نشاط مضاد للألم من Cistanche Salsa Stolons ، المتزايد في جمهورية كازاخستان

المواد النباتية

Cistanche الصلصا(كامي) بيك ، Orobanchaceae ،تم جمع stolons في صحراء Moinkum ، قرية Bakanas ، في يوليو 2014 في ألماتي. تم التعرف على المادة النباتية بواسطة الدكتور ج. سيتباييفا من معهد علم النبات والإنتاج النباتي بوزارة التعليم والعلوم في جمهورية كازاخستان حيث تم إيداعها تحت الرقم 01-04 / 306.

تحليل كيميائي

ستولونسجيم الصلصا(2 جم) تم إخضاعها لاستخراج الميكروويف. في البداية تم طحن المادة إلى 0. 0 01-2. 000 مم ثم وضعها في وعاء محكم لاستخراجها لمدة 10 دقائق عند 100-1100 درجة مع الإيثانول 80 بالمائة ( نسبة 1:10). تم تحليل مستخلص الهيدرويثانول (CSHE) بواسطة HPLC-MS. يذاب المستخلص الخام في ميثانول (9.6 مجم / مل) ويرشح خلال 0.45مم غشاء تفلون قبل التحليل. نموذج كروماتوجراف سائل HP 1100 Series (شركة Agilent Technologies ، Inc. ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مزود بمزيل غاز متدفق ، ومضخة متدرجة منخفضة الضغط بأربع قنوات ، ومضخة تلقائيةحاقن. تم فصل المركبات الفينولية كروماتوجرافيًا بواسطة عمود Zorbax Eclipse XDB-C18 ، 2.1× 50 مم ، مليئة ببوليمر جيل سيليكا أوكتاديسيل سيليل (1.8μ). تم إجراء التحليل الكروماتوغرافي بتدفق طور متحرك يبلغ 0 .2مل / دقيقة ، ضغط تشغيل شديد من 175 إلى 2 0 0 كيلوباسكال ، درجة حرارة فرن العمود 30 درجة ، حجم عينة 2 مل ، وضع تغذية شطف متدرج: 0-36 دقيقة 10 بالمائة A - 90 بالمائة ب؛ 36 دقيقة - 100 بالمائة ب (eluent A: ميثانول ، eluent B: 0.2 بالمائة محلول حمض الفورميك). تم إجراء الكشف بواسطة الأشعة فوق البنفسجية بأطوال موجية 254 و 334 و 350 و 410 و 450 و 550نانومتر. تم استخدام مقارنة فترات الاستبقاء التي تم الحصول عليها والأشعة فوق البنفسجية وأطياف الكتلة مع تلك الخاصة بالمركبات المرجعية لتحديد المركبات الكيميائية في المستخلص. تم إجراء التحليل الكمي باستخدام معيار فيرباسكوسايدو echinacoside تحليلها تحت نفس الظروف الكروماتوغرافية. تسمح منحنيات المعايرة الخاصة بهم بحساب كمية كل من phenylpropanoid الآخرجليكوسيد في مستخلص الإيثانول لهذا النبات. لم يتم التحقق من صحة الطريقة.

الحيوانات

فئران ويبستر السويسرية (20-25g ، شهرين من العمر) في هذه الدراسة (تم التبرع بها من قبل Instituto Vital Brazil ، Niterói ، RJ ، البرازيل). تم الاحتفاظ بالحيوانات في ظروف قياسية (دورة مظلمة فاتحة تبلغ 12 ساعة و 22 ± 2 درجة ورطوبة 70-80 بالمائة. الطعام والماءبالشهرة الإعلانية). لا تتلقى الحيوانات سوى الماء من أجل تجنب تدخل الغذاء في امتصاص المادة 12ح قبل بدء التجارب. حدث التأقلم مع ظروف المختبر لمدة 1 على الأقل ح قبل كل اختبار. تم إجراء جميع البروتوكولات وفقًا للمبادئ التوجيهية الخاصة بالمعايير الأخلاقية للتحقيق في الألم التجريبي في الحيوانات واتبعت المبادئ والإرشادات التي اعتمدها المجلس الوطني للسيطرة علىتجربة الحيوانات (CONCEA) ، التي تمت الموافقة عليها من قبلمعهد العلوم الطبية الحيوية / UFRJ ، اللجنة الأخلاقية لأبحاث الحيوان ، وحصل على الرقم DFBCICB 015-04 / 16. تم تنفيذ جميع البروتوكولات التجريبية خلال مرحلة الضوء. تم الاحتفاظ بأرقام الحيوانات لكل مجموعة كحد أدنى ووفقًا لقواعد CONCEA. في نهاية كل تجربة تم قتل الفئران بجرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين.

العلاجات

في هذه الدراسة تم تقييم CSHE في 10 و 30 و 100 ملغم / كغم. تمت إذابة المستخلص في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ، Fisher Biotech) من أجل تحضير محلول مخزون عند 100 ملغ / مل. تم استخدام برنامج تلفزيوني كمخفف لتحضير الجرعات المختلفة. المحاليل التي تحتوي على 10 و 30 و 100ملغم / كغم من مستخلص الهيدرويثانولجيم الصلصاتم تحضيرها. كانت الأدوية القياسية المستخدمة هي المورفين 2.5ملغم / كغم (ميرك ، مخفف في محلول ملحي فوسفاتي (PBS)) ، حمض أسيتيل الساليسيليك 200مجم / كجم (Sigma Aldrich ، مذاب في 5م من هيدروكسيد الصوديوم(هيدروكسيد الصوديوم) في 0. 9 بالمائة ملحي) وكبسازيبين 10 nMol لكل مخلب. أعطيت Saline plus DMSO (بنفس التركيز كما في أعلى معاملة بالمستخلص) لمجموعة التحكم السلبية. تم إعطاء جميع العلاجات (المستخلص والمعايير المختبرة) عن طريق الفم. كان الاستثناء الوحيد هو الكسازيبين الذي تم إعطاؤه عن طريق الحقن داخل العظم.

الآلام الحادة التي يسببها الفورمالين

تم حقن محلول 2.5 بالمائة فورمالين (37 بالمائة فورمالدهيد) (20ul) في المنطقة الأخمصية من القدم الخلفية اليمنى للفئران 60دقيقة بعد العلاج (مستخلص الهيدرويثانول منجيم الصلصاأو حمض أسيتيل الساليسيليك 2 0 0 مجم / كجم أو المورفين 2.5 مجم / كجم) (Matheus et al.، 2005). تم وضع الحيوانات بشكل فردي في حجرة زجاجية شفافة وتم تسجيل وتحليل المدة الزمنية بالثواني التي قضوها في لعق مخالبهم بعد حقن الفورمالين على فترتين منفصلتين ، المرحلة المبكرة من الألم العصبي (0-5 دقائق بعد الحقن) و المرحلة المتأخرة من الألم الالتهابي (15-30 دقيقة بعد الحقن).

الشعور بالألم الناجم عن الكابسيسين

اعتمد هذا الاختبار على الطريقة التي وصفها Sakurada et al. مع بعض التعديلات (ساكورادا وآخرون ، 1992). كبخاخات (20 ميكرولتر) ج18H27لا3(Galena ، Campinas ، SP) في المنطقة الأخمصية من المخلب الخلفي الأيمن للفئران (1.6 ميكروغرام / مخلب) بعد ساعة واحدة من العلاج (مستخلص الهيدرويثانول منجيم الصلصاأو capsazepine 1 0 nMol / paw). تم وضع الحيوانات بشكل فردي في غرفة زجاجية وتم تسجيل مدة (فترات) لعق المخالب بين 0 و 5دقيقة بعد حقن الكابسيسين ثم تحليلها.

الشعور بالألم الناجم عن الغلوتامات

في الطريقة التي وصفها بيريث وآخرون. (2002) ، محلول الغلوتامات في برنامج تلفزيوني (20 ماي) (l- تم حقن حمض الجلوتاميك ، سيجما الدريتش ، 3.7 نانوغرام / قدم) في المنطقة الأخمصية من المخلب الخلفي الأيمن للفئران بعد ساعة واحدة من العلاج (مستخلص الهيدرويثانول منجيم الصلصاأو المورفين 2.5 مجم / كجم). تم وضع الحيوانات بشكل فردي في غرفة زجاجية وتم تسجيل مدة لعق المخالب (بالثواني) بين 0 و 15 دقيقة بعد حقن الغلوتامات ثم تحليلها.

تحليل احصائي

يتم تقديم البيانات الكيميائية على أنها متوسط ​​± SD لخمس تجارب. تتكون جميع المجموعات التجريبية الدوائية من ستة فئران على الأقل. سمح تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Dunnett بتصور الأهمية الإحصائية بين المجموعات باستخدام برنامج GraphPad Prism 5. 0.pتم اعتبار القيم مهمة عندما كانت أقل من 0. 05 (p < 0.05).

مناقشة

تم تحديد ما مجموعه عشرة غلوكوزيدات فينيل بروبانويد فيجيم الصلصا(ينمو في كازاخستان) مستخلص الهيدرويثانول. كانت إكيناكوسيد (10.98 مجم / جم) ، أكتيوسيد (9.44 مجم / جم) وتوبولوسيد ب (7.94 مجم / جم) هي المركبات الرئيسية التي تم تحديدها. ارتبطت البيانات التي تم الحصول عليها مع الأدبيات المتاحة لأنواعسيستانشتنمو في مناطق مختلفة من آسيا (Zhou et al.، 2014، Xie et al.، 2005، Jiang et al.، 2009). Echinacoside و acteoside هي المكونات الرئيسية ، والتي تشكل الأساس لتوحيد الأنواع المخزنةجيم الصحراءوC. tubulosa، المدرجة في دستور الأدوية الصيني في 2005. نقترح أنه يمكن أيضًا استخدام هذه المركبات لتوحيد معاييرجيم الصلصاstolons من كازاخستان ، حيث أنها الرئيسية في مستخلص الإيثانول المائي المدروس.

وفقًا للنتائج الدوائية لهذه الدراسة ، من الممكن الإشارة إلى أن CSHE عامل فعال ضد الألم العصبي والالتهاب كما لوحظ في اختبار الفورمالين. أفضل ما نعرفهجيم الصلصالم يتم اختباره من قبل فيما يتعلق بأفعاله المضادة للألم. دراسة من عام 2002 معجيم الصحراء(لين وآخرون ، 2002) أظهر أن هذا النبات يقدم أنشطة مضادة للألم ومضادة للالتهابات عند تقييمه في نماذج مثل التواء الكلي والفورمالين وذمة القدم. على الرغم من عدم وجود محاولة للتحقق من المكونات الرئيسية في المستخلصات النشطة ، إلا أنهم اعتبروا أن مستخلص البيوتانول وطبقة الماء هما العنصران النشطان. ليس من المستغرب أن تكون هذه المذيبات على مقياس قطبية يطابق فينيل بروبانويدجليكوسيدات الموجودة فيجيم الصلصا. علاوة على ذلك ، أثبت لين وزملاؤه أن التأثير المضاد للألم لـجيم الصحراءالمستخلصات لم تكن بسبب عمل المركب في المستقبل الأفيونيأو مرتبطة بجهاز المناعة. في دراستنا ، أظهر المستخلص الغني بالفينيل بروبانويد نشاطًا في مرحلتي اختبار الفورمالين. كان النشاط الذي تمت ملاحظته ناتجًا في الواقع عن الهدف الدوائي الذي تم فحصه وليس إلى أي تغيير محتمل في المحرك كما يتضح من اختبار قضيب الروتا. تشير نتائج اختبار الفورمالين إلى احتمال حدوث ألم عصبي بالإضافة إلى الألم الناجم عنوسطاء التهابات. في البداية قررنا التحقيق في مسار الألم العصبي. نظرًا لأن المركبات المماثلة من الأنواع الأخرى التي تمت دراستها سابقًا لم تظهر أي نشاط لمستقبلات الأفيون ، فقد قررنا اختبار نماذج أخرى ، مثل نماذج الجلوتامات والكابسيسين.

الجلوتامات هو ناقل عصبي مثيرالتي لها دور مهم في تعديل الألم في جميع أنحاء الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. يتم التوسط في هذا الإجراء عن طريق مستقبلات الغلوتامات المتضاربة بالبوابة الترابطية(iGluRs) ومستقبلات الغلوتامات الأيضية. يمكن تقسيم iGluRs إلى ملفاتN-الميثيل-d-أسبارتات (NMDA) و- أمينو -3- هيدروكسي -5- ميثيليسوكسازول -4- حمض بروبيونيك (AMPA) (كولبر ، 2015). أظهرت الأبحاث أنه عند معاداة مستقبلات NMDA و AMPA مع الكيتامين وكاينات، على التوالي ، لوحظ تأثير مضاد للاستقبال. ومع ذلك ، فإن المضادات التي تستهدف هذه المستقبلات قد تسببت حتى الآن في حدوث تأثير سلبي كبير ولهذا السبب تم إجراء تركيز بحثي جديد على mGluRs على أمل أن يتسبب الدواء الذي يتم توسطه من خلال هذا المستقبل في إحداث آثار جانبية أقل (Palazzo وآخرون ، 2014). أظهرت نتائج اختبار CSHE أن هذا العلاج كان فعالًا في تقليل الألم الناجم عن الجلوتامات. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كان هذا التأثير يتم توسطه من خلال مستقبلات مؤثرات الأيض و / أو مستقبلات التمثيل الغذائي. المورفين هو أحد الأدوية المتاحة التي لها تأثير على انتقال الجلوتامات (Deyama et al. ، 2007). تم الإبلاغ في الأدبيات أن تنشيط مستقبلات الغلوتامات يزيد من استجابات TRPV1 (Szteyn وآخرون ، 2015). لهذا السبب ، من الممكن أن يكون التأثير الملحوظ لـ CSHE ناتجًا عن نشاط على TRPV1 وليس بالضرورة من خلال استجابة مباشرة على مستقبلات الغلوتامات.

كانت الخطوة التالية من هذا البحث هي إجراء اختبار لعق المخالب باستخدام الكابسيسين كعامل مؤثر ، وهو ناهض مستقبل TRPV1. أظهرت النتائج أن CSHE بالفعل قلل من الألم من خلال مستقبل TRPV1.

في حالة CSHE ، تقريبًا في جميع المنهجيات المختبرة ، يمكننا أن نلاحظ أن جرعة 30 مجم / كجم حققت نتائج أفضل من 100 مجم / كجم. يمكن أن يكون هذا بسبب تشبع المحلول المؤدي إلى المركبات المترسبة وكمية أقل من الأدوية المتاحة بيولوجيًا.

كان تأكيد التركيب الكيميائي الراسخ للمستخلص الكازاخستاني CSHE خطوة مهمة لأن المكونات الرئيسية الموجودة فيه قد تم بالفعل تأكيد إجراءاتها المضادة للالتهابات / مضادات الالتهاب بطريقة ما. على سبيل المثال ، تم إنشاء إشنكوسايد كواحد من المبادئ الفعالة المسؤولة عن العمل المضاد للألمإشنسا(هوستتمان ، 2003). أيضًا ، أشارت دراسة سابقة أجراها Schapoval وزملاؤه (Schapoval et al. ، 1998) إلى أن الأكتيوسايد هو أحد المبادئ النشطة الرئيسية في مستخلص الإيثانول المُعد باستخدامستاشيتارفيتا كاينينسيسحسب تقييم وذمة مخلب ونماذج الصفيحة الساخنة. كما اعتبر Backhouse وزملاؤه (Backhouse et al. ، 2008) أن acteoside هو المبدأ النشط لـبودليجاجلوبوساباستخدام عدة نماذج لتقييم الألم ، بما في ذلك اختبار الفورمالين. يتم الآن تطوير تركيبات جديدة باستخدام أحدث المعارف لزيادة الاستقرار وإطالة أمد تأثير مضادات الأكتوزيد (Isacchi et al. ، 2016).

استنتاج

تم التعرف على عشرة مواد ذات طبيعة فينولية في ستولونس الكازاخستانيةجيم الصلصاعن طريق تحليل HPLC / MS. يمكن أن تكون هذه المركبات مسؤولة عن نشاط مضادات التقرن التي لوحظت في النماذج التجريبية التي تم إجراؤها هنا. مع الأخذ بعين الاعتبار أن الجنس على أراضي كازاخستانسيستانشيتم تمثيلها بشكل رئيسي من قبل الأنواعجيم الصلصا، يمكننا أن نوصي بحصادها وتوحيدها باستخدام إشنكوسايد وأكتيوسيد كمركبات قياسية ، للحصول على مادة خام ذات نوعية جيدة للطب الصيني التقليدي.