الببتيد المشتق من النترين-1-يعزز الحماية ضد موت الخلايا العصبية ويخفف من النزف داخل المخ في الفئران - الجزء الأول

خلاصة:

لقد تم الإبلاغ عن أن Netrin-1 يشارك في الحماية العصبية بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، فإن الحد الأدنى من المجال الوظيفي لـ Netrin-1 والذي يمكنه الحفاظ على الحماية العصبية مع تجنب الآثار الجانبية الرئيسية لـ Netrin يظل بعيد المنال.

يعد الجهاز العصبي المركزي من أهم الأجهزة العصبية في جسم الإنسان، فهو الذي يتحكم في تفكير الإنسان، ومشاعره، وتصرفاته. عندما يتضرر الجهاز العصبي المركزي، ستتأثر ذاكرة الأشخاص أيضًا. لكن لا تقلق، يمكننا اتخاذ بعض الطرق الإيجابية التي تساعد في استعادة الذاكرة.

أولاً، عليك أن تفهم تأثير تلف الذاكرة. يمكن أن يؤثر تلف الجهاز العصبي المركزي على القدرات المعرفية لدى الأشخاص وعمليات التفكير والانتباه، وكلها تؤثر بشكل مباشر على ذاكرة الأشخاص. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي تلف الجهاز العصبي المركزي أيضًا إلى عدم الاستقرار العاطفي، مما يجعل الأشخاص أكثر عرضة للذعر والقلق والاكتئاب، مما يؤثر على استعادة الذاكرة.

ومع ذلك، على الرغم من أن تلف الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يؤدي إلى بعض الآثار السلبية، إلا أنه يمكننا اتخاذ بعض التدابير الإيجابية لتعزيز استعادة الذاكرة. أولاً، يمكننا تجربة بعض التدريبات المعرفية، مثل القراءة والكتابة وحل الألغاز. يمكن لهذه الأنشطة تحفيز الدماغ لإنتاج خلايا عصبية جديدة ومساعدة الدماغ على بناء ذكريات وطرق تفكير جديدة.

ثانيًا، يمكننا أيضًا تعزيز استعادة الذاكرة من خلال بعض التمارين البدنية. أظهرت الدراسات أن التمرين المناسب يمكن أن يحفز الدماغ لإنتاج خلايا عصبية جديدة واتصالات عصبية ويعزز معالجة الدماغ للمعلومات الجديدة. ولهذا السبب يأتي بعض الأشخاص فجأة بفكرة جيدة أو يحلون مشكلة صعبة أثناء الجري أو المشي.

وأخيرا، علينا أن ننتبه إلى دور المدخول الغذائي الصحيح في الذاكرة. يتطلب الأداء الطبيعي للدماغ بعض العناصر الغذائية الضرورية، مثل البروتين والفيتامينات والعناصر النزرة. إذا كان طعامنا يفتقر إلى هذه العناصر الغذائية، فسيؤثر ذلك على ذاكرتنا وقدرتنا على التفكير. ولذلك يجب علينا اختيار بعض الأطعمة الغنية بهذه العناصر الغذائية في نظامنا الغذائي، مثل الأسماك واللحوم الخالية من الدهون والخضروات والفواكه.

باختصار، سيكون للضرر الذي يلحق بالجهاز العصبي المركزي تأثير معين على ذاكرة الناس، ولكن يمكننا تعزيز استعادة الذاكرة من خلال التدريب المعرفي المناسب، وممارسة الرياضة البدنية، ومراقبة النظام الغذائي. آمل أن يتمكن الجميع من مواجهة تحديات الحياة بشكل إيجابي، والحفاظ على موقف متفائل، والسعي لاستعادة صحة الجهاز العصبي المركزي والذاكرة الجيدة. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche هو دواء صيني تقليدي له العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية Cistanche من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك حمض التانيك، والسكريات، وجليكوسيدات الفلافونويد، وما إلى ذلك، والتي يمكن أن تعزز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق "معرفة" لتحسين الذاكرة قصيرة المدى

هنا، قمنا بدراسة التأثير الوقائي العصبي للببتيد E1 المشتق من مجال EGF3 الخاص بـ Netrin -10 (البقايا 407-422). لقد وجدنا أنه يتفاعل مع سرطان القولون والمستقيم المحذوف (DCC) لتنشيط فسفرة كيناز الالتصاق البؤري التي تظهر الحماية العصبية.

تمكنت إدارة الببتيد E1 من تحسين التعافي الوظيفي من خلال تقليل موت الخلايا المبرمج في نموذج الفئران التجريبي للنزيف داخل المخ (ICH).

باختصار، نكشف عن التسلسل الوظيفي لـ Netrin-1 الذي يشارك في عملية الاسترداد بعد ICH ونحدد الببتيد المرشح لعلاج ICH.

الكلمات المفتاحية: نزيف داخل المخ. هيمين. الحماية العصبية. نترين-1; الببتيد.

1. مقدمة

النزف داخل المخ (ICH) هو نوع فرعي من السكتة الدماغية المدمرة مع ارتفاع معدل الوفيات والمراضة [1-3] والذي يتضمن تمزق غير طبيعي للأوعية الدموية الدماغية داخل الدماغ [4،5].

يفضل الاستئصال الجراحي للأورام الدموية لتحقيق الإرقاء وتخفيف الضغط داخل الجمجمة [6]. ومع ذلك، لا يزال من الممكن أن تؤدي البقايا الدموية ومنتجات تحلل الدم إلى تعزيز إصابة الدماغ الثانوية بعد التراث الثقافي غير المادي، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية وتأخير التعافي الوظيفي [7-9].

وبالتالي، فإن تطوير استراتيجيات فعالة تستهدف تلف الخلايا العصبية الناجم عن إصابات الدماغ الثانوية سيكون مفيدًا لعلاج السكتة الدماغية. يعد Netrin-1 واحدًا من أكثر البروتينات المدروسة جيدًا والتي تنظم توجيه المحاور العصبية وتكوّن التشابكات العصبية [10-12] من خلال التفاعل مع مستقبلاتها. تم حذفه في سرطان القولون والمستقيم (DCC) وUNC5H (متماثل غير منسق -5) لتنشيط بقاء الخلية والتمايز والانتشار [13-15].

تحفز المستقبلات إشارة الموت للتوسط في موت الخلايا المبرمج عندما يكون النترين -1 غائبًا [16]. من المعروف أن ارتباط Netrin -1 مع DCC يؤدي إلى تقليص حجم DCC ويبدأ فسفرة التيروزين 861 من الالتصاق البؤري (FAK) للحث على نمو الخلايا العصبية والتوجيه المحوري [17،18].

يتضمن ربط Netrin-1 مع DCC مجال EGF3 لـ Netrin-1 ومجال FN5 لـ DCC في تنشيط مسار إشارات Netrin-1 [19,20]. في الآونة الأخيرة، تبين أن النترين -1 له تأثيرات وقائية عصبية في المناطق الإقفارية [21].

يرتبط مستوى التعبير عن Netrin-1 في المصل، والذي يثبط موت الخلايا المبرمج ويعزز تجديد الخلايا العصبية، بشكل إيجابي مع تعافي المريض من السكتة الدماغية [22،23].

ومن المثير للاهتمام أن زرع الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم التي تفرز النيترين -1 في العصب الوركي الجرذ التالف يبدأ في تجديد محور عصبي [24] ويقلل من موت الخلايا العصبية الحركية [25]. يؤدي الحقن التجسيمي لبروتين Netrin -1 في البطينين إلى تقليل موت الخلايا العصبية بعد نزيف تحت العنكبوتية من خلال تنشيط إشارات DCC/APPL1/AKT [26].

يقوم البوليببتيد المشتق من مجال EGF3 لـ Netrin-1 (الأحماض الأمينية 423-433) بتنشيط فسفرة ERK بشكل ملحوظ ويعزز إنتاج NO، الذي له تأثيرات وقائية للقلب [27،28]. ومع ذلك، تم تحديد Netrin-1 كمؤشر حيوي محتمل لتكوين الأورام [29–31] لأن تنظيم حالة Netrin-1 موجود في العديد من السرطانات المشتقة من الأنسجة [32].

عندما يرتبط Netrin-1 بمستقبله DCC أو Unc5H، ترسل المستقبلات إشارة إيجابية تؤدي إلى البقاء والالتهاب وتولد الأوعية ومكافحة موت الخلايا المبرمج، والذي بدوره ينظم تكوين الأورام [31].

لذلك، من المهم جدًا تحديد المجال الوظيفي الأدنى للنيترين-1 الذي يمكنه الحفاظ على الحماية العصبية وتجنب الآثار الجانبية الرئيسية للنيترين-1.هنا، وجدنا أن الببتيد E1 (البقايا 407-422)، المشتق من مجال EGF3 الخاص بـ Netrin-1، يتفاعل مع DCC لحماية الخلايا العصبية من السمية الناجمة عن الهيمين.

في نموذج تجريبي لفئران التراث الثقافي غير المادي، أدى تطبيق الببتيد E1 إلى تحسين التعافي الوظيفي، على النحو الذي تحدده الاختبارات السلوكية. علاوة على ذلك، يمكن للببتيد E1 أن يمنع الخلايا العصبية من التدهور بعد ICH.

بناءً على هذه النتائج، حددنا التسلسل الوظيفي لـ Netrin-1 الذي يشارك في التعافي بعد ICH وقررنا أن هذا الببتيد يمكن استخدامه لعلاج ICH.

2. النتائج

2.1. يعد مجال EGF3 أمرًا بالغ الأهمية لتفاعل Netrin-DCC

يتكون Netrin-1 من نطاق VI وثلاثة تكرارات EGF ومجال طرفي C [33]. يكشف الهيكل البلوري لمجمع Netrin-1/DCC البشري أن نطاق Netrin-1 EGF3 ضروري لتفاعل Netrin-1/DCC، ولكن ليس نطاقي EGF1 وEGF2 [34].

أدى طفرات بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية (His407 أو Gln442 أو Gln443) في مجال EGF3 إلى تعطيل ارتباط Netrin -1 / DCC تمامًا [19]. مجالات EGF1/2 مطلوبة لتحويل الإشارات الجذابة إلى إشارات مثيرة للاشمئزاز عندما يتعايش Unc5 مع DCC [20].

وبالتالي ، قمنا أولاً بإنشاء الطول الكامل وحذف EGF 3- (Netrin -1 ∆407–443) بنيات Netrin -1 (الشكل 1A) والتعبير بشكل عابر عن هذه التركيبات في خلايا HEK293T المستزرعة لـ GSTpulldown .

لوحظ الارتباط بالنسبة للبنيات التي تعبر عن Netrin -1 ولكن ليس Netrin -1 (∆407–443) (الشكل 1C). تشير هذه النتائج إلى أن مجال EGF3 الذي يحتوي على الأحماض الأمينية 407-443 هو المسؤول عن تفاعل Netrin-1 مع DCC. للتحقيق في دور مجال EGF3 في Netrin-DCC، قمنا أولاً بتنقية myc-taggedNetrin{{12 }} أو Netrin مقطوعة -1 (∆407–443) (الشكل 1B).

بعد ذلك، تم نقل خلايا HEK293T باستخدام بلازميد يحمل DCC [كدنا] واحتضانها ببروتين Netrin -1، ثم تم تقييم ارتباط Netrin -1 عن طريق الصبغ المناعي.

لقد وجدنا أن Netrin كامل الطول -1، ولكن غير مقطوع Netrin -1، كان قادرًا على الارتباط بـ DCC في غشاء البلازما (الشكل 1D). لتحديد ما إذا كان مجال EGF3 يمكنه التفاعل مع DCC، أنشأنا بنية GST-EGF3 لسحب الخلايا المتحللة التي تزيد من تعبير DCC. لاحظنا ربطًا محددًا لـ DCC مع GST-EGF3 (الشكل 1E).

علاوة على ذلك، قمنا بتركيب الببتيدEGF3 المسمى FITC وأكدنا أنه، مثل Netrin كامل الطول -1}، كان قادرًا على الارتباط بـ DCC في غشاء البلازما (الشكل 1F). تشير بياناتنا مجتمعة إلى أن مجال EGF3 مسؤول عن تفاعل Netrin-1 مع DCC.

2.2. يستحث مجال EGF3 الفسفرة في المسارات النهائية للنترين-1

يؤدي تفاعل Netrin-1 وDCC إلى تنشيط مسارات إشارات متعددة، بما في ذلك FAK وSFK وERK [16,35]. يعد كيناز الالتصاق البؤري (FAK) أحد الأنشطة الرئيسية لفسفرة التيروزين المرتبطة بإشارات Netrin -1 / DCC.

يقوم Netrin -1 بتنشيط فسفرة FAK وفسفرة كيناز بروتين عائلة Src (SFKs) [17]. تلعب مسارات إشارات FAK وSFK دورًا محوريًا في مرحلة تطور الجهاز العصبي وإصلاح الإصابات [36،37]. علاوة على ذلك، يمكن لـ Netrin-1 تنشيط الكيناز الذي ينظم الإشارة خارج الخلية -1/2 (ERK1/2)، والذي يتوسط عمل مسار بروتينكيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) [38-40].

لاستكشاف ما إذا كان مجال EGF3 مهمًا لتنشيط مسارات الإشارات النهائية عبر ربط Netrin -1 بـ DCC، قمنا أولاً بفحص تأثير مجال EGF3 على فسفرة التيروزين 861 لـ FAK (الشكل 2A) . لقد وجدنا أن حذف EGF3 يمنع فسفرة FAK في الخلايا العصبية القشرية المزروعة (الشكل 2B، C)، مما يؤكد الدور الأساسي لـ EGF3 في مسار إشارات Netrin -1.

بعد ذلك، تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية المزروعة باستخدام بروتين GST-EGF3fusion لمدة 20 دقيقة، وأكد النشاف الغربي أيضًا أن العلاج باستخدام بروتين الاندماج GST-EGF3 الناجم عن فسفرة FAK وERK وSFK (الشكل 2D – G).

تشير هذه النتائج إلى أن مجال EGF3 الخاص بـ Netrin-1 يعمل كمحفز قوي لتنشيط مسارات الإشارات النهائية.

الشكل 1. مجال EGF3 الخاص بـ Netrin-1 هو المنطقة الحرجة لتفاعل Netrin-1/DCC. (أ) الرسوم التوضيحية لبنيات Netrin-1. بنيات Netrin -1 هي Netrin -1 كاملة الطول، وNetrin -1- (∆407–443) وGST-EGF3. (ب) تم قياس كمية Netrin المنقى -1- (∆407–443) -Myc/His من خلال المقارنة مع المنحنى القياسي لـ BSA. (C) التطعيم المناعي للكسر المنسدل بواسطة بروتين دمج مجال GST-DCC FN5 وGST وحدهما. (D) صور التألق المناعي لـFlag-DCC التي تعبر عن 293T من الخلايا المحتضنة باستخدام وسط التحكم، Netrin-1-myc/his وNetrin-1-(∆407–443) -Myc/his لمدة 30 دقيقة، على التوالي، والكمية تحليل. شريط النطاق، 10 ميكرون. (E) التطعيم المناعي للجزء المنسدل بواسطة بروتين الاندماج GST-EGF3 وGST على طول. (F) صور التألق المناعي لـ Flag-DCC التي تعبر عن 293T من الخلايا المحتضنة مع وسط التحكم وFITC المسمى Pep EGF3 لمدة 30 دقيقة، على التوالي، والتحليل الكمي. شريط النطاق، 10 ميكرون.

الشكل 2. يقوم مجال EGF3 بتنشيط المسارات النهائية لـ Netrin -1. (أ) الإجراء التجريبي. ( ب ) تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية (E17 و DIV3) باستخدام Netrin -1 أو Netrin -1- (∆4 0 7–443) أو وسيط التحكم لمدة 2 0 دقيقة. تم تحضين lysates الخلية مع الجسم المضاد لـ p-FAK -861 لتأكيد نشاط Netrin -1. (ج) يظهر التحليل الكمي لنتائج اللطخة الغربية في (ب). ن=3. (D) تمت معالجة الخلايا العصبية القشرية (DIV3) بـ 1.5 ميكرومتر GST (+)، أو 1.5 ميكرومتر من بروتين الاندماج GST-EGF3 (+)، أو 1.5 ميكرومترين -1 (+) لمدة 20 دقيقة. تم تحضين lysates الخلية باستخدام مضادات p-FAK -861 ومضادات p-SFK -418 ومضادات p-ERK -202 / 204. (E – G) التحليل الكمي للغرب نتائج اللطخة الموضحة في (د). ن=3. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SEM. تم استخدام ANOVA في اتجاه واحد لجميع التحليلات الإحصائية الموضحة في هذا الشكل (* p <0.05، ** p <0.01؛ ns، غير مهم). تظهر تفاصيل تحليل البيانات في الجدول التكميلي S1.

2.3 يتفاعل الببتيد E1 وE2 مع DCC لتنشيط مسار الإشارة المصب لـ Netrin-1

كما هو موضح سابقًا، فإن الببتيد الصغير المشتق من مجال EGF3 لـ Netrin -1 (الأحماض الأمينية 423-433) يسبب فسفرة ERK [27]. قمنا بتركيب الببتيدات E1 (البقايا 407-422) وE2 (البقايا 423-433) التي تم اشتقاقها من مجال EGF3 الخاص بـ Netrin -1 (الشكل 3A).

وجدنا أن حضانة الببتيد E1 زادت مستويات FAK المفسفرة وSFK (الشكل 3B، D، E) في خلايا الثقافة بطريقة تعتمد على الجرعة ولكنها لم تغير مستويات ERK المفسفرة (الشكل 3B، F).

على عكس الببتيد E1، فإن الببتيد E2 لم يتسبب فقط في فسفرة التيروزين لـ FAK (الشكل 3C، G) وفسفرة التيروزين لـ SFK (الشكل 3C، H) ولكن أيضًا في تحفيز فسفرة التيروزين لـ ERK (الشكل 3C، I) في الخلايا العصبية القشرية المستنبتة.

لم يكن لببتيد التحكم (Pep Ctrl) أي تأثير يمكن اكتشافه على فسفرة التيروزين لـ FAK وSFK وERK (الشكل S1). علاوة على ذلك، لاحظنا أن الفسفرة في مكونات مسار إشارات FAK الناجم عن الببتيد E1 كانت تعتمد على الوقت (الشكل S2). تشير هذه النتائج إلى أن E1 وE2 هما الحد الأدنى من الببتيدات الوظيفية لـ Netrin-1.

الشكل 3. يعمل الحد الأدنى من تسلسلات مجال EGF3 على تنشيط المسارات النهائية لـ Netrin -1. (أ) الرسوم التوضيحية للببتيدات. (ب) تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية (DIV3) بتركيزات متدرجة من الببتيد E1. تم تحضين lysates الخلية باستخدام مضاد p-FAK -861 ومضاد p-SFK -418 ومضاد p-ERK -202 / 204. (ج) تم علاج الخلايا العصبية القشرية المزروعة بتركيزات متدرجة من الببتيد E2.

تم جمع Lysates واحتضانها مع الأجسام المضادة المشار إليها لقياس الفسفرة من FAK، SFK، وERK. (D – F) يظهر القياس الكمي لمدى الفسفرة FAK وSFK وERK الناجم عن الببتيد E1 في الخلايا العصبية في (B). ن=3. (G – I) يظهر القياس الكمي لمدى فسفرة FAK وSFK وERK الناجم عن الببتيد E2 في (C). ن=3. (J) تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية المشتقة من DCC من النوع البري والأجنة المتحولة المتماثلة الزيجوت باستخدام الببتيدات المشتقة من Netrin -1 أو Netrin -1- وتم إفسادها.

وتعرضت المحللات الناتجة إلى التطعيم المناعي. (K) يظهر القياس الكمي لمستويات FAK PY {{0}} ومستويات DCC في الخلايا العصبية المتحولة DCC في (J). ن=3. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SEMs. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لجميع التحليلات الإحصائية الموضحة في هذا الشكل (* p <0.05؛ns، غير مهم). وترد تفاصيل تحليل البيانات في الجدول التكميلي S1.

لتحديد ما إذا كان تنشيط مسار إشارات FAK يعتمد على DCC، قمنا بقياس مدى فسفرة التيروزين لـ FAK الناجم عن هذه الببتيدات في الخلايا العصبية DCC +/+ وDCC−/−. لقد وجدنا أن كلا الببتيدات E1 و E2 فشلا في تحفيز الفسفرة FAK في الخلايا العصبية DCC -/− (الشكل 3J، K).

لقد وجدنا أيضًا أن الببتيدات المصنعة ذات علامات العلم E1 و E2 (Flag-E1 و Flag-E2) ترتبط مباشرة بمجال DCCFN5 (الشكل S3).

2.4. الببتيد E1 يحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا الناجم عن الهيمين في المختبر

لإظهار الحماية ضد إصابة الخلايا العصبية للببتيد E1، استخدمنا تفاعل سمية محفز للهيمين لتقليد إصابة الدماغ الثانوية بعد نزيف داخل المخ [41،42].

تم تحضين الخلايا العصبية المزروعة التي تعبر عن GnRH (NLT) [43-45] مع الهيمين بتركيزات ومدد مختلفة. أدى حضانة خلايا NLT مع الهيمين عند الجرعة المميتة المتوسطة (60 ميكرومتر) إلى انخفاض يعتمد على الوقت في معدل بقاء الخلية، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية قد تناولت الهيمين وتم استقلابه (الشكل S4).

لفحص ما إذا كان تعبير Netrin-1 وDCC قد استجاب لموت الخلايا العصبية الناجم عن الهيمين، تم تحضين خلايا NLT المستزرعة مع الهيمين لفترات مختلفة. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن مستويات التعبير عن Netrin -1 وDCC زادت بشكل ملحوظ عند 6 ساعات بعد حضانة الهيمين ثم انخفضت تدريجياً (الشكل 4A، B).

للتحقق مما إذا كانت الببتيدات E1 وE2 قادرة على تخفيف موت الخلايا العصبية الناجم عن الهيمين، أجرينا اختبار CCK-8 باستخدام Netrin-1 وPepCtrl والببتيد E1 والببتيد E2.

لقد وجدنا أن هذه الببتيدات ليس لها أي تأثير يمكن اكتشافه على قابلية بقاء الخلية (الشكل 4C والشكل S5). بالمقارنة مع الحضانة مع Pep Ctrl وpeptideE2، الببتيد E1 وNetrin -1 يحسن موت الخلايا العصبية الناجم عن الهيمين (الشكل 4D). نحن أيضًا ملطخون بـ calcein-AM و PI للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.

أظهرت النتائج أن كلاً من Netrin-1 والببتيد E1 يحميان من الموت الناجم عن الهيمين في المختبر (الشكل 4E–G). وعلاوة على ذلك، 1.5 ميكرومتر الببتيد E1 خفف من الموت الناجم عن الهيمين في الخلايا العصبية الأولية (الشكل 4H، I). بشكل عام، أظهرت هذه النتائج أن الببتيد E1 يحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا الناجم عن الهيمين.

2.5. Netrin-1-يعمل الببتيد E1 المشتق على تعزيز التعافي الوظيفي بعد ICH

لمعرفة ما إذا كان الببتيد E1 المشتق من Netrin -1 يلعب دورًا مهمًا في التعافي غير الوظيفي بعد السكتة الدماغية النزفية، أنشأنا نموذج ICH تجريبيًا في الفئران عن طريق حقن كولاجيناز ممزوجًا بالحبر في الجسم المخطط (الشكل S6A).

بعد ثلاثة أيام، تم عرض صور لشريحة الدماغ لتتبع موضع الحقن وحجم الكولاجين بالحبر (الشكل S6B، C). أظهرت الفئران المصابة بنزيف في الجسم المميت ضعفًا على الجانب المماثل بسبب إصابة الدماغ (الشكل S7A-C).

كان الورم الدموي في ICH التالي للمخطط مرئيًا مقارنةً بحقن المياه المالحة (الشكل S7D). تمت زيادة مستويات البروتين النسبية لـ Netrin-1 وDCC في القشرة المحيطة بالدم في الفئران ICH مقارنة بفئران التحكم في اليوم الثاني، وكان Netrin-1 لا يزال أعلى بشكل ملحوظ في اليوم 3، مما يشير إلى أن Netrin-1 مهم لاستعادة إصابات الدماغ (الشكل S7E، F).

بعد ذلك، تم حقن TAT-peptide E1 (FITC-Pep TE1) المسمى FITC، والذي أضاف تسلسل TAT للطرف N من الببتيد E1، في فئران ICH وأظهر FITC-Pep TE1 أنه يعبر حاجز الدم في الدماغ ( الشكل S8).

تم حقن ICH وفئران التحكم داخل الصفاق مع الببتيد (12 ملغم / كغم) يوميًا أو بحجم مساوٍ من المياه المالحة (الشكل 5A). وجدنا أن الإدارة مع الببتيد TE1 حسنت معدل البقاء على قيد الحياة وأنقذت العيوب في وزن الجسم بعد ICH (الشكل 5B، C).

وجدنا أيضًا أن حجم كولاجيناز المتتبع بنسبة متساوية من الحبر في كل مجموعة كان متشابهًا، مما يؤكد أن نموذج ICH القياسي للكولاجيناز أدى إلى ورم دموي داخل الجسم قابل للتكرار (الشكل 5D). حسّن الببتيد TE1 الدرجات السلوكية لفئران ICH في اختبار إزالة الشريط (الشكل 5E). ) واختبار الاسطوانة (الشكل 5F).

كما هو متوقع، خفض الببتيد TE1 حجم الاحتشاء بعد ICH (الشكل 5G، H). مجتمعة، تشير هذه النتائج إلى أن الببتيد E1 كان قادرًا على تقليل حجم الورم الدموي وتحسين التعافي الوظيفي في نموذج الفأر من ICH.

الشكل 4. الببتيد E1 يخفف موت الخلايا الناجم عن الهيمين في المختبر. (A) لطخة غربية من Netrin -1 وDCC في خلايا NLT المستنبتة المعرضة لهيمين (6 0 ميكرومتر). (ب) يظهر التحليل الكمي للنتائج اللطخة الغربية في (أ). ن=3. (C) أظهرت فحوصات CCK -8 أن الببتيدات المتسلسلة لم تغير قابلية الخلية للخلايا. ن=4. (D) 1.5 ميكرومتر Pep E1 يحافظ على صلاحية خلية NLT عند إضافتها جيدًا بعد التعرض للهيمين (6 0 ميكرومتر). ن=4. (E) مقايسة حية (أخضر)/ميتة (حمراء) لخلايا NLT المعرضة للهيمين (6 0 ميكرومتر، 6 ساعات). شريط النطاق، 50 ميكرون. (F، G) التحليل الكمي للفحص الحي/الميت في (E). ن=9. (H) أظهرت فحوصات CCK-8 أن Pep E1 يمكن أن يقلل من موت الخلايا الناجم عن الهيمين في الخلايا العصبية المزروعة الأولية. n=8.(I) تصوير مقايسة حية/ميتة للخلايا العصبية ذات الثقافة الأولية (50 ميكرومتر، 6 ساعات). شريط النطاق، 50 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SEM. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه أو ANOVA ثنائي الاتجاه لجميع التحليلات الإحصائية الموضحة في هذا الشكل (* p <0.05، ** p <0.01، *** p <0.001؛ ns، غير مهم). وترد تفاصيل تحليل البيانات في الجدول التكميلي S1.

الشكل 5. الببتيد E1 المشتق من Netrin-1- يعزز عملية الاسترداد بعد ICH. (أ) رسم تخطيطي للنموذج التجريبي لحقن الببتيد TE1 داخل الصفاق في نمذجة ICH للفئران. (ب) تم تسجيل نسبة البقاء على قيد الحياة بعد ICH لكل مجموعة، وتم استخدام طريقة كابلان ماير. ن=10. (ج) يتغير وزن الجسم بعد خمسة أيام من ICH. n=6.(D) مزيج الكولاج/المحلول الملحي مع نسبة متساوية من الحبر (إجمالي 0.6 ميكرولتر) المحقون في المخطط للفئران C57، كانت الصور التمثيلية التي تظهر منطقة الحبر مماثلة في الفئران المعالجة بـ / بدون الببتيد TE 1 5 بعد أيام من ICH. (E، F) حقن IP للببتيد TE1 (12 مجم/كجم) ولكن ليس تحكم TAT (12 مجم/كجم)، تحسين السلوك كما يتم مراقبته بواسطة مهمة إزالة الشريط (E) أو مهمة الزاوية (F).

سالين، ن=10 حيوانات فردية؛ ICH، n=6 حيوانات فردية؛ ICH + TAT، n=6 حيوانات فردية؛ ICH + TE1، n=8 حيوانات فردية. ( G ) الهيماتوكسيلين التمثيلي والأقسام الملطخة بالإيوسين في الفئران المعالجة بـ / بدون الببتيد TE 1 5 بعد أيام من ICH. شريط النطاق، 1 ملم. (ح) قياس حجم النزف في أقسام الدماغ المبينة في (ز).

المالحة، ن {{0}} من الحيوانات الفردية؛ ICH، n=6 حيوانات فردية؛ ICH + TAT، n=6 حيوانات فردية؛ ICH + TE1، n=8 حيوانات فردية. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SEM. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه أو ANOVA ثنائي الاتجاه لجميع التحليلات الإحصائية الموضحة في هذا الشكل (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, ليست مهمة). وترد تفاصيل تحليل البيانات في الجدول التكميلي S1.

2.6. Netrin -1- الببتيد المشتق E1 يقلل من موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية بعد ICH

لاستكشاف الآليات الأساسية للببتيد E1 في عملية الاسترداد الوظيفي للتراث الثقافي غير المادي. اكتشفنا انحطاطًا عصبيًا في المنطقة المحيطة بالدم عن طريق تلطيخ فلورو اليشم C (FJC).

لقد وجدنا أن إعطاء الببتيد TE1 قلل بشكل كبير من عدد الخلايا الإيجابية FJC في مناطق الورم المحيطي، مما يشير إلى أن pep TE1 يمنع تنكس الخلايا العصبية بعد ICH (الشكل 6A، B). أجرينا تلطيخ TUNEL ووجدنا أن الببتيد TE1 قلل بشكل كبير من عدد الخلايا العصبية الإيجابية لـ TUNEL (الشكل 6C، D).

لم يكن عدد الخلايا النجمية الإيجابية TUNEL تغييرًا قابلاً للاكتشاف بعد علاج الببتيد TE1 (الشكل 6E، F). بالإضافة إلى ذلك، باستخدام 4 كيلو دالتون ديكستران المسمى بـ FITC كمتتبع للإشارة إلى نفاذية حاجز الدم في الدماغ (BBB)، وجدنا أن الببتيد TE1 لم يؤثر على استعادة نفاذية BBB (الشكل S9A، B).

كانت مستويات وحدات التألق الخام في المصل (RFUs) متشابهة، مما يؤكد وجود التتبع المحقون في جميع الحيوانات التي تم تحليلها (الشكل S9C). استخدمنا أيضًا lectin المسمى بالفلوريسئين لتسمية الأوعية الدقيقة لكننا فشلنا في ملاحظة أي تحسن بعد علاج TE1 (الشكل S9D، E). قبل كل شيء، تشير هذه النتائج إلى أن الببتيد E1 يعزز تعافي الخلايا العصبية بعد ICH عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج العصبي.

الشكل 6. يمكن للببتيد E1 المشتق من Netrin -1- أن يحمي من موت الخلايا العصبية وانحطاطها، لكن ليس الخلايا النجمية بعد ICH. (A) المقاطع التمثيلية الملطخة بـ Fluoro-jade C في الفئران المعالجة بـ/بدون TE1 بعد 5 أيام من ICH. شريط النطاق، 50 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، على التوالي. (ب) القياس الكمي للخلايا الإيجابية لفلورو اليشم C في المنطقة المحيطة بالدم (ن=4). (C) TUNELstaining يُظهر تأثيرات TE1 على إصابة الدماغ الثانوية (SBI) بعد 5 أيام من ظهور ICH. صور تمثيلية من مجموعات Saline وICH وICH + TAT وICH + TE1.

تعرضت كل مجموعة للتراث الثقافي غير المادي باستثناء المجموعة المالحة. شريط النطاق، 50 ميكرومتر، و10 ميكرومتر على التوالي. (د) تظهر التحليلات الكمية للنسبة المئوية للخلايا العصبية الإيجابية في TUNEL في (ج). ن=4. (E) توطين TUNEL مع GFAP بعد 5 أيام من ICH. صور تمثيلية من مجموعات Saline وICH وICH + TAT وICH + TE1. شريط النطاق، 50 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، على التوالي. (F) تظهر التحليلات الكمية للنسبة المئوية للخلايا النجمية الإيجابية لـ TUNEL في (E). ن=4. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SEM.

تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لجميع التحليلات الإحصائية الموضحة في هذا الشكل (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** ف < 0.001، **** ف < 0.0001، ليست كبيرة). وترد تفاصيل تحليل البيانات في الجدول التكميلي S1.

3. المناقشة

حددت دراستنا تسلسل الببتيد الأساسي لـ Netrin-1 والذي يعد ضروريًا للتعافي الوظيفي بعد ICH. من خلال التفاعل مع DCC، يحمي الببتيد المشتق من Netrin-1- من موت الخلايا العصبية بسبب التلف الثانوي بعد ICH، وبالتالي فهو علاج واعد للتراث الثقافي غير المادي.

يتطلب التطبيق العلاجي لـ Netrin-1، وهو بروتين عالي الوزن الجزيئي، تحديد الحد الأدنى من التسلسل الوظيفي لـ Netrin-1 الذي يعزز الإشارة السفلية. في دراستنا، تم إنشاء الببتيدات E1 (البقايا 407-422) وE2 (البقايا 423-433)، المشتقة من مجال EGF3 الخاص بـ Netrin -1، على التوالي. لقد وجدنا أن الببتيد E1 (البقايا 407-422) محمي ضد موت الخلايا العصبية بعد ICH.

لقد وجدنا أن مستويات التعبير Netrin-1 وDCC قد زادت في علاج خلايا NLT بعد العلاج. يتم تحرير الهيمين من الهيموجلوبين بعد ICH ويؤدي إلى إصابة ثانوية لكل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية [46-48].

بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أيضًا زيادة في مستويات البروتين من Netrin-1 وDCC بعد ICH التجريبي. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أيضًا زيادة في مستويات البروتين من النيترين -1 وDCC بعد ICH التجريبي.

تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة التي توضح أن netrin-1 يلعب دورًا مهمًا في التعافي بعد ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com