خلاصة:تم الإبلاغ عن أن جذور Vitis amurensis لديها القدرة على تبييض الجلد من خلال تقييم تكوين الميلانين والأنشطة المثبطة للتيروزيناز. في هذه الدراسة ، تم استخدام جذور V. amurensis لتحديد مكونات التبييض بسرعة باستخدام LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزيناز ، ولتحسين عملية الاستخراج لاستخدامها كمواد وظيفية لتبييض الجلد من خلال منهجية سطح الاستجابة. أظهرت النتائج أن جذور V. amurensis أظهرت تأثيرات مثبطة للتيروزيناز بواسطة اثنين من أوليغومرات stilbene ، ε-vinifera (1) وفيتامين B (2) ، كما تنبأ LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة الحيوية. تم تحديد ظروف الاستخلاص المثلى (تركيز الميثانول 66 في المائة ، حجم المذيب 140 مل ، ووقت الاستخلاص 100 دقيقة) لمكونات تبييض البشرة بعائد 6.20 في المائة ، وكان النشاط المثبط للتيروزيناز 87.27 في المائة. تم تأكيد العلاقة بين كل عامل والاستجابة المقابلة له من خلال تحليل ارتباط بيرسون. أظهر حجم المذيب علاقة خطية واضحة مع المحصول ، وكان لتركيز الميثانول علاقة خطية قوية مع النشاط المثبط للتيروزيناز للمركبين 1 و 2 ، وكذلك تركيبة كل منهما. بشكل عام ، ثبت أن LC-Q-TOF-MS مقترنًا بالمقايسة الحيوية لديه القدرة على العثور بفعالية على مكونات نشطة جديدة ، بالإضافة إلى المكونات النشطة المعروفة ؛ يمكن اقتراح الفيتامينات كعامل تبييض طبيعي جديد.

وفقًا للدراسات ذات الصلة ،سيستانشهو عشب شائع يعرف باسم "عشب معجزة يطيل الحياة". مكونه الرئيسي هوالسيستانوسيد، والتي لها تأثيرات مختلفة مثلمضادات الأكسدة, مضاد التهاب، وتعزيز وظيفة المناعة. الآلية بين cistanche وتفتيح البشرةيكمن في التأثير المضاد للأكسدة من cistancheجليكوسيدات. ينتج الميلانين في جلد الإنسان عن طريق أكسدة التيروزين المحفزالتيروزيناز، ويتطلب تفاعل الأكسدة مشاركة الأكسجين ، لذلك تصبح الجذور الخالية من الأكسجين في الجسم عاملاً مهمًا يؤثر على إنتاج الميلانين. يحتوي سيستانشالسيستانوسيد، وهو أحد مضادات الأكسدة ويمكن أن يقلل من توليد الجذور الحرة في الجسم ، وبالتالي يمنع إنتاج الميلانين.

انقر فوق قائمة بيع بالقرب مني

لمزيد من المعلومات:

david.deng@wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501

الكلمات الدالة:فيتيس أمورينسيس LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزيناز ؛ منهجية استجابة السطح؛ ارتباط بيرسون

1 المقدمة

الميلانين مسؤول عن لون جلد وشعر الثدييات ويحمي الجلد من الأشعة فوق البنفسجية ، لكن إنتاج الميلانين المفرط وتراكم الميلانين في الجلد يسبب اضطرابات الجلد المفرطة التصبغ مثل النمش والكلف والبقع العمرية والإيفيليد ونبات الشيخوخة. يلعب التيروزيناز ، المعروف باسم إنزيم أوكسيديز المحتوي على النحاس ، دورًا مهمًا في تخليق الميلانين الحيوي. حفز الإنزيم تفاعلي أكسدة متتاليين: الخطوة الأولى ، هيدروكسيل L-tyrosine إلى 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي-إل-فينيل ألانين (L-DOPA) ، والخطوة الثانية ، أكسدة L-DOPA إلى دوباكينون. الدوباكينون مادة شديدة التفاعل يمكنها أن تتبلمر تلقائيًا لتنتج الميلانين [1-3]. ومن ثم ، يمكن استخدام مثبطات التيروزيناز كعلاج لاضطرابات الجلد المرتبطة بفرط التصبغ وكعوامل لتبييض البشرة.

يتم توزيع Vitis amurensis ، وهو نوع من العنب البري ، بشكل أساسي في آسيا (كوريا والصين واليابان). تستهلك الثمار الناضجة نيئة وتحتوي على عناصر غذائية وفيرة مثل السكروز والجلوكوز والبروتين والفيتامينات ، لذا فهي تستخدم كمواد للنبيذ والعصير والهلام والمربى. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام أوراقها في السلطة [4]. تم استخدام جذوره وسيقانه كدواء تقليدي لعلاج السرطان والألم العصبي وآلام البطن [5،6]. تتكون جذورها من stilbenes (مكون رئيسي) ، procyanidins ، الفلافونويد ، triterpenoids ، وغيرها من المركبات الفينولية. حتى الآن ، تمت دراسة التركيبات الكيميائية للجذر بتفصيل كافٍ. على وجه الخصوص ، تم الإبلاغ عن العديد من أوليغومرات الستيلبين ، بما في ذلك ريسفيراترول وأمورينسين أ وفيتامين أ (زائد) -ε-vinifera و amurensins C-M و ​​ampelopsin A و D و ampelopsin E ، [6]. يُظهر المستخلص الميثانولي للجذر تأثيرًا مضادًا للميلانين ضد تكوين الميلانين الذي يسببه الهرمون في خلايا B16F10 وفي 3 ، 4- أكسدة ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA) عبر تيروسيناز الفطر [7]. بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر مستخلصات ضمة امورينسيس ومركباتها النشطة تأثيرات مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات وقائية للأعصاب ومضادة للأورام [7-10].

يمكن لـ LC-MS جنبًا إلى جنب مع اختبار حيوي تأكيد المظهر الكيميائي والنشاط البيولوجي للمكونات في المنتجات الطبيعية في وقت واحد دون الحاجة إلى الاستخراج والعزل. لذلك ، تم استخدامه مؤخرًا لتحديد المركبات النشطة بيولوجيًا بكفاءة وسرعة في المنتجات الطبيعية [11-13].

التحسين هو عملية تسمح بأقصى كفاءة للأنظمة أو المنتجات التجريبية. منهجية سطح الاستجابة (RSM) ، التحليل متعدد المتغيرات ، تصميم التجارب باستخدام التقنيات الرياضية والإحصائية القائمة على النماذج التجريبية ، والتعبير عن الارتباط بين التصميم التجريبي والنتائج كدالة متعددة الحدود ، هي بعض التقنيات التي توفر ظروف تحسين مثالية بأقصى قدر من الكفاءة. RSM هي طريقة تحسين دقيقة وفعالة تستخدم على نطاق واسع في مختلف المجالات ، بما في ذلك معالجة الأغذية والكيمياء والبيولوجيا والزراعة [14-16]. على مدى العقود الماضية ، ازداد الاهتمام بالأدوية ومستحضرات التجميل والأغذية الوظيفية التي تحتوي على منتجات طبيعية ؛ وبالتالي ، هناك بحث مستمر في كل من الأوساط الأكاديمية والصناعية بهدف تطوير مثل هذه المنتجات [17 ، 18]. تتضمن الخطوة الأولى في هذه الدراسات استخراج المكون النشط بيولوجيًا من المنتجات الطبيعية. في هذا الوقت ، نظرًا لأن العديد من العوامل مثل وقت الاستخلاص ودرجة الحرارة ونسبة السائل والصلب وحجم المذيب قد أثرت على المكونات المستخرجة ، يلزم إجراء تحسين لاستخراج المكونات النشطة بيولوجيًا إلى الحد الأقصى.

على حد علمنا ، نادرًا ما تم الإبلاغ عن المكونات المثبطة للتيروزيناز وتحسين مستخلصات جذور ضمة الأمورينز [5،19]. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى الحصول بسرعة على مثبط التيروزيناز من جذور V. amurensis باستخدام LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزيناز ولتحسين ظروف الاستخراج لتوسيع استخدام جذور V. amurensis كعامل تبييض للجلد بواسطة RSM.

2. النتائج والمناقشة

2.1. LC-QTOF MS مقترنًا بمقايسة مثبطة للتيروزيناز باستخدام مستخلص الجذر من V. amurensis

أظهر مستخلص MeOH بنسبة 8 0 بالمائة من جذر V. amurensis نشاطًا مثبطًا لإنزيم التيروزيناز مهمًا (80.7 ± 0.8 بالمائة عند 50 ميكروغرام / مل ، الجدول S1). لتحديد المركبات المثبطة للتيروزيناز في جذر V. amurensis بدون عزل ، تم إجراء LC-QTOF-MS مقترنًا بمقايسة مثبطة للتيروزيناز. تم الحصول على الملف الكيميائي لمستخلص جذر V. amurensis في الجولة الأولى (الشكل S1) ، وتم تحديد المركبات النشطة بيولوجيًا باستخدام مقايسة مثبطة للتيروزيناز للكسور التي تم جمعها كل 30 ثانية من التشغيل الثاني (الشكل 1). كان هناك ذروتان بين 19 و 22 دقيقة على مخطط كروماتوجرام الكتلة الذي يُتوقع أن يكون لهما نشاط مثبط للتيروزيناز مهم ، وتم تحديد هياكلهما على أنه ثنائي ستيلبين (1) ورباعي ستيلبين (2) باستخدام التنميط الكيميائي (الجدول 1).

2.2. تحديد مكونات التيروزينيز المثبطة لجذر V. amurensis

أولاً ، تم عزل مكونين من المتوقع أن يكون لهما نشاط مثبط للتيروزيناز من جزء EtOAc ، وتم تقييم نشاطهما الحيوي. تم تحديد هياكل المركبات المعزولة 1 و 2 على أنها ε-vinifera (1) [20،21] وفيتامين B (-vinifera ، 2) [21-23] ، على التوالي ، باستخدام 1H-NMR و 13 C-NMR و ESI-MS (الشكل 2 ، الأشكال S2 و S3 ، والجدول S2). في المقايسة المثبطة للتيروزيناز ، كانت قيم IC للمركبات 1 و 2 وحمض الكوجيك 3.51 و 10.74 و 27.09 ميكرومتر على التوالي. أظهر كلا المركبين تأثيرات مثبطة للتيروزيناز أعلى من عنصر التحكم الإيجابي ، حمض الكوجيك وهو مكون تبييض الجلد المعروف (الجدول 1 والشكل S4). في الدراسات السابقة ، تم الإبلاغ عن أن ε-vinifera (1) لها نشاط مثبط للتيروزيناز [23] ؛ ومع ذلك ، تم تحديد فيتامين ب (2) لأول مرة في دراستنا.

بشكل عام ، تظهر النتائج ، المرتبطة بالبيانات المتوقعة لـ LC-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزيناز وفيتامين ب (2) ، إمكانية استخدام مثبط جديد للتيروزيناز. علاوة على ذلك ، أجريت دراسات الالتحام الجزيئي لدعم نتيجة النشاط التثبيطي الكبير للتيروزيناز لاثنين من أوليغومرات الستيلبين. كما هو مبين في الجدول 1 ، أظهرت المركبات 1 و 2 درجة إرساء أعلى من عنصر التحكم الإيجابي ، حمض كوجيك ، بما يتوافق مع بياناتنا التجريبية. ومع ذلك ، كانت نتائج الالتحام للمركبات تتعارض مع نتائجنا التجريبية. تم وصف أنماط التفاعل للمركبين 1 و 2 في الشكل 3. شكل المركب 1 4 روابط هيدروجينية ، وتفاعلان مسعوران ، وتفاعل زوج واحد بي وحيد ، وشكل المركب 2 11 رابطة هيدروجينية ، و 7 تفاعلات كارهة للماء ، وتفاعل فان دير فالس ، و 3 تفاعلات ثنائية ثنائية. نتيجة لذلك ، تم التأكيد على أنه يمكن إدخال المركبات في الموقع النشط للبروتين المستهدف والارتباط ببقايا الأحماض الأمينية المحفزة التي يمكن أن تمنع نشاط التيروزيناز. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن ε-vinifera (1) كمثبط تنافسي يرتبط بنفس الموقع الذي يرتبط L-DOPA بالتيروزيناز [23]. لوحظ أن فيتامين ب (2) يرتبط بنفس موقع بيتا فينيفيرا (1) ، مما أكد أن فيتامين ب (2) هو مثبط تنافسي جديد.

2.3 تحسين استخراج جذر V. amurensis باستخدام RSM

للاستفادة من جذور V. amurensis كمواد وظيفية لتبييض البشرة ، تم تصميم ظروف الاستخراج المثلى بواسطة Box-Behnken design (BBD) لزيادة إنتاجية الاستخلاص والنشاط المثبط للتيروزيناز. تأثيرات الاستجابات المستقلة مثل إنتاجية الاستخلاص ، والنشاط المثبط للتيروزيناز ، وكمية المركب 1 ، وكمية المركب 2 ، وكمية مجموع المركبين 1 و 2 ، على المتغيرات الثلاثة المستقلة (وقت الاستخراج ، تركيز MeOH / الماء ، و حجم المذيب) ، (الجدول 2). تم تعيين نطاق المتغيرات كوقت الاستخراج (4 0 و 70 و 1 00 دقيقة) وتركيز MeOH (40 و 70 و 1 00 بالمائة) وحجم المذيب ( 35 و 87.5 و 140 مل) بناءً على تجربة أولية لعامل واحد (البيانات غير معروضة). تم التعبير عن القيم التي تم الحصول عليها من التجارب المصممة ككثيرات حدود للارتباطات بين المتغيرات باستخدام تحليل الانحدار (الجداول S4-S13 والشكل S5). نتيجة لأداء التحسين الفردي لكل تفاعل (الجدول 3) ، كان من المتوقع أن يمثل العائد 6.21 بالمائة عند الاستخراج بـ 1 00. 00 دقيقة ، MeOH 64.78 بالمائة ، 140. {{42} } مل. تم استخراج النشاط المثبط للتيروزيناز (بالمائة) مع 65.22 دقيقة ، MeOH 1 00. 00 بالمائة ، 140. 00 مل ظروف ، وكان من المتوقع أن تظهر قيمة 90.37 بالمائة. كمية المركب 1 عند 65.74 دقيقة ، MeOH 1 00. 00 بالمائة ، 35.00 مل تم توقعه على أنه 37.45 ميكروغرام / مجم ، وكمية المركب 2 عند 70.00 دقيقة ، MeOH 70.00 بالمائة ، 92.24 تم توقع أن يكون مل على أنه 86. 77 ميكروغرام / مجم. بالإضافة إلى ذلك ، كان من المتوقع أن تظهر المحتويات الإجمالية للمركبين 1 و 2 قيمة قصوى تبلغ 108.10 ميكروغرام / مجم عند استخلاصها في ظل ظروف 75.20 دقيقة ، MeOH 100.00 بالمائة ، و 35.00 مل. أسفرت التجارب المستندة إلى الظروف المُحسَّنة عن 6.19 ± 0.36 بالمائة ، ونشاط تثبيط التيروزيناز 91.72 ± 3.48 بالمائة ، ومحتوى المركب 1 36.54 ± 1.78 ميكروجرام / مجم ، ومحتوى المركب 2 85.74 ± 16.57 ميكروجرام / مجم ، ومجموع المركبات 1 و {{85} } تم الحصول على 10 ± 19.11 ميكروغرام / مجم ، وأظهرت الاستجابات الفردية لكل متغير اختلافًا بنسبة 5 بالمائة أو أقل عن القيم المتوقعة نظريًا. تم إجراء تحسين الاستجابة المتعددة لتعظيم إنتاجية الاستخراج والنشاط المثبط للتيروزيناز (الجدول 3). كانت الظروف المثلى كما يلي: وقت الاستخراج ، 100 دقيقة ؛ تركيز MeOH ، 66.38 في المائة ؛ وحجم المذيب ، 140 مل. باستخدام هذه الشروط ، تم تحديد الناتج ليكون 5.95 ± 1.13 في المائة وكان النشاط المثبط للتيروزيناز 85.93 ± 1.57 في المائة ؛ كانت هذه القيم مماثلة للقيم المتوقعة ، 6.20 و 87.25 في المائة على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل العلاقة بين كل متغير والاستجابة المقابلة باستخدام ارتباط بيرسون (الجدول 4). أظهر إنتاجية الاستخراج علاقة خطية واضحة بين وقت الاستخراج وتركيز MeOH وعلاقة خطية سالبة مع كمية المركب 1. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر النشاط المثبط للتيروزيناز علاقة خطية قوية بين كمية المركب 2 وكمية المجموع. للمركبين 1 و 2 وعلاقة خطية واضحة مع المركب 1. لذلك ، كان النشاط المثبط للتيروزينيز لجذر V. amurensis متناسبًا مع كلا المركبين 1 و 2 ولكنه أظهر علاقة خطية أقوى مع كمية المركب 2 من المركب 1.

3. المواد والطرق

3.1. الإجراءات التجريبية العامة

تم إجراء تحليل كروماتوجرافي سائل متوسط ​​الضغط (MPLC) باستخدام Biotage Isolera (Biotage AB ، Uppsala ، السويد). نظام واحد مجهز بمضخة كروماتوغرافيا فلاش عالية الأداء (HPFC) ، وكاشف متغير مزدوج الطول الموجي ، وجامع. تم الحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي باستخدام مطياف بروكر SPECTROSPIN 300 ميجاهرتز (شركة بروكر ، بيليريكا ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء Methanol-d4 ، وهو مذيب NMR ، من Cambridge Isotope Laboratories، Inc. تم شراء Acetonitrile (ACN) والماء والميثانول (MeOH) من الدرجة اللونية من ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (سيول ، جمهورية كوريا). تم شراء L-tyrosine و mushroom tyrosinase و kojic acid و formic acid من شركة Sigma-Aldrich Co (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).

3.2 المواد النباتية

تم الحصول على جذر V. amurensis من Gyeongbuk ، كوريا ، وتم شراؤه أيضًا من Omniherb (دايجو ، جمهورية كوريا). تم التعرف عليهم من قبل البروفيسور كي يونغ لي ، من كلية الصيدلة في جامعة كوريا. تم إيداع عينة قسيمة (KUP-HD071) في مختبر العقاقير ، كلية الصيدلة ، جامعة كوريا.

3.3 قياس الطيف الكتلي LC-Q-TOF

تم إجراء LC باستخدام سلسلة Agilent 126 0 (Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تشتمل على مضخة ثنائية ، ومزيل غازات عبر الإنترنت ، وجهاز أخذ عينات آلي ، ومقصورة عمود يتم التحكم فيها حرارياً ، وكاشف صفيف ثنائي ضوئي. تم إجراء الفصل الكروماتوغرافي باستخدام عمود Shiseido CapCell PAK C18 (5 ميكرومتر ، 4.6 مم ، ID × 15 0 نانومتر). يتكون الطور المتحرك من الماء (المذيب أ) و ACN (المذيب ب) ، وكلاهما يحتوي على 0 .1٪ حمض الفورميك. كانت ظروف التدرج على النحو التالي: 0 - 5 دقائق ، 10 بالمائة ب ، 5-30 دقيقة ، وزيادة خطية ب من 10 إلى 90 بالمائة. تم ضبط معدل الزميل على 0.6 مل / دقيقة ؛ تم حقن 5 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من العينات لتحليل LC-Q-TOF-MS و LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزيناز ، على التوالي. تم إجراء قياس الطيف الكتلي باستخدام مطياف الكتلة Agilent 6530 Q-TOF (Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع واجهة تأين بالرش الكهربائي (ESI) في الوضع السلبي. تم جمع بيانات الكتلة من m / z 50–1 00 0 في وضع النقطه الوسطى. كانت معلمات الكتلة كما يلي: الجهد الشعري ، 4000 فولت ؛ ضغط البخاخات ، 40 رطل / بوصة مربعة ؛ جهد الشظية ، 175 فولت ؛ جهد الكاشطة ، 65 فولت ؛ درجة حرارة غاز التجفيف ، 325 درجة مئوية ؛ معدل زميل من غاز التجفيف ، 12.0 لتر / دقيقة ؛ طاقة الاصطدام 10 و 20 و 30 و 40 فولت. تم إجراء ضبط معلمة الاستحواذ ومعالجة البيانات باستخدام LC-MS / MS Data Acquisition باستخدام 6530 series Q-TOF (الإصدار B.05.00) (برنامج MassHunter Workstation ، Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

3.4. LC-Q-TOF-MS مقترنًا بمقايسة التيروزيناز المثبطة

تم إجراء LC-Q-TOF-MS مقترنًا بمقايسة مثبطة للتيروزيناز باستخدام الطريقة المحددة في الدراسة السابقة [24]. باختصار ، استمر الفحص على مرحلتين. في الجولة الأولى ، تم الحصول على الملف الكيميائي للعينة باستخدام LC-Q-TOF-MS. في التشغيل التالي ، تم جمع الشطف بعد المرور عبر نظام LC وفقًا لشروط LC-Q-TOF المحددة في 96- لوحات بئر كل 30 ثانية. تم تقييم النشاط المثبط للتيروزيناز للكسور التي تم جمعها باستخدام مقايسة مثبطة للتيروزيناز.

3.5 عزل المركبات المثبطة للتيروزيناز من جذر V. amurensis

لعزل المركبات المثبطة للتيروزيناز التي تم تحديدها باستخدام LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة المثبطة للتيروزينيز ، تم استخراج جذر V. amurensis (3. 0 1 كجم) ثلاث مرات بنسبة 8 0 في المائة MeOH لمدة 6 0 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام ultrasonication. تم ترشيح المذيب المستخلص وتركيزه للحصول على مستخلص خام (215.7 جم) ، والذي تم تعليقه في الماء وتم تقسيمه بالتتابع باستخدام n-hexane و ethyl acetate (EtOAc) و n-BuOH. تعرض جزء EtOAc (25.85 جم) لعمود كروماتوجراف على هلام السيليكا باستخدام n-hexane: EtOAc تحت ظروف التدرج (2 0: 1 → 0: 1) لإنتاج سبعة كسور (E1 – E7). تم فصل الجزء E4 باستخدام MPLC و 100 جم SNAP KP-Sil ، خرطوشة هلام السيليكا ، وثنائي كلورو ميثان: MeOH تحت ظروف التدرج (97: 3 → 0: 100) لإنتاج سبعة كسور فرعية (E4–1 إلى E4–7) . تم الحصول على المركب 2 (417.0 مجم) من E4-5. تمت إعادة رسم كروماتوجراف الجزء الفرعي E4-4 على MPLC باستخدام SNAP 25 جم Ultra ، خرطوشة هلام السيليكا ، وكلوروفورم: MeOH: H2O تحت ظروف التدرج (50: 4: 1 → 15: 4: 1) لإنتاج سبعة كسور ( E4–4–1 إلى E4–4–7). تم الحصول على المركب 1 (396.0 مجم) من E4–4-5 ، والذي لوحظ كنقطة واحدة على لوحة كروماتوجرافيا طبقة رقيقة (TLC).

3.6 المقايسة المثبطة للتيروزيناز

تم تقييم النشاط المثبط للتيروزيناز باستخدام طريقة موصوفة سابقًا مع تعديل طفيف [25]. تمت معالجة الميكرولتر من العينة و 5 0 ميكرولتر من 0. 1 U / ميكرولتر من فطر التيروزيناز في 96- أطباق جيدة وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية. بعد 15 دقيقة ، تمت إضافة 5 0 ميكرولتر من 1 ملي مولار من L- التيروزين ثم تفاعلت عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم قياس كمية الدوباكروم المتكونة عند 495 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة Spectra Max 19 {{2 0} (الأجهزة الجزيئية ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب النشاط المثبط للتيروزيناز باستخدام المعادلة التالية: تثبيط التيروزيناز (النسبة المئوية)=[1 - (S - S0) / (C - C0)] × 100 ، حيث S هو امتصاص العينة ، والتيروزيناز ، و L - التيروزين. S0 هو امتصاص العينة و L-tyrosine ؛ C هو امتصاص التيروزيناز و L- التيروزين ، و C0 هو امتصاص L-tyrosine. تم استخدام حمض كوجيك ، وهو مثبط معروف للتيروزيناز ، كعنصر تحكم إيجابي. تم حساب قيم IC50 باستخدام GraphPad Prism 6 (GraphPad Software، Inc.، La Jolla، CA، USA).

3.7 دراسات الالتحام الجزيئي

تم إجراء الإرساء الجزيئي باستخدام برنامج SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd. ، St. تمت إزالة جميع جزيئات الماء من البروتين المستهدف ، وأجري تحضير الترابط بواسطة بروتوكول تحضير "التطهير" في SYBYL-X 2.1.1. تم حساب تقارب البروتين - الترابط بواسطة مجال قوة Tripos وتم التعبير عنه على أنه مجموع الدرجات. تم تصور الوضع الراسخ للرابط من مجمع بروتين-يجند في برنامج Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

3.8 التصميم التجريبي والتحليل الإحصائي

تم إنشاء حالة محسّنة لاستخراج المكونات بأقصى نشاط مثبط للتيروزيناز من جذر V. amurensis باستخدام BBD مع ثلاثة متغيرات وثلاثة مستويات (MINITAB Release 14.12. 0 Statistical Software). بناءً على النتائج الأولية لتجربة العامل الفردي ، تم اختيار المتغيرات المستقلة بما في ذلك وقت الاستخراج (X1) ، MeOH وتركيز الماء (X2) ، وحجم السائل (X3) ، ومجموعة من المتغيرات الخاصة بهم (الجدول S3). تم ترميز متغيرات RSM باستخدام ثلاثة مستويات ، −1 و 0 و 1. بشكل عام ، تم تصميم 15 تجربة بما في ذلك 3 مكررات في مركز التصميم (الجدول 2). كاستجابات مستقلة ، تم قياس العائد (النسبة المئوية) والنشاط المثبط للتيروزيناز (النسبة المئوية) وكمية المركب (1) (ميكروغرام / مجم) وكمية المركب (2) (ميكروغرام / مجم). تم تقييم النشاط المثبط للتيروزيناز للمستخلص بتركيز 50 ميكروغرام / مل. يتم التعبير عن كل إجابة باستخدام المعادلة متعددة الحدود التالية من الدرجة الثانية:

حيث تشير R إلى الاستجابة ؛ 1 و 2 و 3 هي المعاملات الخطية ؛ 12 و 23 و 13 هي معاملات التفاعل بين ثلاثة متغيرات ؛ و 11 و 22 و 33 هي المعاملات التربيعية.
علاوة على ذلك ، تم إجراء تحليل ارتباط بيرسون لتحديد وجود علاقة خطية بين كل متغير واستجابة. معامل ارتباط بيرسون له علاقة خطية قوية بين {{0}. 7 و 1. 0 ، علاقة خطية واضحة بين 0. 3 و 0. 7 ، علاقة خطية ضعيفة بين {{1 0}. 1 و 0. 3 ، وليس هناك علاقة خطية أو علاقة خطية مهملة بين 0. 0 و 0.1. يتم التعبير عن الارتباط الإيجابي والسلبي اعتمادًا على ما إذا كان معامل ارتباط بيرسون موجبًا أم سلبيًا.

3.9 التحليل الكمي للمركبات المثبطة للتيروزيناز 1 و 2

تم قياس كمية كل مركب 1 و 2 في المستخلصات التي تم الحصول عليها باستخدام الشروط التجريبية المصممة 15 باستخدام منحنيات المعايرة (الجدول 2). تم تحديد منحنيات المعايرة للمركبين 1 و 2 باستخدام المنطقة الواقعة تحت منحنى كروماتوجرام الأشعة فوق البنفسجية (33 0 نانومتر مكتسبة بتركيزات 0.1-1000 ميكروغرام / مل و 7.81-1000 ميكروغرام / مل ، على التوالي). تم إجراء LC باستخدام نظام Waters 2695 LC (ووترز ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) بنفس شروط نظام LC المفصل في المواد والطرق ، قياس الطيف الكتلي LC-Q-TOF.

4 - نتائج

تم وصف ε-Viniferin (1) وفيتامين B (2) من جذور V. amurensis كمكونات لتبييض الجلد باستخدام LC-Q-TOF-MS مقترنًا بمقايسة مثبطة للتيروزينات. على وجه الخصوص ، تم تحديد فيتامين ب (2) لأول مرة كمركب مثبط للتيروزيناز في هذه الدراسة وأظهر ε-vinifera (1) وفيتامين B (2) تأثيرات مثبطة للتيروزيناز أعلى من التحكم الإيجابي ، حمض الكوجيك. تم تحديد ظروف التحسين مع أقصى تأثير مثبط للتيروزيناز وحاصل جذور V. amurensis باستخدام وقت الاستخراج (100 دقيقة) وتركيز MeOH (66.38 بالمائة) وحجم السائل (140 مل). أظهرت النتيجة تطابقًا جيدًا بين القيم التجريبية والقيم المتوقعة. وبالتالي ، أثبت LC-Q-TOF-MS إلى جانب المقايسة الحيوية إمكانية العثور بفعالية على مكونات نشطة جديدة ، بالإضافة إلى المكونات النشطة المعروفة ، فيتامين ب (2) ، والتي يمكن اقتراحها كعامل تبييض طبيعي جديد.

المواد التكميلية: ما يلي متاح على الإنترنت ، الشكل S1: مخطط كروماتوجرام MS في وضع التأين السلبي (A) ؛ مخطط كروماتوجرافي للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (ب) من مقتطفات من جذور V. amurensis ، الشكل S2: أطياف 1H-و 13C-NMR للمركب 1 (300 و 75 ميجاهرتز ، CD3OD) ، الشكل S3: أطياف المركب 1H-و 13C-NMR 2 (300 و 75 ميجاهرتز ، CD3OD) ، الشكل S4: المؤامرة السينية و IC50 للتحكم الإيجابي ، المركبان 1 و 2 ، الشكل S5: استجابة السطح والمخططات الكنتورية التي توضح تأثير معلمات الاستخراج (X1: وقت الاستخراج ، دقيقة ؛ X2: تركيز MeOH ، النسبة المئوية ؛ X3: حجم المذيب ، مل). (أ) العائد. (ب) النشاط المثبط للتيروزيناز ؛ (ج) المركب 1 ؛ (د) المركب 2. (هـ) مجموع المركبين 1 و 2 ، الجدول S1. النشاط المثبط للتيروزيناز لمستخلصات جذور V. amurensis ، الجدول S2: بيانات 1H- و 13C NMR للمركبات 1 و 2 في CD3OD (δ في جزء في المليون) ، الجدول S3: المتغيرات والمستويات المستقلة لمنهجية سطح الاستجابة ، الجدول S4: الانحدار المقدر معامل العائد ، الجدول S5: تحليل التباين في العائد ، الجدول S6: معامل الانحدار المقدر للنشاط المثبط للتيروزيناز ، الجدول S7: تحليل التباين للنشاط المثبط للتيروزينيز ، الجدول S8: معامل الانحدار المقدر للمركب 1 ، الجدول S9: تحليل التباين للمركب 1 ، الجدول S10: معامل الانحدار المقدر للمركب 2 ، الجدول S11. تحليل التباين للمركب 2 ، الجدول S12: معامل الانحدار المقدر لمجموع المركبات 1 و 2 ، الجدول S13: تحليل التباين لمجموع المركبات 1 و 2.
الكاتب الاشتراكات: وضع المفاهيم ، KYL ؛ المنهجية ، K.-EO ، HS ، و KYL ؛ البرمجيات ، K.-EO ، و HS ؛ التحقق من الصحة ، HS ؛ التحليل الرسمي ، K.-EO ، و HS ؛ التحقيق ، K.-EO ، HS ، MKL ، و KYL ؛ تنظيم البيانات ، K.-EO ، HS ، BP ، و KYL ؛ الكتابة - إعداد المسودة الأصلية ، K.-EO ، و HS ؛ الكتابة - المراجعة والتحرير ، HS و MKL و BP و KYL ؛ الإشراف و MKL و BP و KYL قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.
التمويل: تم دعم هذا البحث من خلال منحة مؤسسة الأبحاث الوطنية الكورية الممولة من الحكومة الكورية (NRF -2017 R1A2B4003403 و NRF -2019 R1A6A1A03031807) ومنحة من مشروع البحث والتطوير في كوريا لتكنولوجيا الصحة من خلال تطوير صناعة الصحة الكورية معهد (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (HF20C0038).
بيان توفر البيانات: البيانات المقدمة في هذه الدراسة متوفرة في المواد التكميلية.
تضارب المصالح:الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
توفر العينة: غير متاح

مراجع

1 - رنجبار ، س. Shahvaran، PS؛ إدراكي ، ن. Khoshneviszadeh، M. ؛ درودي ، م. صراففي ، واي. Hamzehloueian، M.؛ Khoshneviszadeh، M. 1، 2، 3- benzylidene (thio) barbiturates المرتبط بالتريازول 5- كمثبطات جديدة للتيروزيناز وكاسحات للجذور الحرة. قوس. فارم. 2020، 353، 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang، T.-S .؛ دينغ ، H.-Y. ؛ لين ، هـ. تحديد 6 ، 7 ، 40 - ثلاثي هيدروكسي أيزوفلافون كمثبط فعال لإنزيم التيروزيناز. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 2005 ، 69 ، 1999-2001. [CrossRef] [PubMed]

3 - ميازاوا ، م. أوشيما ، تي. كوشيو ، ك. إتسوزاكي ، واي. Anzai، J. Tyrosinase inhibitor من نخالة الأرز الأسود. J. أجريك. الغذاء تشيم. 2003 ، 51 ، 6953-6956. [CrossRef]

4. تشين ، س. دياو ، إل. سونغ ، ح. Zhu، X. Vitis amurensis Rupr: مراجعة للكيمياء وعلم العقاقير. طب النبات 2018، 49، 111-122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin، K.-S .؛ أوه ، YN ؛ هيون ، SK ؛ كوون ، هجرية ؛ Kim، BW Betulinic acid المعزول من جذر Vitis amurensis يثبط 3- isobutyl -1- methylxanthine الناجم عن تكوين الميلانين عن طريق تنظيم مسارات MEK / ERK و PI3K / Akt في خلايا B16F10. الغذاء تشيم. توكسيكول. 2014 ، 68 ، 38-43. [CrossRef]

6. كيم ، هـ. ثونج ، بى تى ؛ نجوك ، TM ؛ لي أنا. هونغ ، إن دي ؛ Bae ، K. النشاط المثبط للأكسدة و lipoxygenase من oligostilbenes من أوراق وساق Vitis amurensis. ياء إثنوفارماكول. 2009 ، 125 ، 304-309. [CrossRef]

7. Jin، K.-S .؛ أوه ، YN ؛ هيون ، SK ؛ كوون ، هجرية ؛ كيم ، BW Vitis amurensis Ruprecht جذر مثبط - تحفيز الخلايا الصباغية التي يسببها الهرمون في خلايا B16F10. نوتر. الدقة. الممارسة. 2014 ، 8 ، 509-515. [CrossRef]

8. Jang، MH؛ بياو ، XL ؛ كيم ، هاي تشو ، EJ ؛ بايك ، SH ؛ كوون ، جنوب غرب ؛ بارك ، JH ريسفيراترول أوليغومرات من Vitis amurensis تخفف الإجهاد التأكسدي الناجم عن الأميلويد في خلايا PC12. بيول. فارم. ثور. 2007 ، 30 ، 1130-1134. [CrossRef]

9. Lee، E.-O .؛ لي ، H.-J. ؛ هوانج ، إتش-إس. آهن ، ك. تشاي ، سي ؛ كانغ ، ك. لو ، ياء ؛ كيم ، S.-H. تثبيط قوي لنمو سرطان الرئة من لويس بواسطة الهكسانول أ من جذور Vitis amurensis من خلال الأنشطة الأبوطوزية والمضادة لتولد الأوعية. مادة مسرطنة 2006 ، 27 ، 2059-2069. [CrossRef]

10- باك ، م. ترونج ، VL ؛ كانغ ، إتش- إس. جون ، م. جيونج ، دبليو- إس. التأثير المضاد للالتهابات للبروسيانيدين من بذور العنب البري (Vitis amurensis) في خلايا RAW 264.7 التي يسببها LPS. أكسدة. ميد. خلية. لونجيف. 2013 ، 2013. [CrossRef]

11. شين ، هـ. تشونغ ، هـ. بارك ، ب. Lee ، KY تحديد المكونات المضادة للأكسدة من Polygonum aviculare باستخدام LC-MS إلى جانب اختبار DPPH. نات. همز. علوم. 2016 ، 22 ، 64-69. [CrossRef]

12. بارك ، س. شين ، ح. بارك ، واي. تشوي ، أنا. بارك ، ب. Lee ، KY توصيف المكونات المثبطة لإنتاج NO من Catalpa ovata باستخدام LC-MS إلى جانب اختبار قائم على الخلية. بيورج. تشيم. 2018 ، 80 ، 57-63. [CrossRef] [PubMed]

13. إنجكانينان ، ك. دي بيست ، سي. فان دير هايدن ، ر. هوفت ، أ. كاراباتاك ، ب. إيرث ، ح. تجادن ، يو. فان دير جريف ، ياء ؛ Verpoorte، R. تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء مع الأشعة فوق البنفسجية المقترنة عبر الإنترنت ومقياس الطيف الكتلي والكشف الكيميائي الحيوي لتحديد مثبطات أستيل كولينستيراز من المنتجات الطبيعية. تشروماتوجر. 2000 ، 872 ، 61-73. [CrossRef]

14. بيزيرا ، ماساتشوستس ؛ Santelli ، RE ؛ أوليفيرا ، إب ؛ فيلار ، ل. Escaleira ، منهجية سطح الاستجابة (RSM) كأداة لتحسين الكيمياء التحليلية. تالانتا 2008 ، 76 ، 965-977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak، A .؛ شوجناكا ، ك. Podstawczyk ، د. داويك ، أ. Pokomeda، K. تطبيق منهجية سطح الاستجابة وطرق الشبكة العصبية الاصطناعية في نمذجة عملية الامتصاص الحيوي وتحسينها. بيوريسور. تكنول. 2014 ، 160 ، 150-160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo، PW؛ Brereton ، RG التصميم التجريبي I. الفحص. محلل اتجاهات. تشيم. 1996 ، 15 ، 26-31. [CrossRef]

17. Wang، Y .؛ تشاو ، إل. تشانغ ، ر. يانغ ، العاشر ؛ الشمس ، واي. شي ، لام ؛ Xue ، P. تحسين الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية من خلال منهجية سطح الاستجابة ، والقدرة المضادة للأكسدة ، والنشاط المثبط للتيروزيناز للأنثوسيانين من نخالة الأرز الأحمر. علوم الغذاء. نوتر. 2020 ، 8 ، 921-932. [CrossRef]

18. Weremfo، A .؛ Adulley ، F. ؛ Adarkwah-Yiadom ، M. التحسين المتزامن لاستخراج المركبات الفينولية بمساعدة الميكروويف والنشاط المضاد للأكسدة من بذور الأفوكادو (مطحنة بيرسيا الأمريكية) باستخدام منهجية سطح الاستجابة. J. الشرج. طرق علم. 2020، 2020، 7541927. [CrossRef]

19. كو ، ياء ؛ تشوي ، ياء ؛ باي ، SK ؛ كيم ، ياء ؛ Yoon، KD فصل خمسة أوليغوستيلبين من V itis amurensis بواسطة كروماتوغرافيا عالية الأداء متدرجة ذات معدل زميل. J. سبتمبر Sci. 2013 ، 36 ، 3860-3865. [CrossRef]

20. Wang، K.-T .؛ تشين ، إل جي ؛ Tseng ، S.-H. ؛ هوانغ ، جي إس. هسيه ، م. وانغ ، سي. التأثيرات المضادة للالتهابات من ريسفيراترول وأوليغوستيلبين من فيتيس ثونبيرجي فار. تايوانيانا ضد التهاب المفاصل الناجم عن عديدات السكاريد الدهنية. J. أجريك. الغذاء تشيم. 2011، 59، 3649–3656. [CrossRef]

21. هو ، ياء ؛ لين ، تي ؛ شو ، ياء ؛ دينغ ، ر. وانغ ، جي. شين ، ر. تشانغ ، واي دبليو. Chen، H. Polyphenols المعزولة من أوراق Vitis thunbergii var. taiwaniana تنظم المسار المتعلق بـ APP. بيورج. ميد. تشيم. بادئة رسالة. 2016 ، 26 ، 505-511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima، Y .؛ كاميجو ، أ. أوهيزومي ، واي. نيوا ، م. إيتو ، ياء ؛ Hisamichi، K. تاكيشيتا ، م. oligostilbenes جديد من Vitis coignetiae. تتراهيدرون 1995 ، 51 ، 11979-11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska، M.؛ بيليت ، ك. درويت ، س. مونش ، تي ؛ أونلوبير ، م. Tungmunnithum ، D. ؛ Giglioli-Guivarc'h، N. ؛ هانو ، سي ؛ Lanoue ، A. مستخلصات قصب العنب كمكون تجميلي متعدد الوظائف لتجديد النشاط: تقييم نشاط سيرتوين ، تثبيط التيروزيناز ، وإمكانات التوافر البيولوجي. جزيئات 2020، 25، 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang، HH؛ أوه ، ك.إي. جو ، YH ؛ آهن ، ج. ليو ، س. تركي ، أ. جانغ ، جي. هوانج ، ب. لي ، كنتاكي Lee ، MK توصيف المكونات المثبطة للتيروزيناز من الأجزاء الهوائية من Humulus japonicus باستخدام اختبار LC-MS / MS المقترن عبر الإنترنت. بيورج. ميد. تشيم. 2018 ، 26 ، 509-515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu، Q .؛ كيم ، سي ؛ جو ، YH ؛ كيم ، إس بي ؛ هوانج ، ب. Lee ، MK Synthesis والتقييم البيولوجي لمشتقات ريسفيراترول كمثبطات لتكوين الميلانين. جزيئات 2015 ، 20 ، 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com WhatApp: 86 13632399501