مثبط ASK1 NQDI ‑ 1 يقلل من الإجهاد التأكسدي والتهاب الخلايا العصبية عبر مسار إشارات ASK1 / p38 و JNK في إصابة الدماغ المبكرة بعد نزيف تحت العنكبوتية في الفئران الجزء 1

خلاصة. يعد الإجهاد التأكسدي والتهاب الأعصاب من العمليات المرضية الرئيسية بعد النزف تحت العنكبوتية (SAH). قيمت الدراسة الحالية التأثيرات المضادة للأكسدة ومضادات الاستماتة العصبية لإشارة موت الخلايا المبرمج ‑ تنظيم كيناز 1 (ASK1) مثبط إيثيل ‑ 2،7 ‑ ديوكسو ‑ 2،7 ثنائي هيدرو ‑ 3H نافثو (1،2 ، 3 ‑ de) quinoline1 carboxylate (NQDI 1) في إصابة الدماغ المبكرة (EBI) بعد SAH في نموذج الفئران. تم استخدام إجمالي 191 فأرًا وتم إحداث نموذج SAH باستخدام ثقب حيدة. تم استخدام النشاف الغربي لاحقًا للكشف عن مستويات التعبير الذاتية للبروتينات. ثم تم استخدام التألق المناعي لتأكيد التوطين الخلوي العصبي لـ ASK1. تم تقييم الوظيفة العصبية قصيرة المدى باستخدام درجات Garcia المعدلة واختبار توازن الحزمة لمدة 24 ساعة بعد SAH ، في حين تم تقييم الوظيفة العصبية طويلة المدى باستخدام اختبار rotarod واختبار Morris Water Maze. تم تقييم موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية بواسطة تلطيخ TUNEL وتم تقييم الإجهاد التأكسدي عن طريق تلطيخ ثنائي هيدرو إيثيديوم 24 ساعة بعد SAH. ارتفعت مستويات التعبير البروتيني للفسفرة (p‑) ASK1 و ASK1 بعد SAH. تم حقن NQDI ‑ 1 داخل البطيني لمدة ساعة واحدة بعد SAH وأظهر تحسينات كبيرة في كل من الوظيفة العصبية قصيرة وطويلة الأجل وقلل بشكل كبير من الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج العصبي. تسبب حقن NQDI ‑ 1 في انخفاض كبير في مستويات التعبير البروتيني لـ p ASK1 و p p38 و p ‑ JNK و 4 hydroxynonenal و Bax وزاد بشكل ملحوظ من مستويات التعبير البروتيني لأكسجين الهيم 1 و Bcl 2. أدى استخدام مثبط p38 BMS ‑ 582949 أو مثبط JNK SP600125 إلى انخفاض كبير في مستويات التعبير البروتيني لـ p p38 أو p JNK ، على التوالي ، وانخفاض كبير في الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية ؛ ومع ذلك ، فإن هذه المثبطات لم تظهر أي تأثير على مستويات تعبير البروتين p ‑ ASK1 أو ASK1. في الختام ، أدى العلاج باستخدام NQDI 1 إلى تحسين الوظيفة العصبية وتقليل الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج العصبي في EBI بعد SAH في الفئران ، ربما عن طريق تثبيط الفسفرة ASK1 ومسار إشارات ASK1 / p38 و JNK. يمكن اعتبار NQDI ‑ 1 عاملاً محتملاً لعلاج المرضى المصابين بـ SAH.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ويمكنه البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ، ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر فوق خدمة مكافحة الشيخوخة Cistanche Para Que Serve

【لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com / WhatApp: 8613632399501】

الكلمات الدالة: نزيف تحت العنكبوتية ، NQDI ‑ 1 ، إشارة موت الخلايا المبرمج ، تنظيم كيناز 1 ، الإجهاد التأكسدي ، موت الخلايا المبرمج ، إصابة الدماغ المبكرة

مقدمة

النزف تحت العنكبوتية (SAH) هو مرض وعائي حاد خطير ينتج عن تدفق الدم إلى الفضاء تحت العنكبوتية من الدماغ (1). ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، لا توجد أدوية فعالة متاحة لتحسين تلف أنسجة المخ بعد SAH بعد منع عودة النزيف (2). لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى مزيد من الدراسات حول آليات إصابة الدماغ بعد SAH واستكشاف خيارات العلاج المناسبة لتحسين تشخيص SAH.

تشير إصابات الدماغ المبكرة (EBI) إلى تلف أنسجة الدماغ الثانوي الناجم عن اضطرابات فسيولوجية متعددة ومجموعة من التغيرات المرضية التي تحدث خلال 72 ساعة من بداية SAH (3). في مرحلة الاستجابة الحادة التالية للنزيف تحت العنكبوتية ، تبدأ الإصابة بدخول كميات كبيرة من الدم إلى الحيز تحت العنكبوتية ، ويتبع ذلك سلسلة من الإصابات المرضية (4). نظرًا لأن الميتوكوندريا معرضة بشكل خاص لنقص الأكسجة والإصابة الدماغية ، فإن خلل الميتوكوندريا هو أحد الإصابات المرضية الأولية التي عانى منها بعد SAH (5). يتم إطلاق أعداد كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يؤدي إلى تعزيز الإجهاد التأكسدي وتنشيط مسار موت الخلايا المبرمج في الميتوكوندريا ، مما يتسبب في إصابة الميتوكوندريا واختلال وظيفي (6). لذلك ، فإن الطرق العلاجية التي تقلل من الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج هي المفتاح لتحسين تشخيص SAH.

إشارة موت الخلايا المبرمج ‑ ينظم كيناز 1 (ASK1) ، وهو عضو في عائلة بروتين 3 كيناز المنشط للميتوجين (MAP3K) ، بواسطة أنواع مختلفة من الإجهاد الخلوي وله دور مهم في الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج (7). في الثقافات الأولية للخلايا العصبية في قرن آمون الفأر ، يعكس مثبط Rho kinase fasudil الارتفاع الناجم عن ‑amyloid للفسفرة (p‑) ASK1 ، مما يقلل من موت الخلايا المبرمج في مرض الزهايمر (8). على حد علمنا ، ومع ذلك ، لم يتم تقييم الخيارات العلاجية التي تستهدف ASK1 بعد SAH.

تم الإبلاغ عن Ethyl ‑ 2،7 ‑ dioxo ‑ 2،7 dihydro -3 H-naphtho (1،2، 3- de) quinoline 1- carboxylate (NQDI ‑ 1) مثبط محدد لـ ASK1 وتم التحقق من صحته باستخدام فحوصات المختبر كيناز (9 ، 10). أفادت الدراسات السابقة أن NQDI-1 قد يكون فعالًا في علاج العديد من الأمراض من خلال تثبيط نشاط ASK1 (11 ، 12). يخفف NQDI ‑ 1 من تلف الميتوكوندريا الناجم عن ميكروسيستين ‑ LR وموت الخلايا المبرمج في الخلايا الحبيبية المبيضية عن طريق تثبيط تنشيط ASK1 (13). علاوة على ذلك ، يمكن للإندوميتاسين إحداث استجابات متتالية موت الخلايا المبرمج في الخلايا الدبقية عبر تنشيط ASK1 لإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (14). لذلك ، فإن المانع ASK1 NQDI 1 قد يمارس تأثيرات اعصاب بعد SAH من خلال تثبيط نشاط ASK1. يعتبر كل من p38 و JNK يشكلان مسارات إشارات المصب لـ ASK1 ؛ المنشط p38 و JNK يمكن أن يزيد من تنشيط مجموعة متنوعة من الركائز ، بما في ذلك عوامل النسخ النووي وكذلك البروتين كينازات والبروتينات الوظيفية الأخرى ، مما يؤدي إلى ظهور الإجهاد التأكسدي والاستماتة (15).

تم الافتراض أن مثبط ASK1 NQDI 1 يمارس تأثيرات اعصاب ويقلل من الإجهاد التأكسدي والتهاب الأعصاب عبر مسار إشارات ASK1 / p38 و JNK في EBI بعد SAH في الفئران.

المواد والأساليب

حيوانات تجريبية.تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية التابعة لجامعة وسط الجنوب (الموافقة رقم 2019sydw0104). تم إيواء ما مجموعه 191 من الفئران Sprague ‑ Dawley (SD) التي تزن 280-320 جم في درجة حرارة ثابتة (21 - 23 درجة مئوية) ورطوبة (45-50 بالمائة) بيئة مع دورة فاتحة / مظلمة 12/12 وكان لديهم حرية الوصول إلى الماء والغذاء. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا لإرشادات أبحاث الحيوانات: الإبلاغ عن التجارب في الجسم الحي (16) وتم إجراؤها بواسطة دليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الخاص بإرشادات رعاية واستخدام الحيوانات (17). عندما وصلت الفئران إلى النقطة الزمنية المحددة مسبقًا للتجربة أو استوفت معايير معينة للقتل الرحيم [فقدان كامل للشهية لمدة 24 ساعة أو ضعف الشهية (50 في المائة أقل من المعدل الطبيعي) لمدة 3 أيام ، أو عدم القدرة على الأكل أو الشرب ، أو تم تقييمها على أنها بالقرب من الموت (سلوك مؤذٍ للنفس ، وضعية غير طبيعية ، وضيق تنفسي ، وما إلى ذلك)] ، وُضعت الفئران في جهاز القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون مع معدل إزاحة حجم ثاني أكسيد الكربون بمعدل 30 بالمائة / دقيقة (18). تم تأكيد الوفاة بانقطاع التنفس وضربات القلب واتساع حدقة العين. تم تعبئة جثث جميع الفئران في أكياس وتجميد للتخلص منها بطريقة سليمة بيئيًا.

نموذج SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >تم اعتبار 8 من خلال تقييم درجة درجات SAH لتلبية المتطلبات التجريبية وأن يكون نموذجًا ناجحًا. كان الإجراء الخاص بالمجموعة الصورية مشابهًا للإجراء الخاص بمجموعة SAH ، باستثناء أن سلك البرولين 4 - 0 لم يخترق جدار الشرايين. تمت مراقبة التنفس ومعدل ضربات القلب ولون الجلد وردود الدواسة كل 5 دقائق خلال مراحل التعافي الجراحية والتخديرية. من بين هؤلاء ، مات 23 فأرًا وتم استبعاد 8 فئران ، واستُكملت هذه الوفيات والاستثناءات بفئران جديدة على غرار SAH.

شدة SAH.تم تقييم شدة SAH باستخدام درجة تصنيف SAH بعد 24 ساعة من SAH (2 0). تم تقسيم الجانب البطني من أنسجة المخ إلى 6 مناطق ، تم تصنيف كل منها 0 - 3 اعتمادًا على كمية الجلطة الدموية ومدى جودة حجب الأوعية الدموية: النتيجة 0 تشير إلى عدم وجود جلطة ، 1 يشير إلى كمية صغيرة من الجلطة ، 2 يشير إلى كمية معتدلة من الجلطة ولكن الأوعية الكبيرة في قاعدة الجمجمة لا تزال قابلة للتحديد ، و 3 يشير إلى كمية كبيرة من الجلطة والأوعية غير المعروفة في قاعدة الجمجمة. تم جمع الدرجات الإقليمية الست لحساب النتيجة الإجمالية (0-18) ، حيث أشارت الدرجات الأعلى إلى نزيف أكثر شدة. تم اعتبار الفئران التي حصلت على مجموع درجات SAH أقل من أو تساوي 8 على أنها خفيفة SAH ، مستبعدة من التجارب اللاحقة ، وتم استبدالها بالفئران المصممة حديثًا.

إدارة المخدرات.لتمكين تركيزات الدواء في أنسجة المخ ليتم تنظيمها بشكل أكثر دقة بشكل مستقل عن الكبد وعوامل أخرى ، تم إعطاء siRNAs و NQDI ‑ 1 عن طريق الحقن داخل البطين (21). بعد التخدير (الحث ، 3 في المائة من الأيزوفلورين ؛ الصيانة ، 2 في المائة من الأيزوفلورين) ، تم تثبيت الفئران على جهاز التوضيع التجسيمي في الدماغ. تم تثبيت microinjector في bregma عند 1. 0 خلفي ، 1.5 يمين ، وعمق 3.3 ملم. تم إذابة ASK1 siRNA (القط رقم 4390771 ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) أو التحكم في Scr siRNA (القط رقم 4390843 ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) في 5 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع الأيونات الخالي من النيوكلياز بتركيز من 500 pmol وتدار 48 ساعة قبل SAH. كانت تسلسل ASK1 siRNA على النحو التالي: Sense 5'CGG CAGACAUUGUAUCAAtt ‑ 3 'و antisense 5'UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc ‑ 3'. تم استخدام تركيزات الدواء والجرعات التي تم الإبلاغ عنها في دراسة مماثلة (22) وقابلية ذوبان NQDI-1 لتحديد التركيزات المستخدمة في هذه الدراسة. تم حقن ثلاث جرعات من NQDI 1 (1 ، 3 ، 10 ميكروغرام / كجم ؛ Selleck Chemicals) أو محلول السيارة بحجم إجمالي 5 ميكرولتر / فأر 1 ساعة بعد SAH. يمكن لـ BMS ‑ 582949 (100 مجم / كجم ؛ Selleck Chemicals) و SP600125 (30 مجم / كجم ؛ Selleck Chemicals) وحلول المركبات عبور حاجز الدم في الدماغ وتم إعطاؤها داخل الصفاق لمدة ساعة واحدة بعد SAH (23،24).

وظيفة عصبية قصيرة المدى.تم استخدام درجة Garcia المعدلة ودرجة توازن الحزمة لتقييم الوظيفة العصبية قصيرة المدى بعد 24 ساعة من SAH. تم تقسيم درجة Garcia المعدلة إلى ست فئات على النحو التالي: الحركة الطوعية ، وحركة الأطراف الطوعية ، وتمديد forepaw ، وقدرة التسلق ، والاستجابات الحسية الجسدية ، والاستجابة اللامسة ، تم تسجيل كل منها على حدة وتلخيصها لإعطاء درجة إجمالية تتراوح من 3 إلى 18 (25). تم اعتبار الدرجات الأعلى للإشارة إلى وظيفة عصبية أفضل. بالنسبة لدرجة توازن الشعاع ، تم وضع الفئران على عارضة لمدة دقيقة واحدة وتم تقييم درجة تتراوح من 0 - 4 بناءً على المسافة المقطوعة (26). تم اعتبار الدرجات الأعلى للإشارة إلى وظيفة عصبية أفضل.

وظيفة عصبية طويلة المدى.تم إجراء تجارب Rotarod السابقة للتكيف على الفئران باستخدام نفس السرعة والتسارع الأوليين قبل نمذجة SAH. تم وضع الفئران على جهاز اختبار قضيب دوار Rotamex (أدوات كولومبوس) لاختبار Rotarod في الأيام 7 و 14 و 21 بعد SAH (27). أولاً ، تم ضبط سرعة Rotarod الأولية على 5 دورات في الدقيقة والتسارع إلى دورتين في كل 5 ثوانٍ. بعد وضع الفئران ، تم تسجيل كمون سقوط الفئران. ثم سمح للفئران بالراحة لمدة ساعة واحدة. أخيرًا ، تم اختبار زمن انتقال الفئران مرة أخرى بسرعة أولية تبلغ 5 دورات في الدقيقة وتسارع دورتين لكل 5 ثوانٍ. تم اعتبار الكمون الأطول في السقوط للإشارة إلى تنسيق حركي أفضل في الفئران. في الأسبوع الرابع بعد نمذجة SAH ، تم استخدام اختبار متاهة موريس المائية لتقييم ذاكرة التعلم والتوجه المكاني للفئران (27). تم إجراء تمرين تعلم السباحة وإيجاد منصة تقع تحت سطح الماء من اليوم الأول إلى اليوم الخامس في الأسبوع الرابع (الأيام 28-33 بعد SAH) وتم تسجيل مسار السباحة وزمن الهروب ومسافة السباحة. في اليوم الأخير ، تمت إزالة المنصة للاختبار ، وتم تسجيل مسار السباحة ومسافة السباحة ومدة ربع المسبار لمدة 60 ثانية.

إذا تلطيخ.بعد التروية المتسلسلة لمحلول ملحي 4 درجات مئوية و 4 درجات مئوية ، 4 في المائة بارافورمالدهيد من القلب لإزالة الدم من أنسجة المخ ، تم الحصول على أنسجة دماغية سليمة. بعد الجفاف المتدرج للسكروز ، تم قطع أنسجة المخ إلى أقسام 10 ميكرومتر في وضع إكليلي وتم تخزينها عند -20 درجة مئوية. تم استخدام تلطيخ IF لتقييم توطين ASK1 مع الخلايا العصبية. تم حظر أقسام الأنسجة المجمدة باستخدام 5 في المائة من مصل الحمير (القط رقم G1217‑5ML ؛ Wuhan Service Technology Co.، Ltd.) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: (فأر ؛ 1: 200 ؛ قطة رقم 67072‑1 ‑ Ig ؛ مجموعة ProteinTech ، Inc.) ، جزيء محول الربط المضاد للكالسيوم المتأين ‑ 1 (إيبا 1 ؛ أرنب ؛ 1: 200 ؛ القط رقم 10904‑1 ‑ AP ؛ مجموعة ProteinTech Group ، Inc.) ، والبروتين الحمضي الليفي المضاد للدبقية (GFAP ؛ الدجاج ؛ 1: 200 ؛ القط. no. ab4674 ​​؛ Abcam). تم تحضين أقسام الأنسجة بعد ذلك لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة على النحو التالي: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti ‑ Mouse IgG (H plus L) (cat. no.715-585‑150 ؛ 1: 500 ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories، Inc.) و Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti ‑ Rabbit IgG (H plus L) (cat. no. 711‑545‑152 ؛ 1: 500 ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories، Inc.) و Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti ‑ Chicken IgY (IgG) (H plus L) (cat. no. 703‑545‑155 ؛ 1: 500 ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories، Inc.). بعد ذلك ، تم تلطيخها لنواة الخلية باستخدام 2 ميكروغرام / مل DAPI (القط رقم G1012-100ML ؛ Wuhan Service Technology Co.، Ltd.) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم تقييم المقاطع باستخدام مجهر أوليمبوس BX53 مضان (شركة أوليمبوس) وتم التقاط الصور.

تلطيخ ثنائي هيدرو إيثيديوم (DHE).تم إجراء تلطيخ DHE لتقييم الإجهاد التأكسدي للدماغ (28). تم تحضين أقسام أنسجة المخ المجمدة بـ 2 ميكرو مول / لتر DHE (Thermo Fisher Scientific ، Inc.) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد تلطيخ نواة الخلية باستخدام 2 ميكروغرام / مل من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تم تقييم المقاطع باستخدام مجهر مضان أوليمبوس BX53. تم اختيار ما مجموعه ستة أقسام من كل أنسجة دماغية بشكل عشوائي وتم اختيار ستة مناطق في كل قسم بشكل عشوائي للتصوير. تم حساب عدد الخلايا الإيجابية لـ DHE باستخدام برنامج ImageJ 1.4 (المعاهد الوطنية للصحة) وتم حساب المتوسط ​​وأخذ على أنه النسب المئوية النهائية لكل قسم من أنسجة المخ.

تلطيخ TUNEL.تم استخدام تلطيخ TUNEL لتقييم النسبة المئوية للخلايا العصبية الأبوطوزكية (29). تم حظر أقسام الأنسجة المجمدة باستخدام 5 في المائة من مصل الحمير لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة وتم تحضينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المضادة ‑ NeuN (أرنب ؛ 1: 200 ؛ القط رقم 26975‑1 ‑ AP ؛ ProteinTech Group، Inc .). تم تحضين أقسام الأنسجة بعد ذلك مع الجسم المضاد الثانوي الفلوريسنت Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti ‑ Rabbit IgG (H plus L) (القط رقم 711-545-152 ؛ 1: 500 ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories ، Inc.) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء تلطيخ TUNEL باستخدام مجموعة One Step TUNEL Apoptosis Assay (القط رقم C1090 ؛ معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. أخيرًا ، تم تلوين أقسام الأنسجة لنواة الخلية باستخدام 2 ميكروغرام / مل من DAPI لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الاختيار العشوائي لمواقع عد TUNEL وحساب الخلايا العصبية الإيجابية لـ TUNEL لكل قسم باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه لحساب DHE.

النشاف الغربي (WB).تم استخدام WB لتقدير مستويات التعبير البروتيني. بعد نضح 4 درجات مئوية من محلول ملحي من القلب لإزالة الدم من أنسجة المخ ، تم الحصول على أنسجة دماغية سليمة. أفادت الدراسات السابقة أن نموذج SAH ، المستحث عن طريق ثقب الأوعية الدموية في الجانب الأيسر ، يؤدي إلى درجة من التحيز تجاه أحداث النزيف ويمكن أن يكون شديدًا نسبيًا من حيث الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ في الجانب الأيسر (30). لذلك ، تم استخدام أنسجة المخ على الجانب الأيسر لتقييم الضرر المرضي بعد نمذجة SAH. تم استخلاص بروتينات أنسجة المخ باستخدام محلول تحلل RIPA (القط رقم P0013B ؛ معهد بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد تركيز البروتين في العينات بمقايسة BCA (القط رقم P0012 ؛ معهد بيوتايم للتقنية الحيوية) وتم تعديله لاحقًا إلى 5 ميكروغرام / ميكرولتر عن طريق إضافة كميات مختلفة من الماء المقطر المزدوج. تمت إضافة 5 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر من عينات البروتين إلى كل مسار وتم فصل عينات البروتين هذه على 10 بالمائة من المواد الهلامية بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. تم حظر الأغشية لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة باستخدام حليب بودرة خالي الدسم بنسبة 5٪ (القط رقم P0216-300g ، معهد بيوتايم للتقنية الحيوية). تم غمر الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية بأجسام مضادة أولية على النحو التالي: Anti ‑ p ‑ ASK1 (Ser ‑ 83؛ 1: 1، 000؛ cat. no. MA5‑28020؛ Thermo Fisher Scientific، Inc .)، anti ‑ ASK1 (1: 1، 000؛ cat. no. 8662؛ Cell Signaling Technology، Inc.)، anti ‑ p ‑ p38 MAPK (Thr180 / Tyr182) (1: 1 ، 000؛ cat. no. 9216؛ Cell Signaling Technology، Inc.)، anti ‑ p38 MAPK (1: 1، 000؛ cat. no. 8690؛ Cell Signaling Technology، Inc.) ، ومضاد ‑ phospho ‑ الإجهاد ‑ Acti‑ بروتين كيناز / Jun ‑ amino ‑ Terminal kinase (phospho ‑ SAPK / JNK) (Thr183 / Tyr185؛ 1، 000؛ cat. no. 9255؛ تشوير الخلية Technology، Inc.)، anti ‑ SAPK / JNK (JNK؛ 1: 1، 000؛ cat. no. 9252؛ Cell Signaling Technology، Inc.)، anti ‑ 4 hydroxynonenal (4 ‑ HNE؛ 1: 1 ، 000؛ cat. no. ab46545؛ Abcam)، anti ‑ heme Oxygenase 1 (HO ‑ 1؛ 1: 1، 000؛ cat. no. 82206؛ Cell Signaling Technology، Inc.) ، anti ‑ Bcl ‑ 2 (1: 1، 000؛ cat. no. 26593‑1 ‑ AP؛ ProteinTech Group، Inc.)، anti ‑ Bax (1،1 000؛ cat. no. 60267‑1 ‑ Ig؛ ProteinTech Group، Inc.) ومضاد ‑actin (1: 2 ، 000 ؛ cat. no. 4970 ؛ Cell Signaling Technology، Inc.). تبع ذلك حضانة مع الفجل الحار بيروكسيديز ‑ الأجسام المضادة الثانوية المقترنة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة: الماعز المضاد للفأر IgG ‑ HRP (cat. no. sc ‑ 2005؛ 1: 5، 000؛ Santa Cruz Biotechnology ، Inc.) أو الماعز المضاد للأرنب IgG ‑ HRP (القط رقم sc ‑ 2004 ؛ 1: 5000 ؛ Santa Cruz Biotechnology، Inc.) ، وتم تصور النطاقات المحددة باستخدام مجموعة ECL (القط رقم P0018AS ؛ Beyotime Institute of Biotechnology) وتم تصويره باستخدام نظام UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). تم إجراء تحليل قياس الكثافة النسبي لنطاقات WB باستخدام برنامج ImageJ 1.4 (NIH) وتم تطبيع مستويات التعبير البروتيني ضد ‑actin.

تصميم تجريبي

يتغير التعبير والتوطين الخلوي لـ ASK1 بعد SAH. تم تعيين ما مجموعه 36 جرذًا بشكل عشوائي إلى ست مجموعات (ن =6 / مجموعة) على النحو التالي: 1) تشغيل الشام (الشام) ، 2) 3 ساعات بعد ‑ SAH ، 3) 6 ساعات بعد ‑ SAH ، الرابع ) 12 ساعة بعد ‑ SAH ، v) 24 ساعة بعد ‑ SAH و vi) 72 ساعة post ‑ SAH. تم استخدام WB لتقييم التغيرات في مستويات التعبير البروتيني لكل من ASK1 و p ‑ ASK1. تم تقسيم ما مجموعه 4 فئران إضافية إلى مجموعات صورية (ن =2) و SAH 24 ساعة (ن =2) وتم استخدام تلطيخ IF لتقييم التوطين المشترك لـ ASK1.

التأثيرات العلاجية لمثبط ASK1 NQDI ‑ 1 على الوظيفة العصبية قصيرة وطويلة المدى بعد SAH. تم تقسيم ما مجموعه 3 0 جرذان إلى 5 مجموعات (ن =6 / مجموعة) على النحو التالي: 1) شام ، 2) SAH بالإضافة إلى مركبة ، 3) SAH زائد 1. 0 ميكروغرام / كجم NQDI ‑ 1، iv) SAH زائد 3. 0 ميكروغرام / كجم NQDI ‑ 1 و v) SAH زائد 1 0. 0 ميكروغرام / كجم NQDI ‑ 1. تم استخدام درجات غارسيا وتوازن الحزمة المعدلة لتقييم الوظيفة العصبية قصيرة المدى لمدة 24 ساعة بعد SAH. بناءً على مدى التحسن العصبي قصير المدى ، تم تقييم 3.0 ميكروغرام / كغ NQDI ‑ 1 لتكون أكثر مجموعة جرعة مناسبة ، واستخدمت هذه الجرعة من NQDI-1 في التجارب اللاحقة. تم تقسيم ما مجموعه 30 جرذًا إلى 3 مجموعات (ن =10) على النحو التالي: 1) شام ، 2) SAH بالإضافة إلى مركبة ، و 3) SAH بالإضافة إلى NQDI ‑ 1. تم استخدام تجربة rotarod لتقييم الوظيفة العصبية طويلة المدى في الأيام 7 و 14 و 21 بعد SAH ، وتم إجراء اختبار Morris Water Maze في الأسبوع 4 بعد SAH لتقييم الوظيفة العصبية على المدى الطويل.

التأثيرات العلاجية لمثبط ASK1 NQDI ‑ 1 على الإجهاد التأكسدي والاستماتة. تم تقسيم ما مجموعه 12 جرذًا إلى 3 مجموعات (ن =4 / مجموعة) على النحو التالي: 1) شام ، 2) SAH بالإضافة إلى مركبة ، و 3) SAH بالإضافة إلى NQDI ‑ 1. تم إجراء تلطيخ (THE) لتقييم الإجهاد التأكسدي وتم استخدام تلطيخ TUNEL لتقييم موت الخلايا المبرمج العصبي بعد 24 ساعة من SAH.

دور مسار إشارات ASK1 / p38 و JNK في التأثيرات العلاجية لـ NQDI-1. تم تقسيم ما مجموعه 48 جرذًا إلى 8 مجموعات (ن =6 / مجموعة) على النحو التالي: 1) شام ، 2) SAH ، 3) SAH بالإضافة إلى مركبة ، 4) SAH بالإضافة إلى NQDI ‑ 1 ، v) SAH بالإضافة إلى مخلوط (Scr) قصير التداخل (si) RNA ، vi) SAH plus ASK1 siRNA ، vii) SAH plus BMS ‑ 582949 and viii) SAH plus SP600125 groups. تم حقن ASK1 siRNA ومثبط p38 BMS ‑ 582949 ومثبط JNK SP600125 لتقييم ما إذا كان ASK1 و p38 و JNK متورطين في التأثيرات الوقائية العصبية لـ NQDI.

تحليل احصائي. تم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري وتم الحصول على البيانات التجريبية لـ WB في 6 مكررات مستقلة ، بينما تم إجراء تلطيخ DHE وتلطيخ TUNEL كأربع مكررات مستقلة. تم تحليل البيانات باستخدام الإصدار 17 من SPSS (SPSS ، Inc.). تم تقييم البيانات من اختبار متاهة موريس المائية باستخدام ANOVA مختلط / مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، متبوعة باختبار LSD اللاحق. تم اختبار البيانات من التجارب المتبقية للتوزيع الطبيعي باستخدام اختبار التوزيع الطبيعي Shapiro ‑ Wilk متبوعًا بأسلوب ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey للمقارنة المتعددة اللاحق. تم رسم الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism 7 (GraphPad Software ، Inc.). ص<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

نتائج

الوفيات وشدة SAH. تم استخدام ما مجموعه 191 من الفئران SD في هذه الدراسة ، تم استبعاد 8 منها بسبب SAH معتدل فقط (درجة تصنيف SAH أقل من أو تساوي 8). من الفئران SD المستخدمة في التجارب ، كان 34 فأرًا في المجموعة الصورية وخضع 149 فأرًا لنمذجة SAH. لم تموت أي جرذان في المجموعة الصورية ؛ ومع ذلك ، مات 23 فأرًا بعد نمذجة SAH (معدل الوفيات 15.4 بالمائة) (الجداول SI-V). مقارنةً بالمجموعة الصورية ، كانت الجلطات في الفضاء تحت العنكبوتية موجودة في المقام الأول بالقرب من حلقة ويليس وعلى جانبي الشريان القاعدي بعد نمذجة SAH (الشكل 1 أ). أظهرت درجة تصنيف SAH بعد 24 ساعة من نمذجة SAH عدم وجود فرق كبير في شدة النزف بين جميع المجموعات غير الشامخة وفرقًا كبيرًا بين الشام وجميع المجموعات غير الصورية (الشكل 1 ب).

يتغير تعبير البروتين والتوطين الخلوي لـ ASK1 بعد SAH. زادت مستويات التعبير البروتيني لـ ASK1 ووصلت إلى ذروتها عند 24 ساعة في الدماغ بعد SAH (الشكل 1C و D). ومع ذلك ، فإن نسبة تعبير البروتين عن p ASK1 / ASK1 لم تظهر فرقًا كبيرًا (الشكل 1C و E). تم توضيح التوطين الخلوي لـ ASK1 مع الخلايا العصبية الإيجابية لـ NeuN ، والخلايا النجمية الإيجابية لـ Iba ‑ 1 ، والخلايا النجمية الإيجابية لـ GFAP في كل من المجموعة الصورية ومجموعة SAH لمدة 24 ساعة (الشكل 1F ‑ H).

يحسن مثبط ASK1 NQDI ‑ 1 الوظائف العصبية قصيرة المدى لمدة 24 ساعة بعد SAH. تم حقن NQDI ‑ 1 (1 ، 3 ، 1 0 ميكروغرام / كغ) داخل البطيني 1 ساعة بعد SAH. كان لدى الفئران التي تخضع لنمذجة SAH درجات أقل بكثير من Garcia وتعديل توازن الشعاع لمدة 24 ساعة بعد نمذجة SAH ؛ ومع ذلك ، أدت الجرعات الثلاث من NQDI-1 إلى تحسن جزئي كبير في الوظيفة العصبية قصيرة المدى (الشكل 2 أ و ب). كانت درجات Garcia المعدلة أعلى بكثير في مجموعة SAH plus NQDI ‑ 1 (3. 0 ميكروغرام / كغ) مقارنة بمجموعة SAH plus NQDI ‑ 1 (1. 0 ميكروغرام / كغ) ؛ ومع ذلك ، لم تظهر فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة مع مجموعة SAH plus NQDI ‑ 1 (1 0. 0 ميكروغرام / كغ) (الشكل 2 أ و ب) ، مما يشير إلى زيادة تركيز NQDI 1. لا تؤدي إلى مزيد من التحسن في الوظيفة العصبية قصيرة المدى بعد SAH. لذلك ، تم اعتبار NQDI 1 (3.0 ميكروغرام / كجم) ليكون التركيز الأمثل الفعال واستخدم في التجارب اللاحقة.

يحسن مثبط ASK1 NQDI ‑ 1 الوظائف العصبية طويلة المدى بعد SAH. باستخدام سرعات بدء من 5 أو 10 دورة في الدقيقة لاختبار Rotarod ، انخفض زمن انتقال السقوط بشكل كبير في مجموعة المركبات SAH plus مقارنة بالمجموعة الوهمية ، في حين تم إطالة زمن انتقال السقوط بشكل كبير بعد الحقن داخل البطيني لـ NQDI ‑ 1 مقارنة مع مركبة SAH plus المجموعة (الشكل 2C و D). علاوة على ذلك ، خلال الأيام 1-5 من مرحلة التدريب لاختبار متاهة موريس المائية في الأسبوع الرابع بعد ‑ SAH ، أظهرت مجموعة المركبات SAH plus وقتًا أطول بكثير للهروب ومسافة السباحة مقارنة بالمجموعة الوهمية ، في حين أظهر علاج NQDI ‑ 1 انخفاض كبير مقارنة مع مجموعة المركبات SAH plus (الشكل 2E-G). في مرحلة الاختبار مع إزالة المنصة الدائرية تحت الماء ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في سرعة السباحة بين المجموعات الثلاث (الشكل 2H). كانت مدة رباعي المسبار أقصر بشكل ملحوظ في مجموعة المركبات SAH plus مقارنةً بالمجموعة الصورية ، وأدى علاج NQDI-1 إلى إطالة وقت الاستغلال بشكل كبير مقارنةً بمجموعة SAH بالإضافة إلى مجموعة المركبات (الشكل 2I).

يقلل مثبط ASK1 NQDI ‑ 1 من الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج العصبي على مدار 24 ساعة بعد SAH. تم قياس مستوى الإجهاد التأكسدي باستخدام تلوين DHE وتم تقييم نسبة الخلايا العصبية الأبوطوزية باستخدام النسبة المئوية للخلايا العصبية الإيجابية لـ TUNEL 24 ساعة بعد SAH. كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ DHE أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة المركبات SAH plus مقارنةً بالمجموعة الصورية وانخفض العلاج NQDI-1 بشكل ملحوظ مقارنةً بمجموعة المركبات SAH plus (الشكل 3 أ و). كانت النسبة المئوية للخلايا العصبية الإيجابية لـ TUNEL أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة المركبات SAH plus مقارنة بالمجموعة الصورية. ومع ذلك ، انخفضت النسبة المئوية للخلايا العصبية الإيجابية لـ TUNEL بشكل ملحوظ بعد العلاج باستخدام NQDI 1 مقارنة مع مجموعة المركبات SAH plus (الشكل 3B و D).

تعمل ASK1 siRNA و BMS ‑ 582949 و SP600125 على تحسين الوظائف العصبية قصيرة المدى على مدار 24 ساعة بعد SAH. مقارنة مع مجموعة SAH plus Scr siRNA أو مجموعة المركبات SAH plus ، أظهرت إدارة ASK1 siRNA أو BMS ‑ 582949 أو SP600125 تحسنًا كبيرًا في درجة توازن Garcia والشعاع المعدلة (الشكل 4 أ و ب).

يخفف NQDI ‑ 1 من الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج بعد SAH من خلال تقليل الفسفرة لـ ASK1 و p38 و JNK. كانت مستويات التعبير البروتيني لـ ASK1 و p p38 و p JNK و 4 ‑ HNE و H O 1 و Bax و Bcl 2 أعلى بشكل ملحوظ بعد SAH مقارنة بالمجموعة الشام ؛ ومع ذلك ، فإن نسبة p ASK1 / ASK1 لم تكن مختلفة بشكل كبير (الشكل 5A ‑ M). لم يؤدي حقن المركبات أو Scr siRNA إلى فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير البروتيني مقارنة بمجموعة SAH. بالمقارنة مع مجموعة المركبات SAH plus ، تسبب العلاج باستخدام NQDI ‑ 1 في انخفاض كبير في مستويات التعبير البروتيني لـ p ASK1 / ASK1 و p ‑ p38 و p ‑ JNK و 4 ‑ HNE و Bax ، في حين أن مستويات التعبير البروتيني لـ H O تمت زيادة ‑1 و Bcl 2 بشكل ملحوظ. بالمقارنة مع مجموعة SAH plus Scr siRNA ، انخفضت مستويات التعبير البروتيني لـ ASK1 بشكل ملحوظ بعد حقن ASK1 siRNA. نتج عن العلاج باستخدام ASK1 siRNA أيضًا انخفاض كبير في مستويات التعبير البروتيني لـ p p38 و p JNK و 4 ‑ HNE و Bax وزيادة ملحوظة في تعبير H O ‑ 1 و Bcl ‑ 2 مقارنة مع SAH بالإضافة إلى Scr siRNA مجموعة.

يقلل مثبط p38 BMS ‑ 582949 من مستويات التعبير البروتيني لـ p p38 ولكنه لا يؤثر على مستويات تعبير البروتين p ASK1 أو ASK1 أو p JNK. أظهر العلاج بالمثبط p38 BMS ‑ 582949 انخفاضًا كبيرًا في مستويات التعبير البروتيني لـ p p38 و 4 ‑ HNE و Bax وأيضًا زيادة تعبير البروتين بشكل ملحوظ عن H O 1 و Bcl 2 مقارنة مع مجموعة المركبات SAH plus ؛ ومع ذلك ، فإن مستويات التعبير البروتيني لـ ASK1 و p ASK1 / ASK1 و p JNK لم تظهر فروقًا ذات دلالة إحصائية (الشكل 6A ‑ M). يعمل مثبط JNK SP600125 على تقليل مستوى التعبير البروتيني لـ p ‑ JNK ولكنه لا يؤثر على مستويات تعبير البروتين p ‑ ASK1 أو ASK1 أو p p38. تسبب العلاج بمثبط JNK SP600125 في انخفاض كبير في مستويات التعبير البروتيني لـ p JNK و 4 ‑ HNE و Bax وزيادة ملحوظة في مستويات التعبير البروتيني HO 1 و Bcl 2 مقارنة مع مجموعة المركبات SAH plus ؛ ومع ذلك ، فإن مستويات التعبير البروتيني لـ ASK1 و p ASK1 / ASK1 و p p38 لم تتغير بشكل كبير (الشكل 7A - M).

【لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】