Acteoside كخيار علاجي محتمل لسرطان الخلايا الكبدية الأولية: دراسة قبل السريرية

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

دي ما ، وخوان وانغ ، ولو ليو ، وميتشي تشين ، وجيونغ وانغ

الملخص

الخلفية: سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو ورم خبيث شائع له خصائص التشخيص السيئ والمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. على وجه الخصوص ، يتوفر عدد قليل فقط من خيارات العلاج النظامية لمرضى سرطان الكبد المتقدم ، وتشمل سورافينيب ونظام أتزوليزوماب بالإضافة إلى بيفاسيزوماب الموصوف مؤخرًا كعلاجات محتملة للخط الأول. نقترح هنا أكتيوسيد ، وهو جليكوسيد الفينيثانويد الموزع على نطاق واسع في العديد من النباتات الطبية كمرشح محتمل ضد سرطان الكبد المتقدم.

الطرق: تم تحليل تكاثر الخلايا ، وتشكيل المستعمرات ، والهجرة في سلالات الخلايا HCC البشرية الثلاثة BEL7404 و HLF و JHH -7. تم إجراء فحص الأوعية الدموية باستخدام HUVES. تم إنشاء طراز BEL7404 أو JHH -7 الفئران العارية ذات الطعم xenograft لتحليل التأثيرات المضادة للأورام المحتملة للأكتيوسيد. تم استخدام qRT-PCR والنشاف الغربي للكشف عن آليات مضادات الأورام المحتملة للأكتيوسايد.

نتائج:Acteoside من cistancheمنع تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرات والهجرة في جميع خطوط الخلايا HCC البشرية الثلاثة BEL7404 و HLF و JHH -7. تم الكشف عن حظر تكوين الأوعية بواسطة أكتيوسيد من خلال تثبيط تكوين الأنبوب وهجرة الخلايا من HUVECs. أدى الجمع بين الأكتيوسايد والسورافينيب إلى تثبيط أقوى لتكوين مستعمرة الخلية وهجرة خلايا سرطان الكبد بالإضافة إلى تولد الأوعية في خلايا هوفكس. تم توضيح الفعالية المضادة للورم في الجسم الحي لأكتيوسيد في BEL7404 أو نموذج الفئران العارية لطبقة xenograft JHH -7 ، مع التحسين عند الدمج مع سورافينيب في تثبيط نمو JHH -7 xenograft. كشفت المعالجة الإضافية لخلايا JHH -7 باستخدام أكتيوسيد عن زيادة في مستوى البروتين المثبط للورم p53 بالإضافة إلى انخفاض مستوى الببتيداز المرتبط بالكاليكرين (KLK1 و 2 و 4 و 9 و 10) مع عدم وجود أهمية كبيرة تغييرات في بقية الجينات KLK1-15.

الاستنتاجات:Acteoside من cistancheيمارس تأثيرًا مضادًا للأورام من خلال تنظيمه لمستويات p53 بالإضافة إلى تثبيط تعبير KLK وتكوين الأوعية. يمكن أن يكون Acteoside مفيدًا كعامل مساعد في علاج سرطان الكبد المتقدم في العيادة.

الكلمات الرئيسية: Acteoside ، سرطان الخلايا الكبدية ، Sorafenib ، Xenograft ، p53 ، Kallikrein

خلفية

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو ورم خبيث شائع له خصائص سوء التشخيص وارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم [1 ، 2]. تم تحديد عوامل مختلفة للمساهمة في حدوث وتطور سرطان الكبد ، بما في ذلك الإصابة بفيروس التهاب الكبد B أو C ، وتعطيل الجينات الكابتة للورم مثل p53 ، والتنشيط غير الطبيعي للجينات الورمية مثل K-ras ، وبعض جزيئات الإشارة مثل PI3K و ERK / MAPK و Wnt / -catenin بالإضافة إلى تهرب الجهاز المناعي المضيف [3 ، 4]. لإدارة سرطان الكبد ، فإن الاستئصال وزرع الكبد والاستئصال بالترددات الراديوية هي خيارات لمرضى سرطان الكبد في مراحله المبكرة ، ولكن مع معدلات عالية من التكرار والورم الخبيث [3 ، 5 ، 6]. بالإضافة إلى ذلك ، يتوفر عدد قليل فقط من خيارات العلاج النظامية لمرضى سرطان الكبد المتقدم ، وتشمل سورافينيب ونظام أتزوليزوماب بالإضافة إلى بيفاسيزوماب الموصوف حديثًا كعلاجات أولية محتملة [7]. في هذا السياق ، من المهم والاهتمام إما تطوير عوامل جديدة تستهدف أهدافًا جزيئية متعددة أو وضع استراتيجية جديدة مثل تطبيق العلاج المركب في علاج سرطان الكبد المتقدم.

Acteoside من cistancheهو جليكوسيد فينيلثانويد موزع على نطاق واسع في العديد من النباتات الطبية ، بما في ذلك Ligustrum purpurascens [8] ، و Rehmannia glutinosa [9] ، و Ligustrum purpurascens [10]. أظهرت الأدلة المتزايدة أن الأكتوزيد يمكن أن يمارس أنشطة بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك نشاطه المضاد للورم. على سبيل المثال ، أظهر Acteoside تأثيرات قوية مضادة للتكاثر على خلايا سرطان البروستاتا [11]. أدى التسليم داخل الصفاق من الأكتوزيد إلى كبت نمو الورم في نموذج الفأر الميلانيني ربما من خلال تثبيط بروتين كيناز سي [12]. بالإضافة إلى ذلك ، عزز أكتيوسيد توعية خلايا سرطان القولون والمستقيم بـ 5- فلورويوراسيل من خلال استهداف إشارات PI3K / Akt [13]. أظهرت بياناتنا السابقة أيضًا تثبيط تكوين الميلانين بواسطة أكتيوسيد في خلايا سرطان الجلد B16 [14]. على الرغم من ذلك ، لا يتوفر سوى القليل من المعلومات فيما يتعلق بالفعالية المحتملة للأكتيوسيد في علاج سرطان الكبد والآليات الكامنة الكامنة المحتملة.

في هذه الدراسة ، أظهرنا ذلكActeoside من cistancheيمنع تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرة والهجرة في جميع خطوط الخلايا البشرية الثلاثة HCC BEL7404 و HLF و JHH7. يتم أيضًا تثبيط تكوين الأوعية بعد العلاج باستخدام الأكتوزيد ، كما يتضح من تثبيط تكوين الأنبوب وهجرة الخلايا من HUVECs. تم توضيح الفعالية المضادة للورم في الجسم الحي لأكتيوسيد في BEL7404 أو نموذج الفئران العارية لطبقة xenograft JHH -7 ، مع تعزيز عند الدمج مع سورافينيب في تثبيط نمو JHH -7 xenograft. يمكن أن تُعزى التأثيرات المضادة للأورام للأكتيوسيد إلى التنظيم الأعلى لـ p53 وكذلك قمع KLKs وتكوين الأوعية.

طُرق

زراعة الخلايا

تم الحصول على خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HCC) BEL7404 و HLF و JHH7 من American Type Culture Collection وتم تربيتها بشكل روتيني في وسط DMEM يحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني مكمل بـ 100 وحدة / مل من البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة رطبة بدرجة 37 مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. تم عزل الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) من أوردة الحبل السري البشري (المقدمة من قبل مختبرات أبحاث ScienCell ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم الحفاظ عليها في وسط خلية بطانية كما هو موضح سابقًا [15].

الكواشفActeoside من cistanche (A 0 1) تم شراؤها من Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co.، Ltd. (تايتشو ، الصين ؛ رقم القطعة 100581 ؛ نقاء أكبر من أو يساوي 99 بالمائة بواسطة HPLC). تم الحصول على Sorafenib من Selleck Chemicals (هيوستن ، الولايات المتحدة الأمريكية). قمنا بحل أكتيوسيد في 0.9 في المائة من محلول ملحي. تم تحضير محلول مخزون سورافينيب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ؛ 10 ملي مولار) ، مقطوعًا ، وتخزينه عند - 20 درجة.

الحيوانات

تم استخدام ذكور الفئران BALB / c (نو / نو) (18-20 جم ، 6-8 أسابيع وقت الاستلام) في الدراسة (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. ، شنغهاي ، الصين). تم إيواء الحيوانات في أقفاص بولي سلفون مهواة بشكل فردي في غرفة يمكن التحكم بدرجة الحرارة والضوء فيها (12 ساعة - 12 دورة مظلمة ، الأضواء مضاءة في الساعة 7: 00 صباحًا) مع وصول مجاني للطعام والماء . تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها وتم إجراؤها وفقًا لإرشادات الرابطة الدولية لدراسة الألم فيما يتعلق باستخدام حيوانات المختبر.

مقايسة تكاثر الخلايا تم إجراء النشاط المضاد للتكاثر باستخدام مقايسة MTT. باختصار ، تم طلاء الخلايا بكثافة 4-5 × 103 خلية لكل بئر في 96- ألواح آبار. بعد ربطها طوال الليل ، عولجت الخلايا بسلسلة من تركيزات الأكتيوسايد. بعد العلاجات الدوائية في النقطة الزمنية المحددة ، تم تحضين الخلايا بـ 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT Roche Diagnostic Corporation ، إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية التركيز النهائي: 5 ميكروغرام / مل) لمدة 3-4 ساعات عند 37 درجة. تم إذابة منتج فورمازان في DMSO لتقدير الطول الموجي 570 نانومتر.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>تم عد 10 خلايا تحت المجهر الضوئي (تكبير × 100 ؛ أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).

مقايسة التئام الجروح تم بذر الخلايا في {0} ألواح بئر (1 × 105 خلية لكل بئر) وتم تربيتها حتى 90 بالمائة من التقاء. تم خدش طبقة الخلية بطرف ماصة معقم 200 ميكرولتر لإحداث فجوة جرح. تم تصور هجرة الخلايا إلى المنطقة المصابة في النقاط الزمنية المشار إليها (0 ، 10 ، و 24 ساعة) تحت مجهر ضوئي مقلوب بتكبير × 100. تم إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ.

مقايسة تشكيل الأنبوب تمت زراعة HUVECs كما هو موضح سابقًا [15]. باختصار ، 96- تم طلاء ألواح البئر بمااتريجيل (BD Biosciences ، Franklin Lakes ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ثم إعادتها إلى الحاضنة لتتبلمر لمدة 30-40 دقيقة. تم بعد ذلك بذر HUVECs بكثافة 2 × 10 خلية / مل ومعالجتها بأدوية مختلفة لمدة 8 ساعات. تم تصوير تشكيل الأنبوب باستخدام مجهر مقلوب في النقاط الزمنية المحددة وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ.

تحليل النشاف الغربي

تم تحضير محلول الخلية الكلي باستخدام المخزن المؤقت للمقايسة المناعية الراديوية (RIPA) (5 0 ملي تريس هيدروكلورايد عند الرقم الهيدروجيني 8. 0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 بالمائة NP40 ، 1 بالمائة ديوكسيكولات الصوديوم ، 0.1 بالمائة SDS ، 10 ميكروغرام / مل ليوببتين ، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين و 2 ملي PMSF). تم فصل عينات البروتين بكميات متساوية (20 ميكروغرام / حارة) على هلام SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF (Bio-Rad ، Hercules ، CA). تم تحضين الأغشية طوال الليل باستخدام الجسم المضاد p53 (تقنية تشوير الخلايا ، بوسطن ، ماساتشوستس). بالنسبة لعناصر التحكم في التحميل ، تم شطف الأغشية بمخزن مؤقت للتجريد وتم إعادة تشكيلها باستخدام الجسم المضاد-أكتين (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا). تم الكشف عن البروتينات باستخدام نظام الكشف عن ECL (Perkin Elmer Life Sciences ، بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية).

qRT-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خطوط الخلايا باستخدام كاشف Trizol (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وخضع لتفاعل سلسلة بوليميراز النسخ العكسي (RT-PCR) لتجميع (كدنا) باستخدام مجموعة متاحة تجاريًا. تم إجراء qRT-PCR في الوقت الفعلي باستخدام 2xSYBR Green qPCR Supermix على Stratagene Mx3000P PRC ma chine (Agilent Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عرض تسلسل التمهيدي أدناه: الإحساس 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC -3 ′ ومضاد الشعور 5′- CAAACAAGTT GTGGCGACCC -3 ′ لـ KLK1 ؛ بمعنى 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC -3 ′ ومضاد للحس 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG -3 ′ لـ KLK2 ؛ بمعنى 5′- CCACACCC GCTCTACGATGA -3 ′ ومضاد للحس 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG -3 ′ لـ KLK3 ؛ بمعنى 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC -3 ′ ومضاد للحس 5′- GTTG CAGGAGTCCTCTGGT -3 ′ لـ KLK4 ؛ بمعنى 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT -3 ′ ومضاد للحس 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT -3 ′ لـ KLK5 ؛ بمعنى 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA -3 ′ ومضاد للحس 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT -3 ′ لـ KLK6 ؛ بمعنى 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG -3 ′ ومضاد للحس 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT -3 ′ لـ KLK7 ؛ بمعنى 5′- CTGGCAGGACACTCCAG -3 ′ ومضاد للحس 5′- ACACCGCCACAGTAGTTG -3 ′ لـ KLK8 ؛ بمعنى 5′- GTAGGGGTTCTCGTAGGGT -3 ′ ومضاد للحس 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG -3 ′ لـ KLK9 ؛ بمعنى 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC -3 ′ ومضاد للحس 5′- CTGGGGAGGAAGGATGGA -3 ′ لـ KLK10 ؛ بمعنى 5′-CCCACCCCTTGATTCTGTCT -3 ′ ومضاد للحس 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT -3 ′ لـ KLK11 ؛ بمعنى 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG -3 ′ ومضاد للحس 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC -3 ′ لـ KLK12 ؛ بمعنى 5′-CCTGAACCACGACCATGACA -3 ′ ومضاد للحس 5′-GCAGGGTTGGATGTAGCCT -3 ′ لـ KLK13 ؛ بمعنى 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC -3 ′ ومضاد للحس 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA -3 ′ لـ KLK14 ؛ بمعنى 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG - 3 ′ ومضاد للحس 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG - 3 ′ لـ KLK15 ؛ بمعنى 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT -3 ′ ومضاد للحس 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC -3 ′ لـ GAPDH. تم تطبيع قيم عتبة الدورة (Ct) لكل جين KLK مع قيم GAPDH وتحليلها باستخدام برنامج MxPro.

في الجسم الحي النشاط المضاد للورم A 0 1 بمفرده أو بالاشتراك مع sorafenib تم تحضير 4 معلقات خلايا BEL74 0 (3 × 1 0 6 خلايا) وحقنها تحت الجلد في الجانب الأيمن من الفئران عارية رياضيات. بعد عشرة أيام من التلقيح ، تم فحص الفئران الحاملة للورم (وزن الجسم (جم): 22-26 ؛ متوسط ​​± SEM: 23.8 ± 0. 14) واختيارها عشوائيًا في 7 مجموعات علاجية بعد حجم الورم ({ {12}} مم 3). تم تعيين ما مجموعه 38 فأرًا لمجموعات معالجة مختلفة (ن=5 لكل مجموعة باستثناء مجموعة النموذج (ن=8)). ثم عولجت الحيوانات بالتزقيم الفموي باستخدام أكتيوسيد (A01 ؛ 12.5 ، 25 و 50 ملجم / كجم) ، سورافينيب وحده (50 مجم / كجم) أو بالاشتراك مع A01 (50 مجم / كجم) مرة واحدة يوميًا لمدة 14 يومًا. علاوة على ذلك ، تم أيضًا إعطاء جرعة مقدارها 20 مجم / كجم من A01 عن طريق الوريد. تم اختيار الجرعات بناءً على دراسات سابقة وبياناتنا الأولية [15]. تمت مراقبة نمو الورم كل 3 أو 4 أيام باستخدام الفرجار الإلكتروني ، مع حساب الحجم على أنه 0.5 × طول × عرض (مم 3). بالإضافة إلى ذلك ، تم تضمين تجربة موازية باستخدام التلقيح JHH -7. بعد سبعة أيام من التلقيح ، تم فحص الفئران الحاملة للورم (وزن الجسم (جم): 20-26 ؛ متوسط ​​± SEM: 24.0 ± 0.20) واختيارها عشوائياً في مجموعات العلاج وفقًا لحجم الورم (80-130 مم 3 ). تم تعيين ما مجموعه 23 فأرًا إلى 4 مجموعات معالجة (ن=5 لكل مجموعة باستثناء مجموعة النموذج (ن=8)). ثم تلقت الحيوانات A01 (20 مجم / كجم ، 4) ، سورافينيب وحده (50 مجم / كجم ، ميكروغرام) أو مجتمعة مع A01 (20 مجم / كجم ، 4) مرة واحدة يوميًا لمدة 14 يومًا متتاليًا. تم تخدير جميع الفئران بهيدرات الكلورال (350 مجم / كجم) والتضحية بخلع العنق في نهاية فترة المراقبة. وتمت إزالة كتلة الورم وتصويرها بكاميرا رقمية.

تحليل احصائي

يتم التعبير عن جميع البيانات على أنها تعني ± الانحراف المعياري (SD). ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام تحليل التباين (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey بعد الاختبار. تظهر قيم حجم الورم على أنها تعني ± خطأ معياري للمتوسط ​​(SEM). تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبارات Tukey لتحليل بيانات حجم الورم. تم استخدام برنامج GraphPad Prism للتحليلات الإحصائية. تم اعتبار قيمة p <0. 05="" ذات="" دلالة="">

نتائج

تأثيرات A01 على تكاثر وتكوين مستعمرات سرطان الخلايا الكبدية في المختبر

تم استخدام خطوط خلايا HCC الثلاثة (BEL7404 و HLF و JHH7) لاختبار تكاثر الخلايا. كما هو مبين في الشكل 1 ، كشف اختبار MTT أن A01 يثبط تكاثر جميع خلايا سرطان الكبد الثلاث. لمزيد من التساؤل عما إذا كان النشاط المضاد للتكاثر لـ A01 يرجع إلى قدرته على تثبيط استنساخ الخلايا ، تم إجراء فحص تكوين المستعمرة. أظهر A01 عند 100 ميكرومتر تثبيطًا قويًا لتشكيل المستعمرة في خلايا BEL7404 (الشكل 2 أ و ب). عندما يقترن مع سورافينيب (2 ميكرومتر) ، كانت فعالية التثبيط أقوى من تلك الموجودة في A01 أو سورافينيب وحده. شوهدت نتائج مماثلة أيضًا في خليتي HCC الأخريين ، HLF و JHH -7 (الشكل 2 ج و د).

تأثيرات A01 بمفرده أو بالاشتراك مع سورافينيب على هجرة خلايا سرطان الكبد في المختبر

قمنا بعد ذلك بتقييم هجرة الخلايا باستخدام اختبار جرح الخدش. كما هو مبين في الشكل 3 ، فإن الجمع بين A01 (100 أو 500 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر) منع بشكل كبير التئام الجروح في جميع خلايا سرطان الكبد الثلاث ، بالمقارنة مع مجموعة التحكم. بالنسبة لخلايا BEL7404 ، أنتج كل من A01 (100 أو 500 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر) فقط ميلًا للوقاية من التئام الجروح دون دلالة إحصائية (الشكل 3 أ و د). بالنسبة لخلايا HLF ، أعاق A01 عند 500 ميكرومتر وسورافينيب عند 10 ميكرومتر التئام الجروح. على وجه الخصوص ، أنتج A01 (500 ميكرومتر) مع سورافينيب (10 ميكرومتر) تثبيطًا أقوى لالتئام الجروح من سورافينيب وحده (الشكل 3 ب و هـ). بالنسبة لخلايا JHH ، تم منع التئام الجروح بواسطة A01 (500 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر). أدى الجمع بين A01 (100 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر) إلى تثبيط أقوى لالتئام الجروح من A01 (100 ميكرومتر) أو سورافينيب (10 ميكرومتر) وحده. علاوة على ذلك ، أظهر A01 عند 500 ميكرومتر مع سورافينيب (10 ميكرومتر) تثبيطًا أقوى لالتئام الجروح من A01 (500 ميكرومتر) أو سورافينيب (10 ميكرومتر) وحده (الشكل 3 ج و و).

آثار A01 بمفرده أو بالاشتراك مع سورافينيب على تكوين الأوعية في المختبر

يرتبط تكوين الأوعية الدموية ارتباطًا وثيقًا بنمو الورم وتطوره وانتشاره [16] ، وبالتالي يعتبر أحد الأهداف المتداخلة لعلاج السرطان. أجرينا أولاً اختبارًا لتشكيل الأنبوب لتحليل تولد الأوعية المحتمل في المختبر. كما هو مبين في الشكل 4 ، بدأت المعالجة لمدة 3 ساعات باستخدام سورافينيب وحده (10 ميكرومتر) أو مزيج من A01 (100 و 500 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر) في إظهار تأثيرات مثبطة على تكوين الهياكل الشبيهة بالأوعية ، أي استطالة ومحاذاة HUVECs (الشكل 4 أ و ج). بعد العلاج لمدة 8 ساعات ، A01 (100 و 500 ميكرومتر) ، سورافينيب (10 ميكرومتر) بالإضافة إلى مزيج A01 و سورافينيب كل ذلك أعاق بشكل كبير تكوين الهياكل الشبيهة بالأوعية ، مع تثبيط أقوى من خلال الجمع بين A01 و سورافينيب من A01 أو سورافينيب وحده (الشكل 4 أ و ج). بالإضافة إلى ذلك ، تعد هجرة الخلايا لـ HUVEC خطوة أساسية لتشكيل أوعية جديدة أثناء تكوين الأوعية وبالتالي يتم التحقيق فيها. كما هو مبين في الشكل 4 ب و د ، A01 (500 ميكرومتر) ، سورافينيب (10 ميكرومتر) بالإضافة إلى مزيج من A01 (100 و 500 ميكرومتر) و سورافينيب (10 ميكرومتر) كل ذلك منع بشكل كبير هجرة الخلايا من HUVECs. أنتج A01 (500 ميكرومتر) مع سورافينيب (10 ميكرومتر) تثبيطًا أقوى من A01 (500 ميكرومتر) أو سورافينيب (10 ميكرومتر) وحده.

تأثيرات A01 بمفردها أو مع سورافينيب على نمو الورم في الجسم الحي لـ BEL7404 و JHH -7 HCC xenografts

لمزيد من تقييم فعالية A 0 1 بمفرده أو مع sorafenib على نمو الورم في الجسم الحي لـ HCC ، أنشأنا نموذجًا لماوس عاري xenograft تحت الجلد باستخدام BEL74 0 4 أو JHH -7 الخلايا. كما هو مبين في الشكل 5 ، انخفض حجم الورم بشكل كبير بعد العلاج بـ A 0 1 (25 و 5 0 ملغم / كغم ، عن طريق الفم ؛ 2 0 ملغم / كغم ، عن طريق الوريد الذيل ؛ كل p <0.01 مقابل="" مجموعة="" النموذج)="" أو="" سورافينيب="" (50="" مجم="" كجم="" ،="" عن="" طريق="" تزقيمية="" عن="" طريق="" الفم="" ؛="" p=""><0.01 مقابل="" مجموعة="" النموذج)="" وحدها="" (الشكل="" 5="" أ="" و="" ب).="" أظهر="" الجمع="" بين="" a01="" (50="" مجم="" كجم)="" وسورافينيب="" (50="" مجم="" كجم)="" تثبيطًا="" أقوى="" لنمو="" الورم="" عند="" مقارنته="" مع="" سورافينيب="" وحده="" (p=""><0.01) ،="" ولكنه="" أنتج="" تأثيرًا="" مشابهًا="" لـ="" a01="" وحده="" (الشكل="" 5="" أ="" و="" ج.="" ).="" استخدمنا="" بعد="" ذلك="" نموذج="" الفئران="" العارية="" بطعم="" xenograft="" jhh="" -7="" لإجراء="" مزيد="" من="" الاختبارات="" على="" الكفاءات="" الممكنة="" لمكافحة="" الورم="" لـ="" a01.="" كما="" هو="" مبين="" في="" الشكل="" 6="" ،="" أدت="" المعالجة="" بـ="" a01="" (20="" مجم="" كجم="" ،="" 4)="" أو="" سورافينيب="" (50="" مجم="" كجم="" ،="" ig)="" إلى="" تثبيط="" كبير="" لنمو="" الورم="" لـ="" jhh="" -7="" xenograft="" (p=""><0.01 مقابل="" مجموعة="" النموذج="" )="" ،="" مع="" قدر="" أكبر="" من="" التثبيط="" ،="" عند="" الدمج="" معًا="" (الشكل="" 6="" أ="" و="" ب="" ؛="" p=""><0.01 مقابل="" a01="" أو="" مجموعة="" سورافينيب="">

التعديل المحتمل للببتيداز المرتبط بالكاليكرين و p53 بواسطةActeoside من cistanche

تم اقتراح الببتيداز المرتبط بالكاليكرين (KLK) كمؤشر حيوي للسرطان في تشخيص العديد من السرطانات والتنبؤ بها ، بما في ذلك سرطان الخلايا الكبدية بسبب تعبيره غير المنتظم [17-19]. في هذا السيناريو ، اكتشفنا التعبير الجيني لـ KLK1–15 في خط الخلايا HCC JHH -7. كما هو مبين في الشكل 7 ، نتج عن العلاج باستخدام أكتيوسيد تثبيطًا كبيرًا لمستويات الرنا المرسال KLK1 و 2 و 4 و 9 و 10 (الشكل 7 أ-هـ) ، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في بقية KLK1-15 (البيانات غير معروضة. ). بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أيضًا مستوى بروتين مثبط الورم p53 وكشفنا عن زيادة في العلاج باستخدام أكتيوسيد (الشكل 7f).

مناقشة

لطالما كانت إدارة سرطان الكبد المتقدم مستعصية على الحل بسبب عدم القدرة على التشخيص في المراحل المبكرة والمقاومة الكيميائية للورم [5 ، 6]. سورافينيب ، مثبط متعدد الكيناز الذي أفاد بأنه يمنع تكاثر الخلايا وتكوين الأوعية ، مع مثبط آخر للكيناز الفموي ، لينفاتينيب ، أصبح العلاج القياسي لمرض سرطان الكبد المتقدم [3 ، 5 ، 20 ، 21]. ومع ذلك ، فإن معدلات البقاء الإجمالية متواضعة في ضوء معدلات الاستجابة المنخفضة وعدم الملاءمة في البيئات السريرية [3 ، 22]. أظهرت دراسة حديثة أن أتزوليزوماب بالإضافة إلى بيفاسيزوماب أنتج نتائج سريرية أفضل من سورافينيب في المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد غير القابل للاكتشاف ، مما يجعل هذا المزيج خيارًا جديدًا محتملاً لعلاج سرطان الكبد المتقدم [7]. في هذا السياق ، حددنا أن جليكوسيد الفينيثانويد ،Acteoside من cistancheمنع تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرات والهجرة في سلالات الخلايا HCC البشرية الثلاثة BEL7404 و HLF و JHH -7 بالإضافة إلى تكوين الأوعية المحظورة لـ HUVECs. أدى الجمع بين الأكتيوسايد والسورافينيب إلى تثبيط أقوى لتكوين مستعمرة الخلية وهجرة خلايا سرطان الكبد بالإضافة إلى تولد الأوعية في خلايا هوفكس. قدم Acteoside الفعالية المضادة للورم في BEL7404 أو نموذج الفئران العارية Xenograft JHH -7 ، مع تحسين عند دمجه مع sorafenib في تثبيط نمو JHH -7 xenograft. كشفت تحليلات أخرى عن زيادة في p53 وكذلك انخفاض في بعض جينات KLK. وفقًا لذلك ، ينبغي النظر في الاستخدام المحتمل لـ acteoside كمساعدات في علاج سرطان الكبد المتقدم في العيادة.

وقد أظهرت الأدلة المتزايدة الآثار المضادة للورمActeoside من cistancheفي الخلايا السرطانية المختلفة مثل خلايا الورم الميلانيني B16 وخلايا الورم الأرومي الدبقي وخلايا سرطان القولون والمستقيم وخلايا سرطان الخلايا الحرشفية الفموية وخلايا سرطان البروستاتا وخلايا سرطان الثدي البشري [11-13 ، 23-25] أو في الحيوانات التي تحمل أورامًا [12]. على الرغم من ذلك ، ركزت القليل من الدراسات على تأثيرات الأكتوزيد على سرطان الكبد في المختبر أو في الجسم الحي باستثناء دراسة واحدة تستخدم ثنائي إيثيل نيتروسامين كمادة مسرطنة للحث على تسرطن الكبد في الفئران والكشف عن الوقاية الكيميائية بواسطة الأكتوزيد [26]. في الدراسة الحالية ، أظهرنا التثبيط بواسطة أكتيوسيد لتكاثر الخلايا ، وتكوين المستعمرة ، والهجرة في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية وكذلك نمو الورم في الفئران التي تحمل مواد xenografts لخط خلية HCC ، مما يدل مباشرة على التأثيرات المضادة للورم للأكتيوسيد في سرطان الكبد. علاوة على ذلك ، أدى الجمع بين الأكتوزيد والسورافينيب إلى تأثيرات أقوى ضد الأورام. بالاقتران مع الدليل على أن الأكتوزيد يقي من إصابات الكبد [27-29] مع عدم وجود تأثيرات سامة على الحيوانات وعدم حدوث طفرات [30] ، يبدو أنه من الممكن التطبيق المستقبلي للعلاج المركب من أكتيوسيد وسورافينيب في المرضى الذين يعانون من حالات متقدمة سرطان الكبد في العيادة.

تتكون عائلة kallikrein البشرية من 15 بروتين سيرين متماثل ، أحادي السلسلة ، مُفرز من نوع التربسين أو الكيموتريبسين (KLK1-15) ، وقد شارك في تنظيم نمو الورم ، وتطور الأورام ، وتكوين الأوعية ، والورم الخبيث [18 ، 31]. على وجه الخصوص ، تم اقتراح KLKs كعلامة بيولوجية للسرطان في تشخيص وتوقع العديد من أنواع السرطان ، بما في ذلك سرطان الخلايا الكبدية بسبب تعبيره غير المنظم [17-19]. على سبيل المثال ، يُقترح KLK1 كعلامة حيوية لسرطان المعدة بسبب ارتفاع مستويات KLK1 في أورام المعدة والوقاية من نمو الورم في سرطان المعدة عن طريق تثبيط نشاط KLK1 مع بروتين رابط كاليكرين (KBP) [32]. في هذا السيناريو ، لاحظنا تثبيطًا كبيرًا لمستويات KLK mRNA بواسطة أكتيوسيد (KLK1 و 2 و 4 و 9 و 10). تم الإبلاغ عن استخدام KBP ، الذي يرتبط على وجه التحديد بـ kallikrein الأنسجة ويمنع نشاط kallikrein ، لقمع نمو HCC في الفئران ربما من خلال نشاطه المضاد لتولد الأوعية [33] ، مما يشير إلى احتمال تورط KLKs في تطور سرطان الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتين مثبط الورم p53 قادر على إحداث الشيخوخة والاستماتة وكذلك توقف دورة الخلية. زيادة تعبير p53 يمنح حساسية كيميائية محسنة في الخلايا السرطانية [34]. في هذا الصدد ، أظهرت نتائجنا الغربية زيادة في مستويات p53 بعد العلاج بالأكتيوسايد. مجتمعة ، من المعقول أن نستنتج أن الأكتوزيد يمارس التأثيرات المضادة للورم على سرطان الكبد ، ربما من خلال تنظيمه لـ p53 وكذلك تثبيط KLK وتكوين الأوعية.

وتجدر الإشارة إلى أن الهدف الجزيئي المباشر هو الذيActeoside من cistancheيمكن ربط مباشرة لا يزال غير واضح. كشفت بياناتنا الأولية باستخدام الالتحام الجزيئي عن الارتباط المباشر للأكتيوسيد مع كاليكرين (البيانات غير معروضة). سيكون من الضروري إجراء مزيد من التجارب لتوضيح هذا الافتراض. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لجرعات الأكتيوسايد المستخدمة في فحص الخلية في الدراسة 1 0 - 5 0 مرات أعلى من تلك الموجودة في سورافينيب (10 ميكرومتر) ، أولاً اخترنا جرعات أكتيوسيد وفقًا لـ علاقة الاستجابة للجرعة في مقايسة MTT. ثانيًا ، كانت الجرعات التي استخدمناها (100 ، 500 ميكرومتر) قابلة للمقارنة مع الدراسات السابقة [35] ، حيث منع الأكتوزيد (100 ميكرومتر) تكاثر الخلايا في خلايا سرطان القولون والمستقيم. أخيرًا ، على الرغم من الجرعة الأعلى في فحص الخلية ، أنتج أكتيوسيد تثبيطًا واضحًا لنمو الورم في نموذج الفئران العارية لطعم xenograft HCC في دراستنا (25 و 50 مجم / كجم) ، وكانت التأثيرات مشابهة لسورافينيب (50 مجم / كجم). بالنسبة إلى سورافينيب ، تم استخدامه في دراستنا بجرعة 10 ميكرومتر على المستوى الخلوي. هذه الجرعة مماثلة للدراسات السابقة التي وجد فيها أن سورافينيب يثبط بقاء الخلية مع IC50 من 4.0-6.5 ميكرومتر في خطوط خلايا HCC لخلايا PLC / PRF / 5 و HepG2. في المقابل ، كانت جرعة سورافينيب المستخدمة لقمع نمو طعوم xenografts HCC في إناث الفئران SCID 30 مجم / كجم (po by gavage) [36]. الجرعة الموصى بها في العيادة من سورافينيب للمريض هي 400 مجم في المرة (2 * 0.2 جرام) مرتين في اليوم (800 مجم في اليوم إجمالاً). تتناقض جرعة سورافينيب هذه المستخدمة في العيادة مع تلك المستخدمة في فحص الخلية (قيمة IC50 بمستوى ميكرومتر) ، ربما بسبب ضعف امتصاصه في ظل ظروف الجسم الحي. بالنسبة إلى أكتيوسيد ، بناءً على جرعته في الفئران (50 مجم / كجم ، ميكروغرام) ، فإن جرعته المكافئة للإنسان (60 كجم من وزن الجسم) حوالي 250 مجم. هذه الجرعة مماثلة لسورافينيب المستخدمة في العيادة ويجب أن تكون مقبولة للمرضى.

الاستنتاجات في الختام ،Acteoside من cistancheقادر على إحداث تأثير مضاد للأورام في خطوط خلايا سرطان الكبد وفي الفئران العارية التي تحمل مواد xenografts لخط خلايا سرطان الكبد HCC ، من المحتمل أن تكون التأثيرات من خلال زيادة مستويات p53 وكذلك حظر KLK وتكوين الأوعية. يمكن أن يكون Acteoside مفيدًا كعامل مساعد في علاج سرطان الكبد المتقدم في العيادة.

مراجع

1 Bray F و Ferlay J و Soerjomataram I و Siegel RL و Torre LA و Jemal A. إحصائيات السرطان العالمية 2018: تقديرات GLOBOCAN للوقوع والوفيات في جميع أنحاء العالم لـ 36 نوعًا من السرطان في 185 دولة. CA السرطان J كلين. 2018 ؛ 68 (6): 394-424 ..

2. Llovet JM ، Zucman-Rossi J ، Pikarsky E ، Sangro B ، Schwartz M ، Sherman M ، Gores G. سرطان الخلايا الكبدية. نات ريف ديس برايمرز. 2016 ؛ 2: 16018.

3. Sim HW، Knox J. سرطان الخلايا الكبدية في عصر العلاج المناعي. سرطان بروبل بالعملة. 2018 ؛ 42 (1): 40-8. 4. جيانغ واي ، هان كيو جيه ، تشانغ ج. سرطان الخلايا الكبدية: آليات التقدم والعلاج المناعي. العالم ي جاسترونتيرول. 2019 ؛ 25 (25): 3151–67.

5. Forner A ، Da Fonseca LG ، Diaz-Gonzalez A ، Sanduzzi-Zamparelli M ، Reig M ، Bruix J. الخلافات في إدارة سرطان الخلايا الكبدية. ممثل JHEP. 2019 ؛ 1 (1): 17-29.

6. Hartke J ، Johnson M ، Ghabril M. تشخيص وعلاج سرطان الخلايا الكبدية. سيمين تشخيص باثول. 2017 ؛ 34 (2): 153-9.

7. Finn RS و Qin S و Ikeda M و Galle PR و Ducreux M و Kim TY و Kudo M و Breder V و Merle P و Kaseb AO وآخرون. Atezolizumab plus Bevacizumab في سرطان الخلايا الكبدية غير القابل للاكتشاف. إن إنجل جي ميد. 2020 ؛ 382 (20): 1894-905.

8. He ZD، Ueda S، Akaji M، Fujita T، Inoue K، Yang CR. monoterpenoid و phenylethanoid glycosides من Ligustrum peduncular. كيمياء النبات. 1994 ؛ 36 (3): 709–16.

9. Li H ، Chou GX ، Wang ZT ، Hu ZB. تحديد HPLCأكتيوسيدفي Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006 ؛ 31 (10): 822-4.

10. Wong IY ، He ZD ، Huang Y ، Chen ZY. الأنشطة المضادة للأكسدة لجليكوسيدات الفينيثانويد من Ligustrum purpurascens. جي أغريك فود تشيم. 2001 ؛ 49 (6): 3113-9.

11. مولاني سك ، غوه ، مونغ ك. استراتيجية تركيبية عامة وخصائص مضادة للتكاثر على خطوط خلايا سرطان البروستاتا لجليكوسيدات الفينيثانويد الطبيعية. أورغ بيومول تشيم. 2014 ؛ 12 (18): 2926–37.

12. Cheimonidi C، Samara P، Polychronopoulos P، Tsakiri EN، Nikou T، Myrianthopoulos V، Sakellaropoulos T، Zoumpourlis V، Mikros E، Papassideri I، et al. السمية الانتقائية للخلايا للمادة العشبية أكتيوسيد ضد الخلايا السرطانية ورؤاها الميكانيكية. الأكسدة والاختزال بيول. 2018 ؛ 16: 169-78.

13. عطية يم ، القرش DM ، وجدي ها ، المزار مم. فيرباسكوسايد: تحديد الخلايا السرطانية في القولون والمستقيم وتحديدها الكمي والتحسس المحتمل لـ 5- FU عن طريق استهداف مسار PI3K / AKT. مندوب علوم .2018 ؛ 8 (1): 16939.

14. Liu S، Zhao Z، Huo Z، Xu Z، Zhong Y، Wang X، Yang Y، Wang Z. Osmanthus fragrans flower extraction water extracts and Acteoside المخصب يمنع تكون الميلانين والتصبغ الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية. نات برود كومون. 2018 ؛ 13 (5): 575-80.

15. Wang J ، Ma S ، Chen X ، Zhang S ، Wang Z ، Mei Q. يتآزر مثبط PI3K الجديد S1 مع sorafenib في خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة التي تتضمن إشارات Akt-S6. التحقيق في العقاقير الجديدة. 2019 ؛ 37 (5): 828-36.

16. هاناهان د ، واينبرغ ر. بصمات السرطان: الجيل القادم. خلية. 2011 ؛ 144 (5): 646-74. 17. إمامي ن ، ديامانديس إب. فائدة الببتيدات المرتبطة بالكاليكرين (KLKs) كمؤشرات حيوية للسرطان. كلين تشيم. 2008 ؛ 54 (10): 1600-7.

18. خياط PD ، Kodeboyina SK ، Bai S ، Patel N ، Sharma S ، Ratnani A ، Copland JA ، She JX ، Sharma A. إمكانات العلامات البيولوجية التشخيصية والإنذارية لجينات عائلة kallikrein في أنواع السرطان المختلفة. Oncotarget. 2018 ؛ 9 (25): 17876–88.

19. Kontos CK ، Mavridis K ، Talieri M ، Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) في سرطان الجهاز الهضمي: الجوانب الميكانيكية والسريرية. ثرومب هايموست. 2013 ؛ 110 (3): 450-7.

20. Cheng AL ، Kang YK ، Chen Z ، Tsao CJ ، Qin S ، Kim JS ، Luo R ، Feng J ، Ye S ، Yang TS ، وآخرون. فعالية وسلامة سورافينيب في المرضى في منطقة آسيا والمحيط الهادئ مع سرطان الخلايا الكبدية المتقدمة: المرحلة الثالثة العشوائية ، مزدوجة التعمية ، وهمي تسيطر عليها تجربة. لانسيت أونكول. 2009 ؛ 10 (1): 25–34. 21. Llovet JM ، Ricci S ، Mazzaferro V ، Hilgard P ، Gane E ، Blanc JF ، de Oliveira AC ، Santoro A ، Raoul JL ، Forner A ، et al. سورافينيب في سرطان الخلايا الكبدية المتقدمة. إن إنجل جي ميد. 2008 ؛ 359 (4): 378-90.

22. Song MJ. العلاج الكيميائي للتسريب في الشريان الكبدي لسرطان الخلايا الكبدية المتقدم. العالم ي جاسترونتيرول. 2015 ؛ 21 (13): 3843-9.

23. Liao YF، Rao YK، Tzeng YM. يمارس المستخلص المائي من Anisomeles India ومركبه المنقى نشاطًا مضادًا للنقائل من خلال تثبيط تنشيط NF kappaB / AP -1- MMP المعتمد -9 في خلايا MCF لسرطان الثدي البشري -7. الغذاء تشيم توكسيكول. 2012 ؛ 50 (8): 2930-6.

24. Zhang Y و Yuan Y و Wu H و Xie Z و Wu Y و Song X و Wang J و Shu W و Xu J و Liu B وآخرون. تأثير فيرباسكوسيد على موت الخلايا المبرمج والورم النقيلي في سرطان الخلايا الحرشفية الفموي البشري. Int ياء السرطان. 2018 ؛ 143 (4): 980-91.

25. Hwang TW، Kim DH، Kim DB، Jang TW، Kim GH، Moon M، Yoon KA، Choi DE، Park JH، Kim JJ. التأثير التآزري المضاد للسرطان للعلاج الكيميائي للورم الأرومي الدبقي القائم على الأكتوزيد والتيموزولوميد. إنت J مول ميد. 2019 ؛ 43 (3): 1478 - 86.

26. Peerzada KJ، Faridi AH، Sharma L، Bhardwaj SC، Satti NK، Shashi B، Tasduq SA. يتوسط Acteoside- الوقاية الكيميائية من التسرطن التجريبي للكبد من خلال الإجهاد التأكسدي المنظم وموت الخلايا المبرمج STAT -3. إنفيرون توكسيكول. 2016 ؛ 31 (7): 782-98.

27. Cui Q و Pan Y و Zhang W و Zhang Y و Ren S و Wang D و Wang Z و Liu X و Xiao W. مستقلبات Acteoside الغذائية: الملامح والعزل والتعرف والقدرات الواقية للكبد. جي أغريك فود تشيم. 2018 ؛ 66 (11): 2660–8.

28. Xiong Q ، Hase K ، Tezuka Y ، Namba T ، Kadota S. Acteoside يمنع موت الخلايا المبرمج في D-galactosamine وإصابة الكبد التي يسببها عديدات السكاريد الدهنية. علوم الحياة. 1999 ؛ 65 (4): 421-30.

29. Zhao J ، Liu T ، Ma L ، Yan M ، Zhao Y ، Gu Z ، Huang Y. التأثير الوقائي لـ acteoside على إصابة الكبد المناعية التي تسببها Bacillus Calmette Guerin بالإضافة إلى عديد السكاريد الدهني. بلانتا ميد. 2009 ؛ 75 (14): 1463-149.

30. Lu B، Li M، Zhou F، Huang W، Jiang Y، Mao S، Zhao Y، Lou T. مستخلص زهرة أوسمانثوس الغنية بالجليكوزيد: دراسات السمية الحادة ودون المزمنة. ي إثنوفارماكول. 2016 ؛ 187: 205-12.

31. Diamandis EP، يوسف GM. كاليكرينس الأنسجة البشرية: عائلة من المؤشرات الحيوية للسرطان الجديدة. كلين تشيم. 2002 ؛ 48 (8): 1198-205.

32. Sawant S ، Snyman C ، Bhoola K. مقارنة بين الأنسجة kallikrein و kinin التعبير عن مستقبلات في قرحة المعدة والأورام. إنت إمونوفارماكول. 2001 ؛ 1 (12): 2063–80.

33. Lu L، Yang Z، Zhu B، Fang S، Yang X، Cai W، Li C، Ma JX، Gao G. Kallikreinbinding protein يقمع نمو سرطان الخلايا الكبدية عن طريق النشاط المضاد لتكوّن الأوعية. ليت السرطان. 2007 ؛ 257 (1): 97-106.

34. Guntur VP، Waldrep JC، Guo JJ، Selting K، Dhand R. زيادة البروتين p53 يحسس سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة لباكليتاكسيل وسيسبلاتين في المختبر. الدقة المضادة للسرطان. 2010 ؛ 30 (9): 3557–64.

35. Zhou L، Feng Y، Jin Y، Liu X، Sui H، Chai N، Chen X، Liu N، Ji Q، Wang Y، Li Q. يعزز Verbascoside موت الخلايا المبرمج من خلال تنظيم إشارات HIPK 2- p53 في الإنسان سرطان قولوني مستقيمي. سرطان BMC. 2014 ؛ 14: 747.

36. Liu L و Cao Y و Chen C و Zhang X و McNabola A و Wilkie D و Wilhelm S و Lynch M و Carter C. نموذج السرطان PLC / PRF / 5. الدقة السرطان. 2006 ؛ 66: 11851-8.