ينظم CaWRKY30 بشكل إيجابي مناعة الفلفل من خلال استهداف CaWRKY40 ضد تلقيح Ralstonia Solanacearum من خلال تعديل الجينات المرتبطة بالدفاع الجزء 2

2.5 CaWRKY30 عابر الإفراط في التعبير المحفز لموت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية ، وإنتاج H2O2 ، والتنظيم النسخي لجينات العلامات المرتبطة بالمناعة

أشارت تجارب VIGS إلى أن CaWRKY30 ينظم بشكل إيجابي مناعة الفلفل ضد RSI. تم إجراء تجارب الإفراط في التعبير العابر عن طريق التسلل إلى خلايا GV3101 التي تحمل 35S: 00 (EV) أو 35S: CaWRKY30 في أوراق الفلفل لمزيد من التحقق من صحة هذه المضاربة. لقد درسنا دور CaWRKY30 في التعبير المفرط العابر في تحريض موت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية وتراكم H2O2 في نباتات الفلفل. تم إنشاء تعبير CaWRKY30 في نباتات الفلفل من خلال تجارب النشاف الغربية (الشكل 5 أ).

تم تأكيد موت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية وتراكم H2O2 عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق وتلطيخ DAB ، على التوالي. كشفت النتائج أن الإفراط في التعبير العابر لـ CaWRKY30 تسبب في موت الخلايا الشبيهة بالموارد البشرية وتراكم H2O2 في أوراق الفلفل الذي يتجلى من خلال تلطيخ التريبان الأزرق الداكن وتلطيخ DAB البني الداكن (الشكل 5 ب). تم إجراء الموصلية لدراسة شدة نخر الخلية الناجم عن الإفراط في التعبير العابر لـ CaWRKY ، وأظهرت النتائج أن أوراق الفلفل مفرطة التعبير بشكل عابر عن CaWRKY30 أظهرت المزيد من التسرب الأيوني عند 24 و 48 ساعة بعد تسلل Agro مقارنة بأوراق الفلفل الزائدة. معربا عن ناقلات فارغة (الشكل 5C). تم الكشف عن مستويات التعبير النسبي النسبي لجينات العلامة المرتبطة بالدفاع مثل CaPR1 المرتبط بالتخليق الحيوي ، و CaNPR1 المرتبط بـ SA ، و CaABR1 المستجيب لـ ABA ، وجين العلامة المرتبط بالموارد البشرية CaHIR1 عن طريق تحليل qRT-PCR.

أظهرت نتائجنا أن الإفراط في التعبير العابر لـ CaWRKY30 في أوراق الفلفل أدى بشكل ملحوظ إلى تضخيم تراكم النسخ من CaPR1 و CaNPR1 و CaDEF1 و CaABR1 و CaHIR1 في الفلفل بالمقارنة مع نباتات الفلفل المتجه الفارغة المفرطة بشكل عابر عند 48 نقطة في البوصة (الشكل 5 د). تصور هذه النتائج أن CaWRKY30 يعمل كمنظم إيجابي لموت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية للنبات ، وإنتاج H2O2 ، والتنظيم النسخي لجينات العلامات المرتبطة بالمناعة.

الشكل 5. الإفراط في التعبير العابر عن موت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية المستحث بـ CaWRKY30 ، وتراكم H2O2 ، والتعبير عن جينات العلامة المرتبطة بالمناعة في أوراق الفلفل. تم تأكيد الإفراط في التعبير الناجح لـ CaWRKY 30- من خلال تجربة النشاف الغربية (A) ، موت الخلية الشبيه بالموارد البشرية الناجم عن الإفراط في التعبير العابر لـ 35S: CaWRKY30 ، تم تأكيده من خلال اكتشاف النمط الظاهري ، والتعرض تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، و تلطيخ DAB و Trypan Blue بسرعة 48 نقطة في البوصة ، على التوالي ؛ شريط المقياس=50 ميكرومتر (ب) ، قياس تسرب المنحل بالكهرباء (الموصلية الأيونية) لتقدير استجابة موت الخلية في أقراص أوراق الفلفل عند 24 و 48 ساعة بعد التسلل الزراعي ، على التوالي (C) ، مقايسة qRT-PCR إلى تحقق من مستويات التعبير النسخي لجينات العلامة المرتبطة بالمناعة ، بما في ذلك CaPR1 و CaNPR1 و CaDEF1 و CaABR1 و CaHIR1 في 35S: CaWRKY30 معبرًا عن أوراق الفلفل بدقة 48 نقطة في البوصة ، على التوالي (D). تم ضبط مستوى التعبير النسبي لجينات الواسمات المعروفة المتعلقة بالدفاع في أوراق الفلفل التي تفرط في التعبير بشكل عابر عن المتجه الفارغ على "1". البيانات التي تمثل الوسيلة ± SE من أربعة مكررات بيولوجية. أشرطة الخطأ هي أخطاء معيارية للوسائل. تشير الأحرف المختلفة فوق الأشرطة إلى اختلافات كبيرة بين الوسائل.

2.6. العلاقة المتبادلة بين CaWRKY30 و CaWRKY40

تم الإبلاغ عن أن شبكات WRKY TFs المختلفة تشكل شبكات معًا وقد أبلغنا سابقًا أن العديد من أعضاء WRKY TFs ، مثل CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY40 ، مرتبطون صريحًا ووظيفيًا ببعضهم البعض. لذلك ، نفترض أن CaWRKY30 قد يتعلق بأعضاء آخرين من عائلة WRKY ، بما في ذلك CaWRKY40 ، وهو منظم إيجابي لمناعة الفلفل ضد RSI. تم إجراء تحليل qRT-PCR لمزيد من التحقيق في تنظيم التغذية الراجعة المحتمل لـ CaWRKY بواسطة CaWRKY ، ولدراسة التعديل المحتمل لـ CaWRKY30 بواسطة مقايسة الإفراط في التعبير العابر CaWRKY40 أو عن طريق إسكات CaWRKY40 بواسطة VIGS.

CaWRKY40 هو عامل نسخ WRKY يشارك في استجابات النبات لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية. أظهرت الدراسات أن CaWRKY40 مستحث في الطماطم ويمكن أن يعزز مقاومة النبات تحت الجفاف والمعالجات ذات درجات الحرارة المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، وجدت الدراسة أيضًا أن الإفراط في التعبير عن CaWRKY40 يمكن أن يحسن مقاومة الجفاف للطماطم ويخفف من تثبيط النمو الناجم عن الإجهاد الملحي ، لكن المقاومة لمسببات الأمراض تحتاج إلى مزيد من الدراسة. لذلك ، يلعب CaWRKY40 دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية للنباتات وله إمكانية معينة لزيادة الغلة الزراعية. في الوقت نفسه ، نحتاج أيضًا إلى الانتباه إلى مناعتنا. مناعة الجسم مهمة جدا. Cistanche له تأثير كبير على تحسين المناعة. الكستانش غني بالعديد من المواد المضادة للأكسدة ، مثل فيتامين ج ، وفيتامين ج ، والكاروتينات ، وما إلى ذلك. يمكن لهذه المكونات أن تزيل الجذور الحرة ، وتقلل من الإجهاد التأكسدي ، وتحسن مقاومة جهاز المناعة.

انقر فوق الملحق cistanche deserticola

عبرت نتائجنا عن مستويات النسخ من CaWRKY30 في أوراق الفلفل التي تم التعبير عنها بشكل عابر بزيادة 24 و 48 حصان مقارنة بالنباتات التي تعبر عن ناقل فارغ (EV) بشكل عابر (الشكل 6 أ) ، في حين زادت مستويات النسخ من CaWRKY40 في تلك النباتات بشكل عابر الإفراط في التعبير عن CaWRKY30 مقارنة بالنباتات التي تعبر عن EV بشكل عابر (الشكل 6 ب). على النقيض من ذلك ، أظهرت نتائجنا أن التراكم النسخي لـ CaWRKY40 تم تقليله بشكل ملحوظ في النباتات المصابة بـ Ralstonia المصابة بـ CaWRKY 30- مقارنة بالنباتات غير الصامتة (الشكل 6C). بالإضافة إلى ذلك ، تم قمع التراكم النسخي لجينات العلامات المعروفة المرتبطة بالمناعة ، على سبيل المثال ، CaPR1 و CaNPR1 و CaDEF1 و CaABR1 و CaHIR1 كليًا أو جزئيًا في نباتات CaWRKY30 التي تم إيقاف تشغيلها بواسطة CaWRK (الشكل 6 د).

تشير هذه البيانات إلى تنظيم النسخ لـ CaWRKY40 بواسطة CaWRKY ووجود حلقة تنظيمية إيجابية تتضمن CaWRKY30 و CaWRKY.

الشكل 6. العلاقة المتبادلة بين CaWRKY30 و CaWRKY40. ليف التعبير النسخي. els من CaWRKY40 في أوراق الفلفل التي تعبر بشكل عابر عن CaWRKY30 في فاصل زمني 24 و 48 نقطة في البوصة (A) ، مستويات التعبير النسخي لـ CaWRKY30 في أوراق الفلفل بشكل عابر التعبير عن CaWRKY40 في فاصل زمني 24 و 48 نقطة في البوصة (B) ، تحليل gRT-PCR لمستويات التعبير النسخي CaWRKY40 في نباتات الفلفل الصامتة وغير الصامتة بدقة 48 نقطة في البوصة (C) اختبار gRT-PCR لمستويات النسخ من جينات العلامة المرتبطة بالدفاع في CaWRKY 30- التي تم إخمادها و نباتات الفلفل غير الصامتة تعبر بشكل عابر عن 35S: CaWRKY 40- HA و 35S: 00 عند 48 نقطة في البوصة (D). تعني البيانات بالإضافة إلى SE من أربعة مكررات بيولوجية. أشرطة الخطأ هي أخطاء معيارية للوسائل. تظهر الأحرف المختلفة فوق الأشرطة اختلافات كبيرة بين الوسائل.

2.7. العلاقة المتبادلة بين CaWRY30 و CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY27

في دراساتنا السابقة ، تم اكتشاف أن CaWRKY40 مرتبطًا صريحًا ووظيفيًا بمختلف WRKY TFs ، مثل CaWRKY6 و CaWRKY. تشير العلاقة بين CaWRKY30 و CaWRKY40 إلى أن CaWRKY30 ربما يكون مرتبطًا بمختلف WRKY TFs المتورطة في مناعة الفلفل ضد RSI. لتأكيد هذا الافتراض ، تم إجراء تحليل qRT-PCR لدراسة العلاقة بين CaWRKY30 ومختلف WRKY TFs التي تم الإبلاغ سابقًا عن مشاركتها في مناعة الفلفل ضد RSI ، بما في ذلك CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY. أشارت نتائجنا إلى أنه تم تضخيم التراكم النسخي لـ CaWRKY30 في CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY27 معبرة بشكل عابر عن نباتات الفلفل عند 48 نقطة في البوصة (الشكل 7 أ) ، بينما زاد التراكم النسخي لـ CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY بشكل عابر في أوراق الفلفل. CaWRKY30 بسرعة 48 نقطة في البوصة (الشكل 7 ب). تشير نتائجنا لمقايسة qRT-PCR إلى أن CaWRKY30 و CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY27 مترابطان صراحةً ووظيفياً.

3. مناقشة

يعد بروتين WRKY أحد أكبر عائلات عوامل النسخ النباتية (TFs). من المعروف أن مجموعة من أفراد عائلة WRKY TFs ، تم الإبلاغ عنها من Arabidopsis thaliana و Oryza sativa ، تشارك وتلعب دورًا مهمًا في تنظيم مناعة النباتات. تم الإبلاغ عن اختلافات وظيفية كبيرة بين المتجانسات الهيكلية الوثيقة لـ WRKYs ، ولم يتم التحقيق بشكل كافٍ في وظائف WRKY TFs في مناعة النباتات غير النموذجية ، مثل الفلفل.

تم تمييز جين CaWRKY30 ، وهو جين مجموعة Ill WRKY ، وظيفيًا في الدراسة الحالية. أشارت النتائج إلى أن CaWRKY30 ينظم بشكل إيجابي مناعة الفلفل ضد RSl ، وهو مكون حيوي لشبكة WRKY التي تضم CaWRKY6 و CaWRKY22CaWRKY27 و CaWRKY. يتم دعم تشابك CaWRKY30 في مناعة الفلفل بواسطة عناصر رابطة الدول المستقلة المستجيبة للأمراض ، بما في ذلك عنصر TGA و TGACG-motifIATC-box و TATA-box و W-box الموجود في منطقة المروج لـ CaWRKY. كان هذا الافتراض متسقًا مع زيادة مستويات النسخ من CaWRKY30 بعد وبعد توفير ETH و ABA و SA خارجيًا [49،50].

نظرًا لأن الجينات الناتجة عن التعرض لعامل إجهاد معين معروفة في كثير من الأحيان بأنها متورطة في الاستجابة لهذا الإجهاد [51] ، فقد توقعنا أن CaWRKY30 قد ينظم بشكل إيجابي مناعة الفلفل ضد RSI. تم دعم هذه التكهنات ببيانات إسكات CaWRKY30 بواسطة VIGS ، و CaWRKY30 مقايسة الإفراط في التعبير العابر. هذه المناعة المقلصة بسبب فقدان وظيفة CaWRKY30 كانت مصحوبة بنمو متضخم لـ RSI وتقليل تنظيم جينات العلامات المرتبطة بالمناعة مثل CaPR1 المعتمدة على SA (52CaNPR1 [53] ، CaDEF1 المرتبط بـ JA (54] ، CaABR1 المرتبط بـ ABA [55] ] ، و CaHIR1 المرتبط بالموارد البشرية (561. من ناحية أخرى ، تم تحفيز موت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية و H O ، بسبب الإفراط في التعبير العابر لـ CaWRKY30 مصحوبًا بتنظيم نسخي لجينات العلامات المرتبطة بالمناعة مثل CaPR1 ، CaNPR1 ، CaDEF1 ، CaABR1، andCaHIR1. يشير هذا إلى دور CaWRKY30 كمنظم إيجابي لموت الخلايا الشبيهة بالموارد البشرية ومناعة الفلفل ضد RSI. وبالمثل ، لوحظ في الدراسات السابقة أن AtWRKY30 ، وهو متماثل لـ CaWRKY30 في نبات الأرابيدوبسيس ، ينظم بشكل إيجابي تأثير النباتات. -الوحدة ضد الإجهاد الحيوي واللاأحيائي 157.581. يمكن اقتراح أن CaWRKY30 يتم تنظيمه عند الإصابة بـ Ralstonia ، مما يؤدي إلى تقليل تعرض الفلفل لعدوى مسببات الأمراض البكتيرية.

الهرمونات النباتية مثل ET و ABA و SA هي جزيئات إشارات أساسية متورطة في استجابة النباتات لهجمات مسببات الأمراض والإجهاد الناتج عن درجات الحرارة العالية. وتشارك هذه أيضًا في الحديث المتبادل بين استجابات النباتات للضغوط الحيوية وغير الحيوية [59]. تحرض SA المقاومة ضد مسببات الأمراض التغذوية الحيوية ، بينما تلعب ET دورًا حيويًا في مناعة النباتات ضد مسببات الأمراض النخرية [60]. بشكل عام ، يقترن توليف SA و ET و JA بالمناعة التي تسببها PAMP (PTI) أو مناعة المستجيب (ETI). يمكن لهذه الهرمونات النباتية أن تلعب دورها بالتآزر والعداء بناءً على تركيزاتها أثناء إشارات الدفاع [61]. تم اكتشاف ارتباط تآزري بين عناصر الإشارة الثلاثة هذه في PTI ، بينما تم اكتشاف ارتباط تعويضي في ETI [62]. تم تحفيز CaWRKY30 باستمرار عن طريق الهرمونات النباتية الموردة من الخارج. تم تقليل جينات الواسمات المرتبطة بالمناعة المعروفة SA و ET و ABA مثل CaPR1 و CaNPR1 و CaDEF1 و CaABR1 عن طريق إسكات CaWRK ؛ ومع ذلك ، فقد تم تنظيمها عن طريق التعبير المفرط العابر لـ CaWRKY30 في نباتات الفلفل ، مما يدل على أن CaWRKY30 يشارك في إشارات الدفاع التآزري بواسطة SA و ET و ABA ، مما يؤدي إلى PTI.

أظهر التحليل على مستوى الجينوم تورط العديد من WRKY TFs في مناعة النبات [63-65]. من خلال دراسات الجينوم الوظيفي ، WRKY1 [66] ، -11 [67] ، -17 [67] ، -18 [68] ، -22 [69] ، {{13} } [70] ، -28 [71] ، -33 [72] ، -38 [73] ، -40 [68] ، -45 [74] ، -46 [75] ، -53 [76] ، -54 [75] ، -60 [68] ، -62 [77] ، -70 [75] ، و -75 [78] تم وصفها وظيفيًا في حصانة نبات الأرابيدوبسيس ، مما ينظم المناعة إيجابًا أو سلبًا. تم اقتراح مجموعات WRKY TFs لترتيب نفسها في شبكة نسخ WRKY ، تتألف من حلقات تغذية راجعة أكثر من خمسة وخمسة ووحدات تغذية متقدمة [12]. ومع ذلك ، لا يزال تكوين شبكات WRKY غير مفهوم جيدًا.

في دراسات سابقة ، اكتشفنا أن CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY27 و CaWRKY40 هي منظمات إيجابية لمناعة الفلفل لـ RSI [9،44،45] ، بينما CaWRKY58 هو منظم سلبي [46]. تشير الدراسة الحالية إلى أن CaWRKY30 يعمل كمنظم إيجابي في موت الخلايا الشبيه بالموارد البشرية للفلفل ، واستجابة الفلفل لعدوى R. solanacearum. تم تنظيم مستويات التعبير النسخي لـ CaWRKY30 عند التعبير المفرط العابر لـ CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY و CaWRKY. على العكس من ذلك ، قام CaWRKY30 بإفراط في التعبير العابر بتنظيم تراكم النسخ من CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY27 و CaWRKY40 ، مما يشير إلى وجود شبكات WRKY TFs بالإضافة إلى حلقات ردود الفعل بين CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY40 و CaWRKY40. من المفترض أن تشارك حلقات التغذية الراجعة المتشابهة في مناعة النباتات [47]. كان نفس النوع من حلقة التغذية المرتدة plus ve موجودًا بين CaWRKY40 و CaWRKY6 و CaWRKY40 و CabZIP63 و CaWRKY40 و CaCDPK15. في الدراسات السابقة ، تم اكتشاف CaWRKY6 [44] و CabZIP63 [16] أيضًا للمشاركة بشكل مباشر ونسخ في تنظيم تعبير CaWRKY40 ضد RSI. بالنظر إلى هذه النتائج ، يمكن اقتراح أن يتم تنسيق CaWRKY40 بواسطة فرق عمل مختلفة. في الختام ، يتم تنظيم تعبير CaWRKY40 بشكل مشترك بواسطة CaWRKY6 و CaWRKY22 و CaWRKY30 و CabZIP63 عند RSI ، ويتم تنظيم تعبير CaWRKY40 بواسطة CaWRKY6 و CabZIP63 ، ولكن ليس بواسطة CaWRKY30 في الفلفل بعد التعرض لدرجة حرارة عالية.

4. المواد والطرق

4.1 المواد النباتية وظروف النمو

تم الحصول على بذور الفلفل ميكسي ونيكوتيانا بنتاميانا من معهد أيوب للبحوث الزراعية ، فيصل آباد ، باكستان. زرعت بذور الفلفل و N. benthamiana في أواني بلاستيكية بها خليط تربة [بيتموس وبيرلايت ؛ 2/1 (ت / ت)] وتحفظ في غرفة نمو تحت ظروف مضبوطة ، أي درجة حرارة 25 درجة مئوية ، 60-70 ميكروليتر فوتونات م − 2 ثانية -1 شدة الضوء و 70 بالمائة رطوبة نسبية تحت 16 ساعة ضوء / 8 ح فترة ضوئية مظلمة.

4.2 جيل النواقل

تم استخدام تقنية استنساخ البوابة لتوليد ناقلات. لإنشاء ناقلات ساتلية ، تم استنساخ CaWRKY30 ORF كامل الطول (مع كودون طرفي أو بدون كودون طرفي) في متجه الدخول pDONR207 باستخدام تفاعل BP. بعد ذلك ، تم نقل هذا البناء إلى متجهات الوجهة pMDC83 و CD3687 (علامة HA) و CD3688 (علامة العلم) و Pk7WG2 عن طريق إجراء تفاعل LR لتوليد متجهات للتوطين الخلوي الفرعي والتعبير الزائد ، على التوالي.

لإنشاء متجهات لـ VIGS ، تم اختيار 364 بت في الثانية جزء في 30 - منطقة غير مترجمة (UTR) من CaWRKY30 وتم تأكيد الخصوصية بواسطة BLAST مقابل تسلسل الجينوم في قاعدة بيانات CM334 (http: //peppergenome.snu. ac.kr/ (تم الوصول إليه في 29 أكتوبر 2021)) و Zunla -1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (تم الوصول إليه في 29 أكتوبر 2021)). بعد ذلك ، تم إجراء تفاعل BP لاستنساخ هذا الجزء إلى pDONR207 / 201 ، بعد أن تم نقل هذا البناء إلى المتجه PYL279 عن طريق إجراء تفاعل LR.

4.3 إجراءات نمو وتلقيح الممرض

عزلنا سلالة خبيثة متوافقة من R. solanacearum من نباتات الفلفل المصابة بـ Ralstonia من ديرا غازي خان ، باكستان. تم استخدام طريقة tetrazolium chloride لتنقية إفرازات جزء الأنسجة الوعائية فوق سطح الأرض من النباتات المصابة بالعدوى [9،45]. تم زراعة R. solanacearum المعزول في وسط SPA في شاكر تحكم حراري (200 جم بطاطس ، 20 جم سكروز ، 3 جم مستخلص لحم بقري ، 5 جم تربتون ، 1 لتر من H O المقطر المزدوج) عند 200 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية من أجل بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، تم طرد سلالة R. solanacearum المزروعة في 6500 مساءً و 28 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم سكب مادة طافية سائلة بعد الطرد المركزي ، وتم تخفيف الكريات الموجودة في قاع أنبوب الطرد المركزي في محلول MgCl2 معقم 10 ملي مولار. تم تعديل كثافة الخلايا البكتيرية إلى 108 cfu ml1 (OD 600=0. 8).

لدراسة تأثير RSI على مستويات النسخ من CaWRKY30 وعلى مقاومة نباتات الفلفل لهجوم R. solanacearum ، تم اختراق الورقة الثالثة العليا لنبات الفلفل بـ 10 ميكرولتر من محلول R. solanacearum بواسطة حقنة بدون إبرة. تم حصاد عينات الأوراق المعالجة بمسببات الأمراض في نقاط زمنية محددة لتجارب التلوين الكيميائي النسيجي (على سبيل المثال ، تلطيخ DAB أو تلطيخ التريبان الأزرق) ، والتوصيل الكهربائي ، واستخراج cfu ، و RNA لمزيد من التجارب. بالنسبة لتجربة النمط الظاهري لنباتات CaWRKY 30- الصامتة وغير المحصنة ، فقد أصيبت الجذور باستخدام قضيب زجاجي وتم التسلل باستخدام مادة خبيثة متوافقة مع R. solanacearum. تم الاحتفاظ بالنباتات في غرفة نمو تحت ظروف تحكم عند درجة حرارة 28 ± 2 درجة مئوية ، 60-70 ميكرولتر فوتونات م 2 ثانية -1 شدة ضوء ، 70 بالمائة رطوبة نسبية ، وتحت 16- ضوء / {{12 }} فترة ضوئية مظلمة بعد تلقيح R. solanacearum. تم التقاط صور النمط الظاهري بعد RSI في فترات زمنية محددة.

4.4 التطبيق الورقي للهرمونات النباتية

لدراسة تأثير الهرمونات النباتية ، تم رش نباتات الفلفل الصحية بـ 100 ميكرومتر ETH و 100 ميكرومتر ABA و 1 ملي مولار SA في أربع مراحل أوراق. عولجت النباتات الوهمية (الضابطة) باستخدام ddH2O المعقم. تم جمع العينات المعالجة بالهرمونات النباتية في النقاط الزمنية المرغوبة لاستخراج الحمض النووي الريبي وإجراء مزيد من الدراسة.

4.5 فحص التوطين الخلوي الفرعي CaWRKY30

تمت زراعة خلايا الأجرعية التي تحتوي على 35S: CaWRKY 30- GFP أو 35S: GFP (التحكم) طوال الليل في وسط LB يحتوي على المضادات الحيوية المقابلة. تم الطرد المركزي للوسائط المزروعة عند 6500 دورة في الدقيقة ، وتم سكب المادة الطافية السائلة ، وتم تخفيف الحبيبات الموجودة في القاع في وسط تحريض (10 ملي مولار MES ، 10 ملي مول كلوريد ، درجة الحموضة 5.7 ، و 150 ميكرومتر أسيتوسيرنغون) ، وضبطها على OD {{ 10}} .8. الأجرعية المحتوية على 35S: CaWRKY 30- GFP و 35S: تم حقن GFP في أوراق N. benthamiana باستخدام حقنة بدون إبرة. تم استخدام الطريقة الموصوفة سابقًا لعمل 4 ، 6- ديميدينو -2- تلطيخ فينيل إندول (DAPI) [9]. عند 48 hpt ، لوحظت إشارات مضان GFP و DAPI ، وتم التقاط الصور بواسطة مجهر متحد البؤر مسح بالليزر (TCS SP8 ، لايكا ، سولمز ، ألمانيا) ، بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر و 505-530 نانومتر انبعاث تمرير النطاق منقي.

4.6 تلطيخ كيميائي

تم إجراء تلطيخ النسيج الكيميائي (Trypan blue و 3 ، 30 - diaminobenzidine) كما هو موضح سابقًا [9،11،79]. لإجراء اختبار تلطيخ التريبان الأزرق ، تم غلي أوراق الفلفل في محلول أزرق تريبان (10 مل من حمض اللاكتيك ، 10 مل من الجلسرين ، 10 مل من الفينول ، 40 مل من الإيثانول ، 10 مل من ddH2O ، و 1 مل من التريبان الأزرق) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تُحفظ الأوراق في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات ، وتُغمر في محلول من هيدرات الكلورال (2.5 جم من هيدرات الكلورال المذابة في 1 مل من الماء المقطر) ، وتُزال الملطخة بالغليان لمدة 30 دقيقة. تم تغيير محلول هيدرات الكلورال عدة مرات لتقليل الخلفية ، ثم تم تركيب العينات في 70 بالمائة من الجلسرين. تم وضع الأوراق في 1 مجم / مل من محلول DAB طوال الليل لفحص تلطيخ DAB. تم غلي الأوراق الملطخة بـ DAB في حمض اللاكتيك: الجلسرين: الإيثانول المطلق [1: 1: 3 (حجم / حجم / حجم)] ثم إزالة البقع في الإيثانول المطلق طوال الليل [80]. تم التقاط صور أوراق التريبان الزرقاء والأوراق الملطخة بـ DAB بكاميرا وبواسطة مجهر ضوئي (لايكا ، ويتزلار ، ألمانيا).

4.7 إسكات CaWRKY30 من خلال إسكات الجينات الناجم عن الفيروسات (VIGS)

تم تنفيذ نظام إسكات الجينات الناجم عن فيروس التبغ (TRV) الموصوف سابقًا من أجل إسكات CaWRKY30 في نباتات الفلفل [47،81،82]. تم خلط بنيات Agrobacterium GV3101 التي تحتوي على PYL192 و PYL 279- CaWRKY30 و PYL279 و PYL 279- PDS (OD 600=0. 8) بنسبة 1: 1. تم اختراق هذا المزيج في فلقات نباتات الفلفل التي يبلغ عمرها أسبوعًا 2- بواسطة حقنة بدون إبرة. تم تحضين النباتات المتسربة في غرفة نمو لمدة 56 ساعة في الظلام عند درجة حرارة 16 درجة مئوية ورطوبة نسبية 45 في المائة ، ثم تحولت إلى غرفة نمو في ظروف مضبوطة عند 25 ± 2 درجة مئوية ، 60-70 ميكرولتر فوتونات م 2 s −1 ، ورطوبة نسبية 70 في المائة تحت فترة ضوئية 16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة.

4.8 CaWRKY30 إفراط عابر في التعبير في أوراق الفلفل

تم زراعة خلايا Agrobacterium GV31 0 1 التي تحتوي على CaWRKY 30- علم و EV في وسط LB في شاكر تحكم حراري ، مع وجود المضادات الحيوية المقابلة طوال الليل حتى OD 600=1. 0. بعد ذلك ، تم طرد هذه الجراثيم GV3101 عند 6000 م و 28 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، تمت إزالة المادة الطافية السائلة وتم تخفيف الحبيبات الصلبة الموجودة في القاع إلى OD 600=0 .8 في وسط تحريض (10 ملي مولار MES ، درجة الحموضة 5.4 ، 10 ملي مولار MgCl ، 200 ميكرومتر أسيتوسيرنغون). تم تسريب هذا الخليط في الأوراق بواسطة حقنة بدون إبرة. لوحظت هذه الأوراق التي تم التعبير عنها بشكل عابر لموت الخلايا الشبيهة بالموارد البشرية ، أو تم جمع العينات لإجراء تجارب DAB وتجربة تلطيخ التريبان الأزرق ، ولعزل الحمض النووي الريبي لمزيد من التجارب.

4.9 استخراج الحمض النووي الريبي والكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR

تم استخدام طريقة كاشف TRIzol (Invitrogen) لاستخلاص الحمض النووي الريبي الكلي من عينات أوراق نباتات الفلفل المعالج ومن الشتلات الوهمية. بعد ذلك ، تم استخدام مجموعة Prime Script RT-PCR (TaKaRa ، داليان ، الصين) لعكس نسخ الحمض النووي الريبي المستخرج. تم إجراء تحليل qRT-PCR في الوقت الحقيقي لدراسة مستويات النسخ النسبية لجينات العلامة المستهدفة. تمت معالجة البيانات وفقًا للطرق الموصوفة سابقًا [45،82] ، باستخدام بادئات محددة (الجدول التكميلي S3) ، باستخدام تعليمات الشركة المصنعة لنظام Bio-Rad Real-time PCR (Bio-Rad ، Foster City ، CA ، USA) و نظام SYBR premix Ex Taq II (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. تقدير الموصلية الكهربائية

تم حساب الموصلية الكهربائية (التسرب الأيوني) باستخدام الطريقة الموصوفة سابقًا مع تغييرات طفيفة [44،83]. تم الحصول على ستة أقراص أوراق (عرض 4 مم) باستخدام مثقاب. تم غسل الأقراص ثلاث مرات باستخدام ddH2O المعقم واحتضانها على الفور إلى 10 مل من ddH O. بعد ذلك ، تم الاحتفاظ بأقراص الأوراق هذه في شاكر اهتزاز بلطف (60 دورة في الدقيقة) عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم استخدام مقياس الموصلية (Mettler Toledo 326 Mettler ، زيورخ ، سويسرا) لتسجيل البيانات حول التوصيل الكهربائي.

4.11. النشاف المناعي

تم استخدام إجراء موصوف سابقًا من محلول استخلاص البروتين لاستخراج البروتين من أوراق الفلفل [3]. تم تحضين البروتين المستخلص طوال الليل بمضادات HA agarose عند 4 درجات مئوية (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام الكراك المغناطيسي لجمع الحبيبات وغسلها ثلاث مرات بمحلول ملحي Tris buffer saline (TBS) وتوين 2 0 (0.05 بالمائة). لوحظ البروتين المخفف باستخدام النشاف المناعي ومضاد HA-peroxidase (Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة).

5. الاستنتاجات

في الختام ، نحن نرى أن CaWRKY30 ينشط بشكل نسخ مناعة الفلفل ضد RSI. أدى إسكات CaWRKY30 بواسطة VIGS إلى الحد من مناعة نباتات الفلفل ضد عدوى مسببات الأمراض البكتيرية ، في حين تسبب الإفراط في التعبير العابر لـ CaWRKY30 في مقاومة R. solanacearum. بشكل جماعي ، يعد تكوين حلقة ردود فعل إيجابية ووظيفتها بالتوازي مع TFs الأخرى دليلًا وافرًا على تنشيطها تحت الضغط الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح إنتاج نباتات الفلفل المعدلة وراثيًا المستقرة CaWRKY30 والبروتين المستهدف CaWRKY30 لتوضيح دور هذا الجين بشكل شامل ضد مسببات الأمراض البكتيرية وأيضًا في مسارات التمثيل الغذائي المختلفة.

الكاتب الاشتراكات:

وضع المفاهيم ، AH ، MIK ، MA ، BSA ، ZL و ATKZ ؛ تنظيم البيانات ، AH ، MIK و AME-S ؛ التحليل الرسمي ، ZL و SF ؛ الاستحواذ على التمويل ، AH ، MIK ، MAAA ، MA ، BSA ، AME-S. و ATKZ. إدارة المشروع ، AH و MIK ؛ الموارد ، آه ؛ التحقق من الصحة ، SM ؛ التصور ، SM و SF ؛ الكتابة - المسودة الأصلية ، AH و MIK ؛ الكتابة - المراجعة والتحرير ، IRN ، MAAA ، MA ، BSA ، AME-S. ، ZL ، SF و ATKZ لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل:

يلتزم المؤلف الرئيسي بشدة تجاه لجنة التعليم العالي في باكستان للحصول على مساعدة مالية لإنجاز هذه الدراسة بموجب منحة SRGP رقم {{0} / SRGP / HRD / HEC / 2020. تم تمويل العمل الحالي من قبل مشروع دعم الباحثين بجامعة الطائف رقم (TURSP2020 / 245) ، جامعة الطائف ، الطائف ، المملكة العربية السعودية. تم دعم الدراسة أيضًا من قبل مشروع صندوق التنمية التابع لجامعة فوجيان للزراعة والغابات (CXZX2018114 و CXZX2020008A و CXZX2019024G).

بيان مجلس المراجعة المؤسسية: لا ينطبق.

بيان الموافقة المستنيرة: لا ينطبق.

بيان توافر البيانات: جميع البيانات موجودة داخل المخطوطة والملفات التكميلية الخاصة بها

تضارب المصالح: يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

مراجع

1. عارف م. عطا ، س. بشير، ماجستير؛ خان ، ميشيغان ؛ حسين أ. شاه جهان ، م. الوهيبي ، MS ؛ Elshikh، MS تأثير توقيت تطبيق FosetylAluminium على قمع الكرنال والعوائد الاقتصادية لقمح الخبز (Triticum aestivum L.). بلوس وان 2021 ، 16 ، e0244931.

2. خلوفة أ. خان ، ميشيغان ؛ عارف م. حسين أ. الله ر. عرفان ، م. ماهبارا ، إس. شاه ، RU ؛ أنصاري ، إم جي ؛ Kintl، A. يعمل التنسيب العميق للأسمدة النيتروجينية على تحسين المحصول وكفاءة استخدام النيتروجين والعوائد الاقتصادية للأرز الناعم المزروع. بلوس وان 2021 ، 16 ، e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3 - نعمان ، أ. حسين أ. عدنان ، م. خان ، ميشيغان ؛ أشرف ، م. زينب م. خان ، كا ؛ غرامه ح. يوفر عامل النسخ CAPHL8 الجديد من MYB أدلة حول تطور مناعة الفلفل ضد مسببات الأمراض المنقولة عن طريق التربة. ميكروب. الممرض. 2019، 137، 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. حسين أ. نعمان ، أ. خان ، ميشيغان ؛ زينب م. عقيل ، م. أنور ، م. أشرف ، م. ليو ، زي. رضا ، أ. ماهبارا ، س. التنظيم الجزيئي للمناعة الفطرية للفلفل وتحمل الإجهاد: نظرة عامة على WRKY TFs. ميكروب. الممرض. 2019، 135، 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo، G .؛ أجوريو ، آد ؛ فيجنال ، إل. باتيستا غارسيا ، RA ؛ de León، IP يكشف التنميط النسخي عن استجابات دفاع النبات المحفوظة والخاصة بالأنواع أثناء تفاعل Physcomitrium patens مع Botrytis cinerea. مصنع مول. بيول. 2021 ، 1–21. [CrossRef]

6. أيرتس ، ن. مينديز ، عضو البرلمان ؛ van Wees، SC مستويات متعددة من الحديث المتبادل في شبكات الهرمونات التي تنظم دفاع النبات. مصنع ج. 2021 ، 105 ، 489-504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu، Z .؛ شي ، لام ؛ ونغ ، واي. زو ، ح. لي ، العاشر ؛ يانغ ، س. كيو ، إس. هوانغ ، إكس. هوانغ ، ياء ؛ يعمل حسين ، A. ChiIV3 كهدف جديد لـ WRKY40 للتوسط في مناعة الفلفل ضد عدوى Ralstonia solanacearum. مول. تفاعل جرثومة النبات. 2019 ، 32 ، 1121-1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq، MI؛ مقبول ، مم ؛ علياء.؛ فاروق س. خان ، س. صادق ، م. خان ، كا ؛ علي ، س. خان ، ميشيغان ؛ حسين ، أ. تحسين هندسة الزراعة لنظام الزراعة البينية بين الشعير والبرسيم المصري في مناخ شبه استوائي شبه جاف. بلوس وان 2020، 15، e0233171.

9. حسين أ. لي ، العاشر ؛ ونغ ، واي. ليو ، زي. أشرف ، م. نعمان ، أ. يانغ ، س. إفنان ، م. كيو ، إس. يعمل Yang ، Y. CaWRKY22 كمنظم إيجابي في استجابة الفلفل لـ Ralstonia solanacearum من خلال تشكيل شبكات مع CaWRKY6 و CaWRKY27 و CaWRKY40 و CaWRKY58. كثافة العمليات J. مول. علوم. 2018، 19، 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. مختار ، م. ليو ، العاشر ؛ Somssich ، IE توضيح دور WRKY27 في عقم الذكور في نبات الأرابيدوبسيس. إشارة النبات. Behav. 2018 ، 13 ، e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. خان ، ميشيغان ؛ تشانغ ، واي. ليو ، زي. هو ، ياء ؛ ليو ، سي. يانغ ، س. حسين أ. أشرف ، م. نعمان ، أ. يعمل Shen ، L. CaWRKY40b في الفلفل كمنظم سلبي استجابةً لـ Ralstonia solanacearum عن طريق تعديل جينات الدفاع مباشرةً بما في ذلك CaWRKY. كثافة العمليات J. مول. علوم. 2018، 19، 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. أولجيم ، ت. Somssich ، IE Networks of WRKY نسخ عوامل في إشارات الدفاع. بالعملة. رأي. مصنع بيول. 2007 ، 10 ، 366-371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi، M.؛ Oelmüller، R. WRKY عوامل النسخ: جاك للعديد من المهن في النباتات. إشارة النبات. Behav. 2014 ، 9 ، e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu، Y.-P .؛ شو ، ح. وانغ ، ب. سو ، X.-D. الهياكل البلورية لعوامل النسخ N-terminal WRKY ومجمعات الحمض النووي. خلية البروتين 2020 ، 11 ، 208-213. [CrossRef] [PubMed]

15. تشين ، العاشر ؛ لي ، سي. وانغ ، ح. عوامل النسخ Guo، Z. WRKY: التطور والربط والعمل. فيتوباثول. الدقة. 2019 ، 1 ، 13. [CrossRef]

16. شين ، إل. ليو ، زي. يانغ ، س. يانغ ، تي ؛ ليانغ ، ياء ؛ وين ، ياء ؛ ليو ، واي. لي ، ياء ؛ شي ، لام ؛ Tang، Q. Pepper CabZIP63 يعمل كمنظم إيجابي أثناء Ralstonia solanacearum أو تحدي ارتفاع درجة الحرارة والرطوبة العالية في حلقة ردود فعل إيجابية مع CaWRKY40. J. إكسب. بوت. 2016 ، 67 ، 2439-2451. [CrossRef] [PubMed]

17. شلوتنهوفر ، سي ؛ يوان ، ل. تنظيم الأيض المتخصص بواسطة عوامل النسخ WRKY. نبات فيزيول. 2015 ، 167 ، 295-306. [CrossRef] [PubMed]

18. جيانغ جيه. ما ، س. أنتم ، ن. جيانغ ، م. تساو ، ياء ؛ عوامل النسخ Zhang ، J. WRKY في استجابات النبات للضغوط. J. Integr. مصنع بيول. 2017 ، 59 ، 86 - 101. [CrossRef]

19. يو ، ك. بيترس ، سم ؛ باكر ، بنسلفانيا ؛ Berendsen ، RL الميكروبات المفيدة تحت الأرض لمناعة الجذور. بيئة الخلية النباتية. 2019 ، 42 ، 2860-2870. [CrossRef]

20. نعمان ، أ. ليو ، زي. يانغ ، س. شين ، إل. حسين أ. أشرف ، م. خان ، ميشيغان ؛ هو ، S. التعبير والتقييم الوظيفي لـ CaZNF830 أثناء استجابة الفلفل لـ Ralstonia solanacearum أو ارتفاع درجة الحرارة والرطوبة. ميكروب. الممرض. 2018 ، 118 ، 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. نعمان ، أ. حسين أ. أشرف ، م. خان ، ميشيغان ؛ ليو ، زي. تم استهداف He، S. CabZIP53 بواسطة CaWRKY40 ويعمل كمنظم إيجابي في الدفاع عن الفلفل ضد Ralstonia solanacearum والتحمل الحراري. بيئة. إكسب. بوت. 2019 ، 159 ، 138-148. [CrossRef]

22. Ashraf، MF؛ يانغ ، س. وو ، ر. وانغ ، واي. حسين أ. نعمان ، أ. خان ، ميشيغان ؛ ليو ، زي. كيو ، أ. غوان ، د. وآخرون. الفليفلة السنوية HsfB2a ينظم بشكل إيجابي الاستجابة لعدوى Ralstonia solanacearum أو درجة الحرارة العالية والرطوبة العالية التي تشكل سلسلة النسخ باستخدام CaWRKY6 و CaWRKY40. فيسيول الخلية النباتية. 2018 ، 59 ، 2608-2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang، L .؛ دوسة ، ك. أنت يا ياء ؛ تشانغ ، واي. جفن العين.؛ زو ، ر. يو ، ياء ؛ وي ، إكس. تشو ، العاشر ؛ جيانغ ، إس. وآخرون. يكشف تسلسل النسخ الزمني عالي الدقة عن ERF و WRKY كلاعبين رئيسيين في الشبكات التنظيمية الكامنة وراء استجابات السمسم للتشبع بالمياه والتعافي. علم الجينوم 2021 ، 113 ، 276-290. [CrossRef]

24. يانغ ، العاشر ؛ زو ، زي. فو ، م. هان ، م. ليو ، زي. تشو ، سي ؛ وانغ ، إل. زينج ، ياء ؛ لياو ، واي. تشانغ ، دبليو. وآخرون. تحديد النسخ على نطاق واسع لجينات عائلة WRKY وتنميط تعبيرها تجاه حمض الساليسيليك في كاميليا جابونيكا. إشارة النبات. Behav. 2021، 16، 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez، M.؛ بابار ، م. إقبال ، ياء ؛ حسنين ، م. عباس ، س. شاه ، س. أشرف ، م. في التحليل البنيوي والوظيفي لجينات Wrky1 و Wrky3 في محاصيل الحبوب المختارة. J. انيم. Plant Sci.-JAPS 2021، 31، 322–341.

26. Liu، Z.-Q .؛ ليو ، واي. شي ، ل.ب. يانغ ، س. شين ، إل. Yu ، H.-X. ؛ وانغ ، R.-Z. ؛ وين ، جي واي. تانغ ، س. حسين أ. وآخرون. مطلوب SGT1 في استجابة دفاع الفلفل التي يسببها PcINF1 / SRC 2-1- بالتفاعل مع SRC 2-1. علوم. ممثل عام 2016، 6، 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. سرينيفاسان ، ك. الأنشطة البيولوجية للفلفل الأحمر (الفليفلة الحولية) ومبدأه اللاذع الكابسيسين: مراجعة. كريت. القس علوم الغذاء. نوتر. 2016 ، 56 ، 1488-1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu، Z .؛ شي ، لام ؛ يانغ ، س. لين ، واي. ونغ ، واي. لي ، العاشر ؛ حسين أ. نعمان ، أ. هو ، S. التحليل الوظيفي والمحفز لـ ChiIV3 ، وهو Chitinase من نبات الفلفل ، استجابة لعدوى Phytophthora capsici. كثافة العمليات J. مول. علوم. 2017 ، 18 ، 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. علي م. لو ، D.-X. ؛ خان ، أ. حق ، سو ؛ جاي ، دبليو إكس. تشانغ ، H.-X. ؛ تشنغ ، G.-X. ؛ محمد أنا. جونج ، Z.-H. التصنيف والتحليل على نطاق الجينوم لعائلة الجينات البروتينات الرابطة للكيتين في الفلفل (الفليفلة الحولية L.) وتنظيم النسخ إلى Phytophthora capsici ، الإجهاد اللاأحيائي ، والتطبيقات الهرمونية. كثافة العمليات J. مول. علوم. 2018، 19، 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. نعمان ، أ. ليو ، زي. عقيل ، م. زينب م. خان ، ميشيغان ؛ حسين أ. أشرف ، م. لي ، العاشر ؛ ونغ ، واي. هو ، س. عوامل نسخ مجال سحاب leucine الأساسية: الطلائع في مناعة النبات. التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة. 2017 ، 39 ، 1779-1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com