التألق الذاتي باعتباره علامة بيولوجية غير جراحية للشيخوخة والمنتجات النهائية للجليكيشن المتقدمة في Caenorhabditis Elegans

لتقييم فائدة التألق الذاتي كعلامة حيوية غير غازية للشيخوخة في Caenorhabditis elegans ، قمنا بقياس التألق الذاتي للديدان الخيطية الفردية باستخدام مقياس التألق الطيفي. يزداد تألق كل دودة مع تقدم العمر. أظهرت الحيوانات ذات الكثافة المنخفضة للفلورة متوسط ​​عمر أطول. عندما تم تحضين البروتينات المستخرجة من الديدان بالسكريات ، زادت شدة التألق وتركيز المنتجات النهائية للجليكيشن المتقدمة (AGEs) بمرور الوقت. عزز ريبوز هذه التغييرات ليس فقط في المختبر ولكن أيضًا في الجسم الحي. قام مانع الجلوكوز ريفامبيسين بقمع هذا الارتفاع في التألق. أظهر مقياس الطيف الكتلي عالي الدقة أن الفيتيلوجينين المتراكم في الديدان القديمة ، والفيتيوجينين الجلوكوز ينبعث منه ستة أضعاف تألق من فيتيلوجينين ساذج.الزيادة في التألق مع تقدم العمر تنبع من المواد السكريةوبالتالي يمكن أن تكون بمثابة علامة بيولوجية مفيدة غير جراحية للعوامل الجوية العمرية.سيستانشيمكن أن يكون بمثابة نموذج جديد للبحث عن العوامل المضادة للشيخوخةودراسة العلاقة بين الأعمار والشيخوخة.

سيستانأعشاب العوامل المضادة للشيخوخة

مقدمة

تم تمديد متوسط ​​عمر البشر بشكل كبير في البلدان المتقدمة خلال نصف القرن الماضي. لكن،الضرر التدريجي مع التقدم في السن يسبب تأثيرات ضارة على الوظائف الفسيولوجية، معروف كشيخوخة، والأمراض المرتبطة بالشيخوخةتتزايد أيضًا فيتتناسب مع طول العمر. تمديد"تمتد الصحة" ضروري الآن بدلاً من إطالة العمر وحده. التدخلات التي تبطئ الشيخوخة وتطيل الفترة الصحية مرغوبة. برينر وآخرون. قدَّمأنواع معينة انيقة، وهو نيماتودا تربة صغيرة تعيش بحرية تتغذى على البكتيريا ، لاستخدامها فيدراسات الوراثة الجزيئية للتمايز والتطوير.

بعد ذلك ، تم استخدام الدودة على نطاق واسع كنظام تجريبي للدراسات البيولوجية ، بما في ذلك البحث عن الشيخوخة ، بسبب هذا الحيوان'البساطة والشفافية وسهولة الزراعة وقصر العمر وملاءمة التحليل الجيني2. في الدودة ، يمكن فحص الشيخوخة عن طريق إضعاف القدرة الحركية ، ومقاومة الإجهاد ، والقدرة المعرفية ، وضخ البلعوم ، وتراكم ما يسمى بصبغة العمر الدهنية.3–5 .

مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية ، بما في ذلك مضادات الأكسدة والعديد من الأدوية ، مرشحة لمنع الشيخوخة6,7. علاوة على ذلك ، نظرًا لأننا أبلغنا عن إمكانية إطالة الفترة الصحية والعمر الافتراضي للديدان الخيطية عن طريق التغذية على بكتيريا البروبيوتيك8,9، كما أظهر عدد من المختبرات آثار طول عمر البكتيريا المفيدة10–12. تم فحص تأثيرات طول العمر من خلال منحنيات البقاء على قيد الحياة ، ولكن مثل هذه الدراسات في الديدان تتطلب أكثر من 3 أسابيع ، على الرغم من العمر القصير نسبيًا للديدان.C. ايليجانس. لتقييم آثار التدخلات ضد الشيخوخة ، فإن مؤشرات الشيخوخة المريحة وغير الغازية مرغوبة لتتبع التأثير في الديدان الفردية و (في النهاية) على البشر كهدف نهائي.

يستخدم Lipofuscin ، وهو ما يسمى بصبغة العمر ، على نطاق واسع كمؤشر للشيخوخة. ومع ذلك ، فإن العلاقة الدقيقة بين التألق الذاتي والشيخوخة والعمر في الدودة ظلت غير واضحة. Gerstbrein et al. ذكرت أن أصباغ العمر هي مراسلين صالحين للديدان الخيطية هيلثسبان13، في حين أن Coburn et al. ذكرت أن التألق الأزرق (الإثارة / أطوال موجات الانبعاث تتمحور حول 340/430 نانومتر) بمثابة علامة موت لعدة ساعات قبل وبعد الموت فيC. ايليجانس14. لقد تم اقتراح أن الزيادات في التألق الذاتي الأزرق لوحظت بمرور الوقت في السكان المسنينC. ايليجانسقد لا يعكس معدل الشيخوخة أو الحالة الصحية للسكان في حد ذاته ، ولكن بدلاً من ذلك جزء من الموتى أو شبه الأموات في العينة15.

اجتذبت المنتجات النهائية المتقدمة للجليكيشن (AGEs) الاهتمام العلمي16 لأنها تتشكل بكميات كبيرة في حالات السكري ، وأيضاً أثناء الشيخوخة الفسيولوجية ، وتؤدي إلى الإجهاد التأكسدي. AGEs هي مركبات معقدة تتكون من تفاعلات غير إنزيمية بين السكريات المختزلة والمجموعات الأمينية في البروتينات أو الدهون أو الأحماض النووية ؛ يتم بعد ذلك تكوين قواعد شيف ومنتجات أمادوري من خلال تفاعلات ميلارد ، مما يؤدي إلى ظهور الأعمار. AGE محتوى مرتفع في مرضى السكري والتهاب المفاصل الروماتويدي والزهايمر'مرض وأمراض أخرى17–19. في مرضى السكري ، يرتبط تراكم AGE بشكل جيد مع شدة مرض الأوعية الدموية الدقيقة ويزداد مع تقدم العمر. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح ما إذا كانت AGEs تمثل سببًا للإمراض أم أنها منتجات ثانوية فقط. تعتبر الأعمار من الأسباب المحتملة للشيخوخة20,21، على النحو المقترح من النتائج في أC. ايليجانسنموذج سمية السكر22,23.

تم تطوير طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من خلال استخدام الأجسام المضادة ذات الخصوصية للعديد من مركبات AGE24–26. ومع ذلك ، فإن الأساليب غير الغازية للسماح بتقديرات تقريبية لمستويات AGE مطلوبة أيضًا. منذ عدة أجيالفلوريداuorescent وما يرتبط بهافلوريداتظهر شدة التوهج دلالةفيفيغير قادر على الارتباط بالمستويات التي تم قياسها بواسطة ELISA27، قمنا بفحص ما إذا كان هذافلوريدايمكن استخدام الإزعاج كعلامة بديلة لتتبع حالة الأعمار العمرية والشيخوخة فيC. ايليجانسنموذج.

للتحقق مما إذا كان لوحظضوئييعكس الموت فقطضوئيذكرت من قبل Coburn et al. ، تم فحص الديدان عن طريق تتبعفلوريداانتفاخ الديدان الفردية في حينتوقيت موت الحيوانات المعنية. علاوة على ذلك ، فإنآثار مثبطات تكوين AGE علىضوئيو AGE التراكم أيضًا للتحقق من فائدةC. ايليجانسكحيوان نموذجي لبحوث AGE.

نتائج

تألق ذاتي للبروتينات المستخرجة كعلامة حيوية للشيخوخة والعوامل العمرية في الديدان

أشار القياس الطيفي الفلوري للبروتينات المستخرجة إلى أن الإثارة عند 325–365 نانومتر من صنع 17- دودة عمرها يومفلوريدامع أعلى انبعاثات في 400–430 نانومتر (ذروة 420 نانومتر) الفاصل الزمني (الشكل.1أ). الازرقفلوريداكان الترهل أقل نسبيًا خلال مرحلة البلوغ الصغيرة (3- من عمر يوم إلى 5- يوم) ولكنه زاد بمرور الوقت (في 7- الحيوانات بعمر يوم واحد) (الشكل.1ب). ينبعث Lipofuscin ، وهو ما يسمى بصبغة العمر ، من اللون الأحمرفلوريداuorescence (الإثارة في 530–560 نانومتر ، الانبعاث عند 585–645 نانومتر)15؛ في دراستنا السابقة ، تم اكتشاف هذه العلامة في أواخر الديدان (أكثر من 13- يوم)9. 

منذ السياراتفلوريداظهر التوهج الموجود في الدراسة الحالية في مرحلة مبكرة وزاد بمرور الوقت ، تلقائي أزرقفلوريداكان من المتوقع أن يكون التوهج علامة بيولوجية أفضل لتتبع الشيخوخة. نظرًا لأن العديد من مركبات AGE معروفة بأنها فلورية تلقائية ، فقد فحصنا العلاقة بين محتويات AGE والأزرقفلوريداuorescence بواسطة النشاف الغربي الذي فيه جسم مضاد لـ N.ε- تم استخدام (carboxymethyl) lysine (CML) ، وهو ممثل AGE. أظهر النشاف أن نطاقًا رائعًا تم تضخيمه بمرور الوقت (الشكل.1ج والشكل التكميلي 1). في الواقع ، أشار القياس الكمي للمنطقة إلى زيادة AGE (الشكل.1د) ، على الرغم من أن CML ليس تلقائيًافلوريدامتوهج.

لتحديد ما إذا كانت السيارةفلوريداوأشار إلحاح بشكل غير مباشر إلىالزيادة في AGEs التي شكلتها تفاعل Maillard ، البروتيناتالمستخرجة من متجانسات الديدان تم تحضينها بطريقة معقمة لمدة تصل إلى 4 أسابيع مع تقليل السكريات مثل الجلوكوز والريبوز والفركتوز. الفلوريداازدادت شدة البروتينات بمرور الوقت في وجود السكريات ، بينما لم تكن هناك زيادة ملحوظة فيفلوريداإضطراب في التفاعلات التي يتم إجراؤها بدون سكريات (الشكل.2أ). أصبحت بروتينات الدودةفلوريدايوريسنت عن طريق glycation حتى في المختبر. من بين التفاعلات التي أجريت مع كل من السكريات الثلاثة ، أنتجت تلك التي تحتوي على الريبوز الأعلىفلوريداإرهاق ، متبوعًا بالسكريات الأخرى. هذافاييمكن تفسير nding من خلال تقرير من Bunn و Higgins حيث يعتمد تفاعل كل أحادي السكريد مع المجموعات الأمينية لتشكيل روابط قاعدة شيف على مدى وجوده في الهيكل المفتوح (الكاربوني) بدلاً من الحلقة ( هيكل نصفي أو نصفي) ، وزادت معدلات التفاعل بترتيب الريبوز (1 0. 0) ، الفركتوز (4.5) ، والجلوكوز (0.6) (× 10)−3 مم−1 h−1 )، على التوالى28.

الشكل 1 القياس الطيفي الفلوري وأعمار عينات بروتين الدودة. امصفوفة انبعاث الإثارة (EEM) مؤامرات من تألق ذاتي من الديدان المفسدة في عمر 3- يوم و 17- يوم. الفلوريدايتم عرض مستويات التألق عند الطول الموجي للانبعاث في مخططات EEM كخرائط حرارة ملونة. تم التخلص من مائة دودة (من النوع البري N2) لكل منها 3- بعمر يوم واحد و 17- يوم في 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل و 4 ميكرولتر من 15 بالمائة SDS. تم إطلاق البروتينات عن طريق دورات ذوبان الجليد ، وتم جمع أطياف الإضاءة الضوئية باستخدام أفلوريدامقياس الطيف الضوئي (Hitachi FL -4500). تم تحليل خصائص التألق للديدان الخيطية المتحللة باستخدام EEMفلوريداالتحليل الطيفي للاضطراب. الإثارة عند 325–365 نانومتر من صنع 17- دودة عمرها يومفلوريدامع أعلى انبعاثات في 400–430 نانومتر الفاصل الزمني المسارات المقابلة كسلسلة منفلوريداشدة التوهج ، في حين أن الديدان الصغيرة البالغة من العمر يوم واحد لم تفعل ذلكفلوريدااضطر. التحليل متعدد المتغيرات (الإثارة أحادية الطول الموجي مع انبعاث متعدد الأطوال الموجية ، والمسح المتزامنفلوريداuorometry) أسفرت عن مؤامرات EEM تتكون من إثارة مسح ضوئي واحد.b مستويات السياراتفلوريداشدة (ex 340 / em 360–600) عن طريق عينات البروتين الدودية المستخرجة من الحيوانات من كل فئة عمرية (3–13 يومًا). تم جمع الديدان (من النوع البري N2) في أنابيب وغسلهاخمسةمرات ، و lysed في كل أنبوب. تم بعد ذلك طحن العينات باستخدام مطحنة صغيرة لاسلكية (فوناكوشي ، طوكيو ، اليابان) لإطلاق البروتين. تم قياس محتويات البروتين كمياً كما هو موضح في الطرق. أفلوريداتم تحديد طيف التألق لكل عينة 30- ميكرولتر (تحتوي على 1.5μg من البروتين الكلي) باستخدام نموذج قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعدد الأوضاع معمل SH -9000 (Corona Electric ، Ibaraki ، اليابان). تم إجراء كل قياس ثلاث مرات.c تحليل النشاف الغربي لـ AGE CML في العينات المستخرجة من مجموعات الديدان (النوع البري N2) من مختلف الأعمار. يتم عرض صورة تمثيلية لثلاث تجارب قابلة للتكرار. تم اشتقاق البقع من أجزاء مختلفة من نفس الجل (كما هو موضح في الشكل التكميلي 1) وتمت معالجتها بالتوازي.د التحديد الكميمن AGEs في البقع الغربية باستخدام قياس الكثافة. الأشرطة محاطة بإطارات مستطيلة الشكل.1تم تحديد كمية c ، وتظهر البيانات من ثلاث تجارب قابلة للتكرار على أنها تعني ± SE.

على التوالى.

لتقييم ما إذا كانت الزيادات فيفلوريداكان الإلحاح في وجود السكريات ناتجًا عن تكوين AGE ، تم استخدام ELISA للكشف عن مركب AGE التمثيلي CML. زاد سرطان الدم النخاعي المزمن في هذه التفاعلات ، وكان المستوى في العينات المحتضنة مع الريبوز أعلى بنحو سبعة أضعاف من تلك الموجودة في الضوابط المحتضنة بدون سكريات لمدة 4 أسابيع (الشكل 1 ب).2ب). بالمقارنة مع الريبوز ، كانت كميات CML المنتجة مع الجلوكوز أو الفركتوز منخفضة ، على غرار CML في المجموعة الضابطة ؛ هذاالعثور علىيتوافق مع تقرير سابق29.

التألق الذاتي كمؤشر بيولوجي للشيخوخة والعوامل العمرية في الجسم الحي

اختبرنا بعد ذلك ما إذا كانفلوريدايمكن الكشف عن التوهج ليس فقط من البروتينات المستخرجة ولكن أيضًا في الديدان الحية. عندما تمت قراءة التألق الذاتي للديدان الفردية على غلاف بلاستيكي ممتد على 384- ألواح جيدة مع قارئ صفيحة صخرية متعددة الأوضاع ، كانت نتائج القياس الطيفي مماثلة لتلك الخاصة بالبروتينات المستخرجة (الشكل.3أ). كثافة اللون الأزرق الفرديةفلوريدازيادة الإزعاج بمرور الوقت (الشكل.3ب والشكل التكميلي 2) ، بينما لا أحمرفلوريداتم الكشف عن التألق بهذه الطريقة. منذ اللون الأزرقفلوريداتم الإبلاغ سابقًا عن أن التوهج (340/430 أو 350/460 نانومتر) مرتبط بالوفاة14,15، تم إجراء التحليل من خلال استبعاد البيانات التي تم الحصول عليها في غضون يومين قبل الحيوان'ق الموت. ومع ذلك ، فإن اللون الأزرقفلوريدالا يزال نضج الديدان يزداد بمرور الوقت: زيادةفلوريدالذلك يجب أن يكون الإلحاح مستقلاً جزئيًا عن الموتفلوريداإصرار. لاختبار ما إذا كان التألق الذاتي يمكن أن يكون علامة حيوية للشيخوخة ، قمنا بفحص عدد الأيام التي يمكن أن تعيش فيها الديدان بعد قياس التألق الذاتي على 13- ديدان عمرها يوم واحد. كان متوسط ​​العمر المتوقع لكل دودة مرتبطًا عكسياً بكثافة التألق الذاتي (الشكل.3c).

الفلوريداكما ارتفعت شدة التعرق في الديدان المزروعة بالريبوز (الشكل.4أ)؛ كان عمر هذه الديدان دلالةفيفيأقصر بكثير من ديدان التحكم (الشكل.4ب). على النقيض من ذلك ، فإن الديدان التي نمت على وسط يحتوي على ريفامبيسين ، مانع AGEs ، انبعثت أقلفلوريداقهر مقارنة بالديدان الضابطة التي نمت بدون ريفامبيسين (الشكل.4ج) ؛ تم الإبلاغ سابقًا عن التأثير المؤيد لطول العمر للريفامبيسين30. بالإضافة إلى،داف -2، متحولة تمثيلية مؤيدة لطول العمر ، تتألق تلقائيًا أقل مقارنة بالنوع البري (الشكل.4د) ، في حين أنفلوريدازيادة شدة الإنبات من النوع البري مع تقدم العمر.

جزء منفلوريدامن المتوقع أن يتم اشتقاق التوهج من المركبات المنتجة بالاقتران مع موت الحيوانات. الازرقفلوريدايمكن أن يكون التوهج هو علامة الموت التي يشير إليها Coburn et al. لوحظ فيC. ايليجانسلعدة ساعات قبل الموت وبعده ؛ يأتي الضوء الأزرق من حمض الأنثرانيليك الذي يتشكل فور موت الديدان14. يقال ، الموتفلوريداينبعث التوهج من الشكل الجليكوزيلاتي لحمض الأنثرانيليك الذي ينتجه مسار الكينورينين14. كيو -1وبناءً عليه ، كان من المتوقع ألا تنبعث الديدان الطافرة ، التي تفتقر إلى إنزيم كينورينينيز ، الموتفلوريداإصرار. ومع ذلك ، حتى في وجود هذه الطفرة ، لا يزال يبدو أن الديدان المسنة تنبعث منها أعلىضوئيمن الديدان الأصغر سنًا (الشكل.5أ) ، والديدان التي تزرع على وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مدعومة بإشارات الريبوز المعروضةفيفيبهدوء أعلىفلوريدامن تلك التي تزرع في غياب الريبوز التكميلي أو مع السوربيتول السكر الضبط (الشكل.5ب). كان من الواضح أن عمر الديدان التي تم الحفاظ عليها بالريبوز أقصر من عمر الديدان الأخرى (الشكل.5ج) ، مما يشير إلى التأثيرات المؤيدة لشيخوخة الأعمار في الديدان.

تحديد المواد ذات الفلورسنتللتعرف على المواد التيفلوريداتم إجراء فحص LC MALDI في الحيوانات المسنة ، على البروتينات المستخرجة. يتم سرد البروتينات الستة الأكثر وفرة الموجودة في كل عينة في الجدول1؛ على وجه الخصوص ، تم إثراء فيتيلوجينين وعوامل الاستطالة من بين أفضل -45فلوريداتقوية البروتينات في الديدان القديمة. علاوة على ذلك ، باستخدام MS عالية الدقة والبيئة الحسابية Mascot ، بحثنا عن البروتينات التي كانت أكثر وفرة في 15- الديدان القديمة 3- في الديدان القديمة وحددنا 180 بروتينًا (الجداول التكميلية 1–3). على الرغم من أن الفيتيلوجينين قد تم إثرائه مرة أخرى (موجود بمستويات أعلى بستة أضعاف في الديدان الأكبر سنًا مقارنة بالشباب) ، كانت مستويات عوامل الاستطالة متشابهة في المجموعتين (الشكل التكميلي 3). للتحقق مما إذا كانت هذه البروتينات يمكن أن تُغلف لتشكيل AGEs ذاتي التألق ، تم تحضين عامل الاستطالة المنقى والفيتيلوجينين مع الريبوز في المختبر. أظهر التألق المنبعث من فيتيلوجينين جليكوكين أطيافًا مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من المستخلصات الخام المسترجعة من 17- ديدان عمرها يوم واحد (الشكل 1 ب).6أ). على الرغم من أن الريبوفلافين معروف بفلوريداعلى وجه السرعة ، وجدنا أن الطول الموجي لانبعاث الريبوفلافين كان مختلفًا عنأن مستخلصات الدودة. كان مضان FL للفيتيلوجينين السكري وعامل الاستطالة ستة وثلاثة أضعاف (على التوالي) من البروتينات غير المصقولة لمدة 23 يومًا في المختبر (الشكل.6b).

كما ازدادت AGE المكتشفة عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة لـ CML بمرور الوقت من 3- يوم إلى 13- ديدان عمرها يوم في الجسم الحي (الشكل.1ج). من خلال النشاف الغربي المتزامن مع الأجسام المضادة للفيتيلوجينين ، وجدنا أن إشارات مكافحة سرطان الدم النخاعي المزمن كانت بنفس حجم النطاقات مثل فيتيلوجينين (الشكل 1 ب).6ج). على الرغم من تراكم فيتيلوجينين YP170 و YP115 مع تقدم العمر خلال هذه الفترة ، فقد تم تعزيز شدة إشارات AGE أعلى من الزيادة في كمية vitellogenin YP170 (الشكل 1 ب).6د). كشف الفحص المجهري الفلوري أن 13- ديدان عمرها يوم واحد (الشكل.7d–f ، العمودين 2 و 3) الإشارات المنبعثةفيفيضوء أزرق أكثر كثافة من 3- صغار البالغين يوم واحد (الشكل.7a–ج ، العمودين 2 و 3 ؛ تين.7ز) ؛ كما بدت الغدد التناسلية أكثر إشراقًا (الشكل.7d–و ، العمودين 1 و 2). CML هو عمر تمثيلي ، على الرغم من أن سرطان الدم النخاعي المزمن ليس نيونًا في حد ذاته. من المعروف أن البنتوسيدين ، وهو عمر آخر ، هو الفلوريسنت. ومع ذلك ، فإن المناعة مع عدم وجود الأجسام المضادة لـ CML ولا مضادات البنتوسيدين قدمت اختلافات بارزة بين الديدان القديمة والشابة (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، أظهر مضاد CML انتشارًا منتشرًا عبر الأنسجة ، بينما لم يظهر مضاد البنتوسيدين ذلك.