سقالة كلوثو المضادة للشيخوخة التي يتم تنشيطها من خلال الجينات تعزز استجابة التجديد للشفاء من الجروح في الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية

3. مناقشة

هدفت هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثير الوظيفي لمضاد الشيخوخة - سقالة تنشط جينيًا على ADSCs للإنسان لتحسين تطبيقات التئام الجروح. بشكل عام ، وجدنا أن السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا توفر تنشيطًا محكومًا لقدرات ADSCs التجديدية كما هو موضح في الشكل5. على وجه التحديد ، عززت سقالة التنشيط الجيني بشكل عابر جذوع ADSCs من خلال تنشيط عامل النسخ أكتوبر -4. كما عززت السقالة التي يتم تنشيطها بواسطة الجين التنشيط المبكر للجين المضاد للليفية TGF- 3 ، عامل حاسم للشفاء الخاضع للرقابة مع تقليل الندبات. علاوة على ذلك ، فإن ADSCs المنشط يتحكم مؤقتًا في تكوين الأوعية البطانية ويدعم التئام الخلايا الليفية الجلدية من خلال إشارات paracrine. نحو النضج ، سيطرت ADSCs أيضًا على تنشيط الاستجابة المؤيدة للتليف في الخلايا الليفية الجلدية. وفي الوقت نفسه ، قامت ADSCs الموجودة على السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا بتجديد الغشاء القاعدي الجلدي بشكل فعال عن طريق تعزيز ترسب اللامينين والكولاجين الرابع. ارتبطت هذه الاستجابة أيضًا بتقليل الندبات المصاحبة -تعبير بروتين SMA وتحسين ترسب مصفوفة الإيلاستين النوعي. حددت دراستنا بشكل جماعي أن - تنشيط جين كلوثوسيستانشتمتلك إمكانات هائلة لالتئام الجروحويمكنتقدم العلاج القائم على الخلايا الجذعية لتجديد تطبيقات الشفاء.

الشكل 5. رسم تخطيطي للتأثير الوظيفي لسقالة B-Klotho التي يتم تنشيطها جينيًا على ADSCs البشرية لتطبيقات التئام الجروح. النتائج الرئيسية لهذه الدراسة هي (1) تعزيز عابر لتعدد القدرات للخلايا الجذعية والاستجابة المضادة للليف ، (2) تحسين التحكم في الباراكرين نحو تكوين الأوعية ، وإعادة تشكيل الكولاجين المؤيد للتليف في الخلايا الليفية الجلدية ، وفي النهاية ، (3) زيادة نضج الغشاء القاعدي مع التحكم في التعبير عن البروتينات المرتبطة بالندبة تشير الخطوط المنقطة لمصفوفة الإيلاستين إلى تحسين الترسيب النوعي.

انقر هنا لمعرفة كيفية حدوث ذلكآثار التئام الجروح

في استراتيجيات التئام الجروح ، يتم تطبيق العلاج الجيني القائم على البلازميد لتحسين الاستجابات الخلوية بشكل عابر حتى اكتمال إصلاح الجرح [37]. تظهر السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا أيضًا أن العلاج - يتم تنظيم جين كلوثو بشكل عابر على مدى 14 يومًا. التعبير المحسن بشكل ملحوظ (170- الطي) لملف يمكن أن يُعزى -Klotho mRNA في اليوم الثالث إلى محفز CMV المبكر والمعروف بتحسين التنشيط النسخي للجين المحوّل المشفر [38]. ومع ذلك ، في MSCs ، يمكن أن يخضع الفيروس المضخم للخلايا لمثيل الحمض النووي أو نزع هيستون الذي يمكن أن يقلل من التعبير الجيني [39]. علاوة على ذلك ، فإن البلازميدات عمومًا عبارة عن حلقات غير متكررة ، مما يحد من نقل الجين المحور إلى الخلايا المنقسمة ، ويسبب انخفاضًا في تعبير الجينات المحورة بمرور الوقت [40]. وجود علامات غير متجانسة تنشأ من التسلسلات البكتيرية لـيمكن أن يزيد البلازميد من قمع التعبير الجيني [41] ، يساهم بشكل عام في التعبير الجيني العابر.

أحد السبل المتبعة في علاج الجروح التي يصعب التئامها هو استخدام سقالات الخلايا النشطة بيولوجيًا. أحد الأسباب هو قدرتها على تعزيز الإصلاح السريع للجروح. تفرز الخلايا النشطة الأيضية في الكسب غير المشروع عوامل paracrine وتخضع للتمايز ، وتنظم أحداث الإشارات المعقدة في بيئة الجرح [42]. تتمتع الخلايا الجذعية ، على وجه الخصوص ، بقدرة فريدة على استشعار المحفزات الخارجية وتعديل استجابتها لاستعادة التوازن [43]. ومع ذلك ، تفقد الخلايا الجذعية جذورها عندما يتم توسيعها في المختبر لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا للتطعيم. تظهر دراستنا أنه يمكن تعزيز الجذعية بشكل عابر باستخدام سقالة تنشط بالجينات وتحمل جينًا مضادًا للشيخوخة -كلوثو. على وجه التحديد ، لاحظنا أن سقالة تنشيط الجينات المضادة للشيخوخة عززت التعبير عن جين الجذعية أكتوبر -4 في ADSCs. أكتوبر -4 هو أحد عوامل النسخ الرئيسية في الخلايا الجذعية الجنينية وضروري للتطور الجنيني المتحكم فيه [44]. في ADSCs ، يمكن أن يؤدي تنشيط جين {0}} أكتوبر إلى تعزيز تكاثرها وإمكانية التمايز [45]. وبالتالي ، فإن زيادة التعبير عن أكتوبر -4 قد تسهل التمايز السريع لـ ADSCs على السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا في الخلايا المضيفة وتساعد في عملية الشفاء.

بعد ملاحظة تنشيط جين أكتوبر -4 في ADSCs ، قمنا بعد ذلك بتقييم الفاعلية الوعائية لـ ADSCs. تولد الأوعية أمر بالغ الأهمية للتكامل الفعال للطُعم مع الأنسجة المضيفة [46]. تؤدي الخلايا الموجودة في الكسب غير المشروع إلى تكوين الأوعية الدموية من خلال إفراز عوامل الباراكرين. يعتبر تولد الأوعية أيضًا حدثًا حاسمًا في نمو الأنسجة الحبيبية ويقل نشاطها مع نضوج النسيج الحبيبي [47]. هذا القيد المبرمج للنشاط الوعائي في المراحل المتأخرة من الشفاء ضروري للسيطرة على التندب والتبييض المفرط الذي يمكن أن يعيق إعادة تكوين النسيج الظهاري [48]. تُظهر النتائج التي توصلنا إليها أيضًا أن ADSCs على السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا يمكن أن تعزز نمو البطانة وتتحكم في نموها من خلال إشارات paracrine. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الزيادات الكبيرة في النشاط الأيضي للخلايا البطانية وتنبت استجابةً لليوم 3 سم تُظهر إمكانات السقالة المُفعَّلة بالجينات ADSCs للتكامل مع الأنسجة المضيفة بسرعة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجذعية CM هو نهج خالٍ من الخلايا يتم تبنيه بشكل شائع لتحسين جودة التئام الجروح [49]. كحد من القيود ، نقر بأن الخلايا البطانية الجلدية للبالغين ستخدم نموذجًا أفضل للخلية لدراسة تكوين الأوعية الدموية. ومع ذلك ، للحفاظ على الاتساق مع دراساتنا السابقة ويتم قبول HUVECs على نطاق واسع باعتبارها مرشح خلية "المعيار الذهبي" [50] ، اعتمدنا مقايسة تولد الأوعية HUVECs.

تعد الزيادة في نشاط إعادة تشكيل الخلايا الليفية سمة عامة لنضج الأنسجة الحبيبية [51]. خلال هذه المرحلة ، يتم استبدال مصفوفات الكولاجين 3 تدريجيًا بألياف كولاجين 1 أقوى [51]. ثم تعزز ألياف الكولاجين تقلص الجرح [52] ، ولا غنى عن تقلص الجرح لإغلاق الجرح بالكامل [53]. ومع ذلك ، فإن الزيادة المستمرة في ترسب الكولاجين 1 يمكن أن تزيد من تكوين الندبات [54]. يعد التحكم في التندب أمرًا بالغ الأهمية لأنه يمكن أن يمنع نمو الزوائد الجلدية الأخرى مثل بصيلات الشعر والغدد الدهنية والغدد العرقية ، على سبيل المثال ، في جروح الحروق [54]. توضح النتائج التي توصلنا إليها أن العمر (14 يومًا) سم من مجموعة السقالات التي يتم تنشيطها جينيًا يمكن أن يتحكم في تعبير الكولاجين المؤيد للليفية I في الخلايا الليفية الجلدية للبالغين. حدث هذا التأثير الخاضع للرقابة على الخلايا الليفية دون مزيد من التأثير على هجرة الأرومة الليفية أو تعبيرات الكولاجين المضاد للليفية III الخاصة بها بالنسبة إلى مجموعة السقالات الخالية من الجينات. لذلك ، نقترح أن السقالة المنشّطة بالجينات ADSCs قد توفر تحكمًا أفضل في الحد من الندوب في الجسم الحي من خلال تعبير الكولاجين الأول الخاضع للرقابة. أظهر Li et al. أيضًا أن ADSCs CM يمكن أن يقلل بشكل كبير من تعبير الكولاجين I في الخلايا الليفية المشتقة من الندوب الضخامية [55]. أظهرت دراسة أخرى قام بها وانج وزملاؤه انخفاضًا مشابهًا في تعبير الكولاجين الأول في الأرومات الليفية المشتقة من الجُدرة [56] ، مما يدل بشكل جماعي على القدرة المضادة للليفية في CM ADSCs.

واحدة من النتائج الهامة التي لاحظناها مع تطبيق -سقالة كلوثو المنشط جينيًا هي التجديد المعزز للغشاء القاعدي في ADSCs. إن تجديد الغشاء القاعدي ضروري لنضوج الأوعية الدموية وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري بالكامل [57,58]. الأهم من ذلك ، الاتجاه الذي يتم فيه اللامينين البروتينات(2. 1- طية) والكولاجين الرابع (8. 8- أضعاف) تشير أيضًا إلى زيادة نضج الغشاء القاعدي في مجموعة السقالات التي تنشط الجينات [59]. إلى جانب العمل كعامل مضاد للشيخوخة [60] ، يعمل بيتا كلوثو على تعزيز الحساسية لعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) بواسطة مستقبلات FGF [61]. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على زيادة في إشارات FGF لتعزيز نضوج الغشاء القاعدي من خلال ترسب اللامينين والكولاجين IV [62]. لذلك ، بالنظر إلى دور بيتا كلوثو كمستقبل مشارك لـ FGF ، من المحتمل أن يتم التوسط في زيادة النضج القاعدي في مجموعة السقالات التي تنشط الجينات عن طريق زيادة إشارات FGF الخاصة بـ ADSCs.

عنصر الغشاء القاعدي الذي تم تنظيمه بشكل ملحوظ في مجموعة السقالات التي يتم تنشيطها جينيًا هو بروتين الكولاجين الرابع. يمثل بروتين الكولاجين الرابع 50 بالمائة من جميع أغشية القاع [63] ويوفر الاستقرار الهيكلي للغشاء القاعدي [59]. ومع ذلك ، فإن الشيخوخة تقلل بشكل كبير من تعبير الكولاجين الرابع في الموصل الجلدي والبشرة [58,64] ونقص الكولاجين الوريدي يمكن أن يعزز إمراض الندبات [65]. وبالتالي ، تشير نتائجنا إلى أن الفعالية التجديدية المتزايدة للغشاء القاعدي للسقالة التي يتم تنشيطها بواسطة الجينات ADSCs يمكن أن تساعد بشكل كبير في تحسين الشفاء لدى المرضى المسنين. أظهرت دراسات أخرى أيضًا أن ECM المشتق من الأنسجة الدهنية يمتلك إمكانات علاجية هائلة لإصلاح الجلد [66]. علاوة على ذلك ، فإن الطعوم المهندسة بالأنسجة الغنية باللامينين والكولاجين الرابع هي أيضًا ذات أهمية لإصلاح الظهارة التنفسية [67]. 

بالإضافة إلى التحكم المؤيد للليفية تجاه الخلايا الليفية ، توضح دراستنا أيضًا أن ADSCs في السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا تعبر أيضًا عن 2- تعبيرًا منخفضًا عن البروتين المرتبط بالندبة -SMA [68]. على الرغم من أننا لم نقم بتقييم تأثيره في الجسم الحي ، إلا أن الانخفاض المحلي -تعبير SMA ضروري لتحسين الشفاء النوعي [69]. استخدام العوامل الليفية مثل البليوميسين [70] يمكن أن تكون إحدى الطرق لتقييم الخصائص المضادة للليفية بشكل أفضل لبناء سقالة ADSCs / الجين المنشط في المختبر ؛ ومع ذلك ، كان تركيزنا على تحديد الإمكانات العلاجية المؤقتة للبناء.

هناك مؤشر آخر على أن السقالة المنشَّطة بالجينات ADSCs قد تحسن الشفاء النوعي وهو ترسب مصفوفة الإيلاستين الليفية بدلاً من الإفرازات خارج الخلية غير المنتظمة في مجموعة السقالات الخالية من الجينات. يُعد ترسيب الإيلاستين أحد الأنشطة الرئيسية التي تدفع الجنين إلى التئام الجروح بدون ندوب [71]. ومع ذلك ، تفتقر جلود البالغين إلى ترسب الإيلاستين [71]. على هذا النحو ، غالبًا ما يتم دمج التروبولاستين ، سلائف الإيلاستين ، في سقالات المواد الحيوية للتحكم في التندب في التئام الجروح [72]. مجتمعة ، تشير خماسياتنا إلى أن ADSCs / - قد يمنح بناء سقالة تنشيط الجين كلوثو استجابة قوية مضادة للليف في الجسم الحي.

4. المواد والطرق

4.1 إعداد سقالة تنشيط الجينات

تم تطوير السقالة التي يتم تنشيطها جينيًا باستخدام عملية خطوة 2-. أولاً ، تم تصنيع سقالات كبريتات كولاجين شوندروتن الصلبة المسامية بواسطة ملاط ​​تجفيف من الكولاجين البقري من النوع 1 وكبريتات شوندرويتين -6- المشتقة من غضروف سمك القرش (سيغما ، المملكة المتحدة). تم استخدام عملية التجميد والتجفيف المُحسَّنة المصممة لإنشاء مسام موحدة لإنتاج السقالات [73]. بناءً على بروتوكولنا المنشور [74] ، تم بعد ذلك معالجة السقالات المجففة بالتجميد بالجفاف (DHT) عند 105◦C تحت الفراغ للتعقيم والتحسين الميكانيكي. تم بعد ذلك ربط السقالات المعقمة كيميائيًا بـ 14 ملي مولار - (3- ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -N'-ethylcarbodiimide هيدروكلوريد و 5.5 ملي مولار N-Hydroxysuccinimide (2.5 ملي مولار نسب من EDC / NHS) (سيغما ، المملكة المتحدة) زيادة تحسين الاستقرار الميكانيكي [75]. تم بعد ذلك غسل السقالات المتصالبة باستخدام PBS (Gibco ، Paisley ، UK) لإزالة المواد الكيميائية المتبقية. بمجرد أن تصبح السقالات جاهزة ، تم تحضير البوليبلكس بنسبة N / P10 (نسبة النيتروجين إلى الفوسفات) عن طريق خلط حجم محدد مسبقًا من محلول البولي إيثيلين أمين المتفرع (PEI) مع ترميز DNA البلازميد (pDNA) لجين بيتا كلوثو البشري ( -Klotho) ، تم الحصول عليها من SinoBiological ، بكين ، الصين. تم اختيار نسبة N / P10 بناءً على دراساتنا السابقة التي وجدت أن polyplexes المصممة بنسبة N / P 10 يمكن أن تشكل بشكل فعال جسيمات نانوية موجبة صغيرة ومستقرة ببلازميدات كبيرة مثل GLuc (5.76 كيلو بايت) [21,23]. قبل الاستخدام ، تم تخفيف البلازميدات في ماء خالٍ من السموم الداخلية للحصول على تركيز عاملمن 0 .5µg/µL. يحتوي البلازميد على الفيروس المضخم للخلايا المبكر المعزز البشريمروج (CMV3) لتعزيز التعبير المستقر والعابر للشفرةالجين في خلايا الثدييات.

تم السماح لمزيج البلازميد / PEI بالاستقرار لمدة 30 دقيقة للتجميع الذاتي في بوليبلكسالجسيمات النانوية. تم بعد ذلك نقع الجسيمات النانوية في السقالات عن طريق الماصاتأحجام متساوية من محلول بوليبلكس لكل جانب من جوانب السقالة. ما مجموعه 2µكان g pDNAتستخدم لكل سقالة لتطوير سقالة تنشيط الجينات.

4.2 بذر الخلية على - سقالة كلوثو المنشط جينياً

تم توسيع ADSCs البشرية (iXCells Biotechnologies ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى المرور 4 في وسط نمو ADSCs (Cat رقم MD0003) الذي توفره الشركة. ما مجموعه 5× 105 ADSCs (2.5× 105 لكل جانب) لكل سقالة خالية من الجينات (تحكم ،n = 3) أو سقالة تنشيط الجينات (اختبار ،n = 3). بعد ترك الخلايا تستقر لمدة 20 دقيقة تقريبًا ، تمت إضافة 2 مل من وسائط تعداء OptiMEM (Gibco ، المملكة المتحدة) ، وتم تحضين السقالات الخلوية عند 37◦C لمدة 24 ساعة. بعد فترة الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم نقل السقالات الخلوية الخالية من الجينات أو التي تنشط الجينات إلى 12- لوحات جيدة ، وتم تغذيتها بـ 2 مل من وسط نمو ADSCs. تم إجراء تغيير الوسائط بعد ذلك كل 3-4 أيام حتى اليوم 14 عن طريق جمع 1 مل من الوسائط المكيفة (CM) واستبدالها بحجم متساوٍ من الوسائط الجديدة. تم تخزين جميع CM في−80 ◦ج حتى التحليل.

4.3 تحليلات qRT-PCR لتحديد -كلوثو الإفراط في التعبير الجيني وتنشيط الجينات الوظيفية

من أجل تحديد التنظيم العابر للجينات المستهدفة ، تم حصاد الخلايا في اليوم الثالث (المبكر) واليوم الرابع عشر (المتأخر) بعد البذر على السقالات الخالية من الجينات أو التي تنشطها الجينات. تم تحلل الخلايا لأول مرة باستخدام كاشف تحلل Qiazol (Qiagen ، Germantown ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تمت إضافة الكلوروفورم لفصل محللة الخلية إلى مراحل البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي. باستخدام RNeasy Kit (Qiagen ، مانشستر ، المملكة المتحدة) ، تم استخراج الحمض النووي الريبي ، وتم تحديد جودتها وكميتها باستخدام قارئ لوحة Multiskan Go (Thermo Scientific ، المملكة المتحدة) مع ضبط الامتصاص عند 260 نانومتر. تمت إزالة الحمض النووي الجينومي بعد ذلك عن طريق خلط الحمض النووي الريبي مع محلول إزالة الحمض النووي الجيني (Qiagen ، مانشستر ، المملكة المتحدة) والتسخين إلى 42◦C لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، تم إجراء النسخ العكسي لإعداد (كدنا). تكرارات (كدنا) لكل تكرار (n = 3) في لوحات qRT-PCR ثم تم تشغيل الاختبار باستخدام البادئات المدرجة في الجدول1. تم حساب تغيير أضعاف في تعبير mRNA بالنسبة للخلايا الموجودة على السقالة الخالية من الجينات باستخدام 2−∆∆CTطريقة من متوسطات ثلاث مكررات لكل مجموعة. تم استخدام Human GAPDH (Hs _ GAPDH _1_ SG ، Cat. No. QT00079247) كجين التدبير المنزلي.

4.4. تحليلات النشاط الحيوي للعوامل السرية من ADSCs وما فوق - سقالة كلوثو المنشط جينياً

4.4.1. تحليلات النشاط الحيوي المؤيدة لتولد الأوعية

4.4.2. تحليلات شفاء الخلايا الليفية الجلدية ونضجها

بعد اختبار تكوين الأوعية ، قمنا بفحص فاعلية CM للشفاء الجلدي من خلال استخدام اختبار خدش للأرومات الليفية الجلدية البشرية البالغة (iXcells ، Cat رقم 10 HU -014). في هذه الدراسة ، اخترنا على وجه التحديد CM العمر من اليوم 14 لدراسة تأثيره على إغلاق جرح الخلايا الليفية أثناء النضج. ما مجموعه 1× 104 تم زرع الخلايا / البئر في 96- صفيحة البئر واحتضانها طوال الليل في وسط نمو الخلايا الليفية. في اليوم التالي ، تم إنشاء جرح على الطبقة الأحادية عن طريق خدش طرف ماصة 200 ميكرولتر أفقيًا عبر البئر. ثم تم شطف الطبقة الأحادية باستخدام PBS لإزالة أي حطام وتغذيتها بـ CM. تم تسجيل إغلاق الجرح بين 12-16 ساعة بعد الخدش. تم استخدام المناعة المناعية لدراسة التعبير عن الكولاجين المؤيد للليفية 1 (1: 100 ، Novusbio ، المملكة المتحدة) والكولاجين المضاد للليفية III (1: 100 ، Novusbio ، المملكة المتحدة) في الخلايا الليفية. تمت مقاومة الخلايا الليفية بالرودامين (1: 800 ، Abcam ، المملكة المتحدة) لتصوير F-actin. تم إجراء المناعية كما هو موضح في القسم4.5، باستثناء معالجة الأنسجة وإزالة الكافيين. تم استخدام كل من HUVECs والخلايا الليفية في المقطع 4.

4.5 التصوير المناعي لبروتينات المصفوفة خارج الخلية

بعد 14 يومًا من الثقافة ، تم حصاد السقالات الخلوية الخالية من الجينات أو الجينات النشطة للكشف عن ترسب المصفوفة باستخدام التألق المناعي. تم إجراء معالجة العينات كما هو موضح سابقًا. باختصار ، تم غسل السقالات أولاً باستخدام PBS وتثبيتها في 10 في المائة من الفورمالين المخزن المحايد لمدة 20 دقيقة. ثم تمت معالجة العينات الثابتة باستخدام البروتوكول القياسي لإزالة الكافيين. ثم تم تقطيع الكتل إلى 7-µشرائح سميكة م وتجميعها على شرائح مشحونة. تم بعد ذلك نزع الكافيين عن الأقسام باستخدام زيلين متبوعًا بإعادة تميؤ القسم مع تدرجات متناقصة من الإيثانول. بعد ذلك ، تم نفاذية الخلايا بـ 0. 2 بالمائة توين®20 (Sigma-Aldrich ، فرنسا) في PBS لمدة 30 دقيقة (غسل 10 دقيقة× 3) وحظر باستخدام 1 0 بالمائة NGS (Normal Goat Serum ، Invitrogen ، Rockford ، IL ، USA) / 5 بالمائة BSA / 0.3 M Glycine (تم تحضيره في محلول permeabilizing) لمدة ساعة واحدة. بعد الحجب ، تم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني ثم حضنتها عند 4◦C بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة لاستهداف بروتينات المصفوفة المدرجة في الجدول2. في اليوم التالي ، تم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 2-3 دقائق لإزالة أي أجسام مضادة أولية غير مرتبطة. بعد ذلك ، تم تحضين الشرائح إما في Alexa 488- الماعز المترافق المضاد للفأر IgG (A32723 ، Invitrogen ، المملكة المتحدة) أو Alexa 594- الماعز المترافق المضاد للأرنب IgG (A11012 ، Invitrogen ، المملكة المتحدة) عند 1: 800 تمييع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في الظلام. تم إجراء خطوة الشطف كما كان من قبل وتم تجاعيد النوى باستخدام وسيط التركيب مع DAPI (ab104139 ، Abcam ، المملكة المتحدة). تم بعد ذلك تصوير الشرائح باستخدام مجهر مضان (أوليمبوس BX43 ، اليابان) في 20× موضوعي. تم استخدام العينات المحتضنة مع الأجسام المضادة الثانوية فقط كعناصر تحكم.

قياس الصورة

Image] تم استخدام برنامج (صورة ، NIH ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد كمية البروتينات المعبر عنها بشكل شبه كمي. لكل علامة ، تم تحديد قيمة عتبة ثابتة أولاً من خلال التصوير الأولي لأقسام مختلفة. باستخدام قيمة عتبة المجموعة المتكاملة ، تم تحديد الكثافة المتكاملة (المنطقة الملطخة × متوسط ​​القيمة الرمادية) للصور ثم تطبيعها مع عدد الخلايا (عد DAPI) لإعطاء متوسط ​​كثافة مضان نهائي لكل خلية. تم قياس متوسط ​​عدد الصور العشوائية 8-10 لكل تكرار بحد أدنى ثلاث مكررات لكل مجموعة. ثم تم استخدام المتوسطات التي تم الحصول عليها من التكرارات / المجموعة الثلاثة لقياس التعبير النسبي بين المجموعات.

4.6 تحليل احصائي

يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها تعني بالإضافة إلى الانحراف المعياري. تم استخدام اختبار t ثنائي الذيل غير المزدوج بشكل عام لحساب الدلالة الإحصائية بين المجموعات ، حيث تم اعتبار p <0. 05 لتكون مهمة

أظهرت هذه الدراسة أنمكافحة الشيخوخة - تنشيط كلوثو الجيني cistancheالعروض الخاضعة للرقابة تفعيل القدرة التجديدية لـ ADSCs. النتائج الرئيسية لهذه الدراسة هي (1)تعزيز عابر لتعدد القدرات للخلايا الجذعية والاستجابة المضادة للليف, (2)تحسين السيطرة على paracrine نحو تكوين الأوعية، وإعادة تشكيل الكولاجين الموالية للليففي الخلايا الليفية الجلدية ، وفي النهاية (3)زيادة نضج الغشاء القاعديمع السيطرة على تعبير البروتينات المرتبطة بالندبة. بشكل قاطع ، تشير هذه النتائجأن ADSCs محملة -قد تمتلك سقالة كلوثو المنشط جينيًا إمكانات كبيرة أمعالجة مجموعة واسعة من الجروح الجلدية.

الموارد ، ALL ، FJO و MBK ؛ تنظيم البيانات ، ALL و MBK ؛ الكتابة - إعداد المسودة الأصليةالكل ؛ كتابة - مراجعة وتحرير ، ALL و FJO و MBK ؛ التصور ، الكل ؛ إشراف،FJO و MBK ؛ إدارة المشروع ، MBK ؛ اقتناء التمويل ، FJO و MBK جميع المؤلفينقرأت النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقت عليها.

تضارب المصالح:يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

مراجع

1. Laiva، AL؛ أوبراين ، FJ ؛ Keogh، MB الابتكارات في أنظمة توصيل الجينات وعوامل النمو من أجل التئام الجروح السكري.J. الأنسجة المهندس. ريجين. ميد.2018, 12, e296–e312. [كروسريف] [PubMed] 

2. ماكرانتوناكي ، إي. Wlaschek ، M. ؛ Scharffetter-Kochanek ، K. التسبب في اضطرابات التئام الجروح لدى كبار السن.JDDG J. Dtsch. ديرماتول. جيس.2017, 15, 255–275. [كروسريف] [PubMed]

3. جانجولي ، ب. الجوهري ، ج. بورسكا ، AN ؛ بونشل ، ف. جيانوديس ، PV ؛ جونز ، EA تحليل الشيخوخة في الجسم الحي في الخلايا اللحمية اللحمية المتوسطة لنخاع العظم البشري باستخدام مقايسة الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة والمقايسة CD45lowCD271 بالإضافة إلى النمط الظاهري.كثافة الخلايا الجذعية.2019, 2019, 5197983. [كروسريف] 

4. Westerweel، PE؛ ترعة ، م. رفيفي ، س. جاسبرز ، جي إي ؛ أبيض ، IA ؛ هوبر ، أت ؛ Verhaar ، MC ضعف تعبئة الخلايا البطانية السلفية وسدى نخاع العظم المختل في داء السكري.بلوس واحد2013, 8, e60357. [كروسريف] 

5. موراي ، RZ ؛ الغرب ، ZE ؛ كوين ، AJ ؛ Farrugia، BL تطوير واستخدام المواد الحيوية كعلاجات التئام الجروح.يحرق. صدمة2019, 

6. [كروسريف] [PubMed] 6. إبراهيمي ، تيراغرام. بوزوليت ، ف. سكويبان ، سي. بوارد ، ف. André، م. ابن عم ، ب. Tamarat، R. العلاج الخلوي الذي يعتمد على الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية يعزز التئام الجروح الفسيولوجية والمرضية.الشرايين. ثرومب. فاسك. بيول.2009, 29, 503–510. [كروسريف] 

7. وو ، واي. تشين ، إل. سكوت ، PG ؛ تعمل الخلايا الجذعية الوسيطة Tredget، EE على تعزيز التئام الجروح من خلال التمايز وتكوين الأوعية.الخلايا الجذعية2007, 25, 2648–2659. [كروسريف] [PubMed] 

8. فوبرت ب. غونزاليس ، م ؛ Teodosescu، S. بيرارد ، ف. دويل إيزيل ، م. يكالا ، ك. Fraser، JK Adipose-المشتق من العلاج بالخلايا المتجددة لعلاج الجروح الناتجة عن الحروق: مقارنة بين طريقتين للإيصال.حال. العناية بالجروح2016, 5, 288–298. [كروسريف] [PubMed]

9. عاصي ر. فوستر ، TR ؛ هو ، ح. ستاماتي ، ك. باي ، ح. هوانغ ، واي. دارديك ، أ. إن تسليم الخلايا الجذعية الوسيطة في سقالات مُحاكية بيولوجيًا يعزز التئام القرحة السكرية.ريجين. ميد.2016, 11, 245–260. [كروسريف] [PubMed] 

10. جيانغ ، واي. تشين ، ب. ليو ، واي. Zhufu ، Z. ؛ يان ، العاشر ؛ هوى ، العاشر. تان ، Q. تأثير سقالة الكولاجين مع خلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية المشتقة من الدهون على التئام الجروح السكري: دراسة في نموذج الخنازير السكري.هندسة الأنسجة. ريجين. ميد.2013, 10, 192–199. [كروسريف] 

11- الفالنجا ف. Sabolinski، M. بناء جلد حي ذو طبقات ثنائية (APLIGRAF®) يسرع الإغلاق الكامل للقرحات الوريدية التي يصعب شفاءها.تجديد إصلاح الجروح.1999, 7, 201–207. [كروسريف] 12. هارت ، م. لوين رودريغيز ، أ. Lessem، J. Dermagraft: يستخدم في علاج الجروح المزمنة.حال. العناية بالجروح.2012, 1, 138–141. [كروسريف] [PubMed] 13. دينه ، TL ؛ فيفز ، أ. فاعلية أبليجراف في علاج تقرحات القدم السكرية.بلاست. إعادة شرح. سورج.2006, 117, 152S–157S. [كروسريف] [PubMed]

14. إيجلشتاين ، WH ؛ Falanga، V. هندسة الأنسجة وتطوير Apligraf®، وهو ما يعادل جلد الإنسان.كلين. هناك.1997, 19, 894–905. [كروسريف] 

15. جيانغ ، تي. شو ، جي ؛ وانغ ، س. يانغ ، إل. زينج ، إل. تشاو ، ياء ؛ Zhang، X. في المختبر ، أدى التوسع إلى إضعاف جذعية الخلايا الجذعية الوسيطة للممر المبكر لعلاج عيوب الغضاريف.ديس موت الخلية2017, 8, e2851. [كروسريف] [PubMed]

16. ليو ، ج. دينغ ، واي. ليو ، زي. ليانغ ، إكس. الشيخوخة في الخلايا الجذعية الوسيطة: التعديلات الوظيفية ، الآليات الجزيئية ، واستراتيجيات التجديد.أمام. تطوير الخلية. بيول.2020, 8, 258. [كروسريف] [PubMed] 

17. وانج ، دبليو. شو ، العاشر ؛ لي ، زي. ليندلين ، أ. Ma، N. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية الوسيطة عن طريق توصيل الجينات غير الفيروسية.كلين. هيمورهيول. مايكرو سيرك.2014, 58, 19–48. [كروسريف] 

18. Deveza، L .؛ تشوي ، ياء ؛ لي ، ياء ؛ هوانغ ، ن. كوك ، ياء ؛ يانغ ، ف. التعبير الزائد CXCR4 الناجم عن الجسيمات النانوية الناجم عن البوليمر يحسن تجدد الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة في نموذج إقفار هيندليمب للفأر.ثيرانوستيكس2016, 6, 1176–1189. [كروسريف] [PubMed] 

19. أوبراين ، إف جي المواد الحيوية والسقالات لهندسة الأنسجة.ماتر. اليوم2011, 14، 88-95. 20. ياناس أنا. تزيرانيس ​​، د. هارلي ، ب. لذلك ، P. سقالات نشطة بيولوجيًا قائمة على الكولاجين: تقدم في المعالجة والتوصيف.فيلوس. عبر. R. Soc. الرياضيات. فيز. م. علوم.2010, 368, 2123–2139. [كروسريف] 

21. Laiva، AL؛ رافتري ، RM ؛ كيو ، ميغابايت ؛ O'Brien، FJ Pro-angiogenic effect of SDF -1 السقالات المستندة إلى الكولاجين المنشط جينيًا في تكوين الأوعية الدموية التي تحركها الخلايا الجذعية.كثافة العمليات J. فارم.2018, 544, 372–379. [كروسريف] [PubMed] 

22. Lackington، WA؛ رافتري ، RM ؛ O'Brien، FJ الفعالية المختبرية لقناة توجيه عصبية تنشيط الجينات تتضمن جزيئات نانوية غير فيروسية تحمل تشفير الجينات لـ NGF و GDNF و c-Jun.اكتا بيوماتر.2018, 75, 115–128. [كروسريف] 

23. تيرني ، EG ؛ دافي ، GP ؛ Hibbitts ، AJ ؛ كريان ، سا ؛ O'Brien، FJ تطوير المصفوفات غير الفيروسية التي يتم تنشيطها جينيًا لتجديد العظام باستخدام سقالات البولي إيثيلين أمين (PEI) والسقالات القائمة على الكولاجين.J. التحكم. يطلق2012, 158, 304–311. [كروسريف] [PubMed] 24. Laiva، AL؛ أوبراين ، FJ ؛ كيو ، MB SDF -1 تعمل سقالة الكولاجين المنشط جينيًا على التمايز الوظيفي لخلايا شوان البشرية لتطبيقات التئام الجروح.التكنولوجيا الحيوية. بيونج.2021, 118, 725–736. [كروسريف] [PubMed]