أغشية النانو سليلوز البكتيرية النشطة بيولوجيًا المخصبة بعلامة الأوكالبتوس Globulus. مستخلص الأوراق المائي لتطبيقات العناية بالبشرة المضادة للشيخوخة

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:ظهرت الأغشية البكتيرية النانوسليلوز (BNC) ، ذات الخصائص الفيزيائية والميكانيكية الرائعة ، كحامل بوليمر حيوي متعدد الاستخدامات للمركبات النشطة بيولوجيًا لتطبيقات العناية بالبشرة. في هذه الدراسة ، تم تحميل أغشية BNC بالجليسرول (كمادة ملدنة وعامل مرطب) وجرعات مختلفة (1-3 ميكروغرام سم -2) من مستخلص مائي تم الحصول عليه من التقطير المائي لأوكالبتوس غلوبولوس لابيل. أوراق (HDE) ، لاستخدامها كأقنعة للوجه. جميع الأغشية مقاومة وقابلة للطرق بدرجة كبيرة في الحالات الجافة والرطبة ، مع خصائص ميكانيكية مماثلة أو حتى أفضل من تلك الخاصة بقناع BNC التجاري. علاوة على ذلك ، وجد أن HDE يمنح نشاطًا مضادًا للأكسدة يعتمد على الجرعة إلى BNC النقي. بالإضافة إلى ذلك ، عند التخزين لمدة 3 أشهر عند درجة 22-25 ورطوبة نسبية 52 في المائة (RH) أو عند 40 درجة مئوية و 75 في المائة رطوبة نسبية ، تم التأكد من أن نشاط مضادات الأكسدة والجانب العياني للغشاء يبلغ 2 ميكروغرام سم {{10 }} من HDE تمت صيانتها. تبين أيضًا أن الأغشية غير سامة للخلايا تجاه خلايا HaCaT و NIH / 3T3 ، وتسبب الغشاء الذي يحتوي على 2 ميكروغرام سم -2 من HDE في انخفاض كبير في نشاط الجالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة في خلايا NIH / 3T3. تشير هذه النتائج إلى ملاءمة وإمكانات الأغشية التي تم الحصول عليها كأقنعة وجه نشطة بيولوجيًا لتطبيقات مكافحة الشيخوخة.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

الكلمات الدالة:النانو سليلوز الجرثومي. الأوكالبتوس جلوبولوس Labill. اوراق اشجار؛ مستخلص مائي النشاط المضاد للأكسدة؛ أقنعة الوجه ورقة. مكافحة الشيخوخة. تطبيقات العناية بالبشرة

1 المقدمة

يتقدم سكان العالم في السن بشكل كبير بسبب الانخفاض في معدل المواليد وتحسن البقاء على قيد الحياة ، وما يترتب على ذلك من زيادة في متوسط ​​العمر المتوقع ، المرتبط بالتطورات الطبية والتكنولوجية التي تحققت خلال العقود الماضية [1،2]. من المتوقع أن يصل عدد سكان العالم الذين تبلغ أعمارهم 60 عامًا أو أكثر إلى حوالي 2.1 مليار بحلول عام 2050 ، وهو ما يمثل زيادة تقارب الضعف عن عام 2017 ، ومن المتوقع أن يتضاعف عدد الأشخاص الذين تبلغ أعمارهم 80 عامًا أو أكثر بمقدار ثلاثة أضعاف تقريبًا في نفس الفترة 3]. ومع ذلك ، على الرغم من تحسن طول العمر ، فإن شيخوخة الجلد هي عملية حتمية ، وبالتالي ، من المتوقع أن يزداد الطلب على منتجات العناية بالبشرة المضادة للشيخوخة.

شيخوخة الجلد هي عملية بيولوجية معقدة تجمع بين آليات داخلية وخارجية [4]. يتم تحديد الشيخوخة الذاتية بشكل أساسي من خلال العوامل الوراثية والتغيرات الهرمونية التي تحدث مع عملية الشيخوخة الطبيعية [4]. من ناحية أخرى ، فإن الشيخوخة الخارجية تتوسطها عوامل خارجية (على سبيل المثال ، التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية (التشيخ الضوئي) ، والجاذبية ، والتدخين ، والتلوث ، وسوء التغذية) [5]. في كلتا عمليتي الشيخوخة ، ولكن بشكل خاص العملية الخارجية ، من المقبول جيدًا أن الإجهاد التأكسدي المتزايد ، الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والناجم عن عدم التوازن بين إنتاج ROS والدفاع المضاد للأكسدة ، يلعب دورًا حاسمًا [{{3} }]. مع تقدم العمر ، هناك أيضًا انخفاض في قدرة خلايا الجلد البشرية على إصلاح تلف الحمض النووي ، مما يساهم في شيخوخة الجلد أيضًا [8].مستخلص سيستانش المضاد للإشعاعوبالتالي ، تتسبب عملية الشيخوخة في العديد من التغيرات الكيميائية الحيوية في تكوين الجلد ، مع تأثيرات على هيكلها ووظيفتها [9] ، مما يؤدي إلى ظهور علامات مرئية مثل التجاعيد ، والجفاف ، وفقدان المرونة ، والترقق ، والملمس الخشن ، أو عدم انتظام التصبغ [7،10] . ومن ثم ، مع السعي المتزايد نحو الصحة والرفاهية ، والذي يتضمن أيضًا صحة الجلد وجمالياته ، فقد تم تطوير مستحضرات التجميل التي تحتوي على مركبات نشطة بيولوجيًا لمنع أو تخفيف شيخوخة الجلد وعلاماتها الخارجية ، وبالتالي تحسين مظهر الجلد ، في طليعة البحث والابتكار في صناعة مستحضرات التجميل على مدى العقود الماضية. في هذا السياق ، ومن بين مستحضرات التجميل للعلاج الموضعي ، تعتبر أقنعة التجميل ، وخاصة أقنعة الوجه الورقية ، سوقًا متنامية ، مع معدل نمو سنوي مركب متوقع يبلغ 8.1 بالمائة من 2019 إلى 2027 [11]. هذا النوع من الأقنعة جذاب بشكل خاص للمستهلكين المعاصرين ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة استخدامه وسرعة استخدامه وفعاليته] 12. يمكن استخدام العديد من المواد كمصفوفة دعم لهذه الأقنعة الورقية ، وهي البوليمرات الاصطناعية (على سبيل المثال ، بولي (كحول الفينيل) والسيليكون ، والأقمشة (على سبيل المثال ، غير المنسوجة والقطنية) ، والهيدروجيل (على سبيل المثال ، الهلاميات المائية القائمة على الكولاجين والحرير ) أو ألياف السليولوز النانوية ، مثل النانوسليلوز البكتيري (BNC) [13]. مع زيادة الطلب على منتجات العناية بالبشرة المشتقة بشكل طبيعي ، اكتسب BNC أهمية وأصبح الآن مادة بيولوجية متفوقة ، تم استكشافها بالفعل وتسويقها من قبل بعض أكبر شركات مستحضرات التجميل (مثل لانكوم وإليزابيث أردن و DHC) [14] التي تتبع اتجاه طلب المستهلكين الموجه نحو البيئة.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90٪) ، محبة للماء عالية ، وبنية نانوية المسام [17]. عندما يتم إنتاجه في الثقافة الساكنة ، يتم الحصول على BNC كغشاء يشبه الهيدروجيل الجيلاتيني بسمك متغير وشكل وعاء الاستزراع (بمعنى قابلية التشكيل في الموقع) ، وهي ميزة عندما يكون الشكل المحدد مسبقًا مطلوبًا [18]. تشتمل مجموعة الخصائص الفريدة لـ BNC أيضًا على درجة عالية من التبلور والنقاء ، وقوة ميكانيكية ملحوظة ، واستقرار حراري [19]. إلى جانب كونها قابلة للتحلل البيولوجي ، أثبتت BNC أيضًا تحملاً جيدًا للبشرة وتوافقًا حيويًا في العديد من الدراسات التي أجريت على الجسم الحي [20-22] ، مما يجعلها مادة مثالية لمنتجات العناية بالبشرة. في هذا الصدد ، وبسبب بنيته النانوية المسامية ، فإن قابلية تطبيق BNC وفعاليته كحامل لتوصيل المركبات النشطة للجلد كان محور العديد من الأعمال ، على سبيل المثال ، لتوصيل الكافيين [23] ، الحرير-سيريسين [24] أو الريتينول [25] أو الروتين [26]. لمزيد من القراءة ، توفر مراجعة حديثة نظرة عامة شاملة على تعدد استخدامات BNC وقابليتها للتطبيق في مستحضرات التجميل الخضراء ، بما في ذلك كحامل للمواد الفعالة للبشرة [27].

يمكن cistanche مكافحة الشيخوخة

تستخدم المركبات الطبيعية النشطة بيولوجيًا على نطاق واسع في مستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة للعناية بالبشرة [28].cistanche هيرباتعتبر المستخلصات النباتية ، على وجه الخصوص ، مصدرًا غنيًا للمركبات النشطة بيولوجيًا (على سبيل المثال ، البوليفينول ، التربينويدات ، الفيتامينات ، من بين أمور أخرى) مع تأثيرات متعددة محتملة على الجلد ، مع الأنشطة المضادة للأكسدة والمضادة للميكروبات لتأثيرات تثبيط التيروزيناز كونها الفوائد الرئيسية المبلغ عنها حتى الآن [ 29]. لذلك ، نظرًا للاتجاه الحالي للمنتجات الطبيعية في مستحضرات التجميل ، تظهر المستخلصات النباتية من بين أكثر المكونات الواعدة لتطوير منتجات العناية بالبشرة. علاوة على ذلك ، تم أيضًا فحص دمج المستخلصات الطبيعية في أغشية BNC لأغراض تجميلية. ومن الأمثلة على ذلك الأعمال التي تشير إلى دمج مستخلص البروبوليس ، المعروف باحتوائه على أنشطة مطهرة وقابضة [13،30] ، أو مقتطفات من الشوفان وإكليل الجبل مع تأثيرات ترطيب [13] ، أو التركيبة التجميلية المكونة من فاكهة Adansonia digitata ، زهرة الكركديه Sabdariffa ، بذور الكوفي أرابيكا ، وفاكهة كيجيليا أفريكانا ، ومستخلصات نبات الأكاسيا والزعفران ، مع خصائص مضادة للشيخوخة ، وهي تنعيم التجاعيد [21]. في الآونة الأخيرة ، قدمت مراجعة نظرة ثاقبة على أهمية ربط BNC مع الفينولات النباتية لمنع تلف الجلد الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية [31].

الأوكالبتوس جلوبولوس Labill. تعتبر الشجرة دائمة الخضرة مصدرًا معروفًا للمركبات النشطة بيولوجيًا ، أي المركبات الفينولية مثل الأحماض الفينولية أو الفلافونويد أو التانينات القابلة للتحلل بالماء [32-36]. تم إثبات الأنشطة المضادة للأكسدة والمضادة للميكروبات لمستخلصات بكتريا E.globulus التي تحتوي على هذه المركبات في العديد من الدراسات [34 ، 35]. فيما يتعلق بالتطبيق في مجال مستحضرات التجميل ، أظهرت دراسة حديثة التأثير الوقائي ، في كل من المختبر (في الخلايا الليفية الجلدية البشرية) وفي الجسم الحي (الفئران الخالية من الشعر) ، لمستخلص إيثانولي بنسبة 50 في المائة من الكتلة الحيوية التجارية المجففة بكتلة E. ، مع نتائج واعدة فيما يتعلق بالوقاية من تكون التجاعيد وجفاف الجلد [37]. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يتم استكشاف مستخلصات بكتريا E.globulus ، بالاقتران مع الركيزة البوليمرية ، لإنتاج أقنعة جلدية نشطة بيولوجيًا للعناية بالبشرة المضادة للشيخوخة.

من هذا المنظور ، كان الغرض من العمل الحالي هو إنتاج أغشية BNC mem-meme محملة بمستخلص مائي مشتق من التقطير المائي (مستخلص التقطير المائي ، HDE) لأوراق E.globulus. التقطير المائي هو طريقة شائعة الاستخدام في الصناعة لاستخراج الزيوت الأساسية [38]. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضًا دمج الجلسرين (G) ، وهو مكون مرطب يستخدم على نطاق واسع في مستحضرات التجميل ، في أغشية BNC (7.5 مجم سم -2) ​​لزيادة مرونتها ، وفي نفس الوقت ، توافقها مع الجلد. وبالتالي ، كان الهدف من هذا العمل هو الحصول على مادة قائمة على أساس حيوي بالكامل بخصائص وظيفية للتطبيق المحتمل كقناع للوجه مضاد للشيخوخة. تم تمييز أغشية BNC المحملة بجرعات مختلفة من مستخلص التقطير المائي من حيث شكلها وخواصها الميكانيكية وثباتها الحراري وقدرتها على امتصاص الرطوبة. علاوة على ذلك ، تم أيضًا تقييم النشاط الكيميائي المضاد للأكسدة للأغشية المختلفة ، وكذلك السمية الخلوية في المختبر (في الخلايا الكيراتينية البشرية وخطوط خلايا الخلايا الليفية للفأر). بالإضافة إلى ذلك ، استقرار نشاط مضادات الأكسدة بعد 3 أشهر من التخزين ، في الظلام ، عند 22-25 درجة ورطوبة نسبية 52 بالمائة (RH) أو عند 40 درجة و 75 بالمائة رطوبة نسبية للغشاء مع 2 ميكرو سم {{19} } من HDE تم تقييمها. أخيرًا ، تم إجراء مزيد من التحقيق في النشاط المضاد للشيخوخة في المختبر لغشاء BNC مع 2 ميكروغرام سم -2 من HDE.

2. المواد والأساليب

2.1. الكيماويات والمواد

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99. 0 بالمائة) و ​​3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) (أكبر من أو يساوي 97.5 في المائة) من Sigma-Aldrich (لشبونة ، البرتغال). جميع المواد الكيميائية الأخرى كانت من الدرجة المعملية.cistanche نمو القضيبكلوريد الكالسيوم ، Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، etoposide ، كاشف الفينول Folin-Ciocalteu ، كلوريد المغنيسيوم ، بيروفات الصوديوم ، محلول التربسين- EDTA ، N - (2- هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين- N '- ({{6} } إيثان سلفونيك) ، 4- (2- هيدروكسي إيثيل بيبرازين -1- إيثان سلفونيك أسيد (HEPES) ، و 2 ، 2- ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل (DPPH) كانت من Sigma-Aldrich (لشبونة ، البرتغال) .تم الحصول على خلاصة البيبتون والخميرة من Himedia Laboratories GmbH (Einhausen ، ألمانيا). تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) والبنسلين والستربتومايسين من Gibco (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم استخدام عينات من قناع الوجه الورقي التجاري BNC في المقايسات الميكانيكية وامتصاص الرطوبة ، لأغراض المقارنة. يوصف قناع الوجه التجاري BNC (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocellulose Mask ، إليزابيث أردن ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) بأنه مشتق من ماء جوز الهند الطبيعي ومدمج في تركيبة مستحضرات التجميل مع خصائص تجديد الجلد التي تحتوي ، من بين مكونات أخرى ، البروبيوتيك (Lactococcus ferment lysate ، Lactobacillus) ، والمستخلصات النباتية (مستخلص زهرة الورد Althea ، وعصير جذر Polymnia sonchifolia ، ومستخلص Crithmum maritimum) ، والكافيين ، والمرطبات ، مثل الجلسرين ، وحمض الهيالورونيك ، أو البولي إيثيلين جليكول (PEG) -450 . تم تجفيف عينات من الصفيحة التجارية BNC في فرن جيد التهوية عند 358 درجة مئوية قبل الاستخدام.فوائد الصلصا cistancheعلامة E.Globulus الطازجة. تم جمع الأوراق من الأشجار البالغة من مزرعة صناعية تابعة لشركة Navigator بالقرب من Aveiro في Sever do Vouga (Bracal) (Aveiro ، البرتغال) وتم إخضاعها لعملية التقطير المائي حتى اكتمال استخراج جزء الزيت العطري (2-3 ح) استخدام جهاز معدّل من نوع Clevenger. في النهاية ، تم استرداد المستخلص المائي ، HDE ، وتجفيفه وتخزينه وحمايته من الضوء في مجفف ، في درجة حرارة الغرفة ، حتى الاستخدام [40].

2.2. إجمالي محتوى الفينول من HDE

تم تحديد إجمالي المحتوى الفينولي (TPC) لـ HDE باستخدام طريقة Folin-Ciocalteu ، كما هو موصوف في مكان آخر [41] ، مع بعض التعديلات. باختصار ، في 96- صفيحة بئر ، تم تخفيف 15 0 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu سابقًا （1∶10 ، o / ø） بالماء و 120 لترًا من محلول كربونات الصوديوم المائي （75 جم لتر- تمت إضافة） إلى 30 ميكرولتر من محلول HDE مائي بتركيزات تتراوح من 1.95 ميكروغرام إلى 500 ميكروغرام -1 من المستخلص. تم تحضين مخاليط التفاعل في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. بعد فترة الحضانة ، تم قياس الامتصاصية عند 760 نانومتر مقابل فراغ (الماء بدلاً من المستخلص) في قارئ الصفيحة الدقيقة Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب TPC كمكافئات لحمض الغال (GAE) من منحنى معايرة المحاليل المعيارية لحمض الغال (5. 13-205 0 ميكروغرام مل -1) وتم التعبير عنها بالملجم من GAE للمستخلص المجفف بالتجميد. تم إجراء الفحص خمس مرات ، وتم تحليل كل عينة في ثلاث نسخ.

2.3 إنتاج أغشية BNC

تم إنتاج أغشية BNC في معملنا باستخدام وسط استنبات سائل هيسترين-شرام (HS) (2 0 جم لتر -1 جلوكوز ، 5 جم لتر -1 ببتون ، 5 جم ليرة لبنانية مستخلص خميرة ، 2.7 جم لتر -1 ثنائي فوسفات الهيدروجين ، 1.15 جم حمض الستريك L ، pH5) الملقح ببكتيريا حمض الخليك Gluconacetobacter sacchari تحت ظروف الاستزراع الثابت [42]. بعد 4-6 يومًا من الاستزراع عند 30 درجة ، تم حصاد أغشية BNC ومعالجتها مرتين باستخدام 0.5 مولار هيدروكسيد الصوديوم عند 80 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تم غسل الأغشية عدة مرات بالماء المقطر للتخلص من المكونات المتوسطة المتبقية والخلايا البكتيرية. أخيرًا ، تم تبييض أغشية BNC بمحلول مائي بنسبة 1 في المائة من هيبوكلوريت الصوديوم متبوعًا بغسل متكرر بالماء المقطر حتى الوصول إلى الرقم الهيدروجيني المحايد. تم تخزين الأغشية المنقاة في ماء عالى النقاء بدرجة 4 زائد حتى الاستخدام.

2.4 تحضير أغشية BNC-G-HDE

أغشية رطبة BNC （قطرها 7. 0 ± 0. 5 سم ؛ سماكة 7000 ± 1000 ميكرومتر） تم تحميلها بجرعات مختلفة من HDE (معبرًا عنها بكتلة HDE لكل مساحة سطح من الغشاء) والجلسرين (7.5 مجم سم -2) ​​(الجدول 1) ، باستخدام طريقة التشريب. بإيجاز ، تم وزن أغشية BNC الرطبة (حوالي 180 مجم من BNC الجاف) وتم تصريفها عن طريق الضغط باليد باستخدام ورق ماص من الدرجة المختبرية حتى انخفض محتوى الماء إلى ما يقرب من 40 في المائة (يقدر بفقدان الوزن). بعد ذلك ، تم نقع الأغشية في 5 مل من محلول مائي يحتوي على الجرعات الخاصة بكل من HDE والجلسرين والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة حتى الامتصاص الكامل لمحلول HDE-G. أخيرًا ، تم تجفيف أغشية BNC (في أطباق بتري) عند 35 درجة في فرن جيد التهوية (خط Venticell Eco ، مجموعة MMM ، Planegg ، ألمانيا) لمدة 20 ساعة على الأقل. تم تخزين الأغشية المجففة وحمايتها من الضوء في مجفف في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. لأغراض المقارنة ، تم تجفيف أغشية BNC النقية (بدون المستخلص والجلسرين) كما هو موصوف سابقًا ، وتم تحضير الأغشية المحملة بالجلسرين (BNC-G) باتباع نفس الإجراء.

2.5 توصيف الأغشية

2.5.1 السماكة

تم قياس سماكة الأغشية الجافة في خمسة مواقع عشوائية باستخدام ميكرومتر رقمي محمول باليد （Mitutoyo Corporation ، طوكيو ، اليابان） بدقة 1 ميكرومتر

2.5.2. علم التشكل المورفولوجيا

تم تحليل الأشكال السطحية والمقطع العرضي (المكسور بالتبريد) للأغشية عن طريق مسح المجهر الإلكتروني (SEM). تم الحصول على الصور المجهرية باستخدام مجهر عالي الجهد (HR-FESEMSU 7 0 Hitachi ، طوكيو ، اليابان) يعمل عند 4.0 كيلو فولت. قبل الحصول على الصورة ، تم وضع العينات على دعامة فولاذية ومغطاة بالكربون.

2.5.3. الأداء الميكانيكي

تم تقييم الأداء الميكانيكي للأغشية في حالات الجفاف والرطوبة (80٪ رطوبة) عن طريق اختبارات الشد. تم تحديد محتوى الرطوبة في الأغشية الرطبة وفقًا لمحتوى الرطوبة المحدد في BNC التجاري. تم إجراء اختبارات الشد على آلة اختبار Instron 5564 أحادية المحور (شركة Instron ، نوروود ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) في وضع الجر بسرعة متقاطعة تبلغ 10 ملم دقيقة - أنا باستخدام خلية تحميل ثابتة 500 نيوتن. أجريت جميع القياسات في خمس مكررات على الأقل باستخدام عينات اختبار مستطيلة （5 × 1 سم 2 ومقياس طول 30 مم. تم رسم منحنيات الإجهاد （MPa والانفعال （بالمائة ، وتم تحديد معامل يونغ وقوة الشد والاستطالة عند الكسر باستخدام برنامج Instron BlueHill 3. في هذه الاختبارات ، تم أيضًا اختبار عينات من قناع الوجه التجاري BNC في نفس الظروف ، للمقارنة.

2.5.4. الاستقرار الحراري

تم إجراء التحليل الوزني الحراري (TGA) باستخدام محلل SETSYS Setaram TGA (SITARAM Instrumentation ، ليون ، فرنسا) مجهزًا بخلية بلاتينية. تم تسخين العينات من درجة حرارة الغرفة إلى 800 درجة مئوية بمعدل ثابت قدره 10 درجات دقيقة -1 تحت جو من النيتروجين.

2.5.5. قدرة امتصاص الرطوبة

تم تقييم قدرة امتصاص الرطوبة لجميع الأغشية عن طريق وضع عينات مجففة (2 × 2 سم) من كل غشاء في مجفف ، في درجة حرارة الغرفة ، مع رطوبة نسبية في كاليفورنيا. 52 بالمائة باستخدام محلول مائي من نترات المغنيسيوم المشبع (52.89 ± 0. 22 بالمائة عند 25 درجة) [43]. أخذت العينات من المجفف ووزنت بعد 0. 5 ساعات ، 1 ساعة ، 2.5 ساعة ، 24 ساعة ، 48 ساعة. تم اختبار جميع الأغشية في ثلاث نسخ. تم حساب امتصاص الرطوبة على النحو التالي:

حيث هو الوزن الأولي للعينة ، و Ww هو الوزن في كل نقطة زمنية.

2.6. في نشاط Chermico المضاد للأكسدة

تم تقدير النشاط المضاد للأكسدة للأغشية المحملة بـ HDE باستخدام طريقة مسح الجذور الحرة DPPH ، باتباع الإجراء المذكور سابقًا [44] ، مع بعض التعديلات. يعتمد التفاعل على انخفاض امتصاص محلول DPPH الناتج عن الكسح الجذري بواسطة المركبات المضادة للأكسدة ، مع التغيير اللاحق في لون محلول DPPH من اللون الأرجواني إلى الأصفر الباهت [45]. باختصار ، تمت إضافة عينات （2 × 5 سم²） من كل غشاء إلى 3.75 مل من الإيثانول EtOH ومحلول ملحي مخزّن بالفوسفات محلول PBS 6 0 ∶4 0 ؛ الرقم الهيدروجيني 5.5）. بعد ذلك ، تمت إضافة 250 ميكرولتر من محلول DPPH 1 ملي مولار في الإيثانول ، وتم تحضين المخاليط الناتجة في الظلام بخلط لطيف (100 دورة في الدقيقة) عند 22 درجة لمدة 0.5 ساعة و 1 ساعة و 2.5 ساعة ، ثم الامتصاص عند تمت قراءة 517 نانومتر مقابل الفراغ (EtOH: PBS1 × pH5.5) باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة MultiskanTM FC (Thermo Scientific ، Waltham ، Massachusets ، EUA). للمقارنة ، مخاليط التفاعل المحتوية على HDE المخفف في EtOH: PBS1 × pH5.5 بتركيز نهائي مكافئ للحد الأقصى لكمية HDE التي يمكن إطلاقها من كل غشاء (HDE 1: 2.5 ميكروغرام مل -1 ؛ HDE1. تم أيضًا تضمين 5∶3.75 ميكروغرام مل -1 ؛ HDE 2∶5.0 ميكروغرام مل -1 ؛ HDE 3∶7.5 ميكروغرام مل-） في الفحص. عنصر تحكم يتكون من EtOH: PBS 1 × pH5.5 باستخدام DPPH وبدون غشاء تم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة لكل عينة وتم حساب نشاط الكسح الجذري لـ DPPH من امتصاص كل عينة (عينة) فيما يتعلق بامتصاص DPPH للتحكم (ApppH) على النحو التالي:

2.7. تقييم استقرار غشاء BNC-G-HDE2 تحت التخزين

بناءً على "الإرشادات الخاصة باختبار الثبات لمنتجات مستحضرات التجميل" [46] ، تم تقييم استقرار تخزين BNC-G-HDE2. لهذا الغرض ، تم وضع عينات 14 سم² من BNC-G （كعنصر تحكم） وأغشية BNC-G-HDE2 في قوارير زجاجية وتخزينها لمدة 3 أشهر في الظلام في حالة التخزين العادية المتوقعة ، في درجة حرارة الغرفة ({{10) }} درجة) و 52 بالمائة رطوبة نسبية (حالة 1 ، باستخدام محلول مشبع نترات المغنيسيوم [43]) وفي حالة معجلة تبلغ 40 درجة مئوية و 75 بالمائة رطوبة نسبية (الحالة الأولى ، باستخدام محلول مشبع بكلوريد الصوديوم [43] ). تم رصد الرطوبة النسبية بشكل دوري باستخدام مقياس الرطوبة الحرارية لضمان ثبات الرطوبة خلال فترة التخزين بأكملها. تم تحليل جميع العينات قبل وبعد 1،2 و 3 أشهر من التخزين فيما يتعلق بنشاطها المضاد للأكسدة (كما هو موضح في القسم 2.6). كما تم تسجيل الجانب العياني للأغشية. لكل حالة ، تم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ.

2.8. في فحوصات المختبر البيولوجية

2.8.1. زراعة الخلايا

تمت زراعة الخلايا الكيراتينية البشرية (HaCaT ، من CLS ، وخدمة الخطوط الخلوية ، Eppelheim ، ألمانيا) والخلايا الليفية للفأر (NIH / 3T3 ، ATCC CRL -1658 ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، عند 37 درجة ، في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون 2-95 في المائة. تم استكمال الوسط بـ 10 بالمائة (o / v) مصل بقري جنيني معطل بالحرارة （FBS） ، 1 بالمائة （o / ø قلم / strep ، 3.7 جم بيكربونات الصوديوم ، و 1 ملي بيروفات الصوديوم. تم فصل الخلايا بمحلول التربسين- EDTA 1 ×.

2.8.2. فحص السمية الخلوية

تم تقييم السمية الخلوية للأغشية باستخدام مقايسة اختزال MTT. تم تعقيم العينات （2.5 سم² من الأغشية （BNC-G و BNC-G-HDE1 و BNC-G-HDE1.5 و BNC-G-HDE2 و BNC-G-HDE3 مرتين بواسطة الأشعة فوق البنفسجية على كل جانب خلال 20 عامًا دقيقة ومحتضنة ، لمدة 24 ساعة ، في 2.5 مل من وسط DMEM الكامل عند 37 درجة في جو هواء مرطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، -95 في المائة ، لتحضير كل مستخلص غشاء.

وفي الوقت نفسه ، تم زرع 2 × 1 0 و 1 × 1 0 4 خلايا / بئر في 96- لوحات جيدة لخلايا HaCaT و NIH / 3T3 ، على التوالي. بعد 24 ساعة ، تم استخدام نفس الحجم من مستخلص الغشاء لاستبدال وسط المزرعة ، وتم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة. كعنصر تحكم ، عولجت الخلايا بنفس الطريقة الموضحة للعينات ولكن تم تعريضها فقط لوسط DMEM. بعد 24 ساعة ، تمت إزالة الوسيط ، وتم تحديد السمية الخلوية كما هو موصوف سابقًا [47]. باختصار ، تمت إضافة محلول جديد من MTT (0.5 مجم لتر -1) محضر في وسط كريبس (الرقم الهيدروجيني 7.4) واحتضانه عند 37 درجة لمدة ساعتين (خلايا HaCaT) أو 4 ساعات (خلايا NIH / 3T3). بعد ذلك ، تم استبدال محلول MTT بـ DMSO واحتضانه لمدة 0 دقيقة ، مع الاهتزاز ، لإذابة بلورات فورمازان تمامًا. بعد الحضانة ، تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي (SLT Spectra I). تم التعبير عن نتائج 3 تجارب مستقلة ، مع 3 مكررات لكل منها ، كنسبة مئوية (نسبة مئوية) من قيمة الامتصاص التي تم الحصول عليها في المجموعة الضابطة وعرضها بيانياً كنسبة مئوية من تخفيض MTT.

2.8.3. نشاط مكافحة الشيخوخة

تم تقييم النشاط المضاد للشيخوخة لغشاء BNC-G-HDE2 باستخدام مقايسة تلطيخ -galactosidase (-gal). تم استخدام غشاء BNC-G كعنصر تحكم. لتحضير مستخلصات الغشاء ، تم تحضين العينات المعقمة (10 سم) في 10 مل من وسط DMEM الكامل كما هو موضح سابقًا لمقايسة السمية الخلوية.

تم زرع خلايا NIH / 3T3 في 12- ألواح بئر بكثافة 2.5 × 104 خلية / بئر وتم السماح لها بالاستقرار لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم استخدام 12.5 ميكرومتر من الإيتوبوسيد للحث على الشيخوخة الخلوية في NIH / 3T3 لمدة 24 ساعة. ثم عولجت الخلايا المحفزة بالإيتوبوسيد بمستخلص غشاء BNC-G-HDE2 لمدة 24 ساعة أخرى.cistanche tubulosa جرعة redditكعنصر تحكم ، تم تحضين الخلايا غير المعالجة بوسط DMEM أو مقتطفات من أغشية BNC-G و BNC-G-HDE. بعد الحضانة ، تمت إزالة وسط الاستزراع وغسل الخلايا باستخدام PBS وتمييزها بمحلول -gal تم تحضيره كما هو موصوف من قبل الشركة المصنعة (Cell Signaling Technology ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل الخلايا الإيجابية للشيخوخة بتكبير 20 × باستخدام مجهر واسع المجال (Carl Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا). تم إجراء ما لا يقل عن 3 تجارب مستقلة في تكرار ، وتم تحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة باستخدام أربع صور مجهرية.

2.9 تحليل احصائي

في معالجة النتائج من اختبار التوصيف والنشاط المضاد للأكسدة واستقرار التخزين للأغشية ، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Tukey لتقييم مستوى الأهمية. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري للمتوسط. فيما يتعلق بالمقايسات في المختبر ، تم تقييم الحالة الطبيعية لتوزيع البيانات من خلال اختبارات الحالة الطبيعية D'Agostino-Pearson و Shapiro-Wilk. تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات بواسطة ANOVA متبوعًا باختبار Dunnett اللاحق أو اختبار t غير المقيد للطلاب. تم تقديم النتائج على أنها متوسط ​​الخطأ المعياري لمتوسط ​​عدد التجارب المشار إليه.

تم قبول الأهمية في قيم p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

تم استخراج هذه المقالة من المواد 2022 ، 15 ، 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials