 24, 2022
لمزيد من المعلومات. اتصلtina.xiang@wecistanche.com
خلفية: هدفت دراسة علم الصيدلة الشبكية هذه إلى تحديد المركبات النشطة والآليات الجزيئية المشاركة في تأثيرات Hypericum japonicum على التهاب الكبد الصفراوي. لقد تحققنا من صحة النتائج في نموذج الفئران ألفا-نافثيل-إيزوثيوسيانات (ANIT) من السمية الكبدية.
المواد / الطرق: تم استرجاع المكونات والأهداف الكيميائية لـ H.japonicum والجينات المستهدفة المرتبطة سابقًا بالتهاب الكبد الركودي من قواعد البيانات العامة. تم إنشاء شبكة باستخدام برنامج Cytoscape 3.7.2 وتم تحليل قاعدة بيانات STRING ووظائف البروتين المحتملة بناءً على النظام الأساسي العام للمعلومات الحيوية. تم استخدام ANIT للحث على التهاب الكبد الصفراوي في نموذج الفئران باستخدام 36 جرذًا من جرذان Sprague-Dawley ، وتم استخدام هذا النموذج للتحقيق في التدخل مع 3 جرعات منكيرسيتين(جرعة منخفضة ، 50 مجم / كجم ؛ جرعة متوسطة ، 100 مجم / كجم ؛ وجرعة عالية ، 200 مجم / كجم) ، المكون النشط الرئيسي لـ H.japonicum. تم قياس مستويات المؤشرات الكيميائية الحيوية في الدم بواسطة مجموعات تجارية ، ومستويات الرسول RNA (mRNA) لعلامات وظائف الكبد والميتوكوندريا والاكسدةتم الكشف عنها عن طريق تفاعل النسخ العكسي - البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (RT-PCR).
نتائج: المكونات النشطة الرئيسية لـ H. japonicum كانت كيرسيتين ، كايمبفيرول ، ورباعي ميثوكسي لوتولين. وتضمنت أهدافهم الرئيسية البروستاغلاندين G / H سينثاز 2 (PTGS2) ، ورم الغدد الليمفاوية B-cell -2 (BCL2) ، والكوليسترول 7- alpha-hydroxylase (CYP7A1) ، ومستقبل farnesoid X (FXR). عزز تدخل كيرسيتين الشفاء من التهاب الكبد الصفراوي.
تقدم نتائج هذا البحث الدعم للبحث المستقبلي حول أدوار كيرسيتين ، كايمبفيرول ، و
الاستنتاجات: tetra methoxy luteolin في أمراض الكبد البشرية وأدوار جينات PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR في التهاب الكبد الصفراوي.
الكلمات الدالة: ركود صفراوي داخل الكبد · شبكات تنظيم الجينات · Hypericum · الطب الصيني التقليدي · علم الأدوية · كيرسيتين
خلفية
ركود صفراويهي متلازمة سريرية تشمل آفات الكبد الناتجة عن تكوين وإفراز وإخراج غير طبيعي للصفراء. ترتبط أمراض الكبد الصفراوية ارتباطًا وثيقًا بالاضطرابات في تخليق حامض الصفراء ونقله وغالبًا ما تسبب إصابة الكبد الصفراوية ، والتي قد تتطور في النهاية إلى تليف الكبد وتليف الكبد وفشل الكبد [1 ، 2].
الركود الصفراوي هو أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب الكبد الصفراوي ، والركود الصفراوي الناجم عن alpha-naphthylisothiocyanate (ANIT) ويمكن أن يؤدي في النهاية إلى التهاب الكبد الصفراوي. ANIT هو مادة كيميائية سامة تستخدم للحث على نخر الخلايا الكبدية ، وتضخم القناة الصفراوية ، وتليف الكبد ، والذي يستخدم لإصابة الكبد أو التهاب الكبد الصفراوي في نماذج الحيوانات التجريبية. في الدراسات البحثية ، يتم حقن الفئران داخل الصفاق مع ANIT لتكرار التهاب الكبد الصفراوي [3-5]. تشمل السمات النسيجية المرضية لإصابة الكبد أثناء الركود الصفراوي نخر أنسجة الكبد ، وانتشار القناة الصفراوية ، والتغيرات المائية ،اشتعالوالتليف. يُظهر الركود الصفراوي الناجم عن ANIT في الحيوانات ارتفاعًا كبيرًا في المؤشرات الحيوية للبلازما لإصابة الكبد ، مثل ألانين أمينوترانسفيراز (ALD) ، وأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST) ، وفوسفاتيز قلوي ، و y-glutamic-yltranspeptidase (y-GGT).الاكسدةيزداد أيضًا بشكل كبير ، كما يتضح من المستويات العالية من أنواع الأكسجين التفاعلية ، وبيروكسيد الدهون ، وخزانات الجلوتاثيون المستنفدة ، وضعف قدرة الأنسجة المضادة للأكسدة في الكبد. الأهم من ذلك ، أن الحيوانات التي يسببها ANIT تظهر تثبيط نشاط نازعة الهيدروجين في الميتوكوندريا ، وانهيار إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتورم الميتوكوندريا. تظهر الميتوكوندريا من الفئران التي يسببها ANIT زيادة قابلية للتأثر بنفاذية انتقال نفاذية الميتوكوندريا وفتح الاستقطاب غير المجعد لنشاط ATPase. وبالتالي ، يرتبط التهاب الكبد الركودي ارتباطًا وثيقًا بوظيفة الكبد ، والإجهاد التأكسدي ، وبنية ووظائف الميتوكوندريا [6،7].
في الوقت الحاضر ، يتم استخدام عدد قليل فقط من الأدوية ، مثل حمض أورسوديوكسيكوليك (UCDA) ، في علاجركود صفراوي[8،9] ؛ لكن هذه الأدوية لها عيوب ، بما في ذلك ضعف الاستجابة وردود الفعل السلبية والامتثال المنخفض. ومع ذلك ، فإن الطب الصيني التقليدي له تاريخ طويل وخبرة إكلينيكية غنية في علاج أمراض الكبد ، مثل ركود صفراوي داخل الكبد. Hypericum japonicum هو العشب الكامل المجفف من Hypericum japonicum Thunb. ex Murray ، المعروف أيضًا باسم Di-er-Cao أو Tian-ji-Huang ، تم استخدامه في علاج اليرقان منذ عهد أسرة تشينغ. يحتوي H. japonicum على وظائف تنقية الحرارة ، وإزالة الرطوبة ، وتهدئة الكبد ، وتقوية المرارة ، ويشيع استخدامه في العلاج السريري لليرقان نتيجة الحرارة الرطبة [10]. يشتمل التركيب الكيميائي لـ H. japonicum على مركبات الفلافونويد ، واللانثانيدات ، والكرومون جليكوسيدات ، ومشتقات الفلوروغلوسينول ، واللاكتونات. من بين مركبات الفلافونويد ، الكيرسيترن ، الأيزوكيرسيترين ، والكيرسيتين -7- O - - l-rhamnoside هي المكونات ذات النشاط الوقائي للكبد [11]. أظهر Ning Wang et al أن المستخلصات المائية ل H.japonicum ، بما في ذلك quercetin و iso-quercetin و quercetin ، تمتلك تأثيرًا مضادًا للتسمم الكبدي ومضادًا للركود الصفراوي على التهاب الكبد الناجم عن رباعي كلوريد الكربون والحيوانات التجريبية التي يسببها ANIT. ومع ذلك ، لا تزال آليات وأهداف H. japonicum في علاج ركود صفراوي داخل الكبد غير واضحة.
في هذه الدراسة ، تم الجمع بين علم الصيدلة الشبكي والتجارب الدوائية. أولاً ، تم تحديد المكونات والأهداف النشطة الرئيسية لـ H.japonicum في السيليكو واستخدامها لبناء شبكة هدف مكون [13 ، 14]. تم إجراء تحليلات الإثراء الوظيفي للجينات المستهدفة لاستكشاف الآليات العلاجية الممكنة في علاج التهاب الكبد الصفراوي. بعد ذلك ، تم استخدام نموذج الفئران لالتهاب الكبد الركودي الناجم عن ANIT للكشف عن الآليات الكامنة وراء تأثيرات H.japonicum في علاج التهاب الكبد الركودي وتأثيراته الوقائية على الكبد. على وجه التحديد ، درسنا إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، موت الخلايا المبرمج للكبد ، تنظيم توازن حمض الصفراء داخل الكبد ، ومسارات أخرى.
المواد والطرق
المواد الكيميائية والكواشف
H. japonicum Thunb. تم شراء Murray السابقين من Kangmei Pharmaceutical Co.، Ltd. (Puning ، الصين) ؛ تم شراء -naphthyl isothiocyanate (ANIT ، 98 بالمائة) من Shanghai Macklin Biochemical Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين) ؛كيرسيتين(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>98 بالمائة) من شركة Dalian Melone Biology Technology Co.، Ltd. (داليان ، الصين). تم شراء زيت الزيتون من شركة Sigma Aldrich Trading Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين). تم شراء Malondialdehyde (MDA) ، superoxide disutase (SOD) ، البيليروبين المباشر (DBI) ، إجمالي البيليروبين (TBIL) ، مجموع حمض الصفراء (TBA) ، ALT ، ومجموعات فحص AST ، ومجموعات الجلوتاثيون بيروكسيداز (GSH-Px). معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية (نانجينغ ، الصين). تم شراء حزمة كاشف اختبار البروتين Bio-Rad DC من مختبرات Bio-Rad (كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مياه HyPure الخاصة بالبيولوجيا الجزيئية و FastStart Universal SYBR Green Master mix (Rox) ومجموعة RevertAid First Strand cDNA من Thermo Fisher العلمية المحدودة (شنغهاي ، الصين). المواد الأولية ضد PTGS2 ، سرطان الغدد الليمفاوية B-cell -2 (BCL2) ، الكوليسترول 7- alpha hydroxylase (CYP7A1) ، farnesoid X receptor (FXR) ، interleukin -1 beta (L {{ 13} ب) ، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-o) تم شراؤها من Service bio Technology Co.، Ltd. (ووهان ، الصين). كانت جميع المواد الكيميائية والكواشف الأخرى ذات درجة تحليلية أو أعلى وتم شراؤها من مصادر تجارية.
الحيوانات
تم شراء ذكور فئران Sprague-Dawley التي يتراوح وزنها بين 180 جرامًا و 220 جرامًا من مركز الحيوانات التجريبية بجامعة ساوثهام الطبية (SCXK (YUE) 2018-0085). تم إيواء الفئران في أقفاص مع الطعام والماء بشرط أن تتأقلم مع المختبر لمدة أسبوع قبل كل تجربة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات والرعاية من قبل لجنة استخدام الموضوعات البشرية والحيوانية في قسم التدريس والبحث بجامعة قوانغتشو للطب. كان رقم شهادة الحيوان 44002100016560.
فحص مكونات وأهداف H.japonicum
بأخذ كلمة Di-er-cao ككلمة بحث رئيسية ، بحثنا عن المكونات الكيميائية والأهداف ذات الصلة بـ H. قاعدة بيانات علاقات العمل الشبكي بين الأدوية والأهداف والأمراض [15]. تم الحصول على أسماء الجينات المقابلة للأهداف باستخدام قاعدة المعرفة UniPort ، وهي مركز مركزي لجمع المعلومات الوظيفية عن البروتينات [16]. تم اختيار الأرغن هو "الإنسان".
توقع الهدف العلاجي وبناء الشبكة
تم استخدام "التهاب الكبد الصفراوي" ككلمة رئيسية للحصول على أهداف البروتين وأسماء الجينات المقابلة لالتهاب الكبد الصفراوي في قاعدة بيانات GeneCards ، والتي تقوم تلقائيًا بالتنقيب عن المعلومات التي تتمحور حول الجينات البشرية وتدمجها من مصادر بيانات لا تعد ولا تحصى [17]. تم اختيار الأهداف مع "الهدايا 230" كأهداف علاجية لالتهاب الكبد الصفراوي. للحصول على الأهداف المحتملة لـ H.japonicum لعلاج التهاب الكبد الصفراوي ، تم تقاطع الأهداف الدوائية مع أهداف المرض وفقًا لـ "اسم الجين". تم استخدام برنامج Cytoscape 3.7.2 [18] لإنشاء شبكة مكون - tar-get ، واستخدمت وظيفة محلل الشبكة لتحليل معلمات طوبولوجيا الشبكة.
تحليل تفاعل البروتين المستهدف
تم استيراد أهداف تقاطع H.japonicum والتهاب الكبد الصفراوي إلى قاعدة بيانات String ، والتي يمكن أن تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين المباشرة (المادية) وغير المباشرة (الوظيفية) (PPI) [19]. بثقة عالية (0. 9) كشرط للفحص وإزالة الأهداف المعزولة وتحديد الأنواع كإنسان ، تم إنشاء شبكة PPI. بعد استيراد البيانات المذكورة أعلاه إلى Cytoscape ، تم استخدام طريقة تحليل Maximal Clique Centrality (MCC) في المكون الإضافي cytoHubba لتحليل الأهداف التنظيمية الرئيسية لشبكة PPI
الوظيفة المستهدفة وتحليل إثراء المسار
لفهم العمليات البيولوجية ومسارات الإشارات لجينات البروتين المستهدفة ، تم إدخال أهداف علاج التهاب الكبد الصفراوي بواسطة H. japonicum في Metascape ، وهي أداة قوية لتحليل الشرح الجيني [20]. كانت الأنواع تقتصر على البشر ، و P.<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">
الآثار العلاجية للكيرسيتين على التهاب الكبد الصفراوي الناجم عن ANIT
تم تقسيم ستة وثلاثين ذكورًا من جرذان Sprague-Dawley بشكل عشوائي إلى 6 مجموعات (عدد =6 لكل مجموعة): تم استلام المجموعة محليًا بمركبة فارغة لمدة 7 أيام وحقن IP بزيت الزيتون (2 مل / كجم من وزن الجسم) في اليوم الخامس ؛ استلمت المجموعة مركبة فارغة شفويًا لمدة 7 أيام ؛ عولجت المجموعة الثانية عن طريق الفم باستخدام UCDA (50 مجم / كجم من وزن الجسم) لمدة 7 أيام ؛ عولجت المجموعة الخامسة عن طريق الفم بجرعة عالية من كيرسيتين (Que H ، 200 مجم / كجم من وزن الجسم) لمدة 7 أيام. عولجت المجموعة الخامسة عن طريق الفم بجرعة متوسطة من كيرسيتين (QueM ، 100 مجم / كجم من وزن الجسم) لمدة 7 أيام. تم علاج المجموعة السادسة عن طريق الفم بجرعة منخفضة من كيرسيتين (كويل ، 50 مجم / كجم من وزن الجسم) لمدة 7 أيام. تم إعطاء الجرذان في المجموعات Il-VIl محلول ANIT- زيت الزيتون (100 مجم / كجم ، IP ، 2 مل / كجم من وزن الجسم) 2 ساعة بعد إعطاء UCDA أو كيرسيتين في اليوم الخامس. مذيب فارغ يوميًا [21 ، 22].
بعد ثمانية وأربعين ساعة من آخر إعطاء لقاح ANIT ، تم قتل الحيوانات عن طريق التخدير عن طريق الحقن IP (100 مجم / كجم بنتوباربيتال). تم جمع الدم من الشريان الأورطي البطني للتقييم البيوكيميائي. تمت إزالة الكبد على الفور ووزنه. تم تجميد جزء كبير من الكبد في نيتروجين سائل ، وتم تثبيت الأنسجة المتبقية في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة ومعالجتها ودمجها في البارافين للفحص النسيجي بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E). تم تقييم الإصابة الكبدية بناءً على مستويات ALT و AST و DBIL و TBIL و TBA و andy-GGT باستخدام محلل الكيمياء الحيوية الأوتوماتيكي Chemray 240 (شركة Rayto Life and Analytical Sciences Co. ، Ltd. ، Shenzhen ، الصين). تم تقييم مستويات MDA و GSH-Px و SOD باستخدام مجموعات تجارية وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، وتم إجراء التقييم النسيجي والتسجيل وفقًا لمعايير موحدة من قبل أخصائي علم الأمراض الذي أعمى عن الدراسة. لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) للنسخ العكسي في الوقت الفعلي ، تم تجميد أنسجة الكبد بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة -80 حتى التحليل.
تحليل PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR و Il -1 و TNF- mRNAs بواسطة RT-PCR
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الكبد باستخدام TRlzol ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (سيرفس بيو ، ووهان ، الصين). تم نسخ إجمالي RNA （1 0 ميكرولتر） إلى cDNA. احتوت إعادة إجراءات PCR （20ul لـ GAPDH و PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR و TNF- و IL -1 على 2 ميكرولتر (كدنا) ، 2 ميكرولتر 2.5 ميكرومتر ، مزيج 10 ميكرولتر ، و 6 ميكرولتر ddH ، O تم تحضين التفاعلات عند 65 درجة لمدة 10 دقائق ، ثم عند 42 درجة لمدة 60 دقيقة ، وانتهت عند 72 درجة لمدة 15 دقيقة. تم سرد تسلسل PCR التمهيدي في الجدول 1. تم إجراء تفاعلات RT-PCR على النحو التالي: مرحلة ما قبل التدوير عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية. لمدة 60 ثانية. كان منحنى الانصهار من 65 درجة إلى 95 درجة بمعدل انحدار 0.3 درجة مئوية / 15 ثانية. تم قياس الإسفار في نهاية كل خطوة تلدين ، وتم مراقبة منحنيات الذوبان لتأكيد خصوصية منتجات PCR. تم استخدام طريقة 2- 一 CT لتحديد مستويات تعبير mRNA لـ PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR و IL -1 B و TNF- mRNAs بالنسبة إلى جين التحكم GAPDH.
تحليل احصائي
تم التعبير عن جميع البيانات على أنها تعني ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism 8.
3. 0 (GraphPad Software Inc.، San Diego، CA، USA). تم تحليل البيانات من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Dunnett.<0.05 was="" considered="" statistically="">
نتائج
مكونات وأهداف H.japonicum
لفحص مكونات H. japonicum بشكل كامل ، لم نقم بتعيين المعلمات الحركية الدوائية ، مثل التوافر الحيوي عن طريق الفم وشبه الدواء كمعايير فحص. من خلال قاعدة بيانات TCMSP ، تم الحصول على 49 مكونًا نشطًا و 499 من مكونات القطران المقابلة لـ H. japonicum. بعد إزالة التكرارات وتصحيح الأسماء بواسطة Uniprot ، تم الاحتفاظ بـ 269 هدفًا. يتم عرض المكونات النشطة لـ H.japonicum والمعلمة في التكوين في الجدول 2.
أهداف H.japonicum في علاج التهاب الكبد الصفراوي
في قاعدة بيانات GeneCards ، تم فحص 682 هدفًا من التهاب الكبد الصفراوي. أخيرًا ، تم الحصول على 93 هدفًا قد تكون مرتبطة بعلاج H. japonicum لالتهاب الكبد الصفراوي عن طريق عبور أهداف المكونات النشطة والأمراض (الشكل 2).
شبكة الهدف المركب
تتكون الشبكة المستهدفة المكونة لـ H. japonicum في علاج التهاب الكبد الركودي من 115 عقدة و 175 حافة ، مع 22 عقدة سداسية تمثل مكونات نشطة و 93 عقدة على شكل V تمثل أهدافًا (الشكل 3).
تم تحديد حجم وشفافية العقد وفقًا للدرجة. كلما زادت قيمة الدرجة ، كلما كبرت العقدة ، وكلما كان اللون أغمق ، زاد الاتصال والأهمية. كما هو موضح في النتائج ، كان لـ H. japonicum تأثير متعدد العناصر ومتعدد الأهداف. أي ، مركب واحد يتفاعل مع أهداف متعددة ، ومركبات مختلفة تتفاعل مع نفس الهدف. وفقًا لمقاييس pa طوبولوجيا الشبكة ، مثل الدرجة ، والترابط ، والقرب ، كانت المكونات النشطة الرئيسية هي quercetin و kaempferol و tet-ramethoxyluteolin (الجدول 3) ، وكانت الأهداف الأساسية PTGS2 ، سينسيز أكسيد النيتريك (NOS3) ، جاما مستقبلات بيروكسيسوم التكاثري (PPARG) ، dipeptidyl peptidase V (DPP4) ، BCL2 ، و TNF (الجدول 4).
شبكة PPI
تم تحليل تفاعل 93 هدف تقاطع دوائي مع مرض باستخدام قاعدة بيانات STRING. تم تعيين ثقة عالية (0. 9) ، وتم إخفاء الأهداف المعزولة ، وتم الحصول على شبكة PPI مع 81 هدفًا و 299 رابطًا للتفاعل (الشكل 4 أ). بتطبيق خوارزمية MCC الخاصة بـ cytoHubba ، كانت أهم 10 أهداف تنظيمية أساسية في شبكة PPI هي TNF و IL6 و IL1B و CXCL8 و IL10 و CCL2 و ICAM1 و NFKB1 و NFKBIA و MYC (الشكل 4 ب).
الوظيفة المستهدفة والمسار الإثراء
تم إجراء الشرح الوظيفي GO وتحليلات إثراء مسار KEGG للأهداف العلاجية باستخدام Metascape. تم الحصول على إجمالي 1899 عنصر GO ، بما في ذلك 41 عنصرًا لتكوين الخلية ، و 105 عنصرًا للوظيفة الجزيئية ، و 1753 عنصرًا للعملية البيولوجية. تضمنت العمليات البيولوجية الرئيسية والمكونات الخلوية التي شارك فيها H. - نوع نشاط endopeptidase (الشكل 5C). في المجموع ، تم تحليل 146 مسار إشارات KEGG ، وأبرزها مسارات إشارات AGE-RAGE و TNF والتهاب الكبد B ، والتخليق الحيوي للأرجينين ، وإفراز الصفراء. (الشكل 5 د).
كيرسيتين محمي ضد التهاب الكبد الصفراوي الناجم عن ANIT في الفئران
في نموذج الفئران الركود الصفراوي داخل الكبد ، استعاد كيرسيتين نسبة وزن الكبد / الجسم في إصابة الكبد بالركود الصفراوي (الشكل 6). تم زيادة مصل ALT و AST و DBIL و TBIL و TBA و Y-GGT ، والتي استخدمت لتقييم انتشار القناة الصفراوية داخل الكبد والركود الصفراوي المرتبط بتلف الخلايا الكبدية ، بشكل كبير في الفئران النموذجية. في المقابل ، يقلل كيرسيتين من مستويات ALT و AST و DBIL و TBIL و TBA و GGT المعتمدة على الجرعة. وبالمثل ، خففت معالجة كيرسيتين من الإجهاد التأكسدي الكبدي الناجم عن ANIT ، وزادت SOD في المصل ومستويات GSH-Px ، وانخفضت مستويات MDA (الشكل 7).
قدمت التقييمات النسيجية بواسطة تلطيخ H&E دليلًا مباشرًا على الآثار الوقائية والعلاجية للكيرسيتين على ركود صفراوي داخل الكبد يسببه ANIT. أظهر تلطيخ H&E أن أنسجة الكبد في المجموعة الضابطة أظهرت بنية مجهرية طبيعية ، وكانت الفصيصات الكبدية واضحة ، وكان كابل خلايا الكبد أنيقًا ومنظمًا ، دون تغييرات شكلية غير طبيعية. في المقابل ، أظهرت أقسام الكبد المعالجة بـ ANIT بنية فصيص الكبد غير المصبوغ ، واضطراب الحبل الكبدي ، وتورم الكبد ، واحتقان الدم ، والنخر (الشكل 8 أ). ومع ذلك ، خفف الكيرسيتين بشكل كبير من درجة التعفن الكبدي وتسلل الخلايا الالتهابية ، مما أظهر علاقة بين الجرعة والتأثير. كشفت هذه النتائج أن الكيرسيتين يحمي من إصابة الكبد التي يسببها ANIT والتي تنشأ من ركود صفراوي داخل الكبد في الفئران.
Quercetin Protected PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR I -1 B و TNF- mRNA Expression
لمزيد من تقييم التأثير الوقائي للكيرسيتين على خلايا الكبد في جرذان إصابة الكبد الصفراوية التي يسببها ANIT ، تم قياس مستويات مرنا لكل من PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR و IL -1 و TNF- باستخدام RT-PCR. كما هو مبين في الشكل 8 ب ، تم تنظيم PTGS2 و CYP7A1 و IL -1 و TNF- مقارنةً بفئران التحكم في مجموعة نماذج ANIT ، ولكن تم تنظيم BCL2 و FXR. ومع ذلك ، فإن إعطاء كيرسيتين (بجرعات 50،100 و 200 مجم / كجم) و UCDA
انخفض بشكل ملحوظ تعبير PTGS2 و CYP7A1 و IL -1 و TNF- mRNA بنسبة 44.4 بالمائة (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">
مناقشة
بشكل جماعي ، استخدمنا نموذج الفئران الذي يسببه ANIT ، والذي أظهر أن H.japonicum يمكن أن يكون علاجًا لالتهاب الكبد الصفراوي. أوضحت تجارب علم الصيدلة الشبكية والديناميكيات الدوائية التأثير والآلية الجزيئية لـ H. japonicum في علاج التهاب الكبد الركودي وقدمت أساسًا نظريًا لمزيد من البحث والتطبيق السريري للعشب.
المكونات الكيميائية الرئيسية ل H. japonicum هي مركبات الفلافونويد [23] ، ومشتقات الفلوروجلوسينول ، وثنائي الببتيدات ، من بين أشياء أخرى [11]. قرر Puthur وآخرون أن IC50 لمستخلصات H.japon-icum acetonic على خلايا الاستسقاء تبلغ 29.30 ميكروغرام / مل ، وتظهر نتائجهم نشاطًا جيدًا مضادًا للورم في المختبر وأن المستخلصات الميثانولية من H.japonicum لها تأثير تآزري على الآفات عن طريق تثبيط بعض الإنزيمات الرئيسية. كشفت تجاربهم أن ل H. japonicum أنشطة بيولوجية مختلفة تتطلب مزيدًا من البحث [24 ، 25]. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن مستخلص H. ja-ponicum له مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية ، بما في ذلك hepa-toprotective ، ومضادات الأكسدة ،مضاد التهاب، والتأثيرات المضادة للأورام. H.japonicum ومكوناته الرئيسية تحمي من التهاب الكبد الناجم عن رابع كلوريد الكربون ، والكوليستا التي يسببها ANIT ، والنشاط الفيروسي ضد التهاب الكبد A وتحسين وظائف الكبد والأضرار التأكسدية [12،26]. Isoquercitrin و quer-cetin 7- rhamnoside هما العاملان الأساسيان الفعالان في الوقاية من الكبد [11،27]. أظهرت الدراسة الحالية أن الكيرسيتين ، المكون الرئيسي لـ H.japonicum ، يمكن أن يقلل من تنكس ونخر الخلايا الكبدية الناجم عن ANIT ، ويقلل من درجة إصابة الكبد. أكدت نتائج H&E كذلك التأثير الوقائي للكيرسيتين على التهاب الكبد الصفراوي.
في هذه الدراسة ، قمنا بدمج البحوث الصيدلانية الشبكية مع التجارب الصيدلانية الحيوانية. أولاً ، قمنا بفحص المكونات والأهداف النشطة الرئيسية لـ H. japonicum في علاج التهاب الكبد الصفراوي. ثم أنشأنا شبكة "مكونة هدف" وقمنا بتحليل الإثراء الوظيفي للأهداف لاستكشاف الآلية المحتملة لعملها العلاجي ضد التهاب الكبد الصفراوي. أخيرًا ، تحققنا من تلك الأهداف والآليات الجزيئية من خلال التجارب على الحيوانات. كانت الفهارس البيوكيميائية والخصائص المرضية للركود الصفراوي داخل الكبد التي لاحظناها متسقة مع الأمراض التي تصيب الإنسان ، مما يدعم الأهمية السريرية لنموذج الفئران لدينا من التهاب الكبد الصفراوي.
يعتبر مستوى حمض الصفراء في الدم دليلًا حاسمًا للتشخيص السريري لاضطرابات الركود الصفراوي داخل الكبد وإصابة الكبد الناتجة عنها. يؤدي الركود الصفراوي داخل الكبد إلى إعاقة الإفراز الطبيعي لوظائف الصفراء والكبد
الإنزيمات ، مما أدى إلى زيادة في مصل TBIL و DBIL و TBA ، وأظهرنا أن كيرسيتين عكس خلل تنظيم حمض الصفراء الناجم عن ANIT. بالإضافة إلى ذلك ، قلل الكيرسيتين بشكل كبير من مستويات مصل AST و ALT و y-GGT ، والتي زادت بشكل كبير بسبب تنكس ونخر خلايا الكبد وتلف غشاء خلايا الكبد.
بيروكسيد الدهون هو أحد الآليات المرضية الهامة لالتهاب الكبد الصفراوي الناتج عن ANIT ، مما يتسبب في تلف خلايا الكبد|28-30]. يعكس مستوى الإجهاد التأكسدي في الجسم شدة التهاب الكبد الصفراوي ، وهذا هو السبب في أن GSH-Px و SOD و MDA ، المستخدمة لتقييم مستويات بيروكسيد الدهون ، هي مؤشرات مهمة. في هذه الدراسة ، أظهرت كل مجموعة جرعات من الكيرسيتين انخفاضًا كبيرًا في MDA ، مع زيادة أنشطة SOD و GSH-Px. أشارت هذه النتائج إلى أن تخفيف تلف خلايا ليفير بواسطة كيرسيتين كان مرتبطًا بكسح الجذور الحرة ، وتثبيط بيروكسيد الدهون ، وتقليل إنتاج بيروكسيدات الدهون.
أشارت نتائج علم الصيدلة الشبكي إلى أن الأهداف الرئيسية ذات الصلة لعلاج التهاب الكبد الصفراوي بواسطة H. japonicum تشمل PTGS2 و NOS3 و PPARG و DPP4 و BCL2 و TNF. في الدراسة الحالية ، 5 أهداف ، PTGS2 ، BCL2 ، TNF- ، FXR ، و CYP7A1. التي ترتبط بالتهاب الكبد الصفراوي وتليف الكبد وتلف الكبد ، تم اختيارها للبحث على المستوى الجزيئي. PTGS2 ، المعروف أيضًا باسم انزيمات الأكسدة الحلقية 2 ، هو جزيء في نهاية مسار مسار NF-KB [31،32]. يشارك PTGS2 في حدوث الالتهاب عن طريق تعزيز تكاثر الخلايا ، وتثبيط موت الخلايا المبرمج للخلايا ، وتعزيز تكوين الأوعية ، وتثبيط وظيفة المناعة. عامل نخر الورم- هو وسيط التهابي مهم يشارك في عملية الركود الصفراوي. في دراستنا ، تم تنظيم مستويات التعبير عن PTGS2 و TNF- protein و mRNA في أنسجة الكبد للفئران النموذجية لإصابة الركود الركودي التي يسببها ANIT ، مما يشير إلى أن التعبير المفرط PTGS2 قد يعزز إصابة الكبد الحادة وتطور ركود صفراوي.
BCL2 هو بروتين يمنع موت الخلايا المبرمج. يمنع الضرر التأكسدي وتفتيت الحمض النووي لمكونات الخلايا وينظم مسارات مضادات الأكسدة [33]. كما أنه يحسن إمكانات غشاء الميتوكوندريا ويمنع إطلاق الميتوكوندريا من السيتوكروم C والعوامل المسببة لموت الخلايا المبرمج من خلال التأثير على نقل غشاء الخلية ، وبالتالي تثبيط موت الخلايا المبرمج في خلايا الكبد والتأثيرات الأخرى [34،35].
FXR هو مستقبل حمض الصفراء الذي ينظم توازن حمض الصفراء في الكبد [36]. إنه يثبط نشاط إنزيم CYP7A1 الذي يحد من معدل تخليق حمض الصفراء من خلال تنظيم التغذية المرتدة السلبية بوساطة مرافقة مغايرة صغيرة ويقلل من تخليق حمض الصفراء. في الوقت نفسه ، يمكن لـ FXR تنظيم التعبير عن الناقلات BSEP و MRP2 على الغشاء الجانبي للقناة الصفراوية الكبدية ، مما يسرع من إفراز ونقل الأحماض الصفراوية من أجل حماية خلايا الكبد [37 ، 38].
أظهرت نتائجنا أن الفئران النموذجية لديها كمية كبيرة من ركود حمض الكوليك تحت تأثير ANIT ، مما يؤدي إلى التنظيم المنخفض لتعبير FXR وزيادة لاحقة في تعبير CYP7A1. أيضًا ، تسبب التعبير الخاضع للتنظيم لـ FXR في انخفاض في التعبير عن جينات المصب BSEP و MRP2 ، والتي تنظمها. استعاد تدخل Quercetin بشكل كبير مستوى التعبير عن FXR في أنسجة كبد الفئران ونظم التعبير عن جيناتها النهائية CYP7A1 و BSEP و MRP2 في الاتجاه المعاكس لمجموعة النموذج. نتائج هذه الدراسة تتفق مع نتائج البحوث السابقة.
التهاب الكبد الصفراوي الناجم عن ANIT له تغيرات بيوكيميائية ومرضية مماثلة لتلك التي تحدث لدى البشر. ومع ذلك ، كانت العملية المرضية لعلاج ANIT الفردي قصيرة في الدراسة الحالية ، مما يقيد البحث الذي يتطلب عادة فترة تجريبية أطول من 48 إلى 72 ساعة. سوف تتغلب الإدارة المتقطعة المتعددة لـ ANIT على هذا العيب. يأخذ علم الصيدلة الشبكي للطب الصيني التقليدي التراكيب الكيميائية الموجودة في المواد الطبية ككائن بحثي ؛ ومع ذلك ، فإن المواد الكيميائية التي تدخل في فعالية الأدوية في الطب الصيني التقليدي ليست بالضرورة مكونًا واحدًا لأن المادة الفعالة قد تكون مجموعة من المكونات الديناميكية الدوائية. نظرًا لأن أهداف ومسارات المواد في الطب الصيني التقليدي معروفة عادةً ، فهناك قيود على اكتشاف آليات جديدة. في المستقبل ، يمكن دمج خوارزميات الذكاء الاصطناعي مع علم الصيدلة الشبكي للحصول على معلومات أكثر شمولاً وموضوعية.
الاستنتاجات
باختصار ، بمساعدة المكونات النشطة مثل كيرسيتين ، يمكن لـ H. japonicum تنشيط FXR ، وتثبيط CYP7A1 ، وتقليل تخليق حمض الصفراء في خلايا الكبد ، وزيادة إفراز حمض الصفراء خارج الكبد. أيضًا ، يمكنه تنظيم BCL2 لتحسين إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتثبيط موت الخلايا المبرمج للكبد ، وتنظيم توازن حمض الصفراء في الكبد. علاوة على ذلك ، من خلال منع التعبير عن PTGS2 و IL -1 و TNF- ، يمكن أن يتداخل مع الاستجابة الالتهابية. باختصار ، وفقًا لتحليل علم الصيدلة الشبكي ، فإن كيرسيتين ، كايمبفيرول ، ورباعي ميثوكسي لوتولين هي المكونات النشطة الرئيسية لـ H. japonicum لتخفيف التهاب الكبد الركودي. قد توفر نتائج هذه الدراسة دعمًا للبحوث المستقبلية حول دور كيرسيتين ، كايمبفيرول ، ورباعي ميثوكسيلوتولين في أمراض الكبد البشرية وأدوار جينات PTGS2 و BCL2 و CYP7A1 و FXR في التهاب الكبد الصفراوي.
