arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

التألق الذاتي باعتباره علامة بيولوجية غير جراحية للشيخوخة والمنتجات النهائية للجليكشن المتقدمة في Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

مناقشة

سابقًا ، تم استخدام التألق الذاتي لمراقبة الدهون الدهنية ، صبغة العمر ، كعلامة حيوية للشيخوخة4,13. على الرغم من أننا لاحظنا اللون الأحمرفلوريداالإلحاح يدل على lipofuscin كما رأينا في الدراسات السابقة9، أزرقفلوريداتم الكشف عن التوهج في مرحلة مبكرة من الحياة عندما تم فحص الديدان باستخدام M165 FCفلوريدامجهر مجسم uorescence (لايكا مايكروسيستمز ، طوكيو ، اليابان) (البيانات غير معروضة). كان الغرض من هذه الدراسة هو فحص ما إذا كان التألق الذاتي الأزرق يمكن أن يكون بمثابة علامة أكثر حساسية لتتبع شيخوخة الديدان الفردية.

anti- senescence cistanche function

سيستانش لمكافحة الشيخوخة

Buy Cistanche

منتج مضاد للشيخوخة جاهز للشحن


الفلوريدازيادة الإزعاج في الديدان الفردية مع تقدم العمر ؛ عدد أقل من الديدانفلوريداuoresced ، وطول العمر المتوقع. وهكذا ، الأزرقفلوريداقد يوفر التوهج واصمًا حيويًا بديلاً لتتبع الشيخوخة. ومع ذلك ، Pincus et al. ذكرت أن الديدان التي ماتت لاحقًا (خلال 24 ساعة)فلوريدامستحضر بسبب التخليق الحيوي للكينورينين ؛ أطلق هؤلاء الباحثون على هذا الضوء الأزرق"موتفلوريداإصرار". يقال ، الموتفلوريداإعادة الإصرارفلوريداالانبعاث عن طريق شكل غليكوزيلاتي من حمض الأنثرانيليك الناتج عن مسار الكينورينين ؛ السياراتفلوريداتم الكشف عن مادة uorescing في حبيبات الأمعاء الشبيهة باللازوزوم31. يمكن أن يكون هذا الضوء الأزرق هو نفس علامة الموت التي قام بها Coburn et al. لوحظ فيC. ايليجانسلعدة ساعات قبل الموت وبعده ، وبحسب ما ورد شوهد في كل من الديدان الصغيرة التي تعرضت لإصابة قاتلة والديدان التي تموت بشكل طبيعي من الشيخوخة. في الواقع ، لاحظنا أنالنوع -1متحولة ، التي تفتقر إلى نشاط كينورينينيز ، كان تألق ذاتي أقل من النوع البري. ومع ذلك ، أشارت نتائجنا إلى وجود جزء من اللون الأزرقفلوريداالإلحاح مرتبط بالشيخوخة وليس بالموت. بشكل ملحوظ ، كما هو موضح في الشكل.3ب ، أظهرت ديدان الشيخوخة زيادة اللون الأزرقفلوريداإضطراب شديد حتى عند استبعاد البيانات التي تم الحصول عليها خلال اليومين السابقين للوفاة. علاوة على ذلك ، لا تزال الديدانفلوريدايزداد مع تقدم العمر ، بغض النظر عن حالةكينو -1الجين. مخفضفلوريداإرهاق فيكينو -1يجب أن يكون متحولة بسبب الخسارةمن تسريع تخليق AGE بواسطة kynurenines بدلاً من نقص الموتفلوريداإصرار32.


بعض مركبات AGE هيفلوريدامتوهج27. استنتجنا أن اللون الأزرقفلوريداقد تشمل التقلبات الانبعاثية من تلك الأعمار ، منفصلة عن تلك المنسوبة إلى الوفاةفلوريداإصرار. عندما تم تحضين بروتينات الدودة المستخرجة مع السكريات في المختبر ، فإنفلوريدازادت شدة التوهج ومستويات AGE بمرور الوقت. الديدان المستزرعة على وسط يحتوي على الريبوزفلوريدايتم تربيتها أكثر من الحيوانات الضابطة في حالة عدم وجود ريبوز إضافي ، حتى عندماكينو -1تم تحور. في المقابل ، أظهرت الديدان المزروعة في وجود ريفامبيسين ، وهو مثبط معروف لإنتاج AGEs ، مستويات منخفضة من اللون الأزرق.فلوريداإصرار. في الواقع ، أشار الفحص المجهري الفلوري إلى أن 13- ديدان عمرها يوم واحد تنبعث منها ضوء أزرق أكثر من 3- صغار البالغين اليوم. فشل المناعة باستخدام الأجسام المضادة لـ CML أو مضادات البنتوسيدين في إظهار وجود AGEs المنتشرة بشكل منتشر في نمط توزيع يشبه اللون الأزرقفلوريداإصرار. الفلوريدايمكن أن تنشأ الإزعاج من وفيرة أخرىفلوريداالأعمار القوية مثل vespertine A و LM -1 و argpyrimidine33,34.


لتوفير صفار البويضات ،C. ايليجانسيستهلك الخنثى الكتلة الحيوية المعوية الخاصة بهم ، مما يؤدي إلى ضمور الأمعاء وترسب الصفار خارج الرحم في وقت لاحق من الحياة. كانت فيتيلوجينين (بروتينات صفار البيض) موجودة بمستويات أعلى مرتين في الديدان القديمة (مقارنة بالحيوانات الأصغر سنًا) ، كما ورد سابقًا35وعرضت ستة أضعاففلوريداإرهاق بعد glycation في المختبر. تشير هذه البيانات إلى أن فيتيلوجينين نفسها قد تولد 12- أضعاففلوريداالتوهج في الديدان الأكبر سنًا مقارنة بالشباب نظريًا. أظهر النشاف الغربي أن العصابات الرئيسية التي تتفاعل مع الجسم المضاد لـ CML كانت بروتينات الصفار. تتطابق هذه النتيجة مع التقارير السابقة لـ Nakamura et al. ، الذين اكتشفوا وجود نسبة كبيرة من الجلوكوز في vitellogenin36، و Golegaonkar وآخرون ، الذين اكتشفوا انخفاض نسبة السكر في فيتيلوجينين -2 ، وفيتيلوجينين -6 ، وعامل الاستطالة 1 ألفا في الديدان الخيطية المعالجة بريفامبيسين30. تفيد التقارير أن فيتيلوجينين تعمل كمضادات للأكسدة وتساهم في إطالة عمر ملكات نحل العسل37. فيC. ايليجانسيلعب فيتيلوجينين دورًا حاسمًا في مقاومة الإجهاد 38. بما أن مضادات الأكسدة يمكن أن تتأكسد بسهولة بنفسها ، فإن تراكم فيتيلوجينين الغليكوزين قد يضعف الحماية من الضرر التأكسدي ، مما يؤدي إلى علاقة عكسية بين متوسط ​​العمر المتوقع وكثافة اللون الأزرق.فلوريداالإلحاح الذي لوحظ في هذه الدراسة. ومع ذلك ، سورندا وآخرون. ذكرت مؤخرًا أن العمر غير مرتبط بمقاومة الإجهاد التأكسدي بوساطة YP115 / YP88 (vitellogenin -6)39. اقترح هؤلاء الباحثون أن تراكم فيتيلوجينين YP170 ، المشتق من فيتيلوجينين 1–5 ، يسبب ضمورًا معويًا ويقلل من العمر الافتراضي ، في حين أن تراكم YP115 / YP88 قد يؤخر ضمور الأمعاء ويطيل العمر. وبالتالي ، قد يساهم تناول فيتيلوجينين -6 والخلل الناتج عن ذلك في حدوث الشيخوخة. على الرغم من عوامل الاستطالةفلوريداتم زيادة كثافة هذه البروتينات بثلاثة أضعاف بعد عملية التحلل في المختبر ، وكانت كميات هذه البروتينات متشابهة بين الديدان الصغيرة والكبيرة. لذلك ، قد تكون مساهمة هذا العامل في التألق الذاتي المحسن أصغر من تلك المنسوبة إلى فيتيلوجينين.

anti- senescence cistanche function


سيستانشتم استخدامه بشكل عام كنموذج لـيذاكرالتدخلات الخاصة بالشيخوخة ومضادة للشيخوخة. اقترحنا استخدام الدودة كنموذج للتحقيق في التأثيرات المؤيدة لطول العمرمن بكتيريا حمض اللاكتيك8. بالنظر إلى التظاهر (في الدراسة الحالية) أن اللون الأزرقفلوريداالتورط في الديدان الخيطية هو مؤشر محتمل لتراكم الأعمار ، نقترح ذلكسيستانش يمكن أن تكون الخنثى بمثابة نموذج للتحقيق في فائدة التدخلات المضادة للشيخوخة التي تعمل من خلال قمع إنتاج AGEs. في المقابل ، من غير المحتمل أن يكون التألق الذاتي مؤشراً بيولوجياً لشيخوخة الديدان الذكورية لأن فيتيلوجينين يجب أن تكون نادرة.

anti- senescence cistanche function

الشكل 5 مضان أزرق من طفرات kynu -1 ، والتي لا ينبغي أن تنبعث منها فلورة الموت. أشدة الإسفار (مثال 340 / em 430) لـ 7- يوم و 13- يومكينو -1المسوخ (n = 37 لكل منهما) ؛ الديدان الأكبر سنا لا تزال تنبعث منها أكثرفلوريدامن الديدان الأصغر سنا ، على الرغم منكينو -1طفره. ومع ذلك ، لا دلالةفيفيتم اكتشاف اختلاف غير قادر في قيم التألق الذاتي بواسطة مان–ويتنيU امتحان.b دودة عمرها {{0} يوم واحد مصحوبة بالريبوز تنبعث من اللون الأزرق بدرجة أكبرفلوريداإصرار على الرغم منالنوع -1طفره. أزرقفلوريداإصرارC. ايليجانسينمو مع الريبوز (n = 24) أو السوربيتول (n = 18) مع ديدان السيطرة بدون السكريات (n = 20). تمت مقارنة قيم التألق الذاتي باستخدام الفولاذ اللامعلمي–طريقة Dwass (**p < 0.01). c منحنيات البقاء على قيد الحياةC. ايليجانسينمو مع الريبوز (n = 62) أو السوربيتول (n = 84) مع ديدان السيطرة بدون السكريات (n = 64). كانت الديدان عمرها 3 أيام في يوم 0. تم حساب بقاء الديدان الخيطية بواسطة كابلان–تم اختبار طريقة ماير ، واختلافات البقاء على قيد الحياة من حيث الأهمية باستخدام اختبار تسجيل الترتيب (**p < 0.01).


طُرق

النيماتوداسيستانش تم توفير سلالة بريستول N2 وسلالاتها الطافرة المشتقة من قبل مركز Caenorhabditis الوراثي بجامعة مينيسوتا. كانت الطفرات المستخدمة في هذه الدراسة هي CB1370داف -2 (e1370)و CB1003كينو -1 (e1003). تم الحفاظ على الديدان الخيطية ونشرها على NGM وفقًا للتقنية القياسية 40. تم استرداد بيض الدودة من الديدان البالغة بعد التعرض لمحلول هيبوكلوريت الصوديوم / هيدروكسيد الصوديوم كما هو موصوف سابقًا 41. تم تحضين معلقات البيض طوال الليل عند 25 درجة للسماح بالفقس والتعليق من الديدان المرحلة L 1- تم طردها مركزيًا عند 156 ×g لمدة 1 دقيقة. تمت إزالة المادة الطافية ، وتم نقل اليرقات المتبقية إلى لوحات NGM (mNGM) المعدلة الخالية من الببتون الطازجة المغطاة بـبكتريا قولونيةسلالة OP50 (OP50). نمت السلالات على لوحات أجار mNGM عند 25 درجة باستثناءداف -2السلالة التي نمت عند 20 درجة حتى مرحلة L4. بدأت جميع الاختبارات مع الديدان الصغيرة البالغة التي بدأت في وضع البيض عند درجة 25. لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة للديدان الخيطية.سلالات بكتيريةتم استخدام OP5 0 كغذاء معروف دوليًا للديدان الخيطية. تم استخدام أجار التربتون الصويا (نيسوي فارماسيوتيكال ، طوكيو ، اليابان) لزراعة OP50. تم تعليق البكتيريا (100 مجم بالوزن الرطب) في 0.5 مل من محلول M9 ؛ تم بعد ذلك نشر 50- قسامة المعلق البكتيري على mNGM في ألواح بقطر 5. 5- سم ما لم ينص على خلاف ذلك.


anti- senescence cistanche function

تحليل متعدد المتغيرات من تألق ذاتي

تم شفاء 100 شخص بالغ في عمر 3 و 17 يومًا ،غسلها ثلاث مرات ، وتركيزها في 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 ، وتخزينها مجمدةفي–80 درجة حتى الاستخدام. قبل الاستخراج ، 3 ميكرولتر من العازلة تحلل (تتكون منمحلول عازلة 5 0 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1 بالمائة من كبريتات دوديسيل الصوديوم(SDS) ، 1 في المائة Triton X -100 ، 1 ملي فينيل ميثيل سلفونيلفلوريدايوريد (PMSF) ، و
تم توزيع 2 بالمائة 2- ميركابتوإيثانول) و 4 ميكرولتر من 15 بالمائة SDS على كل أنبوب. ثم تعرضت العينات لفايلقد دورات تجميد الذوبان لإطلاق البروتين. تم جمع أطياف فوتولومينيسسينت مع أفلوريداإصرارمقياس الطيف الضوئي (Hitachi FL {0}}) مع برنامج تفسير البيانات (FL Solutions الإصدار 2.0). كانت خصائص الإسفار لتعليق الديدان الخيطية

تم تحليلها باستخدام مصفوفة انبعاث الإثارة (EEM)فلوريداالتحليل الطيفي للاضطراب. التحليل متعدد المتغيرات (الإثارة ذات الطول الموجي الفردي متعددانبعاث الطول الموجي والمسح المتزامنفلوريداuorometry) أسفرت عن مؤامرات EEM تتكون من إثارة مسح ضوئي واحد ، ومتزامنضوئيتم رسم أطياف كل سلسلة.



أطياف الإسفار لديدان الشيخوخة

الديدان (3–13 يومًا) من وسط نمو يحتوي على 2'-ديوكسي -5-فلوريدايوريدين (طوكيو للصناعات الكيماوية ، طوكيو ، اليابان). هذايمنع المركب التطور الجنيني للنسل ، وبالتالي يمنع التلوث من النسل. تم جمع ديدان الشيخوخة الفردية فيأنابيب مغسولةخمسةمرات ، تتركز في 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 ، ويتم تخزينها مجمدة عند–80 درجة حتى الاستخدام. قبل الاستخراج ، 100 ميكرولتر من العازلة تحلل(تتكون من 50 ملي مولار من محلول Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، 1 ملي مولار PMSF ، وكوكتيل مثبط البروتياز 1 ميكرولتر (سيغما ، سانت لويس ، مو ، الولايات المتحدة الأمريكية)) كل أنبوب. ثم تم طحن العينات باستخدام مطحنة صغيرة لاسلكية (فوناكوشي ، طوكيو ، اليابان) للإفراج عنها
بروتين. تم قياس محتويات البروتين كميا باستخدام بيرس™ كاشف فحص البروتين 660 نانومتر (Thermo Fisher Scientific Meridian ،والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وأداة NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific). الضوئيتم تحديد الطيف لكل عينة 30- ميكرولتر (تحتوي على 1.5μg من البروتين الكلي) باستخدام مقضب متعدد الأنماط

معمل نموذج قارئ اللوحة المصغرة SH {0}} مع برنامج معالجة بيانات SF6(Corona Electric، Ibaraki، اليابان). تم إجراء كل قياس ثلاث مرات.


image

قياس التألق الذاتي للديدان الحية الفردية (طريقة الالتفاف)

تم غسل الديدان المختارة عشوائياً باستخدام المخزن المؤقت M9 ، ثمتم وضع الديدان الفردية في 1. 0 µL من M9 عازلة على Saran Wrap clingفايlm (Asahi Kasei ، طوكيو ، اليابان) ممتدًا على 384- طبق أسود جيدًا(STEM ، طوكيو ، اليابان). تم تشكيل تجاويف صغيرة على كل بئر باستخدام أمكرر (واتسون ، كوبي ، اليابان). كان هذا التعديل لاستعادة الديدان بأمان بعد القياس بحيث يمكن تتبع التغيير المعتمد على العمر للتألق الذاتي لكل دودة. التشبثفايتم اختيار lm لأنه يتألق تلقائيًا بدرجة أقل من غيره من المنتجات المتاحة تجاريًافايlms.

ومع ذلك ، تم فحص البيانات الفارغة (المخزن المؤقت M9 فقط) ثلاث مرات من أجلكل بئر ، مع الأخذ في الاعتبارتقلبمن بئر إلى بئر. تم تحديد الحد الأدنى من حدود الكشف والحدود القابلة للقياس على أساس البيانات الفارغة في كل يومμ (يعني الفراغ)زائد3.29σ (الانحراف المعياري) وμزائد√2 × 10σ، على التوالى. تألق ذاتي في جسم كل دودة

تم التقاطه باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعددة الأوضاع. بعدالقياس ، تم الحفاظ على كل دودة على حدة على 4. 0- سمصفيحة قطرها مغطاة بـ OP50 (2 مجم / 10μL M9 عازلة) عند 25 درجة. كلتم إجراء الاختبار على 20 دودة على الأقل وكرر مرتين.


قياس العمر المتوقع

تم الحفاظ على الديدان على لوحات mNGM مغطاة بـ OP50 عند درجة 25 حتى عمر 13 يومًا. بعد التقييم من قبلضوئيالمقايسة ، كانت كل منها 30 دودةانتقل إلى ألواح mNGM جديدة منفصلة مغطاة بـ OP50. تم تحضين الأطباق عند 25 درجة ، وتم تسجيل الديدان الحية والميتة كل 24 ساعة. تم اعتبار الدودة ميتة عندما فشلت في الاستجابة للمسة لطيفة مع منتقي الدودة.

anti- senescence cistanche function


الأعمار بعد التكسير في المختبر

تم إجراء استخراج البروتين كما هو موضح سابقًا. تم استخدام الديدان البالغة من العمر ثلاثة أيام للجليكشن الاصطناعي. عينات البروتين (2 مجم / مل)حضنت مع 500 ملي جلوكوز ، 100 ملي ريبوز ، أو 500 ملي سكر فركتوز(فايتركيز nal). تم تحضين جميع العينات عند 37 درجة لـ 0–4 أسابيع. قسامات (50μL) إلى آبار صفيحة من البوليسترين
(سوميتومو باكليت ، طوكيو ، اليابان) وحضنت لمدة ساعتين عند 37 درجة. بعدإزالة محلول العينة ، تم غسل اللوحة باستخدام PBS-T(محلول ملحي مخزون الفوسفات (PBS) ، 0. 05 بالمائة توين 20) ؛ 250μلتر 3 في المئة من الحليب الخالي من الدسمتمت إضافة كل بئر ، وحضنت اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة. كلجيدًا ثم تم غسله بـ PBS-T ، و 100μL من مضاد للشيخوخة (مضاد لـ CML)
الأجسام المضادة أحادية النسيلة (Clone No. 6D12، Trans Genic، Fukuoka، Japan؛ 75 ng /مل) لكل بئر ؛ ثم تم تحضين الطبق في الغرفةدرجة حرارة 1 ساعة. بعد الغسيل بـ PBS-T ، 100μL من البيروكسيداز المترافقتم الاستغناء عن الجسم المضاد IgG المضاد للفأر (Rockland Immunochemicals، Inc.، Limerick، PA، USA؛ 1: 150، 000) لكل بئر ، و
تم تحضين اللوحة عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الغسيل بـ PBS-T ، 100μL من محلول عامل (محلول تلطيخ رباعي ميثيل بنزيدين (TMB): محلول بيروكسيد= 1: 1 ELISA POD الركيزة TMB kit ، شعبية ،تم توزيع Nacalai Tesque ، كيوتو ، اليابان) على كل بئر ، وتم الحفاظ على الصفيحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى إخمادها بواسطة

إضافة 100μلتر من 1 مول / لتر حامض الكبريتيك لكل بئر. امتصاص كلجيد عند 450 نانومتر (sub: 650 نانومتر) ثم تم قياسه على الفور باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم إجراء ELISA ثلاث مرات لكل حالة من ظروف الاختبار.


النشاف الغربي لديدان الشيخوخة

تم معالجة العينات بـ 4 × بولت™ عازلة عينة LDS (Thermo Fisher Scientiفيفيج) و 10 × بولت™ عامل اختزال العينة (Thermo Fisher Scientiفيفيج) وكل عينة تحتوي على 1.5μجم من البروتين الكلي تم تشغيله على بولت™ 4–12 بالمائة Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher Scientiفيفيج). ثم تم نقل البروتينات من الجل إلى البولي فينيلدينفلوريداغشاء يوريد (ATTO ، طوكيو ، اليابان) وتم حظره بنسبة 5 بالمائة من الحليب منزوع الدسم في برنامج تلفزيوني - 0 .1 بالمائة توين 20 لمدة ساعة واحدة. تم تحضين الغشاء طوال الليل عند 4 درجات بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ AGE (مضاد لـ CML) (استنساخ رقم 6D12 عند 1: 1 000) ، وغسله باستخدام PBS-T ، ثم تم تحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h مع جسم مضاد IgG مترافق مع بيروكسيداز الماعز والفأر (1:25 ، 000). بعد الغسيل باستخدام PBS-T ، تم تحضين الغشاء بكاشف الكشف عن النشاف الغربي الرئيسي ECL (GE Healthcare UK ، Little Chalfont ، إنجلترا) وتم مسحه ضوئيًا باستخدام نظام التصوير ChemiDoc Touch (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare UK). تم بعد ذلك غسل الأغشية باستخدام PBS-T ، واحتضانها مع Western BLoT Stripping Buffer (Takara ، Shiga ، اليابان) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وغسلها مرة أخرى باستخدام PBS-T. تمت إعادة فحص الغشاء بواسطة الأجسام المضادة لمضادات الفيتيلوجينين YP115 و YP170 (كل 1: 10000) عند 4 درجات طوال الليل42، وغسلها باستخدام PBS-T ، واحتضانها بجسم مضاد IgG مضاد للفئران الماعز مترافق مع بيروكسيداز (1: 2000) (Proteintech ، Rosemont ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بالنسبة لعناصر التحكم في التحميل ، تمت إعادة فحص الأغشية باستخدام جسم مضاد مضاد للأكتين (Clone No. C4 ؛ Merck KGaA ، Darmstadt ، ألمانيا) والجسم المضاد للفأر المقترن بالبيروكسيديز (GE Healthcare UK). تم تطبيع كثافة الفيتيلوجينين (YP170 و YP115) ونطاقات CML في كل حارة مقابل تلك الخاصة بنطاقات الأكتين في الممر المعني. تم تحليل كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageQuant TL (GE Healthcare). تم إجراء كل فحص مرتين.


آثار ريبوز وريفامبيسين على الأعمار العمرية في الجسم الحي

تمت تربية الديدان البالغة من العمر ثلاثة أيام على mNGM التي تحتوي على 400 ملي ريبوزأو 400 ملي سوربيتول لتتناسب مع الأسمولية للريبوز العالي ؛ تم تقديم طعام الدودة على شكل حرارة (100 درجة ، 10 دقائق) - قتل OP50 لمنع البكتيريا من تخمير السكر. لمنع التلوث بالنسل ، تم نقل الديدان إلى أطباق طازجة يوميًا لمدة 4 أيام حتى تكتمل تمامًا

انتهىوضع البيض (بعمر 7 أيام). لتقييم تأثير الريبوز ، أجرينا فحوصات البقاء على قيد الحياة وقياس التألق الذاتي. كانت دودةتعتبر ميتة عندما فشلت في الاستجابة للمسة لطيفة مع منتقي الدودة. لم يتم تضمين الديدان التي ماتت نتيجة الالتصاق بجدار اللوحة في التحليل وتم إخضاعها للرقابة. في تجربة منفصلة ،MGM تحتوي على 50 ميكرومتر (أخيرالتركيز) ريفامبيسين (مذاب فيتم استخدام DMSO). تم تكرار كل مقايسة مرتين.


anti- senescence cistanche function

التين .6 تألق تلقائي للفيتيلوجينين (فيت) وعامل الاستطالة (EF). أقياس الطيف الضوئي (ex 325 / em 350–600) من فيتيلوجينين وعامل الاستطالة قبل وبعد الجلوكوز في المختبر عن طريق الريبوز لمدة 14 يومًا: gly-Vit و gly-EF عبارة عن فيتيلوجينين جليكاتيد واستطالة جلايكيتعامل ، على التوالي. ريبوفلفليظهر avin (Rib) كممثلlflمركب يوريسنت. مقتطف من 17- من الديدان القديمة (wild-type N2) معروضة للمقارنة (C. ايليجانس). b في المختبر glycation من vitellogenin وعامل الاستطالة عن طريق الريبوز أسفرت عن زيادات في تألق ذاتي
متأخر , بعد فوات الوقت.c تحليل النشاف الغربي لعمر AGE و vitellogenins في العينات المستخرجة من مجموعات الديدان (النوع البري N2) من مختلف الأعمار. تم اشتقاق البقع من نفس الهلام وتم معالجتها مع كل جسم مضاد بالترتيب.د التحديد الكميمن فيتيلوجينين وأعمار من الغربالنشاف باستخدام قياس الكثافة. تم تكرار التجارب مرتين ، وتم عرض البيانات من تجربة تمثيلية. يُظهر كل من الخط والخط المنقط باللون الأحمر التغييرات الطية للعناصر العمرية ، بينما يشير اللون الأسود إلى كميات الفيتيلوجينين. الدوائر والصلبان المغلقة مخصصة لبيانات النطاقات المطابقة لـ YP170 و YP115 على التوالي


التعرف على البروتينات القديمة الخاصة بالديدان

تحليل مطياف الكتلة لمقتطفات من 3- و 17- نيماتودا عمرها يوم واحدتم إجراؤه على مطياف الكتلة AB SCIEX 58 0 0 LC-MALDI-TOF (نيوارك ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع الإصدار 4.0 من Protein Pilot. كلا المصفوفتين كانتهضمها التربسين وخلط مع محلول مصفوفة (7 ملغ / لتر من - سيانو -4- حمض هيدروكسي سيناميك في 0. 1 في المائة (حجم / حجم) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، 70 في المائة
(ت / ت) أسيتونتريل (ACN)). الزميلكان المعدل المستخدم للفصل 300 مل / دقيقة ،تم تحقيق الفصل والفصل باستخدام تدرج خطي من مرحلتين متحركتين ({0}. 1 بالمائة (ت / ت) TFA في 2 بالمائة ACN (مذيب أ) و 0.1 بالمائة (ت / ت) TFA في 80 في المئة ACN(المذيب ب)) بالنسب التالية: أ / ب= 100/0–50/50 (60 دقيقة) ، أ / ب= 50/50–0 / 100 (20 دقيقة) ، أ / ب= 0 / 100 (10 دقائق). تم استخدام نظام كتلة MALDI-TOF للحصول على كتلة الببتيدبصمة. مطابقة الببتيد وتم إجراء عمليات بحث عن البروتين على قاعدة بيانات Swiss-Prot الإصدار 57. 0.


تمت إذابة البروتينات المستخرجة في 50 ملي كربونات الأمونيوم(AmBic) لإنتاج تركيزات البروتين بين 0. 1 و 1 ميكروغرام / ميكرولتر. من أجل تعظيم قابلية ذوبان البروتينات ، يتم حساب حجم المياهتمت إضافة Rapigest (شركة ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) للمحصولفايتركيزات nal لـ 0. 1–0. 2٪ Rapigest في عينات ما قبل الهضم. العينات
تم تسخينها عند 40 درجة مع الرج لمدة 10 دقائق ؛ ثم كانت المحتوياتبالطرد المركزي ، وتم تعليق الحبيبات الناتجة في AmBic التي تحتوي على 10 ملي مولار من DTT. تم تسخين العينات عند 80 درجة لمدة 15 دقيقة وتم تكويرها في درجة حرارة الغرفة. قسامة من 200 ملي يودواسيتاميد (IAM) في 50 ممتمت إضافة AmBic إلى كل عينة للحصول على أأخيرتركيز IAM لـ

20 ملي مولار (في وجود 2 × ضرس فائض من DTT) ؛ ثم كان الخليطالمحتضنة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بمواصلة تفاعل الألكلة. تم خلط التربسين في 50 ملي أمبيك مع كل محلول عند 1:50 (التربسين: تركيز البروتين). تم هضم العينات لمدة 4 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مع الرج. التاليتمت إضافة الطرد المركزي و TFA و ACN إلى المحصولأخيرتركيزات 0 .5–1. 0 بالمائة TFA و 2 بالمائة ACN من حيث الحجم. تم رج العينات لمدة ساعتين عند 60 درجة. بعد الطرد المركزي عند 22200 ×g لمدة 5 دقائق ، كان طافماص في قارورة جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي. تم هضم البروتينات مع التربسين مسبقًاللتحليل عن طريق كروماتوغرافيا سائلة عكسية باستخدام نظام Ultimate3000RSnanoLC (Thermo Fisher Scientific) مقترنًا بنظام ESI-Q-TOF (Impact II Bruker Daltonics). نازعة هيدروجين الكحول الخميرةتم زيادة البروتين (ADH 1_ YEAST) في العينات كمعيار داخلي ؛تم إجراء spiking لتوفير كمية تقارب 50 fmol منقياسي في العمود.


تألق ذاتي بعد في المختبر glycation

تم شراء Vitellogenin في محلول PBS ({0}. 053 ميكرومتر) من Biosense Laboratories AS (Bergen ، النرويج). تم شراء محلول عامل الاستطالة (1.17 ميكرومتر) من شركة Abnova Corporation (مدينة تايبيه ، تايوان). تم تجميد هذه المحاليل باستخدام 0.1 ملي ريبوز لمدة 23 يومًا عند 37 درجة. ريبوflflتم شراء avin من Sigma (طوكيو ، اليابان) وتم حله في PBS بسعر 0. 1 ملم. تم قياس كل محلول بواسطة القياس الطيفي الفلوري تحت نفس الظروف.

تألق مناعيبواسطة الديدان الصغيرة والكبيرةتم تحضين CB1003 المغذي OP50 المتزامن مع العمر عند 25 درجة. تم تخدير بالغين بعمر ثلاثة أيام و 13- يوم واحد باستخدام Bouin'بروتوكول تثبيت الأنبوب43.


anti- senescence cistanche function

الشكل 7 صور مضان لطفرات 3- بعمر يوم و 13- يوم واحد -1. أ-جالديدان عمرها ثلاثة أيام وd–f 13- ديدان عمرها يوم واحد ، مع صور أولية في العمود 1. لاستبعاد التأثيرات المحتملة للموتفلوريداالتقرحات التي تبدأ من يومين قبل الديدان' زوال ، متحولةكينو -1كان مستعملا. يظهر التألق الذاتي في الصور الموجودة في العمودين 2 و 3. تم تكبير الصور الموجودة في العمود 3 من المناطق المشار إليها (بالمستطيلات) من الصور في العمود 2. الديدان المسنة (13- يوم واحد) تلقائيًايتألقدلالةفيفيأعلى بكثير من الديدان الصغيرة (3- يوم واحد). يشير كل شريط مقياس إلى 50μm. ز التحديد الكميمن اللون الأزرقضوئيباستخدام برنامج ImageJ و ImageQuant TL. يمثل كل شريط متوسط ​​قيمفلوريداشدة التوهج لكل 1 مم2 تسعة ديدان. ** يشير إلى دلالة إحصائيةفيفيلا يمكن الاختلاف بين 3- يوم و 13- يوم من الديدان في أp قيمة <0. 01. تمثل أشرطة الخطأ SE.

كانت العيناتمُثَبَّتفي بوين's مثبتمع الميثانول / - مركابتوإيثانولفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لكسر بشرة ، تم وضع الديدان فيهاالأيزوبروبانول وتخزينها في–80 درجة لمدة 10 دقائق ، ثم تحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى. المثبتتمت إزالة الحل وتم استبداله بمحلول BTB (مخزن بورات 25 ملي مولار ، 0. 5 بالمائة Triton X -100 ، 2 بالمائة
-mercaptoethanol) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ؛ الحضانة في BTB كانيتكرر ما مجموعه ثلاث مرات. تم بعد ذلك نقل الديدان من BTB إلى BT (مخزن مؤقت بورات 25 ملي مولار ، 0. 5 بالمائة Triton X -100) ، تم تحضينها في محلول منظم للجسم المضاد (1 × PBS ، 0. 5 بالمائة Triton X -100 ، 0. 1 ملي مولار EDTA ، {{1 0}. 1 بالمائة من ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.05 بالمائة أزيد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.2) عند درجة حرارة الغرفة

ساعة واحدة ، وتم حظره بمحلول عازل للجسم المضاد يحتوي على 10 بالمائة من مصل الماعز(كوزمو بيو ، طوكيو ، اليابان) بدرجة 4 بين عشية وضحاها. تتكون الأجسام المضادة الأولية من جسم مضاد وحيد النسيلة للفأر (مضاد لـ CML) (نسخة رقم 6D12 ؛ 1: 125) وجسم مضاد مضاد للبنتوسيدين (Clone No. PEN -12 ، Trans Genic ؛ 1: 5 0). يتكون الجسم المضاد الثانوي من جسم مضاد للفأر مترافق من Alexa Fluor 555- (Abcam ، Cambridge ، England ؛ 1: 100). تم إجراء جميع تخفيفات الجسم المضاد باستخدام عازلة للجسم المضاد تحتوي على 0.5 بالمائة من مساحة سطح الجسم. تم تركيب العينات على شرائح زجاجية باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتآكل VECTASHIELD (Vector Laboratories ، Burlingame ، CA ، USA).



المجهر مضان

تم تسجيل الصور الفلورية 3- أو {1}} ديدان بالغة عمرها يوم واحد ، مثبتة على شرائح زجاجية كما هو موضح أعلاه ، باستخدام عمود مقلوبفلوريداإصرارمجهر (BZ-X700 ؛ Keyence) مع عدسة موضوعية 10 × (CFI Plan Fluor DL1 0 × / 0.30). آليفلفلنهوض الديدان الحمراءضوئيمن اليكساتمت مشاهدة فلور 555 باستخدام BZ-X DAPI (طول موجة الإثارة (Ex) ، 360 ± 20 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاث (Em) ، 460 ± 25 نانومتر) و TRITC (مثال ، 545 ±12.5 نانومتر ؛ Em ، 605 ± 35 نانومتر)المرشحات، على التوالى. كانت صور القسمتم التقاطها بواسطة وضع القسم مع نوع شق أحادي البعد بامتدادعرض 32 ، وخطوة Z-stack 0 .7μم لـ 40-μعينات م سميكة. لتحديد اللون الأزرقضوئي، الضوئيشدة تقاس بالصورة
تم تطبيع برنامج TL الكمي (GE Healthcare) لقيم الكثافة لكل 1 مم2 من دودة'منطقة الإسقاط. تم تحديد حجم الجسم باستخدام Adobe Photoshop Elements وبرنامج ImageJ الذي طورته المعاهد الوطنية للصحة. في هذا النظام منطقة الدودة'الإسقاطتم تقديره تلقائيًا واستخدامه كمؤشر لحجم الجسم.



تحليل احصائي

تم حساب الارتباط بين متوسط ​​العمر المتوقع باستخدام سبيرمان'معامل ارتباط الرتبة. تمت مقارنة مستويات التألق الذاتي بعد التحلل في المختبر باستخدام عامل ANOVA و Scheffe.'s F امتحان. التمت مقارنة قيم ELISA بعد التحلل في المختبر باستخدام ANOVA أحادي العامل واختبار Dunnett لمقارنات متعددة. بقاء الديدان الخيطيةتم حسابه بواسطة كابلان–تم اختبار طريقة ماير وفروق البقاء على قيد الحياة من أجل الأهمية باستخدام اختبار تسجيل الترتيب. قيم التألق الذاتي بعد العلاج بالريفامبيسين وشيخوخةداف -2وكينو -1تم مقارنة المسوخ لكل استخدام الطالب's t الاختبار ، القياس المتكرر بعامل ANOVA ، و Mann–ويتنيU امتحان. قيم التألق الذاتي بعد علاجات الريبوز لـ N2 أوكينو -1تم مقارنة متحولة باستخدام الفولاذ اللامعلمي–طريقة دواس. تمت مقارنة الكثافات من الفحص المجهري ذاتي التألق باستخدام الطالب's اختبار t. حيث لوحظت الأهمية ، كانت البيانات classiفيفيإد كـ *p < 0.05 and **p < 0.01. All تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام Microsoft Excel مع استكمالها بـبرنامج الوظيفة الإضافيةزائدStatcel 3 (OMS ، طوكيو ، اليابان) و JSTAT لنظام التشغيل Windows(نانكودو ، طوكيو ، اليابان).


ملخص التقارير

يتوفر مزيد من المعلومات حول تصميم البحث في Nature Researchملخص التقارير المرتبط بهذه المقالة.


توافر البيانات

مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها أثناء الدراسة الحالية متاحة من المقابلةالمؤلف بناء على طلب معقول.



مراجع

1. برينر ، س. علم الوراثةأنواع معينة انيقة. علم الوراثة 77, 71–94 (1974).
2. Riddle، DL، Blumenthal، T.، Meyer، BJ، Priess، JR (محرران).ايليجانس الثاني. (باردمطبعة سبرينج هاربور ، كولد سبرينج هاربور ، 1997).
3. هيرندون ، لوس أنجلوس وآخرون. تؤثر العوامل العشوائية والوراثية على تدهور الأنسجة النوعية في الشيخوخةC. ايليجانس. الطبيعة 419, 808–814 (2002).
4. كلاس ، MR الشيخوخة في الديدان الخيطيةأنواع معينة انيقة: العوامل البيولوجية والبيئية الرئيسية التي تؤثر على مدى الحياة.ميكانيكي. الشيخوخة ديف. 6, 413–429 (1977).
5. Son ، HG ، Altintas ، O. ، Kim ، EJE ، Kwon ، S. & Lee ، SV التغيرات المعتمدة على العمر والمؤشرات الحيوية للشيخوخة فيأنواع معينة انيقة. خلية الشيخوخة 18, e12853 (2019).
6. Yoshino ، J. ، Mills ، KF ، Yoon ، MJ & Imai ، S. Nicotinamide mononucleotide ، وهو NAD رئيسي (زائد) متوسط ​​، يعالج الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري الناجم عن النظام الغذائي والعمر في الفئران.ميتاب الخلية. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel، MS، Lapierre، LR & Mack، HID موضوعات ناشئة فيC. ايليجانسأبحاث الشيخوخة: تنظيم النسخ ، والاستجابة للتوتر ، وعلم التخلق.ميكانيكي. شيخ التنمية. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda، T.، Yasui، C.، Hoshino، K.، Arikawa، K. & Nishikawa، Y. Inفلفلانتشار بكتيريا حمض اللاكتيك على طول عمرأنواع معينة انيقةوالدفاع المضيف ضد السالمونيلامعويالأمعاء المصلي.تطبيق بيئة. ميكروبيول. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura، T.، Ikeda، T.، Yasui، C.، Saeki، S. & Nishikawa، Y.أنواع معينة انيقة. علم الأحياء الحيوية 14, 73–87 (2013).
10. Clark ، LC & Hodgkin ، J. Commensals ، البروبيوتيك ومسببات الأمراض فيكاي كاينورهابديتيس ايليجانسنموذج.ميكروبيول الخلية. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro، F. & Gems، D. تحتاج الديدان أيضًا إلى الميكروبات: الميكروبات ، والصحة ، والشيخوخة فيأنواع معينة انيقة. EMBO مول. ميد. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim، Y. & Mylonakis، E.أنواع معينة انيقةتكييف المناعة مع بكتيريا البروبيوتيكالملبنة الحمضةسلالة NCFM يعزز الاستجابات المناعية إيجابية الجرام.تصيب. مناعة. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein، B.، Stamatas، G.، Kollias، N. & Driscoll، M. In vivo Spectrofluorimetryيكشف عن المؤشرات الحيوية الذاتية التي تشير إلى الصحة والقيود الغذائية فيأنواع معينة انيقة. شيخوخة الخلية 4, 127–137 (2005).
14. كوبورن ، سي وآخرون. أنثرانيلاتضوئييمثل موجة نخرية تنتشر بالكالسيوم والتي تعزز الموت العضوي فيC. ايليجانس. بلوس بيول. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus، Z.، Mazer، TC & Slack، FJ Autoفلفلإرهاق كمقياس للشيخوخة فيC. ايليجانس: انظر إلى اللون الأحمر ، وليس الأزرق أو الأخضر.الشيخوخة (ألباني نيويورك) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova، K. & Sebekova، KB بروتينات غليكاتيد في التغذية: صديق أم عدو؟إكسب. جيرونتول. 117, 76–90 (2019).
17. جياكو ، إف أند براونلي ، إم الإجهاد التأكسدي ومضاعفات مرض السكري.الدقة الإعارة. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth، V. et al. المنتجات النهائية المتقدمة للجليكيشن ومستقبلاتها RAGE في مرض الزهايمر'المرض.نيوروبيول. الشيخوخة 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo ، Q. ، Yang ، W. ، Chen ، JY & Wang ، Y. متلازمة الأيض تلتقي مع التهاب العظم العظمي.نات. القس الروماتول. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou، P. & Bohm، M. المنتجات النهائية المتقدمة للجليكيشن: هل هي العوامل الرئيسية في شيخوخة الجلد؟ديرماتو صم كرينول 4, 259–270 (2012).
21. ليو ، ج. وآخرون. مستقبلات للمنتجات النهائية المتقدمة للجليكيشن يعزز الخدجشيخوخة الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة عن طريق تنشيط الإندوبلازمشبكية تعتمد على الإجهاد ، إشارات p21.إشارة الخلية 26, 110–121 (2014).

22. Mendler، M.، Schlotterer، A.، Morcos، M. & Nawroth، PP فهم اعتلال الأعصاب السكري وطول العمر: ما الذي يمكن أن نتعلمه من الديدان الخيطيةأنواع معينة انيقة? إكسب. كلين. إندوكرينول. داء السكري 120, 182–183 (2012).


يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























قد يعجبك ايضا