مضادات الأكسدة ومقاومة الشيخوخة لتركيبة الببتيد (Gal2-Pep) مقترنة بحمض الغال

الجلد شديد التأثر بالشيخوخة المبكرةبسبب الإجهاد الخارجي ، لذلك ، في هذه الدراسة ، تركيبة الببتيد ، (galloyl)2–KTPPTTP (غال2–Pep) عن طريق الجمع بين TPPTTP الببتيد والجاليكحمض (GA). تم تصنيع جميع الببتيدات على 2- راتنج كلوريد الكلوروتريتي باستخدام الببتيد ذو الطور الصلبالتوليف (SPPS) ، وتحليلها على تأين بالرش الكهربائي (ESI) / رباعي الوقت منflflight (Q-TOF) نظام التحليل الطيفي الترادفي (MS). في البداية ، غال2–لم يظهر البيب أي سمية أقل من التركيز 100mM مع معدل بقاء الخلية 88 بالمائة للخلايا الكيراتينية والليفية. الأنواع الاكسجين التفاعلية(ROS) نشاط الكسح في Gal2–كان Pep أكثر استقرارًا مقارنة بـ GA وحده ؛ وبعد أربعة أسابيع في الغرفةدرجة الحرارة ، لهانشاط الكسح ROSظلت أعلى من 50 في المائة. علاوة على ذلك ، فإن تركيبة الببتيد ،فتاه2–أظهر Pep أيضًا تأثيرًا مثبطًا للإيلاستاز في CCD -1064 Skالليفيةالخلايا. بناءً على نتائج RT-qPCR ، ثبت في هذه الدراسة أن Gal2–زاد Pep من تعبير PGC -1a ليمنعالاكسدة، والتحقق من صحة إمكاناته باعتبارهاعامل مكافحة الشيخوخةبواسطةزيادة التعبير عناكتب أنا الكولاجينوبواسطةإنقاص التعبير عن بروتين إنزيم المصفوفة المعدني -1 (MMP1). الالموجودات تم الحصول عليه يعزز الاقتراح القائل بأن تركيبة الببتيد المركبة في هذه الدراسة يمكن استخدامها كمنتجمضادات الأكسدة الطبيعيةوعامل مكافحة الشيخوخةلتطبيقاتها التجميلية.

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات حول منتجات Cistanche المضادة للشيخوخة

1 المقدمة

شيخوخة الجلديحدث نتيجة الانخفاض التدريجي في الانقسام الخلوي للخلايا الكيراتينية وإخوانه.انفجارات داخل الجلد. تتطور التجاعيد على الجلد مع انخفاض عدد الخلايا ، مما يؤدي إلى تمسخ النسيج خارج الخلوي مما يؤدي إلى الجفاف وفقدان الأيلاستشنج في الجلد.1 تلف الحمض النووي داخل الخلاياويحدث أيضًا انخفاض في معدل تخليق البروتينخلال عملية شيخوخة الجلد.2 شيخوخة الجلد لها مساران رئيسيانطرق ، داخلية وخارجية ، مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)

دافعًا رئيسيًا لـالشيخوخة الخارجية. يتفاعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع مكونات الجلد الرئيسية، بما في ذلك الدهون والبروتينات والأحماض النووية ، لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تؤدي إلى الخليةموت.3–5 مستويات ROS الزائدة تؤدي أيضًا إلى الانقسام والارتباط غير الطبيعي لسلاسل الكولاجين أو الإيلاستين وتعزيز التعبير عن البروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) ، مثل MMP -1 ، التي تكسر الكولاجين ، مما يؤدي إلى تجعد الجلد وتسريع شيخوخة الجلد.6,7 لذلك ، العلاج المضاد للأكسدة لإزالةROS ولتفعيل إمكانات الميتوكوندريا له مزايا لحماية الجلد من الشيخوخة.

بالإضافة إلى ROS ، يلعب الإيلاستاز دورًا مهمًا في فقدانمرونة الجلد ، التي تكسر الإيلاستين ، وهو بروتين مهم فيالمصفوفة خارج الخلية.8 الإيلاستين ، بسبب ارتداده المرن الكبيرالخصائص ، توفر مرونة للجلد ، في حين أن الإيلاستاز لديهالقدرة على شق الإيلاستين والبروتينات الأخرى.8 لذلك ، مانعيمكن أن يكون إنزيم الإيلاستاز استراتيجية أساسية لترهل الجلد منع فقدان مرونة الجلد.

في هذه الدراسة ، صممنا مادة جديدة تجمع بينمنشط جاما لمستقبلات البيروكسيسوم المنشط1- ألفا (PGC -1a) - الببتيد المشتق TPPTTP وحمض الغاليك (GA)لاستخدامها في مستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة. GA هي مادة كيميائية نباتية توجد في العديد من الفواكه والخضروات ، بما في ذلك العنب والطماطم والشاي الأخضر ، والمعروف أنها تحتوي على نسبة عالية من مضادات الأكسدة ومضادات الجراثيم eوما يليهاإلخ.9 على الرغم من استخدام GA في صناعات مستحضرات التجميل والمواد الغذائية بسبب هذه الفوائد الإلكترونيةوما يليهاالعواقب ، فإن صياغتها تميل إلى أن تكون غير مستقرة.10 وهكذا قمنا بتطوير (جالويل)2–KTPPTTP (غال2–Pep) لزيادة استقرار GA من خلال ربطها بـ PGC -1a- مشتق من الببتيد TTPTTP.

في هذه الدراسة ، قمنا بتصنيع (جالويل)2–KTPPTTP (غال2– Pep) تركيبة الببتيد مع حمض الغاليك وتأكيدهاقدرته كمضاد للأكسدة وعامل مضاد للشيخوخة.

2. المواد والأساليب

2.1. مواد

تم تعديل Dulbeccoمتوسط ​​النسر (DMEM) ، البنسلين / الستربتومايسين ، مصل بقري الجنين (FBS) ، الفوسفات بووما يليهاeredتم شراء المحلول الملحي (PBS) ، والتربسين من Gibco (Carls

سيئة ، كاليفورنيا). Hydroxybenzotriazole (HOBt) ، diisopropyl carbodiimide (DIC) ، 1 ، 8- diazabicyclo [5.4. 0] undec -7- en (DBU) ،N, N- ثنائي إيزوبروبيل إيثيل أمين (DIEA) وحمض الغاليك وN-سوكسينيل-تراي-ألانيل-pتم الحصول على nitroanilide من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري).L-شكل الأحماض الأمينية (Fmoc-Lys (Boc)–أوه ، معتدلاً-ثر (tبو)–OH و Fmoc-Pro–OH) تم شراؤها من Bead-Tech (سيول ،كوريا).

2.2. تخليق الببتيدات والببتيدات المرتبطة بحمض الغال

تم تصنيع جميع الببتيدات على راتينج كلوريد 2- chlorotrityl (200mمقياس مول ، قيمة الاستبدال¼ 1.46 ملمول ز 1) باستخدام HOBt–تخليق الببتيد ذو المرحلة الصلبة بوساطة مدينة دبي للإنترنت (SPPS).

تم إجراء تركيب الببتيد باستخدام طريقة SPPS مع تعديل طفيفالكاتيونات تشير إلى الدراسات السابقة.11–13 2-تم تضخم راتنج كلورو تريتل (CTC) في ثنائي كلورو

الميثان (DCM ، 8 مل) لمدة 30 دقيقة. تم غسل الراتنج معثنائي ميثيل فورماميد (DMF). تم إجراء جميع التفاعلات في درجة حرارة الغرفة. مشتقات الأحماض الأمينية المحمية Fmoc (2 مكافئ(معادل) ، لـفايتم ربط الحمض الأميني المرفق الأول أو 5 ما يعادله ، بالنسبة للأحماض الأمينية الأخرى) إما بـ DIEA (5 مكافئ ، للحمض الأميني المرفق) أو HOBt / DIC (6 ما يعادل / 5 مكافئ) في DMF aقدمإيهإجراء نزع الحماية من Fmoc باستخدام 2 بالمائة (ت / ت) DBU في DMF (مرتين ، دقيقتان في المرة ، 8 مل). وتم غسل جميع الخطوات 5 مرات باستخدام DMF. تم ربط حمض الغاليك النهائي بالببتيدات المرتبطة بالليسين.بعد اقتران حمض الغال ، كان الراتنجaترشح ، مغسولة ،وتجفف تحت فراغ عالي. حل الانقسام (TFA:الماء منزوع الأيونات [DI]: TIS¼ 95: 2.5: 2.5 ، v / v / v بالمائة) تمت معالجته لمدة ساعتينللحصول على الببتيدات الخام. تم ترسيب الببتيدات الخام وغسلها ثلاث مرات باستخدام ثنائي إيثيل إيثر بارد.

تحليل كروماتوجرافيا سائل عالي الأداء للطور العكسيتم إجراء (RP-HPLC) على فصل المياه 2695وحدة مع عمود Capcell Pak C18 (4.6 ملم 250 مم ، 5mم ، شيسيدو). تتألف مرحلة الجوال من 0. 05 بالمائة من TFA في H.2O (المرحلة المتنقلة أ) و 0. 05 بالمائة من TFA في الأسيتونتريل (المرحلة المتنقلة ب).

تم تحقيق الشطف من خلال استخدام تدرج خطي للجوالالمرحلة B من 5 في المائة إلى 65 في المائة خلال 30 دقيقة عند أمعدل التدفق 1. 0 مل دقيقة 1. تم الكشف عن قمم الببتيد بطول موجة 230 نانومتر. تم إجراء RP-HPLC شبه التحضيري على نظام Waters HPLC (مضخة 600E ، كاشف UV -484) باستخدام جهاز Gemini RP-C18عمود (21.2 مم 250 مم ، 5mم ، ظاهرة). تتألف مرحلة الجوال من 0. 05 بالمائة من TFA في H.2O (المرحلة المتنقلة أ)و 0. 05 بالمائة من TFA في الأسيتونتريل (المرحلة المتنقلة ب). تم تحقيق الشطف من خلال استخدام تدرج خطي للمرحلة المتنقلة B من7 في المائة إلى 22 في المائة على مدى 15 دقيقة عند أlمعدل تدفق 10 مل دقيقة 1. التم الكشف عن قمم الببتيد الطيفي بطول موجة 230 نانومتر.

تمت إذابة الببتيدات المُصنَّعة في 5٪ حمض الفورميك في الماء وتحليلها على التأين بالرش الكهربائي (ESI) /رباعي الوقت منlight (Q-TOF) مطياف الكتلة الترادفيةنظام (MS) (TripleTOF6600 ، ABSciex ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا). تم حقن العينات في نظام Q-TOF المجهز بـمصدر رش النانو فيlمعدل التدفق 1mL دقيقة 1. أيون ESIكانت معلمات المصدر كالتالي: جهد رش أيوني 1.5 كيلو فولت ، غاز ستارة عند 10 رطل لكل بوصة مربعة ، وغمد غاز عند 5 رطل لكل بوصة مربعة. الأطياف فيتم جمع وضع المسح الكامل و MS / MS في نطاقm/z

100–1200 Da في وقت تراكم 25 مللي ثانية لكل طيف.تم زيادة طاقة الاصطدام من 10 إلى 80. النتيجةتم الحصول على البيانات باستخدام Analyst TF لذلكوير وتلقائياتم تعيينه بواسطة centroid 80 في المائة بحد أدنى للذروة ، وتقليل الضوضاء بنسبة 10 في المائة ، وإزالة الخواص المتوسطة مع عتبة 3 في المائة ، وعدم تقليل الضوضاء ، وعدم التمليس. تم تحديد الببتيدات المركبةمع التسامح الشامل 0. 05 Da والمتسلسلة يدويًا باستخدام تفاوت MS / MS 0. 01 دا.

2.3 ثقافات الخلية ومقايسات الجدوى

خلايا بشرية ، بالغة ، منخفضة الكالسيوم ، خلايا ذات درجة حرارة عالية (HaCaT)و CCD -1064 Sk (بشرة بشرية عاديةكانت الخلايا الليفيةمزروع في DMEM مع 10 في المئة FBS و 1 في المئة من البنسلين /الستربتومايسين. تم تحضين الخلايا عند 37 C في غرفة هواء رطبة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون2.بالنسبة لفحوصات الصلاحية ، تم استخدام مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8 ، Dojindo Co. Ltd. ، بكين ، الصين). HaCaT و CCD -1064 خلايا Skتم زرع بذورها في 96- ألواح ميكروية جيدة (5 103 خلية لكل بئر) وحضنت عند 37 C في 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. ثم تعرضت الثقافات لتركيزات مختلفة من الببتيدات المركبة أو GA وحضنت عند 37 C في 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. صلاحية الخليةتم قياسه لاحقًا باستخدام CCK -8 باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

2.4 تحديد نشاط مضادات الأكسدة

2.4.1. فحص DPPH.النشاط المضاد للأكسدة من توليفهاتم تقييم الببتيدات و GA بشكل فردي باستخدام مقايسة DPPH. تم إجراء فحوصات DPPH بعد الإبلاغ عنها مسبقًا

منهجية مع وضع طفيفالكاتيون.12,14–16 أولاً ، 0. 12 مجم مل 1 تم تحضير محلول DPPH في ميثانول ، ثم 100mلتر من محلول DPPH و 100mتم خلط L من الببتيدات المركبة أو GA بتركيزات مختلفة ({{0}}. 1 ملم ، 0. 05 ملم ، 0.01 ملم ، و 1mM) في 96- ألواح ميكروسكوبية جيدة. في حاضنة الاهتزاز المداري ، يكونتم تفاعل المخاليط لمدة 30 دقيقة عند 37 C و 100 دورة في الدقيقة بدونضوء. ثم تم قياس الامتصاصية عند 517 نانومتر وتم حساب قدرة مضادات الأكسدة.

2.4.2. نشاط الكسح ROS.

تم تقييم نشاط الكسح داخل الخلايا ROS باستخدام 20 ، 70- طقم ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسئين(DCF-DA ، Abcam ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زرع خلايا HaCaT في 96- ألواح ميكروية جيدة (5 103 خلية لكل بئر) وحضنت عند 37 C لمدة 24 ساعة.Aقدمفي الحضانة ، تعرضت الثقافات إلى الببتيدات المركبة أو GA (100mم) وحضنت عند 37 C لمدة 24 ساعة. ثم تم تعريض الخلايا لـ 10mحل M DCF-DA واحتضانها لمدة 30 دقيقة. أقدمفي الحضانة ، تم غسل المحلول باستخدام PBS. التم تحليل الخلايا باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند الإثارة و

أطوال موجات انبعاث تبلغ 485 نانومتر و 530 نانومتر على التوالي.

رسم بياني 1خطوة تركيبية وتأكيد تسلسل الببتيدات باستخدام رباعي الوقترحلة جوية(Q-TOF) مطياف الكتلة: (أ) إجراء اصطناعي مفصل (ب) TPPTTP ، (ج) جالويل–TPPTTP و (د) (جالويل)2–KTPPTTP.

2.5 الفحص المحتمل لغشاء الميتوكوندريا

تم استخدام صبغة JC -1 (Thermo Fisher ، الولايات المتحدة الأمريكية) للميتوكوندريامقايسة إمكانات الغشاء (MmP). تم زرع خلايا CCD -1064 Sk و HaCaT في 96- ألواح ميكروية جيدة (5 10 3خلايا لكل بئر)

واحتضنت في 37 C و 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. بعدحضانة إيهتعرضت الثقافات لتركيزات مختلفة من الببتيدات المركبة وحضنت عند 37 C في 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.تمت إضافة صبغة JC -1 إلى خلايا CCD -1064 Sk و HaCaT إلىينتج التركيز النهائي 10mM. Aقدم10 دقائق من الحضانة ، تم غسل الخلايا مرتين مع 37 C برنامج تلفزيوني. أخضر وأحمرضوئيتم قياسها باستخدام Varioskan LUXقارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع (ThermoFisher ، الولايات المتحدة الأمريكية) في الخارجتيشن (lالسابق)/انبعاث (lإم) من 475/530 نانومتر وlالسابق/lإممن 475 /590 نانومتر على التوالي.

2.6. مقايسة النشاط المثبط للإيلاستاز

تم زرع خلايا Sk CCD -1064 في أطباق الآبار 6- واحتضانها عند 37 C في 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. ثم تعرضت الثقافات لتركيز 100mM من الببتيدات المركبة أو GA واحتضانها عند 37 C في 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. تم غسل الخلايا باستخدام dPBS مرتين وجمعنا كل خلية باستخدام مكشطة الخلية. أإيه إضافة 0. 2 م تريس–HCl (الرقم الهيدروجيني 8. 0) مع 0. 1 بالمائة Triton-X إلىالخلايا ، تم تجانس الخلايا بواسطة الموجات فوق الصوتية. تم الطرد المركزي للمحلول المتجانس لمدة 20 دقيقة عند 3000 دورة في الدقيقةو 4 C. ثم ، أقدمإيه أخذ كمية البروتين الطافية-تم إجراء الكاتيون باستخدام اختبار بروتين BCA. بروتين لكل منهماتم الاستغناء عن العينة فيفايتركيز nal 100mgmL 1، وN-سوكسينيل-تراي-ألانيل-p- نيتروانيليد تمت إضافته فيتركيز نهائي 1.6 ملي مولار وتفاعل عند 36 C لمدة 1 ساعة.بعد ذلك ، تم قياس الامتصاصية عند 405 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.

2.7. RT-QPCR

مستويات mRNA للعلامات المضادة للشيخوخة في خلايا Sk CCK -1064تم تقييمها باستخدام RT-qPCR. تم جمع إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف TRIzol (تقنيات الحياة ، كارلسباد ، كاليفورنيا) والعكس

نسخها باستخدام مجموعة كاشف PrimeScript RT (Takara Bio، كوساتسو ، اليابان). نظام CFX96 (مختبرات Bio-Rad ، Hercules ، كاليفورنيا) و iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) لـ RT-qPCR.b- تم استخدام الأكتين لتطبيع مستويات الرنا المرسال من النوع الأول من الكولاجين و MMP -1 و PGC -1a. 

2.8. تحليل احصائي

 يتم تقديم البيانات على أنها المتوسط الانحراف المعياري منثلاثة قياسات مستقلة وتحليلها باستخدام Studentt-الاختبارات مع أp < 0.05 considered to be a signiفرق غير قادر.

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950