التأثيرات المفيدة لجزء جليكوسيد الفينيلثانويد الكلي المعزول من نبات Cistanche Deserticola على البنية المجهرية للعظام في الجرذان المستأصلة المبيض Ⅰ

تم تصميم الدراسة الحالية لتقدير النشاط المضاد لهشاشة العظام لجزء جليكوسيد الفينيليثانويد الكلي المعزول منج. ديزيرتيكولا(CDP) على الفئران الناجمة عن استئصال المبيض (OVX) وكذلك الآليات ذات الصلة. بعد 3 أشهر من تناوله عن طريق الفم،انخفاض كثافة المعادن في العظامتم انتشال المصل Ca و P في فئران OVX وتدهور التربيقالبنية الدقيقة للعظامتم تحسينه جزئيًا من خلال تدخل CDP (60 و120 و240 ملغم/كغم)، وتم تنظيم أنشطة علامات ارتشاف العظم، وتم تنظيم النشاط الحيوي لمؤشر تكوين العظام؛ وفي الوقت نفسه، انخفض محتوى MDA، وتم زيادة GSH عن طريق علاج CDP. من الناحية التركيبية، تم التعرف على 8 مركبات جليكوسيد الفينيليثانويدفايإد في CDP، مع إجمالي محتويات الكمفايبنسبة 50.3% باستخدام طريقة HPLC. ميكانيكيًا، خفض CDP مستويات TRAF6 وRANKL وRANK، وبالتالي قمع التنشيط الناجم عن RANKL/RANK/TRAF6- لـ NF-κمسارات إشارات B وPI3K/AKT وتمنع في النهاية أنشطة البروتينات العظمية العظمية الرئيسية لـ NFAT2 وc-Fos. جميع البيانات المذكورة أعلاه تشير إلى أن CDP أظهر فائدةفايسيال هوما يليهاآثار على البنية المجهرية للعظام في الفئران المبيضة، وهذه eوما يليهاقد تكون الأمور ذات صلة بـ NF-κمسارات إشارات B وPI3K/AKT التي تم تشغيلها عن طريق ربط RANKL وRANK وTRAF6.

مادة عضوية طبيعية لنمو العظام

1 المقدمة

أصبحت هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، حيث تعاني منها واحدة من كل ثلاث نساء أكبر من 50 عامًا، من المخاطر الصحية الرئيسية التي تصيب أكثر من 200 مليون امرأة في جميع أنحاء العالم [1]. عند انقطاع الطمث، عادة ما يؤدي الانخفاض الحاد في مستوى هرمون الاستروجين إلى تجاوز ارتشاف العظم الناجم عن تعزيز تكون العظم. ثم التوازن بين تكوين العظام الناجم عن بانيات العظم والناقضة للعظمارتشاف العظاميتعطل، ويؤدي ارتشاف العظم المتسارع في النهاية إلى هشاشة العظام وحتى كسر الورك أو العمود الفقري [2]. كان يُعتقد أن تمايز ناقضات العظم قد تم تحفيزه عندما يرتبط منشط مستقبل العامل النووي kappa B (RANK) بـ RANKL، وهو رابطة RANK. ومع ذلك، لا يمكن تنشيط الجمع بين RANK وRANKL ما لم يتم ضم العامل المرتبط بمستقبل عامل نخر الورم البروتيني 6 (TRAF6) إليه [3]، يليه تحفيز مسارات الإشارات النهائية بما في ذلك PI3K/AKT وNF-κB. . أخيرًا، تم تنظيم تعبيرات العامل النووي للخلايا التائية المنشَّطة c2 (NFAT2) وc-Fos [4] لتعديل تمايز العظم العظمي وكذلك ارتشاف العظم. وبالتالي، يُعتقد أن العوامل والمنظمين التي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر بتنشيط وتمايز الخلايا الآكلة للعظم هي أهداف حاسمة لمنع فقدان العظام.

هناك بالفعل بعض أدوية العلاج بالهرمونات البديلة السريرية والصناعية مثل استراديول فاليرات والتي تكون فعالة في علاج هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث. ولسوء الحظ، فإن بعض هذه الأدوية تزيد من خطر الإصابة بسرطانات خطيرة بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان بطانة الرحم [5]، مما حد من تطبيقاتها السريرية. ولذلك، فمن الضروري اختيار بدائل أخرى ذات فعالية وأقل آثار جانبية. أثبتت الأدوية الصينية التقليدية (TCM)، بالإضافة إلى المركبات والأجزاء النشطة بيولوجيًا المعزولة [6-9]، فعاليتها في علاج أمراض مختلفة بما في ذلك هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث. من بين هذه المكونات والكسور النشطة بيولوجيًا، يُعتقد أن مركبات جليكوسيد الفينيليثانويد (PhG) ذات الفعالية المحتملة هي عوامل واعدة لعلاج هشاشة العظام [10-12]. تتكون تركيبات PhGs من حمض السيناميك aglycone، وهي مجموعة هيدروكسيل فينيل إيثيل التي يتم دمجها مع -glucopyranose، أو apiose، أو galactose، أو rhamnose، أو xylose عبر رابطة جليكوسيدية. وهي موجودة على نطاق واسع في الأنواع الطبية من جنس Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma هو أحد الطب الصيني التقليدي المسجل في دستور الأدوية الصيني، وإلى جانب كونه أحد الطب الصيني التقليدي المهم [14]، فإن C deserticola هو أيضًا عشب منشط مضاد للشيخوخة مع آثار جانبية قليلة تم تطويره إلى مشروبات طبية وسوائل غذائية معتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الحكومية. استنادًا إلى سجل دستور الأدوية الصيني، تم استخدام C. deserticola تقليديًا من قبل السكان الأصليين لمعالجة مشاكل نقص جوهر الكلى مثل ضعف العضلات وضعف أسفل الظهر، ومركبات جليكوسيد الفينيليثانويد بما في ذلك الإكيناكوسيد والأسيتونيد هي المكونات النشطة بيولوجيًا الرئيسية في هذه العشبة. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي حول "عظام الكلى،" فإن نظام العظام يحكمه جوهر الكلى [15]، ويمكن استعادة المشاكل المتعلقة بالعظام مثل هشاشة العظام عن طريق الأعشاب أو المركبات التي تمتلك نشاط تغذية جوهر الكلى. لذلك، افترضنا أن الجزء الكلي من جليكوسيد الفينيليثانويد المعزول من C. deserticola، جزئيًا على الأقل، كان مفيدًا في علاج هشاشة العظام. لذلك تم تصميم التجربة الحالية للتحقق من صحة فرضيتنا باستخدام نموذج الفئران المبيض (OVX)؛ إلى جانب علامات ارتشاف العظم وتكوينه التي يجب تقديرها، تم أيضًا استخدام مؤشر مضادات الأكسدة وكذلك RANKL/RANK/TRAF6- مسارات إشارات PI3K/AKT وNF-κB المستحثة أيضًا للتحقيق في الآليات الرئيسية للنشاط الحيوي المضاد لهشاشة العظام. .

2. المواد والطريقة

2.1. المواد النباتية والتحضير.

تم جمع إجمالي 30 كجم من سيقان Cistanche deserticola YC Ma من مقاطعة يونغنينغ في 2 سبتمبر015 بالإحداثيات 106.026597 و38.262816، مقاطعة نينغشيا، الصين. تم التعرف على العشبة من قبل الدكتور لين دونغ (قسم العقاقير، جامعة نينغشيا الطبية)، وتم حفظ العينة المقابلة (#20150901) في القسم للتحليل الدوائي. أولاً، تم استخلاص 30.0 كجم من مسحوق C. deserticola باستخدام طريقة الارتجاع مع 70% إيثانول كمذيب؛ تم ضبط نسبة المادة إلى المذيب على أنها 1: 10، وكان وقت الارتداد 2 ساعة لمدة 3 مرات. بعد ذلك، تم تجميع جميع المرشحات وتكثيفها تحت ضغط مخفض عند 60 درجة مئوية. ثانيًا، تم استخدام أعمدة راتنجية كبيرة المسام AB-8 للفصل الأولي، ونسب مختلفة من الإيثانول في الماء (0%، 20%، تم استخدام 30%، 40%، 50%، 60%، كل 60 لتر) للتصفية. ثالثًا، تم دمج الشوائب 40% و50% وتنقيتها بشكل أكبر باستخدام أعمدة راتينج كبيرة المسام AB-8 متكررة مع الشوائب 0%، 20%، 30%، 40%، و50% إيثانول في الماء، و كان كل شاطف 12 لترًا. أخيرًا، تم جمع جزء 40٪ وتكثيفه تحت ضغط مخفض للحصول على 150 جم من رواسب جليكوسيد الفينيل إيثانويد الصفراء الباهتة من C. deserticola (CDP، كان العائد 0.5٪). بالنسبة للتجارب المجراة، تم استخدام مذيب CMC-Na بنسبة 0.5% لحل CDP؛ تم تحديد الإعطاء عن طريق الفم للحيوانات على أنه 1 مل / 100 جرام من وزن الجسم؛ لتحليل لطخة غربية في المختبر، تم إذابة CDP مع DMSO ثم تم تخفيفه باستخدام DMEM للحصول على التركيزات النهائية البالغة 0.1 مجم/مل، و0.01 مجم/مل، و0.001 مجم/مل.

2.2. المواد الكيميائية والمذيبات.

استراديول فاليرات (EV) كان من شركة Delpharm Lille SAS، فرنسا؛ الفوسفاتيز القلوي (ALP)،بروتين جلا العظام(BGP)، والفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP)، ومجموعات ELISA للوصلة التشعبية للديوكسيبيريدينولين (DPD) من شركة Xinyu Biological Engineering Co. Ltd.، شنغهاي، الصين، 201605؛ malondialdehyde (MDA، 20181221)، ديسموتاز الأكسيد الفائق (SOD، 20121218)، والجلوتاثيون (GSH، 20181221) مجموعات كاشف من معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة البيولوجية، نانجينغ، الصين؛ باراثرمون lntact (l-PTH، NEWASHE7UZ)، الكالسيتونين (2L9ISN7AIU)، ومستقبلات ألفا المرتبطة بالإستروجين (ERR، Y3AY8QEWB3) مجموعات ELISA من شركة Elabscience Biotechnology Co. Ltd.، ووهان، الصين؛ طقم كاشف Cathepsin K ELISA من BioVision، أمريكا، 1l300141؛ الأجسام المضادة الأولية لـ RANKL (GR 3193842-5)، RANK (AA02113656)، TRAF6 (2)، c-Fos (AG12059411)، NFAT2 (AO11015648)، NF-κBp65 (AH04138226)، PI3 كيناز p85 ألفا (AC09021266)، AKT 1 (AF05173234)، -actin (17AV0411)، والأجسام المضادة الثانوية من IgG الماعز المضاد للأرانب المترافق مع بيروكسيداز الفجل من ZSGB-BIO، الصين، 136080؛ مجموعة مقايسة BCA pro tein الكاملة والمجموعة التجارية للكشف عن تكوين oste oclast ومصل الأبقار الجنيني ووسيط Eagle's المعدل (DMEM) من Dulbecco من HyClone، Logan، UT، USA؛ غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) من Millipore Life Sciences، Billerica، MA، USA؛ البنسلين والستربتوميسين من جيبكو، روكفيل، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية. جميع العوامل الكيميائية الأخرى المستخدمة كانت من الدرجة AR.

2.3. HPLC الكمي من CDP.

تم استخدام أداة Agilent 1220 HPLC لتحديد وقياس تركيبة CDP. كانت الظروف اللونية كما يلي: عمود C18 (TSK-GEL، 4 6 I d × 250 مم، 5 ميكرومتر)؛ يحتوي الشطف المتدرج على المذيبات A (الأسيتونيتريل) وB (ماء يحتوي على 0.5% حمض أسيتيك) (0-10 دقيقة: 17-20% A؛ 10-30 دقيقة: 20-25% A؛ و 30-40 دقيقة: 25-30% أ); وكان الطول الموجي للكشف 333 نانومتر؛ درجة الحرارة المحيطة وكان معدل التدفق 1.0 مل / دقيقة؛ وكان حجم حقن العينة 5 ميكرولتر. تم تحديد ثمانية مركبات PhG، وهي cistanoside F، وechinacoside، و6′-acetylacteoside، وcistanoside C، وcistanoside A، وacteoside، و2′-acetylacteoside، وisoacteoside؛ باستخدام المواد المرجعية المقابلة وطريقة قياسية خارجية، تم قياس محتويات PhGs 8 المذكورة أعلاه عن طريق تحليل HPLC (الشكل 1).

الشكل 1: بصمة HPLC لـ CDP. تم العثور على ثمانية مركبات جليكوسيد فينيليثانويد في هذا الجزء، وتم تحديد كمية المحتويات الإجمالية على أنها 50.7%. وكانت المركبات ومحتوياتها كما يلي: (1) أكتيوسيد F (3.6%)، (2) إيشيناكوسيد (8.8%)، (3) سيستانوسيد A (5.0%)، (4) أكتيوسيد (13.3%)، (5) إيزواكتيوسايد (3.3%)، (6) أكتيوسايد C (3.6%)، (7) 2′-أسيتيللاكتيوسيد (9.9%)، و(8) 6′-أسيتيللاكتيوسيد (3.2%).

2.4. بروتوكول التجارب الحيوانية.

تم اختيار ما مجموعه 6 0 إناث فئران سبراغ داولي البالغة من العمر 3 أشهر من مركز الاختبارات على الحيوانات بجامعة نينغشيا الطبية، بمتوسط ​​وزن جسم أولي يبلغ حوالي 234 ± 25 جم. تم إيواء الفئران في بيئة قياسية محددة خالية من مسببات الأمراض تهدف إلى التأقلم لمدة أسبوع واحد. بعد ذلك، تم تخدير جميع الفئران (هيدرات الكلورال، 100 ملغم/كغم، IP) فقط أو تم استئصال المبيض الوهمي (SHAM)، أو تمت إزالة مبيضين ثم تم تقسيمهما عشوائيًا إلى 5 مجموعات فرعية: عولجت عن طريق الفم باستخدام مركبة (0.5٪ CMC- تم تعيين Na) كمجموعة نموذجية (OVX)، واستراديول فاليرات (1 مجم / كجم / يوم) كمجموعة إيجابية (EV)، و60، 120، و240 مجم / كجم / يوم من CDP على مستوى منخفض (CDPL)، مجموعات الجرعة المعتدلة (CDPM)، والعالية (CDPH)، على التوالي. تم إعطاء جميع الفئران عن طريق الفم يوميًا واستمرت لمدة 3 أشهر مع تعديل الجرعة كل أسبوعين والتي تعتمد على تغير أوزان الجسم بالكامل. في اليوم الأخير من التجربة على الحيوانات، تم الحصول على بول لمدة 24-ساعة باستخدام الأقفاص الأيضية؛ تم جمع المصل من الشريان الفخذي للفئران المخدرة؛ تم تشريح عظم الفخذ الأيمن والساق وجميع الأعضاء وتخزينها عند درجة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات التي أجريناها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة نينغشيا الطبية.

2.5. تحديد كثافة المعادن في العظام وتحليل الأشعة المقطعية الدقيقة.

أولاً، تم استخدام جهاز قياس امتصاص الأشعة السينية مزدوج الطاقة (لونار، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقدير إجمالي كثافة المعادن في العظام لعظم الفخذ الأيمن لكل فأر؛ ثانيًا، تم استخدام نفس عظم الفخذ لتقدير الصورة ثلاثية الأبعاد للبنية الدقيقة للعظام التربيقية من خلال استخدام جهاز ماسح ضوئي مقطعي دقيق (GE، أمريكا). تم ضبط الدقة المتناحية على 14 ميكرومتر للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد مثالية؛ تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عن طريق تحديد نفس الإحداثيات في لوحة نمو عظم الفخذ لكل عينة؛ والمعلمات الشكلية للعظام بما في ذلك الفصل التربيقي (Tb.Sp)، والرقم التربيقي (Tb.N)، والسمك التربيقي (Tb. Th)، والمحتوى المعدني للعظام (BMC)، والكثافة المعدنية للأنسجة (TMD)، والمحتوى المعدني للأنسجة (TMC). ) تم الحصول عليها من خلال تحليل عائد الاستثمار.

2.6. الفحص البيوكيميائي للمصل والبول.

تم تحديد أنشطة مصل الكاثيبين K، وTRAP، وSOD، وGSH، بالإضافة إلى محتويات مصل PTH، والكالسيتونين، وERR، وMDA، وBGP، والبول DPD، من خلال استخدام مجموعات الكواشف المقابلة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، و تم تقدير مستوى الفوسفاتيز القلوي (ALP) ومحتويات الكالسيوم في المصل والبول (Ca) والفوسفور (P) باستخدام آلة أوتوماتيكية (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp.، Oberlin، OH، USA).

2.7. تحليل لطخة غربية.

تم تحفيز الخلايا العظمية باستخدام خلايا RAW 264.7 المضافة مع عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF) وRANKL. باختصار، تم استزراع 1 × 107 خلايا RAW 264.7 في صفيحة بئر 6- في وجود 30 نانوغرام/مل من MCSF و25 نانوغرام/مل من RANKL. بعد 6 أيام من الاستقراء، تم التعرف على الخلايا الناقضة للعظم الناضجة باستخدام طريقة TRAP الملطخة مع المجموعة المقابلة، ثم تم علاجها بـ CDP (0.1، 0.01، و0.001 مجم/مل على التوالي) لمدة 24 ساعة؛ بعد ذلك، تم تحلل الخلايا باستخدام محلول تحلل يحتوي على 0.5 مليمول من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل ومثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز. تم بعد ذلك فصل المحللة باستخدام 10٪ SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF، والذي تم فحصه باستخدام AKT1 وNF-κB-p65 وRANKL وPI3K p85 وRANK وNFAT2 وTRAF6 وc-Fos و-actin ( 1 : 400) بعد الحجب بحليب خالي الدسم 5% لمدة ساعتين. تم تجريد الأغشية نفسها وفحصها مرة أخرى باستخدام الأجسام المضادة التسعة المقابلة المذكورة أعلاه، على التوالي، ثم تم اكتشافها بواسطة برنامج Image Lab في النهاية. وتكررت التجارب ثلاث مرات.

2.8. تحليل احصائي.

تم تحليل جميع البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب في الجسم الحي وفي المختبر، الموصوفة بأنها متوسط ​​± SD، باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Dunnett (برنامج SPSS 22.0، SPSS، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ كانت p <0 05 ذات دلالة إحصائية.

الخدمة الداعمة لـ Wecistanche

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop