أوليجوجليكوزيدات فينيلثانويد أكيلاتيد مع نشاط وقائي للكبد من نبات الصحراء سيستانش توبولوسا

لمزيد من المعلومات: Ali.ma@wecistanche.com

توشيو موريكاوا وآخرون

الملخص

المستخلص الميثانولي من السيقان الطازجةCistanche tubulosaتم العثور على (Orobanchaceae) لإظهار تأثيرات واقية للكبد ضد D-galactosamine (D-GalN) / ​​عديد السكاريد الدهني (LPS) الناجم عن إصابة الكبد في الفئران. من خلاصة ثلاث جديدةفينيليثانويدتم عزل oligoglycosides و kankanosides H1 (1) و H2 (2) و I (3) مع 16جليكوسيدات فينيلثانويد(4–19) واثنين من السكريات الصغيرة (20،21). تم تحديد هياكل 1-3 على أساس الخصائص الطيفية بالإضافة إلى الأدلة الكيميائية. من بين العزلات ، إشنكوسايد (4 ، IC 50=10. 2 لتر) ، أكتيوسيد (5 ، 4.6 لتر) ، أيزوكتيوسيد (6،5.3 لتر) ، 20- أسيتيل لاكتوسيد (8 ، 4.8 لتر) ، وتوبولوسيد يمنع A (10 ، 8.6 lM) الموت الناجم عن D-GalN من خلايا الكبد. هذه العزلات الخمس ، 4 (31.1 لترًا) ، 5 (17.8 لترًا) ، 6 (22.7 لترًا) ، 8 (25.7 لترًا) ، و 10 (23.2 لترًا) ، وسيستانتوبولوسيد B1 (11 ، 21.4 لترًا) قللت أيضًا من عامل نخر الورم- a- المستحثة السمية الخلوية في خلايا L929. علاوة على ذلك ، أظهرت المكونات الرئيسية (4-6) تأثيرات وقائية للكبد في الجسم الحي بجرعات 25-100 مجم / كجم ، PO.

انقر لتشويه الآثار الجانبية ومنتجات Cistanche

1 المقدمة

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) هو نبات طفيلي معمر ينمو على جذور Salvadora أو Calotropisspecies ، وينتشر في شمال إفريقيا والجزيرة العربية والدول الآسيوية.Cistanche tubulosaبالإضافة إلى السالسا المساعدة والكيستانش الصحراوي الذي تم استخدامه تقليديًا لعلاج العجز الجنسي والعقم وألم الظهر وضعف الجسم بالإضافة إلى عامل محفز للدورة الدموية.فينيليثانويدتم عزل s و iridoids و monoterpenes و lignans من الصين وباكستانCistanche tubulosa.2،4-9 في سياق دراسات التوصيف التي أجريناها على المكونات النشطة بيولوجيًا في هذا الطب الطبيعي ، أبلغنا سابقًا أن خمسة إيريديويد ، كانكانوسيدات A-D و kankanol ، وهو monoterpeneglycoside ، kankanoside E ، اثنانفينيليثانويدتم عزل oligoglycosides ، و kankanosides F و G (23) ، و oligo sugar acylated ، kankanose (21) ، من المستخلص الميثانولي للسيقان المجففةCistanche tubulosa.10،11 بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على المستخلص الميثانولي والعديد من العزلات مثل إشنكوسايد (4) ، أكتيوسيد (5) ، سيستانوسيد F (20) ، 21 ، وكانكانوسيد F تأثيرًا مثبطًا ضد الانقباضات المستحثة. بواسطة النورأدرينالين في الشريان الأورطي الصدري للجرذان المعزول.كانت أنابيب Cistancheوجد أنه يُظهر تأثيرًا وقائيًا على إصابة الكبد التي يسببها D-galactosamine (D-GalN) / ​​عديد السكاريد الدهني (LPS) في الفئران. من المستخلص الميثانولي ، قمنا بعزل ثلاثة أنواع جديدةفينيليثانويدoligoglycosides المسمى kankanosides H1 (1) ، H2 (2) ، و I (3) مع 16 جليكوسيدات فينيل إيثانويد (4-19) واثنين من أوليغوسوغار (20 ، 21). تتناول هذه الورقة العزلة والتوضيح البنيوي لهذه الجديدةفينيليثانويدoligoglycosides (1-3). تمت أيضًا مناقشة المتطلبات الهيكلية للجليكوزيدات الفينيثانويد للنشاط الوقائي للكبد (الشكل 1).

2. النتائج والمناقشة

2.1. التأثير الوقائي للمستخلص الميثانولي من السيقانCistanche tubulosaعلى إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS في الفئران

ينبع الطازجةCistanche tubulosa(المزروعة في أورومتشي ، مقاطعة شينجيانغ ، الصين) تم استخلاصها باستخدام الميثانول تحت الارتجاع باستخدام مستخلص ميثانولي (8.36 بالمائة من السيقان الطازجة). كما هو مبين في الجدول 1 ، عند جرعات من 250-500 مجم / كجم ، PO ، أظهر المستخلص الميثانولي تأثيرًا مثبطًا على الزيادة في مصل الأسبارتات أمين الترانساميناز (sAST) والألانين أمينوترانساميناز (sALT) ، علامات إصابة الكبد ، التي يسببها D- GalN / LPS في الفئران.

2.2. المكونات الكيميائية من ينبعCistanche tubulosa

مستخلص ميثانولي من السيقان الطازجةCistanche tubulosaتعرض لـ Diaion HP -20 عمود كروماتوجرافي (H2O؟ MeOH) لإعطاء كسور H2O- و MeOH (5.63 بالمائة و 2.73 بالمائة على التوالي). تعرض جزء MeOH-eluted لـ SiO2 و ODScolumn chromatographies وأخيراً HPLC لتقديم ثلاثةفينيليثانويدoligoglycosides و kankanosides H1 (1 ، 0. 0 0 08 بالمائة) ، H2 (2 ، 0.0001 بالمائة) ، وأنا (3 ، 0.0007 بالمائة) جنبًا إلى جنب مع 16جليكوسيدات فينيلثانويد، echinacoside2،11 (4، 0. 45٪)، acteoside2،11 (5، 0. 28٪)، isoacteoside2،11 (6، 0. 0 41 بالمائة) ، cis-acteoside12،13 (7، 0. 0 0 0 7 بالمائة) ، 20- acetylacteoside2،11 (8، {{ 42}}. 0 {{5 0} 38 بالمائة) ، decaffeoylacteoside14 (9 ، 0. 0 0 0 2 بالمائة ) ، والجانب tubulo A2،11 (1 0 ، 0. 013 بالمائة) ، cistantubulosides B19 (11 ، 0.0020 بالمائة) ، B29 (12،0.0003 بالمائة) ، arenarioside15 (13 ، 0.0006 بالمائة) ، wiedemanninoside C16 (14،0.0008 بالمائة) ، cistantubuloside A9 (15 ، 0.0009 بالمائة) ، syringalide A 30- OaL rhamnopyranoside4 (16 ، 0.0017 بالمائة) ، campneosides I17،18 (17،0.015 بالمائة) و ​​II17،18 (18 ، 0.0005 في المائة) ، وساليدروسايد 11 (19 ، 0.0027 في المائة) ، واثنان من السكريات الصغيرة ، السيانوزيد F11 (20 ، 0.0004 في المائة) والكانكانوز 11 (21 ، 0.0004 في المائة).

2.3 هياكل kankanosides H1 (1) ، H2 (2) ، و I (3)

تم الحصول على Kankanoside H1 (1) كمسحوق أبيض مع دوران بصري سلبي (½a -24 D -45. 3 في MeOH). أظهر طيف الأشعة تحت الحمراء نطاقات الامتصاص في 3416 و 1736 و 1638 و 16 0 5 و 1518 و 1 {{1 0 7}} 70 و 1040 سم 1 التي تُنسب إلى الهيدروكسيل وكربونيل الإستر ووظائف الأثير ، وحلقات عطرية. أظهر طيف FABMS الموجب والسالب لـ 1 قمم أيونات شبه جزيئية عند m / z 835 (M plus Na) plus و m / z 811 (MH) ، على التوالي ، وتم تحديد الصيغة الجزيئية على أنها C37H48O20 بواسطة دقة عالية موجبة- قياس الأيونات FABMS. أظهر أطياف 1H و 13 C NMR للعدد 1 (CD3OD ، الجدولان 2 و 3) ، اللذان تم تعيينهما بواسطة تجارب NMR المختلفة ، 19 إشارات يمكن تخصيصها لمثيلين اثنين [d 2.70 (2H ، m ، H 2-7) ، 3.66 ، 4.07 (1H لكل منهما ، كلاهما m ، H 2-8)] ، البروتونات العطرية من النوع ABC المقترنة بين العمود الفقري والعرق [d 6.52 (1H، dd، J=1. 8،7.8 Hz، H { {50}}) ، 6.65 (1H ، d ، J=1. 8 هرتز ، ارتفاع -2) ، 6.67 (1H ، d ، J=7. 8 هرتز ، H {{62) }})] ، شقان bD-glucopyranosyl [d 4.29 (1H، d، J=7. 8 Hz، terminal-Glc-H -1)، 4.54 (1H، d، J {{76) }}. 2 Hz، inner-Glc-H -1)] ، وجزء aa-L-rhamnopyranosyl [d 1.06 (3H، d، J=6. 0 Hz، Rha-H {{89 }}) ، 4.80 (1H، br s، Rha-H -1)] مع مجموعة أسيتيل [d 1.98 (3H، s)] ومجموعة trans-p-coumaroyl {an trans-olefin [d 6.34.7.67 (1H لكل منهما ، كلاهما d ، J=16. 0 هرتز ، H -8 و 7)] ونوع البروتونات العطرية المقترنة أورثو A2B 2- [اليوم 6.80 ، 7.46 (2 ساعة لكل منهما ، كلاهما d ، J=8. 7 هرتز ، H -3 ، 5 و 2،6)]}. تم تمييز الروابط بين شقوق oligoglycoside و acyl في 1 من خلال تجربة HMBC ، والتي أظهرت ارتباطات طويلة المدى بين أزواج البروتون والكربون التالية: In-Glc-H -1 و C -8 (dC71.9) ) ؛ interior-Glc-H -2 [d 4.88 (1H، dd-like)] و acetyl carbonylcarbon (dC 171.4) ؛ interior-Glc-H -4 [d 5.08 (1H، dd، J=9. 6، 9.6 Hz)] و p-coumaroyl carbonyl carbon (dC 168.2) ؛ Rha-H -1 و inner-Glc-C -3 (تيار مستمر 80.5) ؛ و terminal-Glc-H -1 و inner-Glc-C -6 (dC69.3) (الشكل 2). أخيرًا ، أدى التحلل المائي القلوي لـ 1 مع 5 في المائة من هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) إلى تحرير حمض ترانس-ب-كوماريك ، والذي تم تحديده بواسطة تحليل HPLC ، جنبًا إلى جنب مع منتج منزوع الأكل. تمت معالجة المنتج المتسيل على التوالي باستخدام 1.0 مولار من حمض الهيدروكلوريك (HCl) لتحرير L-rhamnose و D-glucose ، والتي تم تحديدها بواسطة تحليل HPLC باستخدام كاشف الدوران البصري .10،11 وبالتالي ، تم توضيح بنية kankanoside H1 لتكون {{181) }} (3، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل) ethyl OaL-rhamnopyranosyl - (1- 3) - [bD-glucopyranosyl - (1-6)] -2- O-acetyl {{196 }} O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).

تم عزل Kankanoside H2 (2) كمسحوق أبيض مع دوران بصري سلبي (½a 25 D 52.4 في MeOH). تم العثور على صيغته الجزيئية C37H48O2 0 لتكون مماثلة لصيغة 1 عن طريق قياس FABMS عالي الدقة للأيونات الموجبة. كانت الخصائص الطيفية لـ 2 متشابهة جدًا مع خصائص 1 ، باستثناء الإشارات الناتجة عن مجموعة cis-p-coumaroyl [d 5.79 ، 6.95 (1H لكل منهما ، كلاهما d ، J=12. 8 هرتز ، H {{ 22}} و 7) ، 6.76 ، 7.73 (2H لكل منهما ، كلاهما d ، J=8. 7 هرتز ، H -3 ، 5 و 2،6)]. علاوة على ذلك ، كشفت تجربة HMBC على 2 أيضًا أنماطًا مماثلة من الارتباطات بعيدة المدى كتلك التي تم اكتشافها لـ 1 بين أزواج البروتون والكربون التالية: inner-Glc-H -1 [d 4.51 (1H ، d ، J {{44) }}. 8 هرتز)] و C -8 (تيار مستمر 72.0) ؛ inner-Glc-H -2 [d 4.88 (1H، m)] وأسيتيل كربونيل كربون (dC 171.4) ؛ interior-Glc-H -4 [d 4.98 (1H، dd، J=9. 6، 9.7 Hz)] و p-coumaroyl carbonyl carbon (dC 166.7) ؛ Rha-H -1 [d 4.77 (1H، d، J=1. 4 Hz، Rha-H -1)] و inner-Glc-C -3 (العاصمة 80.7 ) ؛ و terminal-Glc-H -1 [d 4.28 (1H، d، J=7. 8 هرتز)] و inner-Glc-C -6 (DC 69.4) (الشكل 2) . من خلال دراسة التحلل ، أعطت 2 حمض cis-p-coumaric واثنين من السكريات نفسها التي تم الحصول عليها في حالة 1. وبالتالي ، تم توضيح بنية kankanoside H2 لتكون 2- (3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل) ethyl OaL-rhamnopyranosyl - (1-3) - [bD-glucopyranosyl - (1-6)] -2- O-acetyl -4- O-cis-p-coumaroyl- بد-غلوكوبيرانوسيد (2).

تم عزل Kankanoside I (3) أيضًا كمسحوق أبيض مع دوران بصري سلبي (a - 25 D -62. 2 في MeOH). تم تحديد صيغته الجزيئية ، C35H46O18 ، من خلال القياسات الإيجابية والسلبية لـ FABMS و HRFABMS. كانت الخواص الطيفية لـ 3 (CD3OD ، الجدولان 2 و 3) قابلة للتركيب على تلك الموجودة في echinacoside (4) ، باستثناء الإشارات الناتجة عن جزء aglycone {{two methylenes {d 2.95 (2H، dd، J=7). 3 ، 7.8 هرتز ، ارتفاع 2-7) ، [3.79 (1H ، متر) ، 4.1 0 (1H ، dt ، J=16. 9 ، 7.3 هرتز) ، H {{32} }]} ، بروتونات عطرية أحادية الاستبدال [d7.18 (1H، m، H -4) ، 7.26–7.28 (4H، m، H -2، 6، 3،5)]}}. التحلل المائي القلوي لـ 3 مع 5 في المائة من حمض الكافيين المحرر من KOH ، وتم معالجة المنتج المسكن على التوالي بـ 1.0 مولار من حمض الهيدروكلوريك لتحرير L-rhamnose و D-glucose. أخيرًا ، تم توضيح روابط مجموعة الأسيل وشرائح السكر في 3 من خلال تجربة HMBC ، كما هو موضح في الشكل 2. على أساس الأدلة المذكورة أعلاه ، تم توضيح بنية كانكانوسيد الأول لتكون 2- فينيلثيل OaL- rhamnopyranosyl - (1-3) - [bD-glucopyrano-syl - (1-6)] -4- O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranoside (3)

2.4 آثار المكونات الكيميائية من سيقان القشرة الأنبوبية على السمية الخلوية التي يسببها D-GalN في خلايا كبد الفئران الأولية المستزرعة

من المعروف أن إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS تتطور عن طريق الاستجابات المناعية .19 تم الإبلاغ عن هذا النوع من إصابة الكبد في شكلين. أولاً ، يتم زيادة الحساسية لـ TNF-a عن طريق استنفاد ofuridine triphosphate في خلايا الكبد بواسطة D-GalN. ثانيًا ، يتم إطلاق الوسطاء المؤيدين للالتهابات ، مثل NO و TNF-a ، من الضامة التي تنشط LPS (خلايا كوبفر). تم الإبلاغ عن أن موت الخلايا المبرمج للخلايا الكبدية بواسطة TNF-a يلعب دورًا مهمًا في إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS.

في دراساتنا السابقة حول المركبات الواقية للكبد من الأدوية الطبيعية ، أبلغنا أن العديد من المكونات من Hovenia Dulcis ، 21 Bupleurum scorzonerifolium ، 22،23 Curcuma zedoaria ، 24–26Angelica furcijuga، 27،28 Betula sativum، 30 Salacia reticulata، 32 Anastatic argentea hierochuntica، 33 Panax notoginseng، 34 Cyperus longus، 35 Erycibe expansa، 36 Camellia sinensis، 37 Sedum sarmentosum، 38،39 Sinocrassula indica، 40Hedychium corarium، 41 and Piper chaba 42،43 أظهروا تأثيرات وقائية للكبد على إصابة الكبد الناجمة عن D-GalN / LPS في الفئران و / أو بلاتيفيلا فار. جابونيكا ، 29 تأثير مثبط للبيزوم على السمية الخلوية التي يسببها D-GalN في خلايا الكبد الأولية المستزرعة. منذ استخراج الميثانولي من ينبعCistanche tubulosaأظهر التأثيرات الواقية للكبد على إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS في الفئران (رهان الفيديو) ، تم فحص التأثير المثبط للمكونات على السمية الخلوية المستحثة بـ D-GalN في خلايا كبد الفئران الأولية المستزرعة باستخدام 3- (4 ، { مقايسة {6}} ثنائي ميثيل ثيازول -2- يل) -2 ، 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT). كما هو موضح في الجدول 4 ، إشنكوسايد (4 ، IC 50=10. 2 لتر) ، أكتيوسيد (5 ، 4.6 لتر) ، أيزوزيد (6 ، 5.3 لتر) ، 20- أسيتيل لاكتوسيد (8 ، 4.8 لتر) ، أظهر tubulosides A (10،8.6 lM) و B11 (22 ، 14.6 lM) ، و kankanoside G11 (23 ، 14.8 lM) نشاطًا قويًا. كانت أنشطتهم أكبر من الأنشطة التجارية للسيلين (38.8 لتر) ، 33-43 كعنصر تحكم إيجابي.جليكوسيدات فينيلثانويد for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 م)] ؛ (2) أظهرت مجموعة aglycone التي تحتوي على 3 ، 4- نشاط أقوى من المجموعة التي تحتوي على مجموعة هيدروكسي 4- (6> 23) ؛ (3) أدى جزء 60- ObD-glucopyranosyl إلى تقليل النشاط (4 <5،10><8) ؛="" (4)="" أظهرت="" 8-="" جزء="" obd-glucopyranosyl="" الذي="" يحتوي="" على="" مجموعة="" o-caffeoyl="" 40-="" نشاطًا="" أقوى="" من="" مجموعة="" o-caffeoyl="" 60-="" (5="6" ،="" 8=""> 22 ) ؛ و (5) إدخال 20- O-acetylmoiety قلل من النشاط (8 5 5، 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 لتر ، البيانات غير معروضة) ، وبالتالي ، تم العثور على هذه المركبات لا تؤثر على الإنتاج الزائد لـ NO و TNF-a من الضامة التي تنشط LPS.

2.5 آثار المكونات الكيميائية على السمية الخلوية المستحثة بعامل نخر الورم في خلايا L929

من أجل توضيح تأثيرات المكونات على حساسية الخلايا الكبدية لـ TNF-a ، النقص المستحث بـ TNF-a في قابلية خلايا L929 للحياة ، خط خلية حساس لـ TNF ، تم فحص 48 باستخدام اختبار MTT. بدون عينات الاختبار ، تم تقليل صلاحية الخلية إلى كاليفورنيا. 60 في المائة بعد حضانة الخلايا مع 20 نانوغرام / مل TNF-a لمدة 44 ساعة مقارنة بالحالة بدون TNF-a. كما هو مبين في الجدول 5 ، إشنكوسايد (4 ، IC 50=31. 1 لتر) ، أكتيوسيد (5 ، 17.8 لتر) ، أيزو أسيتيوسيد (6 ، 22.7 لتر) ، 20- أسيتيل لاكتوزيد (8 ، 25.7 لتر) ، مثبط tubuloside A (1023.2 lM) و cistantubuloside B1 (11 ، 21.4 lM) انخفاض قابلية الخلية للحياة ، وتم العثور على أنشطتها أكبر من تلك الموجودة في piperine 42،43 و silybin. المتطلبات الهيكلية للجليكوسيدات فينيلثانويد for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)] ؛ و (5) إدخال جزء O-acetyl 20- قلل من النشاط (8 <5 ،="" 22=""><6). تم="" العثور="" على="" هذه="" المتطلبات="" مماثلة="" لتلك="" التي="" لوحظت="" في="" الفصل="" السابق="" فيما="" يتعلق="" بالتأثيرات="" المثبطة="" على="" السمية="" الخلوية="" التي="" يسببها="" d-galn="" في="" خلايا="" الكبد="" الأولية="" في="" الفئران="">

تشير هذه النتائج في المختبر إلى الآليات المحتملة التالية للعمل من أجل التأثير الوقائي للكبد لمكونات السيقانCistanche tubulosa: (1) تقليل السمية الخلوية المستحثة بـ D-GalN (4-6 ، 8 ، 10 ، 22 ، 23) ، و (2) تقليل السمية الخلوية المستحثة بـ TNF-a (4-6 ، 8 ، 10 ، 11) .

2.6. التأثيرات الوقائية لإشنكوسايد (4) ، أكتيوسيد (5) ، وأيزوكتيوسيد (6) ضد إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS inmice وطريقة عملها

أخيرًا ، قمنا بفحص تأثير المديرجليكوسيدات فينيلثانويد، إشنكوسايد (4) ، أكتيوسيد (5) ، و isoacteoside (6) على إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS في الفئران. كما هو مبين في الجدولين 6 و4-6 ، منع بشكل كبير زيادة sAST و sALT المحرض بواسطة D-GalN / LPS في الفئران بجرعات 25-100 مجم / كجم ، PO. من ناحية أخرى ، لم يؤثر 4-6 على الإنتاج الزائد لـ TNF-a من الضامة التي تنشط LPS. علاوة على ذلك ، منع 4-6 بشكل كبير موت خلايا L929 الناجم عن TNF-a ، مما يشير إلى انخفاض في حساسية خلايا L929 تجاه TNF-a (ما قبل الفيديو). تشير هذه النتائج إلى أن 4-6 تقلل من حساسية هذه الخلايا للسمية الخلوية المستحثة بعامل نخر الورم. تم الإبلاغ عن العديد من المركبات التي تمنع موت الخلايا الناجم عن D-GalN وإنتاج TNF-a ، ولكن هناك عدد قليل من المركبات التي تقلل بشكل انتقائي من حساسية خلايا الكبد إلى TNF-a.

في الختام ، من ينبع جديدة منCistanche tubulosa، ثلاثة جديدةجليكوسيدات فينيلثانويدو kankanosides H1 (1) و H2 (2) و I (3) مع 16 معروفًاجليكوسيدات فينيلثانويدتم عزل (4-19) و oligosugars ثنائي الاسيلات (20 ، 21). المتطلبات الهيكلية لتأثيراتها الوقائية على إصابة خلايا الكبد التي يسببها D-GalN ، والآثار الواقية للخلايا على خلايا L929 الناتجة عن TNF-a كانت على النحو التالي ؛ (1) كان جزء aglycone ضروريًا للنشاط ؛ (2) أظهرت مجموعة aglycone التي تحتوي على 3 ، 4- مجموعة ثنائي هيدروكسي نشاطًا أقوى من المجموعة التي تحتوي على مجموعة هيدروكسي 4- ؛ (3) جزء 60- ObD-glucopyranosyl قلل من النشاط ؛ (4) أظهرت 8- جزء ObD-glucopyranosyl الذي يحتوي على 40- مجموعة O-caffeoyl نشاطًا أقوى من ذلك الذي يحتوي على مجموعة O-caffeoyl 60- ؛ و (5) مقدمة لـ {{27 }} جزء O- أسيتيل قلل من النشاطجليكوسيدات فينيلثانويد، إيكيناكوسيد (4) ، أكتيوسيد (5) ، وإيزواكتوزيد (6) ، يثبط زيادة إنزيمات الصوديوم و SALT بجرعات 25-100 مجم / كجم من PO في الفئران المعالجة بـ D-GalN / LPS ، وتم اقتراح هذه التأثيرات المثبطة. يعتمد على انخفاض حساسية خلايا الكبد لعامل TNF-a. مفصلة آليات عملجليكوسيدات فينيلثانويدينبغي مزيد من الدراسة.

3. التجريبية

3.1. عام

تم استخدام الأدوات التالية للحصول على البيانات الطيفية والفيزيائية: دورات محددة ، Horiba SEPA -300 مقياس الاستقطاب الرقمي (l=5 سم) ؛ أطياف الأشعة فوق البنفسجية ، مطياف شيمادزو للأشعة فوق البنفسجية -1600 ؛ أطياف الأشعة تحت الحمراء ، مطياف شيمادزو FTIR -8100 ؛ 1H و 13 C أطياف NMR ، JEOLJNM-ECA600 (600 و 150 ميجا هرتز) و JEOL JNM-ECS400 (400 و 100 هرتز) مع رابع ميثيل سيلان كمعيار داخلي ؛ FABMS و FABMS عالي الدقة ، مقياس الكتلة JEOL JMS-SX 102A ؛ كاشف HPLC ، Shimadzu RID -10 مؤشر انكسار ، كاشف Shimadzu SPD -10 A UV-vis ، وكاشف Shodex OR -2 للدوران البصري. تم استخدام عمود HPLC ، Cosmosil 5C 18- MS-II ، و pNAP (Nacalai TesqueInc. 250 4.6 mm id) و (250 - 20 mm id) للأغراض التحليلية والتحضيرية ، على التوالي.

تم استخدام الظروف التجريبية التالية للكروماتوغرافيا: الفصل اللوني لعمود هلام السيليكا في الطور الطبيعي (CC) ، هلام السيليكا 6 0 N (Kanto Chemical Co.، Ltd، 63–21 0 شبكة ، كروية ، متعادلة ) ؛ هلام السيليكا ذو الطور العكسي CC و Diaion HP -20 (NipponRensui) و Chromatorex ODS DM1 0 20T (Fuji Silysia Chemical، Ltd، 100–200 mesh) ؛ الطور الطبيعي TLC ، ألواح TLC المطلية مسبقًا مع هلام السيليكا 60F254 (Merck ، 0.25 مم) ؛ TLC ذو المرحلة العكسية ، ألواح TLC المطلية مسبقًا مع هلام السيليكا RP -18 F254S (Merck ، 0.25 مم) ؛ HPTLC ذو المرحلة العكسية ، ألواح TLC المطلية مسبقًا مع هلام السيليكا RP -18 WF254S (Merck ، 0.25 مم) ، تم تحقيق الاكتشاف عن طريق الرش بنسبة 1 بالمائة Ce (SO4) 2-10 بالمائة H2SO4 مائي ، متبوعًا بالتسخين .

3.2 المواد النباتية

ينبع الطازجةCistanche tubulosaالمزروعة في أورومتشي ، مقاطعة شينجيانغ ، الصين تم جمعها في سبتمبر 2007. تم تحديد المواد النباتية من قبل أحد المؤلفين (MY). قسيمة المواد النباتية موجودة في ملف في مختبرنا.

3.3 الاستخراج والعزلة

ينبع الطازجة منCistanche tubulosa(2.98 كجم) تم قطعها بدقة وتم تجريفها ثلاث مرات باستخدام الميثانول تحت التدفق لمدة 3 ساعات. يوفر تبخير المذيب تحت ضغط منخفض مستخلص ميثانولي (249.1 جم ، 8.36 بالمائة). تم تعريض المستخلص الميثانولي لـ Diaion HP 2 0 CC (5. 0 kg ، H2O؟ MeOH) لإعطاء H2O- وكسور MeOH (167.84 جم ، 5.63 بالمائة و 81.21 جم ، 2.73 بالمائة ، على التوالى). تم تعريض MeOH-elutedfraction (61. 00 جم) إلى هلام السيليكا ذي الطور الطبيعي CC [1.8 كجم ، CHCl3 – MeOH – H2O (15: 3: 0. 4؟ 1 {{48} }: 3: 0. 5؟ 6: 4: 1، v / v / v)؟ MeOH] لإعطاء سبعة كسور [الأب. 1 (1.12 جم) و 2 (9.56 جم) و 3 (0. 89 جم) و 4 (1 0. 69 جم) و 5 (8.84 جم) و 6 (12.52 جم) و 7 (4.6 0 ز)]. تم فصل الكسر 2 (9.56 جم) بواسطة هلام السيليكا ذي الطور العكسي CC [4 00 جم ، MeOH – H2O (1 {{2 0 1}}: 9 0 ، v / v)؟ MeOH؟ acetone] لإعطاء خمسة كسور [Fr. 2–1 (55.9 مجم) ، 2–2 (4.48 جم) ، 2-3 (3.42 جم) ، 2–4 (1.16 جم) ، 2-5 (31.9 مجم)]. تعرض الكسر 2-3 (1. 0 0 جم) لـ HPLC [Cosmo sil 5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH مائي (7:93، v / ت)] لإعطاء سبعة كسور [الأب. 2-3-1 (66.5 مجم) ، 2-3-2 (2 0. 4 مجم) ، 2-3-3 (26. {287}} مجم) ، 2-3-4 (136.6) مجم) ، 2-3-5 (38 {{3 0 0}}. 6 مجم) ، 2-3-7 (84.9 مجم)]. تمت تنقية الكسر 2-3-4 (1 0 6.6 مجم) بشكل إضافي بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH (5:95، v / v)] لإعطاء salidroside (19،13.7 mg ، {{34 0}. 0 {{4 0 9}} 27 بالمائة). تم فصل الكسر 4 (1 0. 69 جم) بواسطة هلام السيليكا متعدد الطور CC [5 0 0 جم ، MeOH – H2O (3 0: 7 0، v / v)؟ MeOH؟ acetone] لإعطاء أربعة كسور [Fr. 4-1 (878.2 مجم) ، 4–2 (7. {554}} 6 جم) ، 4–3 (1.57 جم) ، 4–4 (792.8 مجم)]. تعرض الجزء 4–2 (1.5 {{56 {565}}} جم) لـ HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II، CH3CN - 1٪ AcOH مائي (2 {{57 {{586}) }}}: 8 0، v / v)] لإعطاء خمسة كسور {الأب. 4–2–1 (42.9 مجم) ، 4–2–2 [= campneoside I (17 ، 67. 0 مجم ، 0. 014٪)] ، 4–2– 3 [= أكتيوسيد (5 ، 1.21 جم ، 0.26 بالمائة)] ، 4–2–4 (41.6 مجم) ، 4–2–5 (181.3 مجم)}. تمت تنقية الجزء 4-2-4 (41.6 مجم) بشكل إضافي بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (18:82 ، حجم / حجم)] لإعطاء isoacteoside (6 ، 19.1 مجم ، 0.0040 بالمائة) و ​​cis-acteoside (7،3.4 مجم ، 0.0007 بالمائة). تمت تنقية الجزء 4–3 (1.57 جم) بواسطة HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH (20:80، v / v)] لإعطاء 11 كسورًا [الأب. 4–3–1 (30.4 مجم) ، 4–3–2 (55.2 مجم) ، 4–3–3 (= 17 ، 22.1 مجم ، 0.0010 بالمائة) ، 4–3–4 (= 5 ، 224.6 مجم ، 0.010 بالمائة) ، 4–3–5 (27.4 مجم) ، 4–3–6 (43.6 مجم) ، 4–3–7 (= 6 ، 825.0 مجم ، 0.037 بالمائة) ، 3-4-3 –8 [= syringa lide A 30- OaL-rhamnopyranoside (16 ، 37.6 مجم ، 0.0017 بالمائة)] ، 4–3–9 (39.8 مجم) ، 4–3–10 [{{310} } acetylacteoside (8 ، 85.4 مجم ، 0.0038٪)] ، 4–3-11 (64.6 مجم)]. تمت تنقية الكسر 4-3-6 (43.6 مجم) بشكل إضافي بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (18: 82 ، حجم / حجم)] لإعطاء kankanosides H1 (1 ، 17.0 مجم ، 0.0008 بالمائة) و H2 (2.3.3 مجم ، 0.0001 بالمائة). تمت تنقية الجزء 4–3–9 (39.8 مجم) بشكل إضافي بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (18:82 ، حجم / حجم)] لإعطاء kankanoside I (3 ، 15.4 مجم ، 0.0007 بالمائة) و ​​6 ( 3.1 مجم ، 0.0001 بالمائة) تم فصل الكسر 5 (8.84 جم) بواسطة هلام السيليكا ذو الطور العكسي CC [400 جم ، MeOH – H2O (20: 80-30: 70، v / v)؟ MeOH؟ acetone] togive سبعة كسور [الاب. 5-1 (870.2 مجم) ، 5-2 (478.9 مجم) ، 5–3 (3.72 جم) ، 5-4 (979.9 مجم) ، 5-5 (1.19 جم) ، 5-6 (1.27 جم) ، 5 –7 (130.1 مجم)]. تمت تنقية الجزء 5-1 (870.2 مجم) بواسطة HPLC [Cos mosilpNAP، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (5:95 ، حجم / حجم)] لإعطاء ديكافوي لاكتوزيد (9 ، 5.1 مجم ، 0.0002 بالمائة) وسيستانوسيد F ( 20 ، 8.1 مجم ، 0.0004 بالمائة). تمت تنقية الجزء 5-3 (3.72 جم) بواسطة HPLC [Cosmosil5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH (15:85، v / v)] لإعطاء ستة أجزاء [الأب. 5–3–1 (128.6 مجم) ، 5–3–2 [= كانكانوز (21 ، 9.4 مجم ، 0.0004 بالمائة)] ، 5–3–3 (64.6 مجم) ، 5–3–4 (72.3) ملغ) ، 5-3-5 [= جانب إيكيناكو (4 ، 2.54 جم ، 0.11 بالمائة) ، و5-3-6 (318.5 مجم)]. تمت تنقية الجزء 5-3-4 (72.3 مجم) بشكل إضافي بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (10:90 ، حجم / حجم)] لإعطاء campneoside II (18.10.6 مجم ، 0.0005 بالمائة). تمت تنقية الجزء 5-4 (979.9 مجم) بواسطة HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH (15:85، v / v)] لأجزاء معينة [الأب. 5-4-1 (28.6 مجم) ، 5-4-2 (90.5 مجم) ، 5-4-3 (99.7 مجم) ، 5-4-4 (= 4 ، 25.7 مجم ، 0.0012 بالمائة) ، 5 –4–5 (16.4 مجم) ، 5–4–6 (318.5 مجم) ، 5–4–7 (21.6 مجم) ، 5–4–8 (= 5 ، 204.4 مجم ، 0.0091٪) ، 5– 4-9 (134.7 مجم)]. تمت تنقية الجزء 5-4-6 (318.5 مجم) بواسطة HPLC [Cosmosil pNAP، CH3CN – 1٪ AcOH (15:85، v / v)] لإعطاء cistantubulosides B1 (11 ، 44.9 مجم ، 0.0020 بالمائة) ، B2 (12 ، 7.6 مجم ، 0.0003 بالمائة) ، و A (15 ، 21.1 مجم ، 0.0009 بالمائة) و ​​wiedemanninoside C (14 ، 17.2 مجم ، 0.0008 بالمائة). تمت تنقية الجزء 5-5 (1.19 جم) بواسطة HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH مائي (18:82 ، حجم / حجم)] لإعطاء tubuloside A (10 ، 300.3 مجم ، 0.013 بالمائة) و ​​arenarioside (13.5.8 مجم ، 0.0006 بالمائة). تم فصل الكسر 6 (12.52 جم) بواسطة هلام السيليكا ذو الطور المعكوس CC [600 جم ، MeOH – H2O (20: 80 30: 70 ، v / v) MeOH أسيتون] لإعطاء أربعة كسور [Fr. 6-1 (553.8 مجم) ، 6-2 (10.69 جم) ، 6–3 (1.40 جم) ، 6-4 (17.8 مجم)]. تمت تنقية الجزء 6-2 (500.0 مجم) بواسطة HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II، CH3CN – 1٪ AcOH المائي (25:75 ، حجم / حجم)] لإعطاء 4 (353.1 مجم ، 0.34 بالمائة ).

3.3.1. كانكانوسيد اتش 1 (1)

مسحوق أبيض ، ½a - 24 D -45. 3 (c 1.06 ، MeOH). الأيونات الموجبة عالية الدقة FABMS: Calcd لـ C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835.2637. الأشعة فوق البنفسجية [MeOH ، نانومتر (سجل البريد)]: 226 (4.33) ، 293 (ش ، 4.36) ، 317 (4.52). IR (KBr): 3416 ، 1736 ، 1638 ، 1605 ، 1518 ، 10701044 سم -1. 1H NMR (600 MHz، CD3OD) d: مذكور في الجدول 2. 13CNMR (150 MHz، CD3OD) dC: يرد في الجدول 3. أيون موجب FABMS: m / z 835 (M plus Na) زائد. الأيونات السالبة FABMS: m / z 811 (MH) -.

3.3.2. كانكانوسيد

H2 (2) مسحوق أبيض ، ½a - 25 D -52. 4 (ج 0. 27 ، MeOH). الأيونات الموجبة عالية الدقة FABMS: Calcd لـ C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835.2637. تم العثور عليها: 835.2644. الأشعة فوق البنفسجية [MeOH ، نانومتر (سجل البريد)]: 228 (4.26) ، 290 (ش ، 4.22) ، 316 (4.37). IR (KBr): 3420 ، 1717 ، 1638 ، 1605 ، 1508 ، 1159 ، 1067 سم -1. 1H NMR (600 MHz، CD3OD) d: الوارد في الجدول 2. 13C NMR (150 MHz، CD3OD) dC: يرد في الجدول 3. الأيونات الموجبة FABMS: m / z 835 (M plus Na) بالإضافة إلى الأيونات السالبة FABMS : m / z 811 (MH) -.

3.3.3. كانكانوسيد أنا (3)

مسحوق أبيض ، ½a -25 D -62. 2 (ك 1. 00 ، MeOH). الأيونات الموجبة عالية الدقة FABMS: Calcd لـ C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777.2581 ، وجدت: 777.2585. الأشعة فوق البنفسجية [MeOH، nm (log e)]: 246 (3.97)، 295 (sh، 4.04)، 334 (4.23). IR (KBr): 3415 ، 1717 ، 1647 ، 1603 ، 1508 ، 10701046 سم -1. 1H NMR (600 MHz، CD3OD) d: معطى في الجدول 2. 13CNMR (150 MHz، CD3OD) dC: يرد في الجدول 3. أيون موجب FABMS: m / z 777 (M plus Na) زائد. الأيونات السالبة FABMS: m / z 753 (MH) -.

3.4. التحلل المائي القلوي والحمضي من 1-3

تم تقليب محاليل من 1 و 2 و 3 (كل 1.5 مجم) في 5 بالمائة من هيدروكسيد البوتاسيوم المائي (KOH ، 0. 5 مل) عند 4 0 درجة لمدة ساعة واحدة. تم تحييد كل محلول باستخدام Dowex HCR W2 (شكل H زائد) ، وتمت إزالة الراتنجات عن طريق الترشيح. أسفر تبخير المذيب تحت ضغط منخفض عن المنتجات المطابقة للآلات التي تم إخضاعها لتحليل HPLC [العمود: Cosmosil pNAP، 250 - 4. 6 mm id؛ المرحلة المتنقلة: CH3CN - 1 في المائة AcOH مائي (15:85 ، ت / ت) ؛ الكشف: الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) ؛ معدل التدفق: 1. يتم تحديد 0 مل / دقيقة] على أنه حمض ترانس كافيك (tR 9.9 دقيقة من 3) ، وحمض ترانس-ف-كوماريك (tR 17.1 دقيقة من 1) ، وحمض الكوماريك cis-p-coumaric (tR17.8 دقيقة من 2) ، على التوالي. ثم تم إذابة كل منها في 1. 0 MHCl (1. 0 مل) وتسخينها عند 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد تبريده ، تم تحييد خليط التفاعل باستخدام Amberlite IRA -400 (شكل OH) ، وتمت إزالة الراتنجات عن طريق الترشيح. بعد إزالة المذيب تحت ضغط منخفض ، تم فصل البقايا بواسطة عمود خرطوشة Sep-Pak C18 (H2O؟ MeOH). تعرض H2O-elutedfraction لتحليل HPLC في ظل الظروف التالية: عمود HPLC ، Kaseisorb LC NH 2-60-5 ، معرف 4.6 ملم - 250 ملم (Tokyo Kasei Co.، Ltd ، طوكيو ، اليابان) ؛ الكشف ، الدوران البصري [Shodex OR -2 (Showa Denko Co.، Ltd ، طوكيو ، اليابان) ؛ المرحلة المتنقلة ، CH3CN-H2O (85:15 ، ت / ت) ؛ معدل التدفق 0.8 مل / دقيقة]. تم إجراء تحديد L-rhamnose (i) و D-glucose (ii) المحررة من 1 أو 2 أو 3 في جزء H2O-eluted من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ بها والدوران البصري مع تلك العينات الأصلية [i ، tR 9.9 دقيقة (سلبي)] و [ii ، tR 17.9 min (إيجابي)].

3.5 المقايسة الحيوية

3.5.1. الكواشف

تم شراء LPS (من Salmonella enteritidis) والوسط الأساسي الأدنى (MEM) ووسط William's E من Sigma-Aldrich Chemical (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ مصل بقري الجنين (FBS) كان من Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ وغيرها من المواد الكيميائية من Wako Pure Chemical Industries، Co.، Ltd (أوساكا ، اليابان). 96- تم شراء الألواح الدقيقة للآبار من شركة Sumitomo Bakelite Co.، Ltd (طوكيو ، اليابان).

3.5.2. الحيوانات

تم شراء الفئران الذكور ddY من Kiwa Laboratory AnimalCo. ، Ltd ، (واكاياما ، اليابان). تم إيواء الحيوانات عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 23 ± 2 درجة مئوية وتم تغذيتها بمختبر قياسي (MF ، Oriental Yeast Co. ، Ltd ، طوكيو ، اليابان). تم إجراء جميع التجارب على فئران واعية ما لم تتم الإشارة إلى غير ذلك. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أبحاث الحيوانات التجريبية بجامعة كينكي.

3.5.3. التأثيرات الوقائية على إصابة الكبد التي يسببها D-GalN / LPS في الفئران

تم تعديل الطريقة التي وصفها Tiegs وآخرون واستخدامها في هذه التجربة. باختصار ، ذكور الفئران التي تزن حوالي 25-30 غم لمدة 20 ساعة قبل التجربة. تم حقن D-GalN (350 مجم / كجم) و LPS (10 lg / kg) المذابة في محلول ملحي داخل الصفاق لإحداث إصابة في الكبد. أعطيت كل عينة اختبار شفويا 1 ساعة قبل حقن D-GalN / LPS. تم جمع عينات الدم من الضفيرة الوريدية تحت الحجاج بعد 10 ساعات من حقن D-GalN / LPS. تم تحديد مستويات SAST و SALT باستخدام طريقة Reitman-Frankel (المجموعة التجارية ، Transaminase CII-Test Wako ، Wako Pure ChemicalIndustries، Co.، Ltd). تم استخدام الهيدروكورتيزون كمرجع مركب. تم تعليق عينات الاختبار بمحلول الصمغ العربي بنسبة 5 في المائة ، وتم إعطاء المحلول عن طريق الفم عند 10 مل / كجم في كل تجربة ، بينما تم إعطاء السيارة عن طريق الفم عند 10 مل / كجم في مجموعة التحكم في لفائف الكور.

3.5.4. التأثيرات الوقائية على السمية الخلوية التي يسببها D-GalN خلايا كبد الفئران المستزرعة الأولية

تم تحديد التأثير الواقي للكبد للمكونات بواسطة {0}} (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT ) المقايسة اللونية باستخدام الخلايا الكبدية الأولية للفئران المستزرعة من 33 إلى 43 خلية كبدية تم عزلها من الفئران المريضة (30-35 جم) بواسطة طريقة نضح كولاجيناز. تم تلقيح معلق خلية في 4 - 104 خلية في 100 لتر من وسط William's E يحتوي على FBS (10 بالمائة) ، والبنسلين G (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100lg / mL) في 96- صفيحة ميكروية جيدة و مزروعة مسبقًا لمدة 4 ساعات عند 37 درجة تحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 في المائة. تمت إضافة الوسط بـ 100 لتر من الوسط الطازج المحتوي على D-GalN (2 ملي مولار) مع أو بدون عينة الاختبار وتم زراعة خلايا الكبد لمدة 44 ساعة. تم تبادل الوسط مع 100 لتر من الوسط الطازج ، وأضيف 10 لتر من MTT [5 مجم / مل في محلول ملحي فوسفاتي (PBS)] إلى الوسط. بعد 4 ساعات من الحضانة ، تمت إزالة الوسيط ، ثم تمت إضافة 100 لتر من الأيزوبروبانول المحتوي على 0.04 مولار من حمض الهيدروكلوريك لإذابة الفورمازان المنتج في الخلايا. تم قياس الكثافة الضوئية (OD) لمحلول فورمازانس بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 570 نانومتر (المرجع: 655 نانومتر). تم الحصول على التثبيط (في المائة) بالصيغة التالية.

تثبيط (نسبة مئوية)=[(OD (عينة) - OD (تحكم)) / (OD (عادي) -OD (تحكم))] × 100

3.5.5. التأثيرات على إنتاج NO في الضامة البريتونية المحفزة بـ LPS

تم إجراء اختبار فحص لعدم وجود إنتاج باستخدام الضامة البريتونية التي يسببها الماوس TGC كما هو موضح سابقًا.

3.5.6. التأثيرات على إنتاج TNF-a في الضامة البريتونية المحفزة بـ LPS

تم تحديد TNF-a الذي تم إصداره في الوسط كما هو موضح سابقًا مع تعديل طفيف. باختصار ، تم جمع الضامة البريتونية المستحثة بواسطة TGC (5 - 105 خلايا / بئر) من التجاويف البريتونية لفئران ddY الذكور ، معلقة في 1 0 0 Lof RPMI 1640 مكمل بـ 5 بالمائة FBS ، بنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 lg / mL) ، ومُزرع مسبقًا في 96- صفيحة دقيقة عند 37 درجة في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون في الهواء لمدة ساعة واحدة. تمت إزالة الخلايا غير المتماسكة عن طريق الغسيل باستخدام PBS ، وأضيف 100 لتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على تركيزات مختلفة من مركب الاختبار. بعد 10 دقائق ، تمت إضافة 100 لتر من الوسط المحتوي على 10 lg / ml LPS واحتضانها لمدة 4 ساعات. تم تحديد إنتاج TNF-a في كل بئر باستخدام مجموعة ELISA (Mouse TNF-a ELISA kit ، Invitrogen). تم إذابة كل مركب اختبار في DMSO ، وأضيف المحلول إلى الوسط (تركيز DMSO النهائي 0.5 بالمائة)

3.5.7. التأثيرات المثبطة على موت الخلايا الناجم عن TNF-a في خلايا L929

تمت المحافظة على خلايا L929 (Dainippon Pharmaceuticals ، أوساكا ، اليابان) في النسر المتوسط ​​الأساسي الأدنى (MEM ، Sigma-Aldrich) التي تحتوي على 1 0 بالمائة FBS ، 1 بالمائة MEM غير أساسية من الأحماض الأمينية (Invitrogen) ، البنسلين G (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ملجم / مل) عند 37 درجة مئوية تحت جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 في المائة. تم تلقيح الخلايا في 96- لوحة زراعة أنسجة البئر [3 -104 خلايا / بئر في 100 لتر / بئر في MEM]. بعد 44 ساعة من الحضانة في الوسط TNF-a (20 نانوغرام / مل) مع عينة الاختبار أو بدونها ، تم تقييم قابلية بقاء الخلايا بواسطة المقايسة اللونية MTT (videante). تم إذابة كل مركب اختبار في DMSO ، و تمت إضافة المحلول إلى الوسط (التركيز النهائي في DMSO 0.5٪).

3.6 إحصائيات

يتم التعبير عن القيم كوسائل ± SEM تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Dunnett للتحليل الإحصائي. قيم الاحتمالية (p) أقل من 0. 05 اعتبرت هامة.

شكر وتقدير

تم دعم TM و KN و OM من خلال منحة مساعدة للبحث العلمي من مشروع `` مركز أبحاث التكنولوجيا الفائقة '' للجامعات الخاصة: دعم تمويل مماثل من منحة مساعدة للبحث العلمي من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان ، 2007-2011 ودعمها أيضًا بمنحة مساعدة للبحث العلمي من MEXT. تم دعم MYand HM من قبل برنامج COE الحادي والعشرين ، ومشروع الحدود الأكاديمية ، ومنحة مساعدة للبحث العلمي من MEX

من: 'Acylatedفينيليثانويدoligoglycosides مع نشاط كبد من نبات الصحراءCistanche tubulosa' بواسطةتوشيو موريكاوا وآخرون

---الكيمياء الحيوية والطبية 18 (2010) 1882-1890.