الجزء الأول استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M1 المكبوتة من Acteoside من خلال مسار إشارات NF-κB المانع واستعادة وظيفة الميتوكوندريا بوساطة AMPK

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

الجزء 1 كيف تعزز Cistanche Acteosides حيوية خلايا الدماغ وتخفيف مرض الزهايمر؟

انقر لمنتجات Cistanches

جامعة يينغ تشى لى الصين الصيدلانية

جامعة يي تشن الصينية الصيدلانية

جامعة سي تشي جيانغ الصين الصيدلانية

جامعة يوان يوان شي الصين الصيدلانية

جامعة شياو لي جيانغ الصينية الصيدلانية

جامعة شان شان وو الصينية الدوائية

جامعة بينغ تشو الصينية الصيدلانية

جامعة هوي يينغ وانغ الصينية الصيدلانية

جامعة بينغ لي الصين الصيدلانية

كلمات البحث: أكتيوسيد، BV -2 الخلايا ، التمثيل الغذائي ، تسلسل الحمض النووي الريبي ، الميتوكوندريا ، التهاب الأعصاب

الملخص

الخلفية: مرض الزهايمر (AD) هو أكثر أنواع الخرف شيوعًا. في حينأكتيوسيد(ACT) ، مركبمعزولمنCistanche tubulosa، يمتلكخصائص اعصاب. ومع ذلك ، فإن الآلية الأساسية في تنظيم استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال غير محددة. الطرق: هنا ، تم تطبيق نموذج AD المستحث بـ AlCl 3- في يرقات الحمار الوحشي للكشف عن الفعالية العلاجية لـ ACT. تم استخدام خلايا BV -2 لتوضيح دور ACT في استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة. تم الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي ، و HPLC-Q-TOF-MS ، واللطخة الغربية ، والالتحام الجزيئي لتأكيد آليتها.

النتائج: خفف ACT بشكل كبير من خلل الحركة التجريبي واضطرابات الجهاز العصبي في الحمار الوحشي. بعد ذلك ، قمع استقطاب M1 وعزز النمط الظاهري M2 في خلايا BV -2 المستحثة بـ LPS. لقد أثبتنا لأول مرة أن ACT قد مارس تأثيرًا نسبيًا عميقًا ، والذي تضمن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية في التلامس ، والتخليق الحيوي للأرجينين ، وكذلك التخليق الحيوي للبانتوثينات و CoA ، المرتبط بوظيفة الميتوكوندريا. خفض علاج ACT استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M1 عن طريق تثبيط مسار إشارات NF-B. كما تم تعزيز مسارات التمثيل الغذائي بواسطة HPLC-Q-TOF-MS. بالإضافة إلى ذلك ، قام ACT بتصحيح ROS المفرط لاستعادة وظيفة الميتوكوندريا من خلال تنظيم PGC بوساطة AMPK -1 و UCP -2 ، بما يتوافق مع التغيرات الأيضية. ومن المثير للاهتمام ، أن ACT قد يرتبط مباشرة بكل من NF-B و AMPK ، كما يتضح من الالتحام الجزيئي. الاستنتاجات: قدم البحث آلية ضخ لـ ACT وأوضح منظورًا جديدًا يعتمد على خلل وظائف الميتوكوندريا للكشف عن العلاقة بين التمثيل الغذائي واستقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة.

خلفية

مرض الزهايمر (AD) هو مرض تنكسي عصبي شائع يترافق مع ضعف الإدراك وخلل الحركة [1]. يتميز بفقدان الخلايا العصبية الشديد ، لويحات الشيخوخة ، والتشابك العصبي النخاعي [2]. إن التسبب في مرض الزهايمر متعدد الأبعاد ويرتبط بالتهاب الأعصاب. الالتهاب العصبي هو الدافع وراء تنشيط الخلايا الدبقية ، المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بتطور الزهايمر [3 ، 4]. أثناء تطور وتفاقم الالتهاب العصبي ، تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة العامل الرئيسي. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية الأولية في الجهاز العصبي المركزي. يرتبط ارتباطًا وثيقًا بسلسلة من العمليات ، والتي تحتوي على نمو الدماغ ، والحفاظ على بيئة محايدة ، بالإضافة إلى الاستجابة للإصابة والإصلاح [1]. علاوة على ذلك ، يمكن تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة إلى النمط الظاهري M1 ويزداد التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات عند حدوث الأمراض العصبية المرتبطة بالالتهابات مثل مرض الزهايمر [5]. تظهر الدراسات أيضًا أن الاستقطاب في النمط الظاهري M1 غالبًا ما يكون مصحوبًا باضطرابات أيضية [6] ، مما يتسبب في اختلال استقلاب الطاقة واختلال وظائف الميتوكوندريا [7]. هذه التغييرات السلبية مستمدة من التنكس العصبي ، حتى الزهايمر.

أكتوسيد(ACT) ، وهو جليكوسيد فينيليثانويد ، مشتق بشكل أساسي منسيستانشتوبولوسا. أدلة متزايدة تشير إلى ذلكفعلتمتلك العديد من الأدويةتشمل الأنشطة الوقائية العصبية [8] ، والتأثيرات المضادة للالتهابات [9] ، ومضادات الأكسدة [10]. على وجه الخصوص ، تم الإبلاغ عن ACT لتحسين التعلم وضعف الذاكرة وكذلك تنظيم التمثيل الغذائي للطاقة في الفئران التي يسببها الستربتوزوتوسين [11]. كما تم اقتراحه لتثبيط موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية وتلف الميتوكوندريا في الفئران التجريبية المناعية الذاتية لالتهاب الدماغ والنخاع [12]. ومع ذلك ، فقد ركزت دراسات أقل على تأثير ACT على استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M1 / ​​M2. على وجه الخصوص ، لم يتم تنفيذ آليات مختلفة ، مثل إصلاح وظيفة الميتوكوندريا وتنظيم التمثيل الغذائي للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، آليةفعلساهم في استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M1 / ​​M2 ظلت غير مستكشفة. يهدف هذا التقرير إلى التحقيق في الفعالية العلاجية لـ ACT بالإضافة إلى الآلية الجزيئية الأساسية لـفعلفيميلادي. هنا،فعلأظهر تأثيرًا مهمًا في الحماية العصبية في يرقات الزرد التي تسببها AlCl 3-. بالإضافة إلى ذلك ، منع ACT استقطاب M1 بشكل فعال وعزز النمط الظاهري M2 في خلايا BV -2 التي يسببها LPS. تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) متكامل مع طريقة التمثيل الغذائي لفهم الآلية الأساسية لـ ACT في تنظيم استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة. تم التحقيق في الحديث المتبادل بين التمثيل الغذائي واستقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة من حيث وظيفة الميتوكوندريا. ستوفر هذه الدراسة احترامًا جديدًا لمزيد من التحقيق في ACT كعامل علاجي محتمل لعلاج مرض الزهايمر.

طُرق

الحيوانات وتجميع النماذج

تم اختيار حمار وحشي من النوع البري (سلالة AB ، عمرها 4 أشهر) في هذه الدراسة (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co.، Ltd.). تم الحفاظ عليها تحت 14/1 0 ساعة فاتحة / مظلمة بدورة عند 28 درجة ، باتباع الطريقة السابقة [13]. تم إنتاج السماد الطبيعي والأجنة التي تم تطويرها بشكل طبيعي وتربيتها لمدة 3 أيام بعد الإخصاب (pdf) في حاضنة إضاءة. تم إجراء جميع تجارب أسماك الزرد تحت إشراف لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة الصين الصيدلانية. تم تقسيم يرقات الزرد إلى ست مجموعات وعولجت من 3 pdf إلى 7 pdf: مجموعة التحكم ، مجموعة النموذج ، النموذج بالإضافة إلى مجموعة donepezil hydrochloride (DPZ) ، نموذج بالإضافة إلى مجموعات ACT. تم الحفاظ على المجموعة الضابطة في الوسط بنسبة 0.2 بالمائة DMSO وعولجت المجموعة النموذجية بـ 150 ميكرومتر AlCl3 (الرقم الهيدروجيني 5.8). تمت معالجة النموذج بالإضافة إلى مجموعة DPZ باستخدام AlCl3 و 8 ميكرومتر DPZ. تمت معالجة مجموعات النموذج بالإضافة إلى ACT مع AlCl3 وتركيزات مختلفة من ACT (200 ، 100 ، 50 ميكرومتر). تم الحصول على ACT (نقاء HPLC أكبر من أو يساوي 98 بالمائة) من Baoji Herbest Bio-Tech Co.، Ltd. (Baoji ، الصين). تم شراء AlCl3 · 6H2O و DPZ من Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.، LTD. (شنغهاي، الصين).

التحليل السلوكي صفحة 3/34 تم تسجيل حركات يرقات الزرد باستخدام محلل سلوكيات ViewPoint (Zebralab 2018 ، ViewPoint Life Sciences Co.، Ltd.) بدرجة 28. كانت Brie§y والمعلمات السلوكية ومعالجة النتائج متوافقة مع الطريقة التي أنشأناها سابقًا [13]. هنا ، تم اختيار متوسط ​​السرعة (AS) ، وتغير السرعة (ΔS) ، ومعدل استرداد خلل الحركة (DRR) ، وكفاءة الاستجابة (RE ، بالمائة) لتقييم استرداد خلل الحركة في أسماك الزرد.

تحديد نشاط أسيتيل كولينستراز (AChE) والكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT)

بعد العلاج من 3 pdf إلى 7 pdf ، تم جمع يرقات الزرد لقياس نشاط AChE و ChAT.

استنادًا إلى بروتوكول الشركة المصنعة ، تم اكتشاف النشاط بواسطة مجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (شركة التكنولوجيا الحيوية MLBIO المحدودة ، شنغهاي ، الصين). وتم تحديد تركيزات البروتين لعينات مختلفة بطريقة BCA

الثقافات والعلاجات الخلوية

تم شراء خط الخلية BV {0}} (خط الخلية الدبقية الصغيرة الفئران الخالد) من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تربيتها في DMEM (KeyGen Biotech Co. ، Ltd ، نانجينغ ، الصين). تم استكمال الوسط بـ 10 بالمائة FBS (Gibco ، Grand Island ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 100 U / mL من البنسلين ، بالإضافة إلى 100 مجم / مل من الستربتومايسين ، مع 95 بالمائة من الهواء / 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة. تم تحضين خلايا BV -2 باستخدام ACT (50 ، 25 ، 12.5 ميكرومتر) أو تم تحفيزها باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS ، 1 ميكروغرام / مل ؛ Sigma-Aldrich ، St Louis ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 24 ساعة. أخيرًا ، تم جمع جميع الخلايا أو المادة الطافية للتحليلات المختلفة.

فحص جدوى الخلية

تم استخدام مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) (JianCheng Bioengineering Institute ، Nanjing ، الصين) لتقييم صلاحية خلايا BV -2. تم زرع الخلايا في 96- صفيحة بئر (1 × 104 خلية / بئر ، Wuxi NEST Biotechnology Co.، Ltd.). باختصار ، تمت إزالة الوسيط في نهاية العلاج ، وتمت إضافة 100 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على محلول CCK -8 إلى كل بئر لمدة ساعتين عند 37 درجة. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Bio-Tek Instrument ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم التعبير عن صلاحية الخلية كنسبة مئوية من مجموعة التحكم. التجربة أعيدت ثلاث مرات.

مقايسة إنتاج أكسيد النيتريك (NO)

تم تحديد NO عن طريق قياس مستويات النتريت في طاف الثقافة BV -2 باستخدام كاشف Griess. Brie§y ، في نهاية العلاج ، تم نقل الوسيط (100 ميكرولتر) إلى لوحة بئر جديدة 96-. تمت إضافة نفس الحجم من كاشف Griess إلى كل بئر وتفاعل لمدة 15 دقيقة في الظلام. تم تحديد الامتصاص عند 540 نانومتر بواسطة قارئ Microplate.

مستويات السيتوكينات الالتهابية في المادة الطافية

تم تحديد تركيزات TNF- و IL -1 و IL -10 في طاف الخلايا BV -2 بواسطة مجموعات ELISA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (MLBIO biotechnology Co. Ltd. ، شنغهاي ، الصين ).

مراقبة التشكل الخلوي

لتحديد تأثير ACT على استقطاب الخلية M1 / ​​M2 للخلية BV -2 ، تم طلاء الخلايا في طبق جيد 6- وتم ملاحظتها تحت المجهر المقلوب (Nikon ECLIPSE Ti2 ، اليابان).

تحديد التمثيل الغذائي الخلوي عن طريق تحليل HPLC-Q-TOF-MS

تم زرع خلايا BV {0} في 6- طبق جيد بشكل منفصل (n =6 / مجموعة). بعد العلاج ، تمت إزالة الوسيط وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. ثم تعرض على الفور للنيتروجين السائل لقمع استقلاب الخلايا. تم حصاد الخلايا باستخدام 8 ٪ ميثانول بارد 0 (1 مل / بئر) وتم نقل المعلق إلى أنبوب إيبندورف سعة 2 مل. لتسهيل ترسيب البروتين ، يتم تدويره بقوة لمدة دقيقة واحدة وطرده عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات. تم نقل المعلق الخلوي إلى أنبوب إيبندورف جديد سعة 2 مل وتجفيفه تحت تيار من النيتروجين وتخزينه عند درجة -80 حتى التحليل. تمت إعادة تكوين المتبقي المجفف في 15 {{4 0} ميكرولتر من 25 بالمائة أسيتونيتريل مبردة مسبقًا. من أجل ضمان استقرار ودقة تحليل التسلسل ، تم دمج أحجام متساوية (1 0 ميكرولتر) من كل عينة خلية كعينات لمراقبة الجودة (QC). أثناء اكتشاف المستقلب ، تم حقن هذه العينات بعد كل ست عينات من الخلايا للتأكد من ثباتها. تم حقن قسامة 1 ميكرولتر لـ HPLC-Q-TOF-MS. تم إجراء تحليل HPLC-Q-TOF-MS على نظام Agilent 1290 HPLC المتصل بمطياف الكتلة Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الفصل على عمود ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 × 1 00 مم ، 1.7 ميكرومتر). تتكون الطور المتحرك من 0.1 بالمائة ماء حمض الفورميك (حجم / حجم ؛ أ) وأسيتونيتريل (ب). تم تعيين معدل §ow عند 0.4 مل / دقيقة مع حالة شطف التدرج الأمثل التالية: 0 إلى 2 دقيقة ، 5 بالمائة ب ؛ 2 إلى 20 دقيقة ، 5 في المائة إلى 95 في المائة ب (وضع الأيونات الموجبة) ؛ 0 إلى 2 دقيقة ، 5 بالمائة ب ؛ 2 إلى 20 دقيقة ، 5 في المائة إلى 95 في المائة ب (وضع الأيونات السالبة). تم تعيين معلمات تشغيل مطياف الكتلة على النحو التالي: درجة حرارة الغاز ، 320 درجة ؛ غاز التجفيف ، 10 لتر / دقيقة ؛ البخاخات ، 35 رطل / بوصة مربعة ؛ VCap ، 4000 فولت ؛ جزء ، 120 V. تم تشغيل البيانات الأولية باستخدام إصدار برنامج MassHunter Workstation B.07.00 (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت معالجة البيانات الأولية مسبقًا بواسطة منصة XCMS. تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) والتحليل الجزئي للتمييز في المربعات الصغرى (PLS-DA) للبيانات الطبيعية باستخدام MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). بالاقتران مع الأدبيات ، تم تحديد المستقلبات التفاضلية (VIP> 1 ، T-test P <0.05) على="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" أخيرًا="" ،="" تم="" إجراء="" تحليل="" المسار="" باستخدام="">

قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP)

تم اكتشاف MMP باستخدام § مسبار متوهج JC -1 (Beyotime ، الصين) وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة. باختصار ، تم شطف الخلايا من مجموعات مختلفة باستخدام PBS واحتضانها بمحلول تلطيخ JC -1 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة. بعد التلوين ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول تلطيخ. بعد ذلك ، تم الكشف عن إشارات الفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD Accuri C6).

قياس الأدينوسين 5'-ثلاثي الفوسفات في الميتوكوندريا (ATP)

تم اكتشاف تركيز ATP في الميتوكوندريا بواسطة مجموعة فحص ATP (Beyotime ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم التخلص من الوسط المستنبت لخلايا BV {0}} من مجموعات مختلفة ، وتم تجانس الخلايا مع محلول تحلل على الجليد. تم استخدام المادة الطافية التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي (12 ، 000 جم ، 5 دقائق) لتحديد تركيز ATP. تم الكشف عن التلألؤ (تفاعل luciferase - uorescein المحفز) بواسطة EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

قياس مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS)

تم استخدام ROS Assay Kit (Beyotime ، الصين) لقياس مستوى ROS. تم تحضين الخلايا من مجموعات مختلفة باستخدام DCFH-DA (10 ميكرومتر) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة. بعد تحميل المسبار ، تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DMEM. بعد ذلك ، تم الكشف عن إشارات متألقة عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD Accuri C6)

المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)

تم زرع خلايا BV -2 في طبق جيد 6-. تمت إزالة الوسط وتمت إضافة 1 مل من 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد بسرعة إلى كل بئر. ثم تم نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل وطرده عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. تم إصلاح الخلايا طوال الليل بـ 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد الجديد عند 4 درجات. بعد التجفيف والجفاف والتضمين ، لوحظت الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني للإرسال HT7800 (هيتاشي ، طوكيو ، اليابان).

تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل البيانات الحيوية

إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا BV {0}} (n=3 / group) باستخدام كاشف Trizol (Vazyme Biotech ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة للكاشف. تم إرسال جميع العينات التحليلية إلى Majorbio (Shanghai Majorbio Bio -harm Technology Co. ، Ltd.) لإجراء اختبار تسلسل الحمض النووي الريبي. تم تحليل البيانات على المنصة المجانية عبر الإنترنت لمنصة ماجوربيو كلاود. كانت معلمات تحليل التعبير التفاضليP-ضبط <0. 05 و|log2FC |أكبر من أو يساوي1. تم تقديم بيانات التسلسل الأصلية إلى قاعدة بيانات أرشيف قراءة تسلسل NCBI (SRA).

تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)

تم حصاد إجمالي الحمض النووي الريبي لخلايا BV -2 في كل مجموعة باستخدام 500 ميكرولتر من كاشف عزل RNA-easyTM (Vazyme Biotech ، الصين) ، وتم إجراء تفاعل النسخ العكسي باستخدام FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech ، الصين) . تم إجراء ردود الفعل وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تعرض (كدنا) لفحوصات qRT-PCR باستخدام بادئات محددة و TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech ، الصين). تم سرد المواد الأولية في الجدول S1 (انظر الملف الإضافي 1) وتم استخدام -actin كعنصر تحكم داخلي. تم استخدام طريقة ΔΔCT 2- للتحليل الكمي.

تحليل لطخة غربية

تم تحليل خلايا BV -2 بواسطة RIPA lysis buffer (KeyGen Biotech Co.، Ltd، Nanjing، الصين) التي تحتوي على 1٪ من كوكتيل مثبط البروتياز (Thermo Fisher) للحصول على البروتين الكلي. تم إجراء SDS-PAGE بنسبة 10 بالمائة لفصل البروتينات التي تم نقلها إلى أغشية NC. بعد حجب الحليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة / BSA لمدة ساعتين ، تم تحضين الأغشية باستخدام AMPK (Proteintech) ، و p-AMPK (A¨nity Biosciences) ، و PGC -1 (Proteintech) ، و NF-B (Proteintech) ، الأجسام المضادة p-NF-κB (ABclonal) أو GAPDH (ABclonal) في 5 بالمائة من TBST عند 4 درجات بين عشية وضحاها. تم تحضين الأغشية بجسم مضاد ثانوي مترافق مع بيروكسيداز الفجل (ABclonal) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم استخدام الركيزة النشاف الغربية عالية الإشارة ECL (تانون ، الصين) ، ونظام التصوير الهلامي (تانون ، الصين) ، وبرنامج ImageJ للتصور والكميات.

الالتحام الجزيئي

تم إجراء تحليلات الالتحام الجزيئي باستخدام برنامج Autodock (الإصدار 4.2). لوحظ التقارب بين ACT والبروتينات بواسطة برنامج AutodockTools. تم استرداد هياكل البروتين ثلاثية الأبعاد (3D) لـ AMPK (معرف PDB: 5g5j) ، و NF-B (معرف PDB: 4q3j) من بنك بيانات البروتين

تحليل احصائي

يتم التعبير عن جميع البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري (SD). تم تحليل الاختلافات بين المجموعات المختلفة من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا بتحليل توكي المتعدد.

نتائج

يخفف ACT من خلل الحركة وتحسين وظيفة النظام الكوليني في يرقات الزرد

تم استخدام نموذج AD المستحث بـ AlCl 3- في يرقات الزرد لتوضيح تأثير ACT على AD. أولاً ، لوحظت حركة يرقات الزرد خلال دورات الضوء / الظلام وتم تسجيل مسارات السباحة (الشكل 1 أ ، 1 ب). تم حساب AS و ΔS لحركة الزرد التي يسببها AlCl3 في الوقت المقابل بعد الإعطاء. أظهرت النتائج أن الجرعات المختلفة من ACT زادت بشكل فعال AS و S من الزرد (الشكل 1 ج). كشف DRR و RE عن مقارنة أكثر سهولة بين ACT و DPZ (الشكل 1 د). وفقًا لذلك ، خفف ACT من خلل الحركة ، وأظهر تأثيرات مماثلة لـ DPZ. من المتفق عليه عمومًا أن النظام الكوليني يلعب دورًا مهمًا في عمليات التعلم والذاكرة. وبالتالي ، تم استخدام أنشطة AChE و ChAT للكشف عن تأثير ACT. التعرض لـ AlCl3 في سمك الزرد الناتج عن تغير كوليني في الدماغ (الشكل 1 هـ). كان من الرائع أن علاج ACT يثبط نشاط AChE. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر نشاط ChAT انخفاضًا بعد علاج ACT. باختصار ، أظهر ACT تأثيرًا عميقًا على وظيفة النظام الكوليني في يرقات الزرد التي يسببها AlCl 3-.

قام ACT بقمع استقطاب M1 وعزز استقطاب M2 في خلايا BV المستحثة بـ LPS -2

تمت دراسة تأثيرات ACT على استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرةفي المختبرباستخدام BV {0}} الخلايا الدبقية الصغيرة. قلل LPS بشكل ملحوظ من صلاحية الخلية BV -2 بعد معالجتها على مدار 24 ساعة. لحسن الحظ ، زاد ACT من قابلية بقاء خلايا خلايا BV المستحثة بـ LPS -2 (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ مورفولوجيا خلايا BV -2. بعد 24 ساعة من تحفيز LPS ، أظهرت أن خلايا BV -2 خضعت لحالة استقطاب M1. وتم منع التغيرات المورفولوجية عن طريق العلاج المشترك ACT (الشكل 2 ب). علاوة على ذلك ، أشارت النتائج إلى أنه على عكس الخلايا BV -2 المحفزة بواسطة LPS ، فإن الخلايا BV -2 التي تمت معالجتها بالاشتراك مع ACT عرضت TNF- المثبط بشكل ملحوظ (الشكل 2 ج) ، IL -1 ( الشكل 2 د) و NO (الشكل 2f) في طاف الخلية. هذه هي السيتوكينات المؤيدة للالتهابات الكلاسيكية كمؤشرات على استقطاب M1 الخلايا الدبقية الصغيرة. على غرار نتائج ELISA ، اكتشفت نتائج qPCR أن تعبيرات TNF- و synthase أكسيد النيتريك (iNOS) و IL -1 و CD 86 mRNA كانت ذات دلالةتم تثبيطه عن طريق العلاج ACT مقارنة مع مجموعة LPS (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، قمنا بقياس مستويات استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M2 بواسطة ELISA (الشكل 2 هـ) و qPCR (الشكل 3 ب) ، والتي أشارت نتائجها إلى أن ACT زاد بشكل كبير من مستويات التعبير المرتبط بالعلامة المرتبطة بـ M2 (IL -10 ، CD206 و TGF- و Arg -1). مجتمعة ، أظهرت هذه النتائج أن ACT قمع استقطاب M1 الخلايا الدبقية الصغيرة وعزز النمط الظاهري M2.

استقطاب M1 / ​​M2 المنظم بواسطة ACT عن طريق تثبيط مسار إشارات NF-B في خلايا BV -2 التي يسببها LPS

تم إجراء تحليل النسخ بواسطة RNA-seq لفهم آلية ACT في خلايا BV -2 من المستوى العام. أوضح PCA أن مجموعات التحكم و LPS و ACT يمكن تمييزها جيدًا (الشكل 4 أ). كشفت عن 899 جينًا معبرًا تفاضليًا (DEGs) بين مجموعة التحكم ومجموعة LPS ، بينما كانت 49 DEGs بين مجموعة LPS ومجموعة ACT (الشكل 4 ب). باستمرار ، كشف تحليل إثراء علم الجينات (GO) (الشكل 4 ج) وتحليل إثراء موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) (الشكل 4 د) أن تأثير ACT كان متورطًا في مسار إشارات NF-B. تم تأكيد مجموعة الجينات المرتبطة بمسار إشارات NF-B بشكل أكبر وتأثر استتبابها بالتأكيد بواسطة LPS. كما هو متوقع ، أثر ACT بشكل كبير على تعبيراتهم (الشكل 4 هـ). يعد مسار إشارات NF-B مسارًا كلاسيكيًا لتنظيم تقدم الالتهاب ، مما يؤدي في النهاية إلى إطلاق العوامل المؤيدة للالتهاب. للحصول على دعم ميكانيكي ، تم تقييم بروتين رئيسي لمسار إشارات NF-B عن طريق تحليل لطخة غربية. أدى تحفيز LPS إلى تنشيط NF- B ، المرتبط بتعزيز استقطاب M1. تمشيا مع تحليل RNA-seq ، يمنع ACT فسفرة NF-B المحفزة LPS (الشكل 4f). لذلك ، خفف ACT من استقطاب M1 الناجم عن LPS عبر مسار إشارات NF- B في خلايا BV -2.

يؤثر ACT على تخليق الأرجينين الحيوي وكذلك البانتوثينات والتخليق الحيوي لأكسيد الكربون في خلايا BV -2 المستحثة بـ LPS

أظهر RNA-seq أن المسارات المتأثرة بـ ACT تضمنت أيضًا التخليق الحيوي للأرجينين (Arg) بالإضافة إلى التخليق الحيوي للبانتوثينات و CoA (الشكل 4 د). وقد تم اقتراح أن تحفيز LPS يسبب اضطرابات استقلاب الخلايا المرتبطة بـ BV -2 المرتبطة باستقطاب M1 [14]. وبالتالي ، تم استخدام مستقلب الخلية غير المستهدف بواسطة HPLC-Q-TOF-MS لتحديد تأثير ACT على استقلاب الخلية. أوضح PCA (الشكل 5 أ) و PLS-DA (الشكل 5 ب) أن مجموعات التحكم و LPS و ACT يمكن تمييزها جيدًا بناءً على المستقلبات داخل الخلايا. تم تغيير مستويات المستقلبات المختلفة في خلايا BV -2 التي يسببها LPS بعد علاج ACT (الشكل 5 ج). بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، كان هناك 11 مستقلبًا تم تغييره بشكل كبير في مجموعة LPS (الجدول S2 ، انظر الملف الإضافي 2). في حين تم تغيير 14 مستقلبًا بشكل واضح بعد علاج ACT (الجدول S3 ، انظر إضافي 3) ، بما في ذلك 11 مسارًا أيضيًا (الشكل 5 د). يتكون تأثير ACT بشكل أساسي من تنظيم استقلاب الأحماض الأمينية (فينيل ألانين ، التيروزين ، والتركيب الحيوي للتربتوفان ، استقلاب D-Glutamine و D-glutamate ، تخليق Arg الحيوي ، استقلاب فينيل ألانين) ، استقلاب النيوكليوتيدات (استقلاب البيورين ، استقلاب بيريميدين للطاقة) التمثيل الغذائي) ، وكذلك استقلاب العوامل المساعدة والفيتامينات (البانتوثينات والتخليق الحيوي CoA). ومن المثير للاهتمام ، أن المسارات الأيضية التي تم الحصول عليها بواسطة المستقلب كانت متوافقة مع RNA-seq ، بما في ذلك التخليق الحيوي Arg وكذلك التخليق الحيوي للبانتوثينات و CoA. أظهر ما ورد أعلاه أن ACT يمكن أن ينظم تخليق Arg الحيوي وكذلك البانتوثينات والتخليق الحيوي CoA في خلايا BV المحفزة بـ LPS -2.

فعل الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا الناجم عن Lps -2

الميتوكوندريا هي في صميم المسارات الأيضية. يتطور الدليل على أن الميتوكوندريا تلعب دورًا رئيسيًا في استقطاب الدبقية الصغيرة M1 / ​​M2. أظهرت الأبحاث السابقة أن LPS يمكن أن يسبب خللًا وظيفيًا في الميتوكوندريا. تم الحكم على نظرة عامة على حالة الميتوكوندريا في التشكل وتوزيع الخلايا بواسطة TEM. بعد تحفيز LPS ، أظهرت خلايا BV -2 تكاثف نواة الكروماتين ، وانخفاض السيتوبلازم ، وكذلك عدد أقل من الميتوكوندريا (الشكل 6 أ). بالإضافة إلى ذلك ، تم إلغاء ترتيب كرستيات الميتوكوندريا الخاصة بمجموعة LPS أو حتى اختفائها ، مما أظهر انحلالًا جزئيًا ، وحجمًا صغيرًا ، وتشكلًا مستديرًا. ومن المثير للاهتمام ، أن علاج ACT يمكن أن يخفف من التغيرات المورفولوجية التي يسببها LPS في الميتوكوندريا. بالتناوب ، قمنا بفحص وظيفة الميتوكوندريا لخلايا BV المعالجة بـ LPS -2 ، بما في ذلك MMP ، وإنتاج ATP في الميتوكوندريا. تم تحسين إنتاج MMP (الشكل 6 ب ، 6 ج) وإنتاج ATP في الميتوكوندريا (الشكل 6 د) بشكل كبير في الخلايا المعالجة باستخدام ACT مقارنة بتلك الموجودة في مجموعة LPS. قد يكون الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا مرتبطًا بزيادة مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلية. كشف تحليل التدفق الخلوي أن محتويات ROS كانت محملة بشكل زائد في مجموعة LPS (الشكل 6 هـ ، 6 و). لحسن الحظ ، قضى ACT على ROS المفرط. يقترح أن ACT قد يعيد وظيفة الميتوكوندريا عن طريق مسح ROS.

استعادة وظيفة الميتوكوندريا ACT من خلال تنظيم PGC -1 و UCP -2

يلعب المنشط المشترك لمستقبلات البيروكسيسوم التكاثري -1 (PGC -1) دورًا مهمًا في التكوُّن الحيوي للميتوكوندريا[15]. أدى تحفيز LPS إلى تقليل التعبير عن PGC -1 ، مما أدى إلى خلل في الميتوكوندريا. بشكل ملحوظ ، تم عكس جين PGC -1 الجين mRNA وتعبير البروتين بشكل ملحوظ عن طريق العلاج ACT في خلايا BV المعالجة بـ LPS -2 (الشكل 7 أ). كان من المعروف أيضًا أن بروتين فصل الميتوكوندريا -2 (UCP -2) ينظم وظائف الميتوكوندريا. باعتباره بروتينًا مصبًا لـ PGC -1 ، يمكنه التحكم في إزالة استقطاب MMP الناجم عن LPS وإنتاج ROS. تشير التقارير الأخيرة إلى أنها أساسية في عملية التنشيط الدبقي الدبقي ، مع التنظيم المعاكس لاستقطاب M1 و M2[16]. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن مستوى بروتين UCP -2 انخفض بعد تحفيز LPS. يمكن أن تؤدي المعالجة المشتركة لـ LPS و ACT إلى تنظيم تعبير UCP -2 مقارنةً بمعالجة LPS. أظهر مستوى تعبير mRNA لـ UCP -2 أيضًا تغييرات مماثلة (الشكل 7 ب). مجتمعة ، استعاد ACT وظيفة الميتوكوندريا من خلال تنظيم PGC -1 و UCP -2.

استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة M1 المكبوتة ACT من خلال استعادة وظيفة الميتوكوندريا عبر تنشيط AMPK

يلعب بروتين كيناز AMP المنشط (AMPK) ، باعتباره مستشعر الطاقة الخلوية الرئيسي ، دورًا مهمًا في الحفاظ على توازن التمثيل الغذائي للخلايا. في نفس الوقت ، PGC -1 هو بروتين مصب لـ AMPK. كشفت النتائج أن LPS يثبط تنشيط AMPK ، مما أدى إلى اضطرابات التمثيل الغذائي للخلايا وخلل في الميتوكوندريا. من الجدير بالذكر أن ACT يمكن أن يزيد من التعبير البروتيني لـ p-AMPK اعتمادًا على الجرعة (الشكل 8 أ). يُقترح أن يزيد ACT من تعبير PGC -1 ويستعيد وظيفة الميتوكوندريا عن طريق تنشيط مسار إشارات AMPK. في هذه الدراسة ، للتحقق مما إذا كان تنشيط AMPK قد ساهم في التأثير التنظيمي لـ ACT على استقطاب M1 / ​​M2 ، تم استخدام المركب C (CC) لتثبيط تأثير AMPK. على عكس مستوى NO الخاضع للتنظيم في مجموعة علاج ACT ، منع CC جزئيًا تأثير ACT على مستوى NO (الشكل 8 د). بناءً على هذه النتائج ، يمكن لـ ACT تنظيم استقطاب M1 / ​​M2 لخلايا BV -2 عن طريق تنشيط AMPK.

رابطة ACT إلى NF-B وتثبيطها وكذلك AMPK المنشط

تم تطبيق الالتحام الجزيئي لتأكيد ما إذا كان ACT يرتبط ببروتينات NF-B و AMPK. أظهرت النتائج أن طاقة الربط لـ ACT و NF- B كانت - 8.4 كيلو كالوري / مول ، أي من ACT و AMPK كانت - 10.8 كيلو كالوري / مول. تحققت جهات مهمة من أن ACT مرتبط مباشرة بـ NF-B و AMPK (الشكل 9). بعد ذلك ، تم استكشاف أوضاع الربط المحتملة والتفاعلات داخل جيب الأحماض الأمينية ، بما في ذلك Phe A146 و Pro A147 و Asn A240 و Leu A236 و Arg A232 و A183 و Arg A239 و Glu A179 و Cys A149 و Tyr A227 من NF -κB (الشكل 9 ج) بالإضافة إلى Phe A213 و Gly A481 و Ala A370 و Leu A482 و Arg A212 و Ile A369 و Arg A106 و Phe A215 و Phe A108 و Thr A309 و Ser A119 و Thr A224 من AMPK (الشكل . 9f). أشارت هذه النتائج إلى أن ACT قد يؤثر بشكل مباشر على NF-B و AMPK لتخفيف استقطاب BV -2 الخلايا الدبقية الصغيرة M1 وتعزيز النمط الظاهري M2.