التأثيرات المضادة للشيخوخة لمستخلص الكالس Leontopodium Alpinum (Edelweiss) من خلال التنميط الترنسكريبتوم

من فضلك اضغطoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:إديلويس (Leontopodium Alpinum) في عائلة Asteraceae هي زهرة برية تنمو في أماكن الحجر الجيري الصخري. هنا ، قمنا بالتحقيق في فعالية مستخلص ثقافة الكالس (مستخلص Leontopodium Alpinum callus ؛ LACCE) باستخدام فحوصات متعددة من المختبر إلى الجسم الحي بالإضافة إلى التنميط النسخي. أظهرت العديد من نتائج المقايسة في المختبر نشاط مضادات الأكسدة القوي لـ LACCE استجابةً للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية. علاوة على ذلك ، قمع LACCE الالتهاب والتجاعيد ؛ ومع ذلك ، تم زيادة نشاط الترطيب بواسطة LACCE. أظهر الاختبار السريري في الجسم الحي أن التطبيق المستمر لـ LACCE على الوجه وأنسجة الجلد يحسن التجاعيد المضادة للحجاج ومرونة الجلد وكثافة الجلد وسماكة الجلد مقارنة مع الدواء الوهمي. أظهرت نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي ما لا يقل عن 16.56 في المائة من الجينات البشرية تم التعبير عنها في خلايا الخلايا الكيراتينية. جينات LACCE التي يتم تنظيمها والتي تشفر العديد من بروتينات KRT ؛ شاركت DDIT4 و BNIP3 و IGFBP3 في التنظيم الإيجابي لعملية النمو ، وموت الخلايا المبرمج ، والتقرن ، وتشكيل حواجز الجلد ، والتي توفر العديد من المزايا لبشرة الإنسان. على النقيض من ذلك ، كانت الجينات الخاضعة للتنظيم عبارة عن جينات مستجيبة للإجهاد ، بما في ذلك المعادن والأكسدة والجروح ونقص الأكسجة والعدوى بالفيروسات ، مما يشير إلى أن LACCE لم تسبب أي ضغط ضار على الجلد. أظهرت دراستنا الشاملة أن LACCE هو عامل واعد لمستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة.

الكلمات الدالة:مكافحة الشيخوخة. الكالس. إديلويس.خلايا الجلد; نسخة

1 المقدمة

إديلويس (Leontopodium noble sub sp. Alpinum (Cass.) Greuter) في عائلة Asteraceae هي زهرة برية تنمو في أماكن الحجر الجيري الصخري على ارتفاعات عالية ، مثل جبال الألب السويسرية [1،2]. نظرًا لندرة أزهارها البيضاء قصيرة العمر ، تمثل إديلويس الجمال والنقاء المرتبطين بجبال الألب والكاربات. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر العديد من البلدان ، بما في ذلك النمسا وبلغاريا ورومانيا وسلوفينيا وسويسرا ، إديلويس رمزًا وطنيًا.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

لفترة طويلة ، تم استخدام إديلويس كدواء تقليدي ضد آلام البطن والتهاب الشعب الهوائية والإسهال والدوسنتاريا والحمى [3 ، أ]. في الآونة الأخيرة ، أظهرت العديد من الدراسات فعالية مستخلصات إديلويس في مكافحة الالتهاب في الفئران والجرذان [3] والخلايا الكيراتينية البشرية والخلايا البطانية [4]. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي مستخلصات جذر إديلويس على مكونات تعزز النقل العصبي الكوليني ، مما يشير إلى قدرتها على العوامل المضادة للذهان [5] ومضادات الأكسدة ، مثل

حمض الليونتوبوديك أ و 35- حمض كافوييلكوينيك ، والذي يمكن استخدامه كعوامل مضادة للشيخوخة [6]. علاوة على ذلك ، أظهرت مستخلصات إديلويس نشاطًا مضادًا للبكتيريا ضد Enterococcus faecium و Escherichia coli و Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus و Streptococcus pneumonia و Streptococcus pyogenes ، مما يشير إلى إمكانية استخدامها في الطب العرقي لاضطرابات الجهاز التنفسي والبطن [7].

قامت العديد من الدراسات السابقة بتحليل مركبات مستخلصات إديلويس. على سبيل المثال ، كشفت طريقة الكروماتوغرافيا الشعرية عن 12 مركبًا دوائيًا مهمًا ، بما في ذلك الفلافونويد وأحماض الكافيين وحمض الليونتوبوديك ، من الأجزاء الهوائية لإديلويس [8]. لاستخلاص مضادات الأكسدة من نباتات إديلويس ، تم تطوير طرق فصل كروماتوغرافيا الفصل بالطرد المركزي (CPC) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) [6]. من المعروف أن المركبات النشطة لمستخلصات إديلويس بين الأجزاء الهوائية والجذور متنوعة [3]. على سبيل المثال ، تنتج جذور إديلويس المشعرة قشور نشطة صيدلانيًا ، مثل تسجيل الدخول و 5- تسجيل الدخول إلى الميثوكسي ، والذي يمكن تحفيزه بواسطة عدة مكونات أخرى ، مثل نترات الفضة والسكروز وميثيل جاسمونات وخلاصة الخميرة [ 9].فوائد استخراج cistancheعلاوة على ذلك ، تم الكشف عن أنماط التمثيل الغذائي لـ 11 نوعًا مختلفًا من Leontopodium بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (1H NMR) ومقياس الطيف الكتلي السائل اللوني (LC-MS) في علاقتهما التصنيفية [10].

يمكن أن يكون Cistanche مكافحة الشيخوخة

يمكن تعريف الكالس النباتي على أنه كتل خلايا غير منظمة أو غير متمايزة ، والتي يمكن تحفيزها بسهولة عن طريق الجرح لتغطية جرح نباتي أو إجراء نظام في المختبر بشكل مصطنع. يُزرع الكالس النباتي صناعيًا عن طريق إضافة العناصر الغذائية ومنظمات نمو النبات في ظروف نمو مطهرة. في الوقت الحالي ، من الممكن إنتاج عدد كبير من الخلايا النباتية المحددة بجودة متساوية في مفاعل حيوي. علاوة على ذلك ، تتمتع الخلية النباتية بالقدرة التي يشار إليها باسم توتيبوتسيتي ، وهي القدرة الجينية لخلية نباتية لإنتاج النبات الناضج بالكامل [11]. وبالتالي ، من الممكن إنتاج نبتة ناضجة من دشبذ النبات المحدد. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الكالس على نطاق واسع لتجديد النباتات للحفاظ على النباتات النادرة والمهددة بالانقراض [12 ، 13].

مثل الخلايا الحيوانية ، تمتلك الخلايا النباتية القدرة على تسهيل تحفيز وتجديد النباتات بعد الإصابة [14]. على الرغم من اعتبار الخلايا الجذعية النباتية على أنها مواد ناشئة في صناعة مستحضرات التجميل ، فإن المواد المتاحة محدودة. من المهم تحديد مصادر نباتية جديدة وتقييم مكوناتها الوظيفية المرتبطة بمستحضرات التجميل.

تشتهر مستخلصات إديلويس باستخدامها في العوامل الصيدلانية ؛ ومع ذلك ، نادرًا ما يتم الإبلاغ عن تأثيرات مستخلص إديلويس كمصدر تجميلي طبيعي. هنا ، قمنا بالتحقيق في فعالية مستخلص الكالس (مستخلص الكالس Leontopodium Alpinum ؛ LACCE) المشتق من أوراق إديلويس باستخدام فحوصات متعددة من المختبر إلى الجسم الحي وكشفنا عن الآلية الجزيئية التي تسببها LACCE باستخدام التنميط الترانسكريبتوم.

2. المواد والأساليب

2.1. إنتاج Edelweiss Callus

تم شراء بذور إديلويس تجارياً. تم نقع بذور إديلويس في 7 0 بالمائة من الإيثانول لمدة 3 0 ثم غسلها بالماء المقطر. مرة أخرى ، تم رج البذور في 0. 3٪ هيبوكلوريت الصوديوم (واكو ، أوساكا ، اليابان) لمدة دقيقتين 0 وغسلها بالماء المقطر. تم إنبات البذور المعقمة على وسط موراشيج وسكووج (MS) الأساسي (Duchefa Biochemie ، هارلم ، هولندا). تم تقطيع أوراق إديلويس في الحالة المعقمة إلى قطع صغيرة (0.5 إلى 1 سم). استحدثنا المرحلة المبكرة من الخلايا النباتية على وسط MS يحتوي على 0. 5-3 ملغم / مل من 6- Benzylaminopurine (6- BAP) (Duchefa Biochemie) و 0. 3-1 مجم / مل من 2 ، 4- حمض ثنائي كلورو فينوكسياسيتيك (2 ، 4- D) (Duchefa Biochemie) في الظلام عند 25 ± 2 درجة [15]. تم تعديل الأس الهيدروجيني لوسط MS إلى 5.8 باستخدام 1N من هيدروكسيد الصوديوم (Duchefa Biochemie). تم نشر الكالس المستحث في طبق بتري. تمت زراعة خط الكالس المختار في مفاعل حيوي في معهد أبحاث مكافحة الشيخوخة في شركة BIO-FD & C Co.، Ltd. ، إنتشون ، كوريا. تم حصاد الكالس المستنبت وغسله ثلاث مرات بالماء المقطر.cistanche جنكيز خانتم تجفيف الكالس باستخدام مجفف التجميد (IlShinbioBase ، Dongducheonsi ، كوريا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تقليب مسامير إديلويس المجففة في ماء مقطر عند 50 درجة لمدة 8 ساعات. تم الحصول على مستخلصات الكالس عن طريق الاستخلاص بالحرارة عند 98 درجة لمدة 10 دقائق.

2.2. ثقافة خلايا جلد الإنسان

تمت زراعة التأثيرات المقيمة لمستخلصات إديلويس على خلايا الجلد البشرية وخلايا الخلايا الكيراتينية (HaCaT) والأرومة الليفية البشرية العادية في ديترويت 551 (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Welgene ، Gyeongsan-si ، كوريا ) مكمل بنسبة 10 في المائة من مصل بقري جنيني (FBS) (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومضاد حيوي - مضاد حيوي بنسبة 1 في المائة (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة مع حالة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

2.3 تقييم نشاط التمثيل الغذائي للخلايا بواسطة فحص MTT

لتقييم السمية الخلوية لـ LACCE على النمو الخلوي ، والتكاثر ، وبقاء خلايا الجلد البشرية ، MTT ({{0}} (45- ثنائي ميثيلثيازول -2- yl) {{3} } ، تم إجراء اختبار 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد) كما هو موصوف سابقًا [16،17]. باختصار ، تم تحضين 551 خلية HaCaT وديترويت بكثافة 5 × 1 0 * خلية لكل بئر ، على التوالي ، في لوحة بئر 96- لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك ، تركيزات نهائية بنسبة 0.1 بالمائة ، 0.5 في المائة ، و 1 في المائة من LACCE تمت معالجتهم لمدة 24 ساعة. تم استخدام الماء المقطر كعنصر تحكم. بعد معالجة LACCE ، تمت إزالة الوسيط متبوعًا بإضافة 4 ميكرو لتر من 5 مجم / مل MTT （Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، مو ، الولايات المتحدة الأمريكية） واحتضانها لمدة 4 ساعات. بعد إزالة الوسط ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (سيغما) وتذويبه لمدة 10 دقائق.تمديد الحياة cistancheتم قياس امتصاص الطول الموجي عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Thermo Scientific Multiskan GO Microplate (Fisher Scientific Ltd. ، Vantaa ، فنلندا). تم الحصول على صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية. قابلية بقاء الخلية (النسبة المئوية)=(مقدار الامتصاص للخلايا المعالجة / مقدار امتصاص خلايا التحكم) × 100.

2.4 تقييم نشاط مضادات الأكسدة بمقايسة DPPH

تم قياس نشاط مضادات الأكسدة لـ LACCE في مقايسة DPH (2 ، 2- ثنائي فينيل -1- بيكريل-هيدرازين-هيدرات) كما تم وصفه سابقًا [18]. باختصار ، 0. 1 مل من تمت معالجة التركيزات النهائية لـ 0. 1 بالمائة ، {{1 {13}}}. 5 بالمائة ، و 1 بالمائة LACCE في 0. 1 مل من 0. 1 ملي مولار من DPPH (Sigma-Aldrich) في وجود 0. 4 مل من الإيثانول. استخدمنا 0.001 بالمائة من حمض الأسكوربيك (فيتامين ج) (سيغما الدريتش) كعنصر تحكم إيجابي. تم خلط العينات جيدًا لمدة 10 ثوانٍ وحضنت في درجة حرارة الغرفة في ظروف مظلمة لمدة 30 دقيقة. تم قياس امتصاص الطول الموجي عند 517 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Thermo Scientific Multiskan GO Microplate (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب نشاط الكسح الجذري باستخدام الصيغة التالية. نشاط الكسح (النسبة المئوية)=[1- (امتصاص عينة الاختبار / امتصاص عنصر التحكم)] × 100.

2.5 تقييم نشاط مضادات الأكسدة عن طريق مقايسة بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)

ينتج بيروكسيد الهيدروجين جذور خالية من الأكسجين في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا. اختبرنا معدل وفيات الخلايا الناتج عن بيروكسيد الهيدروجين في العينات المعالجة بـ LACCE. تم تحضين خلايا HaCaT بكثافة 5 × 1 0 5 خلايا لكل بئر في لوحة بئر 24- لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت معالجة التركيزات النهائية لـ 0. 1 بالمائة ، 0. 5 بالمائة ، و 1 بالمائة LACCE في وجود 1 ملي مولار من H ، O ، لمدة 8 ساعات. كعنصر إيجابي ، تم استخدام 0.033 بالمائة NAC (Sigma-Aldrich). تم استخدام اختبار MTT لقياس معدل بقاء الخلية للعينات المعالجة بـ LACCE الناتجة عن HO2. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا مورفولوجيا الخلية عن طريق تلطيخ الميثيلين الأزرق (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.6. النسخ العكسي في الوقت الحقيقي (RT) -PCR

لفحص تأثير LACCE على مقاومة التجاعيد والترطيب ومقاومة الالتهاب ، قمنا بتنفيذ RT-PCR في الوقت الفعلي باستخدام بادئات معروفة تضخيم جينات العلامة باستخدام مقايسات QuantiTect التمهيدي (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحضين 551 خلية في ديترويت بكثافة 5 × 1 0 4 خلايا لكل بئر في لوحة بئر 96- لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت معالجة التركيزات النهائية لـ 0. 1 بالمائة ، 0. 5 بالمائة ، و 1 بالمائة LACCE لمدة 24 ساعة. تم تصنيع (كدنا) من خلايا ديترويت 551 المعنية التي عولجت بتركيزات مختلفة من LACCE باستخدام مجموعة SuperPrep Cell Lysis & RT من أجل qPCR (تويوبو ، أوساكا ، اليابان) التي تحتوي على كواشف تحلل وكواشف RT وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. للتأثير المضاد للتجاعيد على علاج LACCE ، تم تحديد كمية الجين المشفر Matrix Metalloproteinase -2 (MMP -2) بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) بناءً على إرشادات الشركة المصنعة. لتقييم الترطيب من خلال علاج LACCE ، تم فحص التعبير الجيني Aquaporin 3 (AOP3) بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي. في حالة المقايسة المضادة للالتهابات ، تم تحضين خلايا HaCaT بكثافة 5 × 1 0 4 خلايا لكل بئر في لوحة بئر 96- لمدة 24 ساعة. بعد إزالة الوسيط ، تم تشعيع UVB على خلايا HaCaT. بالنسبة لإشعاع UVB ، تم استخدام 5 مللي جول / سم بواسطة مربع الأشعة فوق البنفسجية CL -1000 (Analytik Jena AG ، Jena ، ألمانيا). بعد ذلك ، تمت معالجة التركيزات النهائية بنسبة 0.1 في المائة و 0.5 في المائة و 1 في المائة من LACCE لمدة 4 ساعات. استخدمنا الديكساميثازون (Dex) (Sigma-Aldrich) كعنصر تحكم إيجابي. من أجل التأثير المضاد للالتهابات لعلاج LACCE ، تم قياس التعبير عن الجينات التي تشفر COX2 و iNOS ، على التوالي ، بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي. تم تطبيع التعبير عن الجينات الفردية للتعبير الجيني GAPDH. 2.7. التقييم السريري لـ LACCE كعامل لمستحضرات التجميل في Vioo

أجرت شركة Ellead دراسة سريرية لتقييم فعالية LACCE في شد الوجه وتحسين التجاعيد حول الحجاج ومرونة الجلد وكثافة الجلد وسمك الجلد بعد الموافقة بناءً على إجراءات التشغيل القياسية (الإصدار 3. {{1} }) (Ellead ، Seongnam ، كوريا) من Ellead IRB وفقًا لإرشادات الممارسات السريرية الجيدة في كوريا (B 1-2015-4-002) التي وصفتها وزارة الغذاء وسلامة الأدوية (MFDS) وإجراءات التشغيل القياسية Ellead (EL-P { {4}}).

لفحص تأثير LACCE في الجسم الحي ، أجرينا تقييمًا سريريًا لـ LACCE لأربعة عوامل مختلفة: شد الوجه وتحسين التجاعيد حول الحجاج ومرونة الجلد وكثافة الجلد وسمك الجلد. لهذا الغرض ، شارك ما مجموعه 21 متطوعة بمتوسط ​​48.04 ± 4.28 سنة تم تقسيمهم إلى 12 متطوعة في الأربعينيات من العمر وتسعة متطوعين في الخمسينيات من العمر ، في التقييم السريري على مدى أربعة أسابيع.

تم إجراء الاختبار السريري في ثلاث نقاط زمنية مختلفة ، خط الأساس ، أسبوعين ، و 4 أسابيع لجميع المتطوعين. منذ أسبوع قبل بدء الدراسة وحتى النهاية ، لم يخضع جميع المتطوعين لعلاجات إضافية لتحسين الجلد ومستحضرات التجميل والمساعدات الصحية ، مما قد يؤثر على النتائج. بعد غسل وجوه المتطوعين باستخدام رغوة التنظيف ، وقف المتطوعون لمدة 30 دقيقة على الأقل في غرفة محكومة بدرجة حرارة ثابتة (20-24 درجة) ورطوبة (40 بالمائة -60 بالمائة من الرطوبة النسبية) . أجرينا القياس بشكل عشوائي على الجانب الأيسر أو الأيمن من وجوه المتطوعين. كان اختبارنا عبارة عن اختبار مزدوج التعمية حيث لم يكن الأشخاص ولا الباحثون يعرفون المنتج الذي كان عينة اختبار. تم وصف الصيغ لحساب المعدلات المنخفضة والمتزايدة في الجدول 1.

2.8. قياس شد الوجه وتحسين التجاعيد حول الحجاج

في الأساس ، تم قياس التجاعيد حول الحجاج ومرونة الجلد وكثافة الجلد وسماكة الجلد على الخد ورفع الوجه في زاوية الفم لجميع المتطوعين. بعد ذلك ، تم وضع عينتين مختلفتين ، LACCE ، وعلاج وهمي (التحكم) على المنطقة المحددة من الوجه مرتين في اليوم (صباحًا ومساءً). تم تقسيم المتطوعين إلى مجموعتين مختلفتين ، المجموعة الأولى (تم تطبيق LACCE على منطقة الوجه اليسرى بينما تم تطبيق الدواء الوهمي على منطقة الوجه اليمنى) والمجموعة الثانية (تم تطبيق الدواء الوهمي على منطقة الوجه اليسرى بينما تم تطبيق LACCE على منطقة الوجه اليسرى. منطقة الوجه اليمنى). بعد أسبوعين وأربعة أسابيع من العلاج ، أجريت نفس القياسات لتقييم تأثير LACCE مقارنة بتأثير الدواء الوهمي.

تم تحليل التجاعيد حول الحجاج باستخدام نظام قياس الجلد البصري ثلاثي الأبعاد (البعد) PRIMOS عالي الدقة (Canfield Scientific ، Parsippany ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وهو مثالي للتحقيق في البنية الدقيقة للجلد والتجاعيد. معلمتان مختلفتان للخشونة ، Ra (متوسط ​​الخشونة) ، وهي متوسط ​​القيم المطلقة لارتفاعات المظهر الجانبي لملف الخشونة ، و Rg (الجذر التربيعي لخشونة التربيع) ، وهو جذر المتوسط ​​التربيعي لمتوسط ​​ارتفاعات ملف التعريف ملف الخشونة ، تم قياسها.

تم استخراج هذا المقال من الجينات 2020 ، 11 ، 230 ؛ دوى: 10.3390 / genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes