تعزيز النشاط المضاد للسرطان في Aspergillus Favus "endophyte of Jojoba" Taxol عن طريق الاقتران مع جزيئات الذهب النانوية بوساطة ‑الإشعاع

الأعشاب الصينية البديلة من تاكسول

الكلمات الدالة:Aspergillus favus · Jojoba · الفطريات Endophytic · جزيئات الذهب النانوية · تاكسول · -الإشعاع · تحسين التغذية

مقدمة

تاكسول هو واحد من أكثر الطيف التجاري انتشارًاالأدوية المضادة للسرطان[1]. يتطور نشاط تاكسول من خصوصيته الفريدة للارتباط مع مغاير التوبولين الخلوي للوحدات الفرعية ، مما يعزز بلمرة التوبولين ، وبالتالي تعطيل الانقسام الانقسامي للخلايا السرطانية [2]. أظهر تاكسول نشاطًا قويًا ضد سرطان الثدي والرئة والرأس والرقبة والرحم والأشكال المتقدمة من ساركوما كابوزي [3]. تم إنتاج تاكسول أولاً من لحاء أشجار الطقسوس Taxus brevifolia "Family Taxaceae" [4، 5]؛ ومع ذلك ، فإن انخفاض العائد من تاكسول<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as الربو,اشتعال، وسرطان[32]. وبالتالي ، كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو استكشاف عزلة فطرية جديدة من نبات الجوجوبا تتمتع باستقرار استقلابي فريد لإنتاج التاكسول ، لتقييم الأساليب المختلفة لتعظيم إنتاجها من التاكسول ، وكذلك لتعزيز النشاط المضاد للتكاثر لمركبات التاكسول المستخرجة. عن طريق الاقتران بجسيمات الذهب النانوية ، بوساطة تشعيع جاما.

المواد والطرق

عزل واستنبات الفطريات الداخلية

تم جمع أجزاء مختلفة من الجوجوبا (Simmondsia chinensis) مثل الأوراق واللحاء والأغصان والبراعم من كلية الزراعة بجامعة القاهرة ، واستخدمت كمصدر للفطريات الداخلية. تم جمع أجزاء النبات وغسلها تحت ماء الصنبور الجاري ، وتعقيم سطحها بنسبة 70 بالمائة من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة ثم شطفها بالماء المعقم [28]. تم تقطيع أجزاء النبات المعقمة السطحية إلى قطع صغيرة تحت ظروف معقمة ووضعت على ألواح من وسط آجار سكر العنب (PDA) ، وسيط Czapek's-Dox ، ووسط أجار مستخلص الشعير [33-36] ، وحضنت الألواح عند درجة 30 من أجل 10 أيام. تم تقييم فعالية التعقيم السطحي لأجزاء النبات عن طريق الطرد المركزي لماء الشطف ، ثم تمت إضافة 500 ميكرولتر من الماء المعقم إلى المادة المترسبة وطليها في وسط PDA [37]. تم تلقيح العزلات الفطرية النقية المنقاة على شقوق PDA لمدة 7 أيام وتخزينها عند 4 درجات.

فحص واستخلاص وتحديد كمية التاكسول من الفطريات الداخلية

تم فحص الفطريات الداخلية المستعادة التي تعيش في الجوجوبا من أجل إنتاج تاكسول من خلال النمو على مرق دكستروز البطاطس (PDB) [38]. تم تلقيح سدادة واحدة من كل من العزلات الممتعة التي يبلغ عمرها 7 أيام في 1 0 0 مل من PDB / 250 مل من مهام Erlenmeyer ، المحتضنة لمدة 15 يومًا عند درجة 30 ± 1 ، تحت ظروف الاهتزاز (120 دورة في الدقيقة). بعد الحضانة ، تم ترشيح الثقافات ، وتعديل المرشح بنسبة 0.2 في المائة من بيكربونات الصوديوم لترسيب الأحماض الدهنية. تم استخلاص التاكسول مع ثنائي كلورو ميثان ، وتم جمع الطور العضوي وتبخره حتى يجف ، وأعيد إذابة البقايا في ميثانول [17 ، 39]. تم فصل تاكسول وتحديده بواسطة TLC باستخدام ألواح هلام السيليكا المطلية مسبقًا Merck 1 مم (20 × 20 سم) (TLC Silica gel 60 F254 ، Darmstadt ، ألمانيا) ، تم الكشف عنها بواسطة إضاءة الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر [39]. تم كشط البقع المفترضة لـ Taxol من ألواح هلام السيليكا TLC وأذوبت في ميثانول ، ودوامة بقوة لمدة 10 دقائق ، وطردها عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تمت إزالة جزيئات السيليكا المترسبة ، وتم أخذ المادة الطافية لتقدير تاكسول وفحص النقاء بواسطة HPLC (YOUNG In، Chromass، 9110 plus Quater nary Pump، Korea) لعمود الطور العكسي C18 (Eclipse Plus C 18 4. 6 × 150 مم ، 3.5 ميكرومتر ، القط # 959963-902). كانت الطور المتحرك المستخدم عبارة عن ميثانول / أسيتونيتريل / ماء (25:35:40 ، حجم / حجم / حجم) بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة [40] ، وتم قياس كسور تاكسول عند 227 نانومتر ، تم تأكيد الهوية والتركيزات الكيميائية من وقت الاحتفاظ ومنطقة ذروة الامتصاص مقارنة بالعينة الأصلية.

التعريف المورفولوجي والجزيئي للفطريات الداخلية المستعادة

تم التعرف على العزلات الفطرية الفطرية الداخلية لمستويات أنواعها بناءً على سماتها المورفولوجية الكلية والجزئية من خلال النمو على وسائط PDA و Czapek's-Dox ومستخلص الشعير وفقًا لمفاتيح المرجع [33-36]. تم تأكيد هوية العزلات الفطرية الأكثر فاعلية في إنتاج التاكسول جزيئيًا بناءً على تسلسل فاصل النسخ الداخلي (ITS) [41 ، 42]. تم استخلاص الحمض النووي الجيني الفطري (gDNA) عن طريق سحق الفطريات (حوالي 0. 2 جم) في النيتروجين السائل ، ثم الاستغناء عن 1 مل من محلول استخلاص CTAB (2 بالمائة CTAB ، 2 بالمائة PVP4 0 ، { {21}}. 2 بالمائة 2- mercaptoethanol ، 2 0 ملي مولار EDTA ، 1.4 مليون كلوريد الصوديوم في 1 0 0 ملي تريس − حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0). كانت مجموعات PCR التمهيدية هي ITS 4 5 ′ - GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG -3 ′ و ITS 5 5 ′ - TCCTCCGCTTATTGATGC -3 ′. يحتوي تفاعل PCR على 10 مايكرولتر من 2 × خليط رئيسي من PCR (i-Taq ™ ، Cat. رقم 25027) ، 2 مايكرولتر من جدنا ، 1 مايكرولتر من كل مادة أولية (10 ميكرولتر / مايكرولتر) ، ويكتمل حتى 20 ميكرولتر بمُقطر معقم ماء. تم تحويل PCR إلى تمسخ أولي عند 94 درجة لمدة دقيقتين ، وتمسخ عند 94 درجة لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة لمدة 10 ثوانٍ ، والتمديد عند 72 درجة لمدة 30 ثانية لمدة 35 دورة ، وتمديد fnal عند 72 درجة لمدة 2. دقيقة. تم تحليل أمبليكونات PCR بواسطة 1.5 بالمائة من هلام agarose في 1 × TBE bufer (Ambion Cat # AM9864) ، باستخدام سلم DNA 1 كيلو بايت (Cat. # PG 010-55 DI) وتم تصورها بواسطة نظام التوثيق الهلامي. تمت تنقية الأمبليكونات وتسلسلها بواسطة Applied Biosystems Sequencer ، HiSQV Bases ، الإصدار 6.0 مع نفس مجموعات البادئات. تم البحث في التسلسلات التي تم الحصول عليها بلاست بشكل غير مكرر على قاعدة بيانات NCBI ، وتم استيرادها إلى برنامج MEGA 6.0 ، ومواءمتها مع خوارزمية العضلات Clustal W [43] وتم إنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام طريقة الانضمام المجاورة لـ MEGA 6.0 [44].

التركيب الكيميائي للتاكسول المستخرج

تم كشط البقع المفترضة لـ Taxol من ألواح هلام السيليكا TLC وتنقيتها ، وتم تحديد النقاوة والتركيز بواسطة تحليلات UV-Vis عند 227 نانومتر (RIGOL ، Ultra -3000 سلسلة) مقارنةً مع تاكسول الأصلية [39]. تم استخدام الوسائط الفارغة تحت نفس الظروف كخط أساس سلبي لتحليلات القياس الطيفي. تم تحليل طيف FT-IR لعينات Taxol المنقى بواسطة مقياس الطيف الضوئي JASCO FT-IR 3600. تم طحن عينة تاكسول بحبيبات KBr ، وضغطها في أقراص تحت تفريغ ، وتم قياس الامتصاص في المنطقة من 400 إلى 4000 سم -1 [3] ، مقارنة بالعينة الأصلية. تم تأكيد التركيب الكيميائي لـ Taxol المستخلص من التحليل الطيفي HNMR (JEOL، ECA -500 II، 500 MHz NMR) مقارنةً بـ Taxol الأصلي. تم حل العينات في CDCl3 ، وتم إعطاء التحولات الكيميائية في جزء في المليون (مقياس δ) ، وتم التعبير عن ثوابت الاقتران بالهرتز (Hz).

تأثير أنواع مختلفة من الوسائط على إنتاج تاكسول

تم تلقيح سدادين أجار (9 مم) من مزارع عمرها 7 أيام لكل عزلة فطرية في ثلاث نسخ في قارورة إرلنماير 100 مل وسط / 250 مل من دكستروز البطاطس (PDB) و Czapekʼs-Dox (CZD) و M1D ومستخلص الشعير (ME). ) مرق الوسائط. تم استخدام عناصر تحكم غير محصنة من كل وسائط خالية من الجراثيم الفطرية كعنصر تحكم سلبي ، تم تحضينها عند 30 درجة لمدة 15 يومًا تحت نفس الظروف. بعد الحضانة ، تم ترشيح المزارع الفطرية واستخراج تاكسول وتحديدها كما هو مذكور أعلاه.

تحسين المعالجة الحيوية للظروف الغذائية لتعظيم عائد تاكسول

تم إجراء تحسين التركيبة المتوسطة لتعظيم محصول تاكسول بواسطة العزلة المرحة القوية باستخدام منهجية سطح الاستجابة باستخدام تصميم Placket-Burman متبوعًا بالتصميم المركب المركزي [17–2 0 ، 45]. من تصميمات RSM ، تم تقييم المتغيرات الإيجابية والهامة التي تؤثر على إنتاج Taxol بواسطة العزلة الفطرية القوية باستخدام حزمة البرامج الإحصائية بواسطة Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc. ، Minneapolis ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء كل تجربة في ثلاث مكررات بيولوجية وتم أخذ القيم المتوسطة في الاعتبار. بعد الحضانة في الظروف المرغوبة ، تم ترشيح الكتلة الحيوية الفطرية ، وتم استخلاص تاكسول وتحديد كميته بواسطة TLC و HPLC كما هو موضح أعلاه.

بلاكيت ‑ بورمان ديزاين

تم استخدام تصميم placket-Burman بشكل متكرر لتحسين مكون الوسائط لنمو الفطريات وإنتاج المستقلبات الثانوية النشطة بيولوجيًا ، وتقييم المتغيرات المهمة التي تؤثر على إنتاج تاكسول [18 ، 2 0 ، 46]. استند اختيار العامل إلى الوسائط المستخدمة في الفحص النوعي والكمي. تم تضمين أحد عشر عاملاً ؛ اختلفت قيم وعوامل سرعة الرج ، والببتون ، والسكروز ، والصويا ، والجلوتامين ، ومستخلص اللحم البقري ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، ووقت الحضانة ، وعوامل سرعة الرج على مستويين ، وتم اختيار المستويات الدنيا والقصوى. تم استخدام برنامج Design-Expert 7.0 الإحصائي لإنشاء مجموعة من 12 تجربة. لكل تجربة ، تم تحديد إنتاج تاكسول في ثلاث مكررات بيولوجية ، وتم أخذ متوسط ​​إنتاج تاكسول في الاعتبار.

تم إجراء تحليل الانحدار للبيانات باستخدام برنامج إحصائي. تم حساب تأثير كل متغير (Biometrika، 2020) باستخدام المعادلة التالية:

حيث ، E هو تأثير متغير الاختبار ، M plus ، و M− هي تركيز تاكسول للتجارب حيث كان المعامل عند مستوييه الأعلى والأدنى على التوالي ، و N هو عدد التجارب التي تم إجراؤها. تم تحديد تأثير كل متغير على الإنتاج من خلال حساب قيم E الخاصة به.

حيث Tot high هي إجمالي الردود على المستوى العالي ، Tot low هي إجمالي الردود على المستوى المنخفض ، و No هي عدد المحاولات.

التصميم المركب المركزي والتفاعلات بين العوامل التي تؤثر على إنتاج تاكسول

تم تحسين العوامل الإيجابية الأكثر أهمية التي أثرت على إنتاج تاكسول بواسطة الأيزو الفطري المختار باستخدام تصميم تجريبي لنموذج CCD من نوع سطح الاستجابة [47]. باستخدام CCD ، تم تحسين تركيزات المكونات المتوسطة ، واستخدمت تفاعلاتها المدروسة لتوليد ما مجموعه 20 تجربة للمتغيرات الثلاثة. لتحديد المستويات المثلى لمتغيرات إنتاج التاكسول من العزلة الفطرية القوية ، تم رسم منحنيات سطح استجابة ثلاثية الأبعاد (3D) لدراسة التفاعل بين العوامل المختلفة ولتحديد الحالة المتغيرة لكل عامل يؤثر على إنتاج تاكسول. تم تنفيذ الرسوم البيانية ثلاثية الأبعاد من خلال الاحتفاظ بثوابت ثلاثة عوامل في مستوى مثالي ورسم الاستجابة التي تم الحصول عليها لعائد تاكسول لمستويات مختلفة من العاملين الآخرين.

تأثير تشعيع جاما على محصول تاكسول

تم تعريض العزلات الداخلية القوية المنتجة للتاكسول -إشعاع باستخدام 6 0 مصدر كوبالت (خلية جاما 4000- A-India) بجرعات مختلفة من أشعة جاما (0. 25–3.0 كيلو جرام) مقارنة للسيطرة على الثقافة غير المشعة ؛ معدل جرعة 1.2 كيلو جرام / ساعة وقت التجارب. تم تلقيح الوسائط المحسنة بواسطة الثقافة المشععة في ظل ظروف ثقافية قياسية ، مقارنةً بلقاح البوغ غير المشع كعنصر تحكم. تم تحضين الثقافات عند 30 ± 2 درجة لمدة 15 يومًا على شاكر دوار (120 دورة في الدقيقة). بعد الحضانة ، تم ترشيح الثقافات واستخراج تاكسول وتنقيتها وتحديد كميتها بواسطة TLC و HPLC كما هو موضح أعلاه.

توليف وتوصيف جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) ؛ الاقتران مع تاكسول

نشاط تاكسول المضاد للسرطان

تم تحديد نشاط Taxol و Taxol-PVP-AuNP المنقى ضد سرطان الكبد (HPG2) وسرطان الثدي (MCF7) بواسطة 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل ثيازول - 2- yl) -2 ، مقايسة 5- ثنائي الفينيل رباعي بروميد (MTT) [48]. تم زرع صفيحة البئر 96- بـ 103 خلية لكل بئر ، وتم تحضينها طوال الليل عند 37 درجة ، ثم تمت إضافة تركيزات مختلفة من الدواء ، وأعيد تحضين الألواح لمدة 48 ساعة. تمت إضافة كاشف MTT (25 ميكرولتر) ، واحتضانه لمدة ساعتين ، وتم قياس اللون الأرجواني لمركب فورمازان المطور عند λ570 نانومتر. تم التعبير عن قيمة IC50 من خلال كمية الدواء التي تقلل من نمو 50 بالمائة من العدد الأولي للخلايا السرطانية التي تطبيع إلى تحكم إيجابي.

النشاط المضاد للميكروبات من Taxol و Taxol ‑ AuNPs المتقارن

تم تقييم النشاط المضاد للميكروبات لتقارنات Taxol و Taxol-AuNPs ضد العزلات البكتيرية المختلفة. Bacillus subtilis ATCC 6633 و Staphylococcus epidermidis و Pseudomonas aeruginosa و Escherichia coli و Enterobacter agglomerans بالإضافة إلى Candida albicans. تم تعليق الخلايا البكتيرية المختبرة في ماء ببتون معقم للحصول على لقاح قياسي من ~ 0. 5 مكفارلاند (1–1.5) × 1 {{1 0} 8 CFU / مل عند λ6 {{18 }} 0 نانومتر. تم تقييم تثبيط النمو (مم) لنمو مسببات الأمراض الجرثومية من خلال طريقة انتشار قرص أجار. تم استخدام أقراص المضادات الحيوية المعقمة التي يبلغ قطرها 6.0 مم كعناصر تحكم إيجابية. تم تحميل أقراص المضادات الحيوية المعقمة (6.0 مم) مع 20 ميكرولتر من الميثانول وحمض أموكسيسيلين كلافولانيك (AMC) كعنصر تحكم سلبي وإيجابي. تم تحميل الأقراص بنفس تركيز تاكسول ، تاكسول- PVP-AuNPs ، و AuNPs (1.0 ميكروغرام / مل). تم تحضير ثلاث مكررات بيولوجية. تم تحضين الصفائح عند 37 درجة لمدة 24 ساعة ، وتم قياس مناطق التثبيط. تم استخدام حمض أموكسيسيلين كلافولانيك (AMC) ونيستاتين لتطبيع النشاط المضاد للميكروبات في تاكسول. تم تحديد منطقة تثبيط النمو بواسطة الفرجار الورني (مم).

تحاليل احصائية

التعريف المورفولوجي والجزيئي لمنتجي التاكسول المحتملين

تم فحص السمات المورفولوجية للعزلة الفطرية القوية المنتجة للتاكسول وفقًا للمفاتيح الوصفية الميكروسكوبية والميكروسكوبية ، كما هو موضح في المواد والطرق ، وكشفت عن قربها المورفولوجي مع A. favus (الشكل 2). نمت العزلة الفطرية على PDA عند 30 درجة لمدة 10 أيام وكشفت السمات الميكروسكوبية والميكروسكوبية عن هويتها مثل الرؤوس المخروطية وطريقة التفرع وهوية وصمة العار وعلم الوجود الكوني وتشكيل الأجسام الثمرية ، وفقًا للعالمية. المفاتيح المورفولوجية [33] ، ووجد أنها مطابقة لـ Aspergillus favus. تم التعرف على عزلة A. favus القوية المنتجة لـ Taxol بناءً على تسلسلات ITS الخاصة بهم ، باستخدام gDNA كقالب. تم حل أمبليكونات PCR (~ 550 نقطة أساس) من A. favus وتنقيتها وتسلسلها (الشكل 2). كان تسلسل ITS لـ A. favus عبارة عن انفجار غير مكرر تم البحث عنه في قاعدة بيانات NCBI ، حيث أظهر تشابهًا بنسبة 99 بالمائة مع A. favus ، مع قيم صفرية E. ، وتغطية استعلام 95 بالمائة. وهكذا ، من خلال التحليلات المجهرية والجزيئية ، تم تأكيد العزلة المستهدفة على أنها A. favus وترسبت في GenBank برقم المدخل MW485934.1 ، وكذلك تم إيداع العزلة في مركز الفطريات بجامعة أسيوط (AUMC) ، مصر مع رقم الترسيب AUMC13892. تشابه العزلة الحالية بنسبة 99٪ مع عزلات A. favus MW485934 ، MT446145 ، KJ 863514 ، MW522551 ،

الشكل 1 منظر مورفولوجي لنبات الجوجوبا. ب ـ مزارع صفيحية للفطريات الداخلية القوية المنتجة للتاكسول ؛ A. favus Bd1 (13) ، A. niger Lv1 (21) ، Penicillium polonium (23) ، A. oryzae Bd (25) على PDA بعد 8 أيام من الحضانة عند 30 درجة. نمت العزلات الفطرية على PDB ، وحضنت في الظروف القياسية ، وتم استخلاص تاكسول وفحصها بواسطة TLC (C). كروماتوجرام D HPLC من تاكسول من العزلات الفطرية القوية. E عائد تاكسول كما تم تقديره من HPLC. التحليل الطيفي F ، UV-Vis للتاكسول المستخرج من العزلات الفطرية. تحليل G FT-IR للتاكسول المستخلص مقارنة بالتحليل الأصلي

التين. 2 أ السمات الكبيرة الشكل ل A. favus an endophyte من الجوجوبا بعد 3 و 5 و 8 أيام من النمو على PDA. السمات المورفولوجية الدقيقة ، الرأس كونيدال من A. favus بتكبير 400X. C PCR amplicon لمنطقة A. favus ITS تبلغ 500 نقطة أساس ، وتسويتها إلى سلم 1 كيلوبايت (Cat. #. SM0312). D التحليل الوراثي لـ ITS A. favus بواسطة طريقة الاحتمالية القصوى [44]

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950