مشتقات أناستاتين تخفف من الإصابة بنقص التروية في عضلة القلب عن طريق الخصائص المضادة للأكسدة

لمزيد من المعلومات ، اتصلtina.xiang@wecistanche.com

الملخص: (±) -Anastatins A و B هي مركبات الفلافونويد المعزولة من Anastatica hierochuntica. في دراسة سابقة ، تم تصميم أربعة وعشرين مشتقًا جديدًا من anastatins ثنائي وثلاثي الاستبدال وتقييم أنشطتها الأولية المضادة للأكسدة. في هذه الدراسة ، تمت دراسة التأثير الوقائي لنقص تروية عضلة القلب - ضخه (I / R) وقدرة مضادات الأكسدة المنتظمة لـ 24 مشتقًا. كان المركب 13 هو الأكثر فاعلية بين جميع المركبات التي تمت دراستها ، مما زاد من بقاء خلايا H9c2 إلى 80.82 بالمائة. تم تقييم قدرة مضادات الأكسدة للمركب 13 في القدرة المضادة للأكسدة الحديديك ، 2،2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- sulfonic acid) ، و 2 ، 2- diphenyl { {20}} فحوصات بيكريلهيدرازيل. لوحظ أن المركب 13 يقلل بشكل كبير من المناطق المصابة بالاحتشاء ويحسن التغيرات النسيجية المرضية وتخطيط القلب الكهربائي في الفئران المصابة بإصابة عضلة القلب I / R. علاوة على ذلك ، قلل المركب 13 من معدلات تسرب نازعة هيدروجين لاكتات المصل ، وكرياتين كيناز ، ومالونيل ديالديهايد من أنسجة عضلة القلب لدى الفئران وزاد من مستوى الجلوتاثيون وأنشطة ديسموتاز الفائق التاليةإصابة عضلة القلب I / R.في الفئران. مجتمعة ، خلصنا إلى أن المركب 13 له تأثيرات قوية في حماية القلب ضد إصابة عضلة القلب I / R في كل من المختبر وفي الجسم الحي بسبب أنشطته المضادة للأكسدة الواسعة.

الكلمات الدالة: مشتقات الفلافونويد؛ خلايا H9c2 نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة ؛ آثار القلب

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات عن المنتج

1 المقدمة

مرض القلب الإقفاري (IHD) هو سبب رئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم [1]. يمكن لاستعادة تدفق الدم في الوقت المناسب أن يحسن بشكل فعال النتيجة السريرية للمرض ؛ ومع ذلك ، فإن ضخه لا يخلو من المخاطر بسبب مدى الضرر الخلوي الناجم عن ضخه نفسه. لذلك ، من المهم للغاية تطوير استراتيجيات علاجية فعالة ضد إصابة عضلة القلب نقص التروية - ضخه (I / R) [2]. آلية إصابة عضلة القلب I / R معقدة للغاية ؛ ويشمل موت الخلايا المبرمج ، والإجهاد التأكسدي [3] ، والكالسيوم الزائد [4] ، والالتهاب [5].الاكسدةقد يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج من خلال مسارات مختلفة لنقل الإشارات ، بما في ذلك كيناز منظم بالإشارة (ERK) ، و c-Jun amino-terminal kinase (JNK) ، وتفعيل p53 (بروتين الورم p53) ، ومتغير p66shc. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتسبب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS) في تلف لا رجعة فيه لأغشية الخلايا والجزيئات الخلوية ، مثل الحمض النووي والأحماض النووية والبروتينات والدهون وتفاعلات سلسلة البداية ، مما يؤدي إلى مزيد من الإضرار بنسيج عضلة القلب. الإجهاد التأكسدي [6] ، الناجم عن عدم التوازن بين تكوين الجذور الحرة وكسح ROS ، يلعب دورًا مهمًا في التسبب في إصابة I / R 1. لذلك ، فإن الاستراتيجيات التي تحمي عضلة القلب من الإجهاد التأكسدي تؤخذ في الاعتبار بشكل كبير في الإدارة إصابة عضلة القلب I / R. لذلك ، نظرًا لقدراتهم المحتملة على إزالة الجذور الحرة ، فإن الاستراتيجيات القائمة على مضادات الأكسدة مفيدة في إدارة إصابة I / R.

في الدراسات السريرية ، تستخدم مضادات الأكسدة لتقليلإصابة عضلة القلب I / R.تنقسم بشكل أساسي إلى نوعين: إنزيمات وغير إنزيمات. إنزيمات مثل الكاتلاز والجلوتاثيون بيروكسيديز تقلل من تركيز بيروكسيد الهيدروجين لمنع تلف الخلايا ؛ مضادات الأكسدة غير الأنزيمية مثل فيتامين هـ ، فيتامين ج ، كاروتين ، إلخ ، تضعف استجابة الإجهاد التأكسدي للأنسجة لتقليل تلف الأنسجة وتعزيز الإصلاح الوظيفي. ومع ذلك ، فإن تطبيق كلاهما له قيود معينة في الوقت الحالي. لا تساعد الكتلة الجزيئية الكبيرة لمستحضرات الإنزيم على الامتصاص [8]. كما أن هناك مشاكل معينة تتعلق باستقرار غير الإنزيمات ، مما يؤدي إلى ضعف استقرار الأدوية ، ومن ثم تتأكسد بسهولة [9].الفلافونويدكنوع من مضادات الأكسدة غير الأنزيمية ، تم الإبلاغ عن امتلاكه مجموعة متنوعة من الخصائص الفعالة ، بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومضادات السرطان ، ومضادات التبول ، وحماية القلب والأوعية الدموية [10]. إنها تمنع تكوين أكاسيد عالية التفاعل وتمنع التفاعلات التأكسدية عن طريق مسح ROS ، مثل الجذور الهيدروجينية والبيروكسينيتريت. Anastatins A و B [11] عبارة عن مركبات فلافونويد ذات نشاط وقائي للكبد. Anastasius A و B مكونات نشطة في Anastatica hierochuntica (نوع فرعي Anastatica ، عائلة Brassicaceae). حاليًا ، هناك عدد قليل جدًا من التقارير عن التركيب الكيميائي والتعديلات الهيكلية للأناستاتين A و B. في عام 2003 ، تم عزل المركبات النشطة من Anastatica hierochuntica وكشف أن لها تأثيرات كبدية ضد السمية الخلوية التي يسببها D-galactosamine في خلايا كبد الفئران الأولية المستزرعة. أظهر ناكاشيما وإيمان أيضًا أن المركبات تمارس نشاطًا مضادًا للأكسدة ومضادًا للسرطان في المختبر. ومع ذلك ، فإن التأثيرات الدوائية للأناستاتين A و B ومشتقاتهما ، وكذلك الإجراءات الخاصة بتوليفاتهما ، لا تزال غير واضحة. لذلك ، هدفنا إلى تصنيع أناستاتين A و B وبعض مشتقاتهما وتقييمها لأنشطة مضادات الأكسدة في نقص الأكسجة /إعادة الأكسجةنموذج (H / R) ، وهو فعال في دراسة إصابة عضلة القلب I / R [12].

في دراسة سابقة ، قمنا بتصنيع anastatins A و B ونظائرهما وتقييم قدراتهما المضادة للأكسدة باستخدام نموذج استنبات الخلية للضرر التأكسدي الناجم عن H2O2 (بيروكسيد الهيدروجين). أظهرت نتائجنا السابقة أن أناستاتين A و B لهما أنشطة قوية في حماية الكبد والتي يبدو أنها مرتبطة بقدراتها المضادة للأكسدة.

في هذه الدراسة ، تم تصنيع anastatins A و B و 24 من مشتقاتها وتقييمها من أجل القدرات المضادة للأكسدة باستخدام اختبارات الطاقة المخفضة والكسح الجذري. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نموذج خلية H9c2 بسيط لـ H / R ونموذج الفئران لإصابة عضلة القلب I / R لتقييم التأثيرات القلبية للمركبات.

2. النتائج

2.1.H / R نموذج المؤسسة

تم تقييم تركيز معالجة Na2S و O4 كما هو موضح في الشكل 1A ، وتم تقليل معدل بقاء خلايا H9c2 مع زيادة تركيز Na2S2O4. في ظل 4 ملي مولار من Na و S و Oa ، انخفضت صلاحية الخلية إلى أقل من 5 0 بالمائة (13.7.25 و 43.4 بالمائة على التوالي في وقت إعادة الأكسجة البالغ 2،1 و 0 ساعة) ، وكان مستوى تقليل صلاحية الخلية أقل. لذلك ، تم استخدام تركيز 4 ملي مولار من Na2S2O4 لتقليد علاج نقص الأكسجة. يوضح الشكل 1 ب أن 4 ملي مولار من معالجة Na2S2O4 لمدة ساعتين بدون إعادة أكسجين (0 ساعة) قللت بشكل كبير من قابلية بقاء الخلية ، وظلت ثابتة. في ظل حالة تركيز 4 ملي من NazS2O4 لمدة ساعتين من محاكاة نقص الأكسجة ، قللت ساعتان من إعادة الأكسجة من معدل بقاء الخلية إلى 17.37 بالمائة الشكل 1C）. كما هو مبين بوضوح في الشكل 1 د ، عكس 10 ميكرومتر من ريسفيراترول قابلية بقاء الخلية المنخفضة الناتجة عن H / R ، والتي كانت أكثر قوة من نفس تركيز حمض الغال (74.34 مقابل 60.44 في المائة لحمض الغال).

نتيجة لذلك ، تم إنشاء نموذج نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة باستخدام Na2S ، O4 بتركيز نهائي قدره 4 ملي مولار لمدة ساعتين من محاكاة نقص الأكسجة متبوعًا بالثقافة في DMEM العادي (تعديل Dulbecco لوسط النسر) / ارتفاع الجلوكوز لتقليد إصابة إعادة الأكسجة . تم استخدام ريسفيراترول بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر كعنصر تحكم إيجابي.

2.2. تعمل Anastatins و Derioatioes على تحسين قابلية خلايا H9c2 الخاضعة للعلاج H / R

أولاً ، درسنا تأثيرات anastatins A و B (الشكل 2A ، B) ومشتقاتهما على صلاحية خلايا H9c2 في MTT (3- (4،5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) {{ 10}} ، مقايسة 5- di-phenytetrazoliumromide) [13]. لم تكن المركبات 20 أ و 21 أ و 22 أ و 20 ب و 22 ب و 20 ج و 20 ج 'و 21 ج و 22 ج و 10 و 11 سامة للخلايا بشكل كبير لخلايا H9c2 (الشكل 3 أ ، ب ، الجدول S2). عكس أناستاتين أ وب ومشتقاتهما وريسفيراترول (تحكم إيجابي) تلف الخلايا الناجم عن نقص الأكسجة (الشكل 4). في المجموعة النموذجية ، انخفضت قابلية بقاء الخلية إلى 20.31 في المائة ، وزادت إلى 82.68 في المائة بواسطة ريسفيراترول ، وزاد أناستاتين أ والمركبات 22 ب ، 22 ج ، 24 ب ، 24 ج ، 13 و 14 من معدل بقاء الخلية إلى أكثر من 70 في المائة ( 71.49.71. 00 و 76.50 و 73.24 و 77.57 و 80.82 و 77.13 بالمائة على التوالي). لذلك ، كان للمركب 13 (الشكل 2 ج) أقوى تأثير وقائي بين مشتقات أناستاتين من إصابة H / R وتم استخدامه في التجارب اللاحقة.

2.3 المركب 13 يخفف من تلف الخلايا الناجم عن H / R والإجهاد التأكسدي

من أجل استكشاف السعة المضادة للأكسدة للمركب ، ثلاثةالاكسدةتم اختيار مؤشرات LDH (نازعة هيدروجين اللاكتات) و GSH (L-Glutathione) و SOD (فوق أكسيد ديسموتاز) لتقييم قدرة المركبات المضادة للأكسدة. LDH هو الإنزيم السيتوبلازمي المستقر الموجود في خلايا عضلة القلب ، والذي يتم إطلاقه بسرعة من وسط خلية إلى خلية عند إصابة غشاء خلية عضلة القلب. كلما زادت خطورة الإصابة ، ارتفع مستوى LDH في وسط المزرعة. أظهر الشكل 5 أ أن ساعتين من نقص الأكسجين متبوعًا بساعتين من إعادة الأكسجة أدت إلى زيادة كبيرة في إطلاق LDH (478.98 U / L مقابل 55.84 U / Lin المجموعة الفارغة ، ص<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4 سعة مضادات الأكسدة للمركب 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>ريسفيراترول. لذلك ، قد تكون قدرة مضادات الأكسدة للمركب 13 أعلى من تلك الموجودة في مضادات الأكسدة النموذجية الأخرى.

2.5 آثار مشتق أناستاتين 13 على إصابة عضلة القلب I / R في الفئران

2.5.1 آثار المركب 13 على الإجهاد التأكسدي وأنشطة إنزيم مضادات الأكسدة

تم تقييم مستوى إصابة عضلة القلب من خلال الكشف عن علامات الإجهاد التأكسدي وأنشطة إنزيم مضادات الأكسدة. تم تقييم تأثيرات المركب 13 على نشاط MDA (malondialdehyde) في أنسجة عضلة القلب ، بالإضافة إلى مستويات LDH و CK (Creatine Kinase) و GSH و SODin المصل. كما هو مبين في الشكل 7 ، أدت إصابة I / R إلى زيادة مستويات LDH (الشكل 7A) و CK (الشكل B) وانخفاض كبير في أنشطة GSH (الشكل 7C) وأنشطة SOD (الشكل 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. آثار المركب 13 على تغيرات مخطط القلب الكهربائي (ECG) ومعدل ضربات القلب

يظهر في الشكل 8. تغييرات نموذجية في مخطط كهربية القلب (مخطط كهربية القلب) ناجمة عن إصابة عضلة القلب I / R. موجة QRS واندماج موجة ST (الشكل 8C) ؛ الجزء ST (الفاصل الزمني بين الموجة S والموجة T) الارتفاع (الشكل 8D) ؛ وانعكاس مقطع ST (الشكل 8E). بعد 15 دقيقة من ربط LAD ، تمت زيادة سعة QRS بشكل كبير من حوالي 0. 5 مللي فولت إلى 1.2 مللي فولت في مجموعة النموذج (الشكل 9 أ) ، بينما لوحظ زيادة أقل في سعة QRS في جميع مجموعات العلاج (من حول 0. 4 مللي فولت إلى 1 ، 0. 8 ، 0. 6 مللي فولت لمجموعة ريسفيراترول والجرعة المنخفضة 13 والجرعة العالية 13 على التوالي) (الشكل 9B-D ). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ اتجاه مماثل عند ربط 3 0 دقيقة. أثناء ضخه ، بدأت سعة QRS في الانخفاض ؛ ومع ذلك ، ظلت موجة QRS في مجموعة النموذج هي الأعلى في الفترة بأكملها. بعد دقيقتين 0 من ضخه ، انخفضت سعة QRS في مجموعة النموذج إلى حوالي {{3 0}}. 8 مللي فولت ، كانت القيمة في مجموعة العلاج حوالي 0.6،0.5 ، 0.5 مللي فولت من أجل ريسفيراترول ، جرعة منخفضة 13 ، جرعة عالية 13 مجموعة على التوالي. بشكل عام ، زاد علاج ريسفيراترول والجرعة المنخفضة 13 والجرعة العالية 13 من سعة QRS المرضية مقارنةً بالمجموعة النموذجية أثناء كل من نقص التروية وعملية إعادة التروية المبكرة ، والتي قد تُعزى إلى نشاطها الوقائي لعضلة القلب.

جنبا إلى جنب مع مراقبة تخطيط القلب ، تم الكشف عن التغيرات في معدل ضربات القلب عن كثب. كما هو مبين في الجدول S3 ، أدت 30 دقيقة من الربط إلى خفض معدل ضربات القلب بشكل كبير في جميع المجموعات ، بينما لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية بين أي من مجموعات العلاج ومجموعات النموذج. بعد ساعتين من ضخه ، زادت معدلات ضربات القلب ولكن لم يتم العثور على تغييرات كبيرة بين أي من المجموعات.

2.5.3. آثار المركب 13 على المنطقة المصابة بالاحتشاء والتغيرات النسيجية المرضية

لتقييم مستوى إصابة عضلة القلب ، تم تلوين أنسجة القلب بواسطة TTC (2 ، 35- ثلاثي فينيل تيترازوليوم كلوريد) وتم الكشف عن التغيرات النسيجية المرضية. كما هو مبين في الشكل 10 ، في المجموعة الصورية ، لم يلاحظ أي تغييرات في عضلة القلب بعد تلطيخ TTC بينما لوحظ مقياس من حوالي 30 في المائة من المناطق المصابة بالاحتشاء الأبيض في مجموعة I / R. في مجموعة ريسفيراترول ومجموعة الجرعات المنخفضة البالغ عددها 13 مجموعة ، تقلصت المناطق المصابة بالاحتشاء بشكل كبير إلى حوالي 10 في المائة ، وتم تقليل المنطقة الملتهبة في المجموعات ذات الجرعات العالية البالغ عددها 13 إلى حوالي 5 في المائة. يوضح الشكل 10 نتيجة فحص تلطيخ HE (hematoxylin-eosin): تضخم خلايا القلب والأغشية والنواة المذابة جزئيًا ، ولوحظ تسلل الخلايا الالتهابية في أقسام الأنسجة من مجموعة النموذج. ومع ذلك ، خففت المعالجة المسبقة بالمركب 13 بشكل كبير من هذه التغيرات النسيجية المرضية. أشارت نتائج تلطيخ TTC وتلطيخ HE إلى أن المركب 13 يمكن أن يقلل احتشاء عضلة القلب الناجم عن I / R بطريقة تعتمد على الجرعة.

3. مناقشة

بهدف النشاط المضاد للأكسدة المحتمل لـ anastatins A و B ، صنع مختبرنا 24 مشتقًا من anastatins وأجرى تحليلًا أوليًا للسمية الخلوية للمركبات ضد الكمبيوتر الشخصي -12 وأنشطتها الواقية للخلايا في HO ، الضرر التأكسدي الناجم [13] . في هذه الدراسة ، أجرينا بشكل أساسي تقييمًا بيولوجيًا متعمقًا لـ 13 مشتقًا من أصل 24 مع أقوى أنشطة مضادات الأكسدة.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء إصابة عضلة القلب I / R في خلايا H9c2 من خلال الحث مع العلاج H / R. أشارت نتائج الدراسة إلى أن أناستاتين A و B ومشتقاتهما المدروسة قد حسنت قابلية خلايا H9c2 بعد العلاج H / R. تم العثور على المركب 13 ليكون الأكثر فاعلية من بين 26 مركبًا تمت دراستها ، وبالتالي تم اختياره لمزيد من التقييم. تم الكشف عن أنشطة LDH (علامة إصابة الخلية) ، SOD ، و GSH (علامات الإجهاد التأكسدي) في طاف خلايا H9c2 بعد العلاج H / R. وجدنا أن المعالجة المسبقة بمركبات الاختبار أدت إلى انخفاض كبير في مستويات LDH وزيادة مستويات SOD و GSH في الخلايا. وهكذا ، افترضنا أن مشتقات أناستاتين تمتلك نشاطًا وقائيًا للقلب يمكن أن يُعزى إلى قدرتها على قمع الإجهاد التأكسدي. تُستخدم مقايسات DPPH و ABTS لتقييم قوة الكسح الجذري للمركب [14]. نتيجة لذلك ، كان للمركب 13 قوة عالية من مضادات الأكسدة ، وقام بكسح ABTS و DPPH عند قيم EC50 منخفضة ، مما يشير أيضًا إلى قمع الإجهاد التأكسدي. ربط LAD هو طريقة شائعة تستخدم لإنشاء نماذج I / R لعضلة القلب. من خلال تقييم سعة مجمع QRS قبل نقص التروية وبعد نقص التروية وبعد ضخه ، وجدنا أن المعالجة المسبقة بالمركب 13 يمكن أن تخفف من عدم انتظام ضربات القلب البطيني بشكل ملحوظ أثناء نقص التروية وضخه في وقت مبكر. علاوة على ذلك ، أثر المركب 13 على مناطق الاحتشاء والتغيرات النسيجية المرضية لاحتشاء عضلة القلب أيضًا. أظهرت هذه النتائج ، جنبًا إلى جنب مع النتائج التي تفيد بأن المركب 13 يقمع الإجهاد التأكسدي ويزيد من مستويات الإنزيمات المضادة للأكسدة في مصل الفئران بطريقة تعتمد على الجرعة ، أن المركب 13 له تأثير قوي ضد إصابة عضلة القلب.

في الختام ، كان لمشتقات أناستاتين قدرات قوية مضادة للأكسدة ، حيث أظهر المركب 13 أعلى نشاط مضاد للأكسدة بين المركبات المختبرة. لا تزال الآليات المسؤولة عن تأثير مشتقات anastatins على مسارات التأشير المرتبطة بالإجهاد التأكسدي بحاجة إلى المناقشة. يمكن لأستازانتين (نوع فرعي من الكاروتين) أن يقضي على أنواع الأكسجين التفاعلية ويزيد من حدة الإصابة بنقص التروية / إعادة التروية [15]. قد تكون الأدوية التي لديها القدرة على منع تولد أنواع الأكسجين التفاعلية واعدة في الأمراض المرتبطة بالإجهاد التأكسدي [4] مثل العلاج بالخلايا وأمراض القلب والأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، يمنع ROS تحريض نقص التأكسج للعامل المحرض بنقص الأكسجة -1 (HF -1) التعبير الجيني المستهدف ، والذي ورد أنه له تأثير وقائي للقلب على إصابة نقص التروية وضخ الدم [16]. نفترض أن البروتين التنظيمي ROS و HIF -1 قد يلعبان دورًا حاسمًا في التأثير الواقي للقلب للمركب 13. Tournefolic acid B (TAB) ، المشتق من الأدوية العشبية الصينية ، يحمي من إصابة عضلة القلب I / R [17 ]. كشفت الدراسة عن الأدوار المهمة لـ TAB في إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وموت الخلايا المبرمج ، ومسارات PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase) / AKT (بروتين كيناز B) في إدارة إصابة عضلة القلب I / R. مسارات أخرى ، مثل مسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) [18] ومسار إشارات AMPK (كيناز البروتين المنشط أحادي الفوسفات Adenosine 5'-monophosphate) [19] ، قد تشارك أيضًا في إصابة عضلة القلب I / R. لذلك ، فإن الخطوة التالية هي البدء بالبروتينات التنظيمية ROS و HIF -1 واستخدام مسارات بوساطة TAB لاستكشاف الآليات التي يمارس بها 13 تأثيرًا مضادًا للأكسدة ويحمي عضلة القلب I / R. علاوة على ذلك ، يجب أيضًا إجراء التجارب على مستوى الخلية في هذه الدراسة في خطوط الخلايا البشرية.

4. المواد والطرق

4.1 ثقافة الخلية

تم شراء خط الخلايا H9c2 لعضلة القلب الجرذ من شركة Nanjing Kebai Biotechnology Company (نانجينغ ، الصين). تمت زراعة الخلايا في DMEM / عالي الجلوكوز (Hyclone ، الولايات المتحدة الأمريكية) واستكملت بنسبة 10 بالمائة FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD ، Lanzhou ، الصين) و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين (Hyclone ، Marlborough ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في مرطب. حاضنة عند 37 درجة مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون.

4.2 فحص جدوى الخلية

تم قياس صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT. تم زرع خلايا H9c2 في 96- لوحة بئر عند 1 × 10 * خلايا / بئر لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا باستخدام Anastatins A و B ومشتقاتها لمدة 48 ساعة أو تمت معالجتها مسبقًا باستخدام Anastatins A و B ومشتقاتها متبوعة بعلاج H / R. بعد ذلك ، تمت إضافة MTT （20 ميكرولتر / بئر） وتربيته عند 37 درجة لمدة 4 ساعات. تم قياس الامتصاصية عند 578 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Tecan ، Infinite 50). تم اعتبار صلاحية الخلية في المجموعة الفارغة بنسبة 100 بالمائة.

4.3 نموذج نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة (H / R) وإدارة الأدوية

4.3.1.H / R نموذج

تم استخدام NazS، O4 لتقليد حالة نقص الأكسجين ، والتي تتفاعل مع الأكسجين [2 0] وتقلل من توتر الأكسجين. تم إجراء مجموعة متنوعة من سبعة تراكيز من 0. 5 ، 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، أو 6 ملي مولار لتحديد التركيزات المثلى لـ Na2S ، O4. لتحديد الوقت الأمثل لنقص الأكسجة ، أجريت مزارع من 0. 5 أو 1،2 أو 3 أو 4 ساعات بعد معالجة محلول Na2S2O4. أجريت الثقافة تحت DMEM العادي / متوسط ​​الجلوكوز العالي لمدة 0 ، 1 ، 2 ، 3 ، أو 4 ساعات لتقليد وقت إعادة الأكسجة [21].

4.3.2. إدارة المخدرات

لإدارة الدواء ، تم فصل أناستاتين A و B ومشتقاتهما (الهياكل الكيميائية في الجدول S1) إلى مجموعتين: anastatins A ومشتقاته ، و anastatins B ومشتقاته. تم استخدام الريسفيراترول كعنصر تحكم إيجابي ، حيث ورد أن له تأثير وقائي للقلب من خلال نشاطه المضاد للأكسدة. لتحديد تركيز عنصر التحكم الإيجابي ، تم تقييم ريسفيراترول ومركب آخر مضاد للأكسدة ، حمض الغاليك （3-100 ميكرومتر） ، باستخدام اختبار MTT الذي عولجت فيه الخلايا لمدة 48 ساعة 【22】. بشكل عام ، تمت معالجة خلايا H9c2 بأناستاتين A و B ومشتقاتها (10 ميكرومتر من التركيز النهائي) بالإضافة إلى 10 ميكرومتر من ريسفيراترول لمدة 30 دقيقة قبل العلاج H / R.

4.4 تقييم القدرات المضادة للأكسدة

4.4.1. مقايسة القدرة المضادة للأكسدة الحديديك (FRAP)

تم إجراء اختبار FRAP وفقًا لطريقة Oivuan 【23】. ما مجموعه 25 ميكرولتر من 1 في المئة من البوتاسيوم فيري سيانيد K3Fe （CN） 6 تم تنقيطه و 1 0 ميكرولتر من المركب 13 ، وفيتامين ج (حمض الأسكوربيك ، Vc) ، وريسفيراترول (0. {{8} } مم) بالإضافة إلى 1 × PBS (الرقم الهيدروجيني =6. 6). تم حفظ الخليط في حمامات مائية 50 درجة لمدة 20 دقيقة متبوعة بتبريد سريع بالجليد. بعد ذلك ، تمت إضافة 25 ميكرولتر من 10 في المائة من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك （TCA ، و 0.1 في المائة من كلوريد الحديديك （FeCl） ، والماء المقطر بالتسلسل. تم نقل الخليط إلى صفيحة بئر 96- وتم تحليل الامتصاص عند 650 نانومتر. تم استخدام محلول Vc (20-200 ميكروغرام / مل) لبناء منحنى قياسي. تم حساب قدرات مضادات الأكسدة من منحنى المعايرة الخطية وتم تمثيلها على أنها مكافئات Vc.

4.4.2.ABTS طريقة

تم إجراء نشاط الكسح الجذري ABTS [24] وفقًا لـ Sugahara et al. وري وآخرون. تم تخفيف ABTSsolution لضبط الامتصاص الطيفي عند 65 0 من 0. 7 0 ± 0. 0 2 نانومتر ، وتم قياس أنشطة الكسح ABTS وفقًا لـ الصيغة التالية ، E=((Acontrol-Ablank) - (A 2 - A1) / (A control-Ablank)) × 10 ، حيث Control هي امتصاص تفاعل التحكم الذي يحتوي على 130 ميكرولتر ABTS بالإضافة إلى محلول العمل وعينة 5.5 ميكرولتر مخفف （DMSO ، و Ablank هو امتصاص 130 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم و 5.5 ميكرولتر DMSO. A هو امتصاص 130 ميكرولتر ABTS بالإضافة إلى محلول عامل （محلول أسيتات الصوديوم） و 5.5 ميكرولتر من المركب 13 （0. 02-20 ملي مولار ، و Az هو امتصاص 130 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم و 5.5 ميكرولتر من المركب 13 （ 0. 02-20 مم）. تم تدوير جميع المخاليط لمدة 30 ثانية وتحضينها عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق متبوعة بقياس الامتصاص عند 650 نانومتر. تم حساب ECs0 باستخدام العلاقة الخطية بين تركيز المركب واحتمال النسبة المئوية لتثبيط ABTS.

4.5 نموذج نقص التروية - ضخه

4.5.1. رعاية الحيوانات

تم الحصول على فئران Sprague Dawley (SD) من مركز الحيوان التابع لأكاديمية PLA العسكرية لمختبر العلوم الطبية (بكين ، الصين). تم تأقلم خمسين من ذكور جرذان SD تزن من {0} جرام لمدة أسبوع واحد تحت درجة حرارة الغرفة 23 ± 1 درجة مع دورة مظلمة / فاتحة لمدة 12 ساعة وتم توفير الطعام والماء. تم تقسيم الجرذان إلى خمس مجموعات: المجموعة الفارغة (لم تتلق الجرذان أي علاج ولكن العملية الوهمية) ، والمجموعة النموذجية (تلقت الجرذان معالجة مركبة وعملية MI / R) ، ومجموعة ريسفيراترول (تلقت الفئران 200 مجم / كجم ريسفيراترول و MI / R). العملية) ، الجرعة المنخفضة 13 مجموعة (تلقت الفئران 100 مجم / كجم من المركب 13 وعملية MI / R) ، والجرعة العالية 13 مجموعة (تلقت الجرذان 200 مجم / كجم من المركب 13 وعملية MI / R). تمت صياغة المركبات في 0.5 في المائة من كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم وجرعاتها كمعلق عند 1 مل / كغ عن طريق الفم مرة واحدة يوميًا لمدة سبعة أيام. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأكاديمية لجامعة تيانجين للعلوم والتكنولوجيا.

4.5.2. بروتوكول تجريبي

تم تخدير فئران سبراغ داولي بنسبة 2 0 يوريتان (0.8 مل / 100 جم) ثم أجرينا إقفار عضلة القلب عن طريق الربط الأمامي الأيسر (LAD). تم الكشف عن القلب من خلال شق صدري أيسر وتم وضعه على 4-0 خياطة من الحرير لإجراء نقص تروية موضعي لمدة 30 دقيقة من الإقفار متبوعًا بساعتين من إعادة ضخ الدم. تم تأكيد دليل نقص تروية عضلة القلب عن طريق ارتفاع المقطع ST وزيادة سعة QRS. أثناء التجربة ، تم الاحتفاظ بالجرذان على جهاز التنفس الصناعي DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd ، بكين ، الصين). تم رصد معدل ضربات القلب وتخطيط القلب من خلال نظام اكتساب الإشارات البيولوجية MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd ، بكين ، الصين). بعد مراقبة عملية نقص التروية / ضخه ، تم التضحية بالجرذان واستخدمت عينات الدم ومتجانسات القلب للكشف عن إصابة عضلة القلب باستخدام مجموعات المباحث التجارية.

4.5.3. تلطيخ TTC وتلطيخ HE

تم قياس مدى المنطقة الدماغية بواسطة تلطيخ ثلاثي فينيل رباعي كلوريد (TTC). تم تجميد عينات القلب على الفور عند درجة {0} لمدة 10 دقائق وتم عمل خمس شرائح رقيقة من 1 إلى 2 مم. بعد ذلك ، تم وضع الشرائح في محلول TTC ​​فوسفات بنسبة 1٪ (درجة الحموضة =7. 0) وصبغتها عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة ، وتم تثبيتها في الفورمالين. تم الحصول على الصور باستخدام كاميرا رقمية ، وتم قياس النسبة المئوية للمنطقة المحتجزة (سلبية TTC) والمنطقة المعرضة للخطر (إيجابية TTC) باستخدام برنامج ImageJ [25]. بالنسبة لتلطيخ HE ، تم استئصال المنطقة المصابة بالاحتشاء وتثبيتها في 10 في المائة من الفورمالديهايد ثم دمجها في البارافين. بعد ذلك ، تم تلوين الأنسجة بـ HE (هيماتوكسيلين يوزين) وفحصها تحت المجهر الضوئي. تم تفويض المقاطع المدمجة المجففة وأقسام الختم من قبل شركة Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin ، الصين).

4.6 مجموعات طيفية تجارية

تم شراء الأدوات التجارية المستخدمة في هذا البحث من شركة Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (بكين ، الصين) وشركة Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing ، الصين). ) ، تم تقييم أنشطة الكرياتين كيناز (CK) والجلوتاثيون (GSH) وديسموتاز الفائق (SOD). تم قياس أنشطة Malondialdehyde (MDA) باستخدام تجانس قلب الفئران. تم إجراء جميع المجموعات التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

4.7 عملية الإحصاء

تم تكرار جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل. تمت معالجة البيانات التجريبية باستخدام برنامج GraphPad Prism7 ، وتم التعبير عن النتيجة التجريبية لكل مجموعة على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (x ± s). تم استخدام اختبار t لمقارنة الدلالة الإحصائية بين المجموعات. ص<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

مراجع

1. أوزدينسكي ، أب ؛ Demyanenko ، S. هيستون acetylation ، و deacetylation في السكتة الدماغية. التجديد العصبي. الدقة. 2021 ، 16 ، 1529-1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li، H .؛ ين ، أ. تشنغ ، زي. فنغ ، م. تشانغ ، هـ. شو ، ياء ؛ وانغ ، ف. Qian، L. إضعاف مسار إشارة تضخيم Na / K-ATPase / Src / ROS مع pNaktide يخفف من إصابة نقص التروية في عضلة القلب. كثافة العمليات J. بيول. ماكرومول. 2018 ، 118 ، 1142-1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin، RM؛ شيا ، إل. وي ، دبليو. شولر ، سي ؛ Leggett ، RE ؛ Lin ، ADY آثار بوغ غانوديرما لوسيدوم المكسور بقذيفة على الإجهاد التأكسدي للمثانة البولية للأرنب باستخدام نموذج في الجسم الحي لنقص التروية / ضخه. مول. خلية. بيوتشيم. 2017 ، 435 ، 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan، Z .؛ ليو ، ح. سونغ ، العاشر ؛ لينغ ، واي. هو ، S. يان ، واي. يان ، ياء ؛ وانغ ، س. وانغ ، إكس. يخفف Chen، A. تشيم. بيول. تفاعل. 2019 ، 307 ، 82-90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy، DJ؛ يلون ، إصابة إقفار عضلة القلب - ضخه: هدف علاجي مهمل. J. كلين. التحقيق. 2013 ، 123 ، 92-100. [CrossRef]

6. يو ، سي. جفن العين.؛ لي ، زي. يو ، د. Zhai ، G. تأثير ساكوبيتريل / فالسارتان على الالتهاب والإجهاد التأكسدي في نموذج فشل القلب الناجم عن دوكسوروبيسين في الأرانب. اكتا فارماسيوت. 2021 ، 71 ، 473-484. [CrossRef]

7. Wang، Y .؛ تشي ، ياء ؛ تشاو ، ح. تانغ ، ياء ؛ شي ، ج.بلاتيكودين D يثبط الإجهاد التأكسدي والاستماتة في خلايا عضلة القلب H9c2 بعد إصابة نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 2018 ، 503 ، 3219–3224. [CrossRef]

8. بافلوفيتش ، م. BNáfrádi Rouster ، P. إنزيم مستقر للغاية يحاكي المركب النانوي من النشاط المضاد للأكسدة. J. علوم واجهة الغروانية. 2019 ، 543 ، 174-182. [CrossRef]

9. تشي ، هرتز ؛ وانجي ، WZ ؛ هو ، نظام JY المضاد للأكسدة من Deinococcus radiodurans. الدقة. ميكروبيول. 2019 ، 171 ، 822-831. [CrossRef]

10. شاو ، إل. شاو ، واي. Yuan، Y. Pinocembrin flavanone يثبط قابلية بقاء الخلية في سرطان البروستاتا البشري -3 عن طريق تحفيز موت الخلايا المبرمج الخلوي ، وإنتاج ROS ، وتوقف دورة الخلية. اكتا فارماسيوت. 2021 ، 71 ، 669-678. [CrossRef]