توصيف إمكانات تثبيط إنزيم CYP3A4 لفلافونيدات مختارة الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.3 مقايسة تثبيط زائف لا رجوع فيه

في مقايسة التثبيط الزائف الذي لا رجعة فيه ، تم تحضين العينات بمركبات الفلافونويد ومعالجتها بأكسدة ، وبعد ذلك تم إخضاعها لغسيل الكلى. في حالة التثبيط الزائف الذي لا رجعة فيه ، يجب استعادة نشاط الإنزيم. في الحضانات مع جميع مركبات الفلافونويد المختبرة ، كان هناك تثبيط كبير لنشاط الإنزيم بعد غسيل الكلى مع وبدون علاج بأكسدة (الشكل 4). في جميع الحالات ، كان الاختلاف في نشاط الإنزيم المتبقي بين عينة الفلافونويد وعينة سداسي فرات البوتاسيوم غير ذي دلالة إحصائية (p<>

كما في التجارب السابقة ، لوحظ أعلى انخفاض في نشاط الإنزيم عند استخدام الكريزين كمثبط. بلغ النشاط المتبقي للإنزيم بعد الحضانة وغسيل الكلى بالكريسين 0. 57 بالمائة ، وبعد الحضانة وغسيل الكلى مع المعالجة المسبقة بسداسي إنوفيرات البوتاسيوم ، كان 1.31 بالمائة (الشكل 4).

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

في حالة التثبيط المباشر (القابل للانعكاس) ، سيُظهر هذا النوع من التجارب انتعاش نشاط الإنزيم بعد غسيل الكلى. في حالة التثبيط الزائف الذي لا رجعة فيه ، يمكن استعادة نشاط الإنزيم بعد العلاج بأكسدة وغسيل الكلى. نظرًا لأن هذه لم تكن هي الحال مع أي من مركبات الفلافونويد التي تم تحليلها ، فيمكن استنتاج أن جميع مركبات الفلافونويد تظهر تثبيطًا لا رجعة فيه للسيتوكروم P 450 3 A4.

3. مناقشة

لقد ثبت أن بعض مركبات الفلافونويد يمكن أن تمنع نشاط إنزيمات السيتوكروم P45 0. Saric-Mustapic et al. [28] وكوندزا وآخرون. [29] أظهر أن الأسيتين والأبيجينين والكريسين والبينوسيمبرين يثبطان إنزيم CYP3A4 في الفحص باستخدام التستوستيرون كركيزة علامة. نظرًا لأن إنزيم CYP3A4 يمتلك موقعًا نشطًا كبيرًا يمكنه استيعاب الركائز بشكل مختلف ، يُنصح بإجراء فحوصات النشاط باستخدام ركيزة علامة أخرى مثل نيفيديبين وميدازولام [3 0]. وبالتالي ، استخدمنا أكسدة نيفيديبين كتفاعل علامة لنشاط CYP3A4 وحددنا المعلمات الحركية للتثبيط. قيم فعالية التثبيط التي تم الحصول عليها باستخدام نيفيديبين كركيزة علامة هي من نفس الترتيب من حيث الحجم عند مقارنتها بمقايسة التستوستيرون للأبيجينين والأكاسيتين والبينوسيمبرين. أظهر الكريزين فقط قيمة أعلى بأربعة أضعاف في هرمون التستوستيرون [29] عند مقارنته بمقايسة نيفيديبين ، أي 0.108 دقيقة -1 أوم -1 مقابل 0.029 دقيقة-ميكرومتر -1. تتوافق أوجه التشابه الملحوظة في حركيات التعطيل مع بيانات الأدبيات التي تؤكد أن النيفيديبين والتستوستيرون لهما مواقع ربط مختلفة تتداخل [31]. يحتوي السيتوكروم P4503A4 على واحد من أكبر المواقع النشطة ويمكنه استيعاب الركيزة والمثبط في نفس الوقت ، حيث يؤثر أحدهما على ارتباط الآخر ، مما قد يفسر الاختلافات الملحوظة بين فحوصات نيفيديبين وهرمون التستوستيرون.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

يمكن تجنب الآثار السريرية للمثبطات العكوسة (أي التفاعلات الدوائية والغذائية) إذا توقف المانع عن العلاج. التفاعلات الأكثر أهمية هي تلك التي لا رجعة فيها ، في حين أن التوقف عن استخدام المانع ببساطة لن يحل مشكلات التفاعل. في هذه الدراسة ، أظهر الكريزين أعلى احتمالية للتثبيط ، مع أدنى درجة من IC50 و K. القيم. أظهرت دراسة الالتحام الجزيئي لمركبات الفلافونويد المرتبطة بالسيتوكروم P 450 3 A4 تقارب ارتباط أعلى للكريسين من خلال تعريض الحلقة B للحديد في المركز النشط للإنزيم [28]. أظهرت دراسة العلاقة بين تثبيط الهيكلهيدروكسيلتساهم المجموعات الموجودة في الحلقة A في التأثير المثبط على الأرجح بسبب تفاعلات أيون أيون ، بينما يمكن أن تكون الحلقة B غير مستبدلة (بينوسيمبرين ، كريسين) أو أحادي الاستبدال (أكسيتين ، أبجينين) من أجل ملاحظة التأثير المثبط (الشكل 1) [28]. تعتبر مركبات الفلافونويد غير المستبدلة (بينوسيمبرين ، كريسين) أكثر عرضة للإيبوكسدة وتوليد الوسطيات التفاعلية التي تعطل CYP3A4. ربما يرجع التأثير المثبط الأقوى الذي لوحظ مع الكريسين إلى صلابة الهيكل ووجود الرابطة المزدوجة C 2= C3 عند مقارنتها مع البينوسيمبرين.

يمكن ملاحظة أهمية هذه الخواص الحركية للإنزيم الموصوفة في سياق التفاعلات بين الغذاء والدواء ، حيث أدى إعطاء الكريزين （20-100 ميكرومتر） إلى زيادة كبيرة في المساحة تحت المنحنى وزيادة تركيز مصل الدم (Cmax) للنتروفورانتوين في الفئران [32] .cistanche Deserticola أماه ،على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن المانع الضعيف نسبيًا القائم على الآلية لإنزيم CYP3A4 / 5 ، الإريثروميسين [33] ، يتسبب في تفاعل معتدل مع سيريفاستاتين لدى متطوعين أصحاء (زيادة بنسبة 21 في المائة في المساحة تحت المنحنى من سيريفاستاتين) [34]. يحتوي الكريزين أيضًا على إمكانية تثبيط أكبر من الميبفراديل ، وهو دواء خافض للضغط تم سحبه بسبب التفاعلات الهامة مع الأدوية الأخرى. تشير نتائج هذه الدراسة إلى أن الكريزين يمكن أن يكون مثبطًا قويًا وربما يتفاعل مع الأدوية الأخرى المستخدمة ،cistanche الصحراءتغيير AUC و Cmax لهذه الأدوية. يتوفر الكريسين بكثرة في البروبوليس (28 جم / لتر) ، وهو ثالث مادة الفلافونويد الرئيسية في العسل 5.3 مجم / كجم [35]. لذلك ، فإن النظام الغذائي الغني بهذه الأطعمة لديه القدرة على التفاعل مع الأدوية المكونة من ركائز CYP3A4.

أظهر Pinocembrin ، وهو مثبط لا رجعة فيه لأنزيم CYP3A4 ، أدنى k ؛ قيمة mg لـ 0. 0 4 ± 0. 01 min -1. كانت فعاليته في التثبيط مشابهة لتلك الخاصة بالأكاسيتين والأبيجينين （0.01 دقيقة -1 ميكرومتر -1）. يوجد Pinocembrin في الغالب في الأطعمة مثل العسل والمشروبات (الشاي والنبيذ الأحمر) ، مما يمثل مصدرًا غنيًا لهذا الفلافونويد [29]. وفقًا لهذه المعلمات الحركية ، يجب توخي الحذر عند استهلاك مصادر pinocembrin هذه جنبًا إلى جنب مع الأدوية التي تعمل كركائز CYP3A4.

أظهر Acacetin ثلاثة أضعاف قيمة IC5 0 أعلى من الكريزين وخمس مرات أعلى من K ؛ القيمة ، مع الحفاظ على قيم تأثير مماثلة مثل مركبات الفلافونويد الأخرى ، مما يشير إلى فعالية تثبيط أقل. يمكن العثور على Acacetin بشكل أساسي في الأنواع النباتية مثل Turnera diffusa و Robinia pseudoacacia و Betula pendula [36] ، ولكن بعض الأطعمة تقدم أيضًا مصدرًا لهذا الفلافونويد. على سبيل المثال ، يعد عصير الكمكوات مصدرًا غنيًا للأكاسيتين ، ويمكن العثور على الأسيتين بتركيزات تبلغ 0.1 مجم / 100 جم من العصير الطازج [37]. أظهر المركب الرئيسي للأكاسيتين ، الأبجينين أعلى قيمة لـ IC50 وأعلى قيمة K ؛ القيمة بين مركبات الفلافونويد الأربعة المختبرة. تم تأكيد القدرة التثبيطية للأبيجينين في الجسم الحي عندما أدى العلاج المركب للأبيجينين والباكليتاكسيل إلى زيادة التوافر الحيوي عن طريق الفم للباكليتاكسيل ، والذي يُعزى بشكل أساسي إلى تعزيز الامتصاص في الجهاز الهضمي من خلال تثبيط البروتين السكري P وتقليل التمرير الأول. استقلاب باكليتاكسيل من خلال تثبيط فصيلة CYP3A في الأمعاء الدقيقة و / أو في الكبد بواسطة الأبيجينين [38]. Apigenin هو الفلافونويد السائد في الكرفس والبقدونس والبابونج. تم الإبلاغ عن أن البقدونس المجفف يحتوي على أقصى كمية من الأبجينين ، عند 45035 ميكروغرام / غرام. تم العثور على مصادر إضافية للأبيجينين في الأعشاب مثل زهرة البابونج المجففة ، والتي تحتوي على 3000 إلى 5000 ميكروغرام / غرام ، وبذور الكرفس التي تحتوي على 786.5 ميكروغرام / غرام [39].

يرتبط تثبيط السيتوكروم P 450 3 A4 بالخطوة الأولى من الدورة التحفيزية للسيتوكروم P450 (الشكل 5). في أغلب الأحيان ، يتم ملاحظة المنافسة بين الركيزة والمثبط في الارتباط بالموقع النشط (الحديد الحديديك). في هذه الحالة ، يُنصح بإجراء تجارب الربط (معايرة الإنزيم) واختبارها مع أكثر من ركيزة واحدة ، حيث أن CYP3A4 لها موقع نشط كبير يمكنه استيعاب أكثر من جزيء واحد من الركيزة / المانع [26،30. في هذه الدراسة ، استخدمنا نيفيديبين كركيزة ، وكانت نتائج كفاءة التثبيط ذات حجم مشابه للمقايسات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا والتي أجريت باستخدام التستوستيرون كركيزة علامة (الجدول 1).

الشكل 5. تتكون الدورة التحفيزية السيتوكروم P450 من تسع خطوات. تمثل الخطوة الأولى ارتباط الركيزة ونقطة التفاعل مع المثبطات القابلة للعكس. في الخطوة الثانية ، يتم اختزال حديد الهيم إلى شكل حديدي ترتبط به مثبطات غير عكسية زائفة.آثار cistancheإذا لوحظ تثبيط لا رجعة فيه ، فعادة ما يكون مرتبطًا بالشكل الجذري للركيزة (التي تشكلت في الخطوة 7) و / أو المنتج (الذي تم تشكيله في الخطوة 8). يمكن أن تتسبب أنواع الأكسجين التفاعلية المتكونة في دورة السيتوكروم P450 غير المجدية (الخطوتان 3 أ و 5 أ) في تدمير الإنزيم ، والذي يمكن منعه عن طريق إضافة SOD و CAT. تم حذف وصف الخطوات غير المتعلقة بالتثبيط. أعد حسب المرجع [26].

ومع ذلك ، كما أظهرنا سابقًا [28،29] وأكدنا هنا في تجاربنا التي أجريت ، فإن جميع مركبات الفلافونويد المدروسة تظهر تثبيطًا لا رجعة فيه. بصرف النظر عن نوع التثبيط الذي لا رجوع فيه (الارتباط الزائف غير القابل للانعكاس أو الارتباط التساهمي للوسيط مع الهيم أو البروتين) ، سيكون التثبيط أكثر بروزًا إذا تم إجراء الحضانة المسبقة ، قبل إضافة ركيزة علامة ، [26]. في الحضانة المسبقة ، يتم تنشيط الدورة التحفيزية عن طريق إضافة نظام التوليد لإنتاج الإنزيم المساعد (NADPH) ، ويُسمح بوقت كافٍ لملاحظة تعطيل الإنزيم. وبالتالي ، فإن جميع أنواع التثبيط التي لا رجعة فيها تتطلب تقليل الإنزيم إلى الشكل الحديدي (الشكل 5).

نظرًا لأن السيتوكروم P450 عبارة عن بروتينات هيموبروتينات ، فقد درسنا ارتباط مركبات الفلافونويد بالشكل الحديدي للموقع النشط وربط وسيط تفاعلي محتمل مع الهيم [26]. لتقييم التشكيل المحتمل لعقرب الهيم ، تم إجراء فحص هيموكروموبيريدين. كل المختبرينمركبات الفلافونويدخفض تركيز الهيم بشكل ملحوظ في كلا الاختبارين ، بأكثر من 5 0 بالمائة. كان الكريسين ، مرة أخرى ، أكثر الموانع فعالية ، حيث يطابق القيم الحركية للتثبيط التي لوحظت في هذه الدراسة. كان تركيز Heme مع pinocembrin أعلى بخمس مرات ، ومع Apigenin ، كان أعلى بعشر مرات تقريبًا من تركيزه مع chrysin (25.3 ± 0.4 و 45.1 ± 1.7 بالمائة ، على التوالي). يشير هذا الانخفاض في تركيزات الهيم إلى أن تثبيط CYP3A4 الذي لا رجعة فيه بواسطة مركبات الفلافونويد المدروسة يمكن أن يعزى إلى الارتباط التساهمي لمادة وسيطة تفاعلية مع الهيم. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تدمير الهيمات بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يقلل من نتائج مقايسة hemochromopyridine. للقضاء على هذا الاحتمال ، أجريت الحضانات في وجود SOD و CAT (الجدول 2) ، مما يؤكد الاستنتاج المذكور أعلاه.

الخطوة الأولى في الدورة التحفيزية لإنزيم السيتوكروم P450 هي ربط الركيزة بأيون الحديديك. إذا أظهر المثبط تثبيطًا تنافسيًا للركيزة ، فيمكن استرداد نشاط الإنزيم عن طريق غسيل الكلى ، حيث يتيح التخلص من المثبط استعادة نشاط الإنزيم بالكامل [26]. ومع ذلك ، إذا ارتبط المثبط بالحديد الحديدية ، فإن استخدام مادة مؤكسدة ، مثل PCF ، قبل غسيل الكلى ضروري لاستعادة نشاط الإنزيم. إذا تم استعادة نشاط الإنزيم ، فإن التثبيط يوصف بأنه زائف لا رجوع فيه [26]. نظرًا لأن نشاط الإنزيم لا يمكن استرداده بعد غسيل الكلى مع أو بدون PCF ، فإن أيًا من مركبات الفلافونويد المختبرة (عند تركيز 25 ميكرومتر) تعمل كمثبطات عكوسة أو غير قابلة للانعكاس من إنزيم CYP3A4. هذا يؤكد أيضًا أن تثبيطًا لا رجعة فيه عن طريق الارتباط التساهمي مع الهيم أو البروتين هو السبب المحتمل لتعطيل الإنزيم.

وتجدر الإشارة إلى أن مادة الكريسين تسبب في انخفاض كامل تقريبًا في الهيم في الحضانة: 97.1 في المائة بدون و 94.5 في المائة مع SOD و CAT (الجدول 2) ؛ بينما أظهرت نتائج نشاط الإنزيم المتبقي في ظل ظروف مماثلة انخفاض نشاط الإنزيم بحوالي 99 بالمائة (الشكل 4). يسجل اختبار Hemochromopyridine الدم من جميع المصادر في الحضانة ، أي السيتوكروم P450 ، وكذلك السيتوكروم ب ؛. تشير نتائج الكريزين إلى أن الوسيط التفاعلي الناتج عن السيتوكروم P450 قد تفاعل مع الهيم من السيتوكروم P450 وكذلك السيتوكروم ب 5.

تم إجراء مزيد من تحليل LC-MS لتحديد وسيطة الفلافونويد التفاعلية المحتملة إما في شكل معقد الهيم أو محاصر باستخدام الجلوتاثيون كزبال جذري (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، لم نتمكن من عزل أي من المقاربات المتوقعة على الأرجح بسبب عدم استقرار وسيط الفلافونويد التفاعلي و / أو الهيم / الجلوتاثيون. ولوحظ سلوك مماثل مع ميبفراديل ، وهو دواء خافض للضغط ، تم سحبه من السوق بسبب التفاعلات الدوائية / الدوائية. على الرغم من أن ميبفراديل تسبب في تقليل الهيم ، لم يتم إنشاء وسيط تفاعلي [40].

4. المواد والطرق

4.1 المواد

تم استخدام أربعة مركبات من مركبات الفلافونويد (acacetin و apigenin و chrysin و pinocembrin) في هذه الدراسة (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء السيتوكروم المؤتلف P 450 3 A4 المتضافر مع اختزال فوسفات نيكوتيناميد - الأدينين - ثنائي النوكليوتيد (NADPH) والسيتوكروم bs في الجسيمات الذاتية من Thermo Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

بناءً على مقايسة أول أكسيد الكربون السيتوكروم P450 [41] ، تم تأكيد محتوى إنزيم CYP3A4 المعلن من قبل الشركة المصنعة ليكون 1 ميكرومتر. تم شراء الجلوكوز -6- فوسفات （G6P） والجلوكوز -6- نازعة هيدروجين الفوسفات (G6PDH) وملح ثنائي فوسفات النيكوتيناميد ثنائي النوكليوتيد (NADP plus) من Sigma-Aldrich. تم شراء فوسفات البوتاسيوم (pa) وثنائي كلورو الميثان (pa) من Kemika dd (زغرب ، كرواتيا) ، وحمض الفورميك (85 بالمائة ، سنويا) من Semikem doo (سراييفو ، البوسنة والهرسك) ، والميثانول المستخدم في إذابة الكاشف والكروماتوجرافيا من Merck KGaA (دارمشتات ، ألمانيا). تم استخدام الماء عالي النقاوة في مخاليط الحضانة والكروماتوغرافيا. تم استخدام فوسفات هيدروجين البوتاسيوم (Kemika dd) لتحضير محلول فوسفات البوتاسيوم pH 7.85 ؛ تم تعديل الأس الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الذي تم شراؤه من Semikem doo Nifedipine (Sigma-Aldrich) ونيفيديبين المؤكسد (المديرية الأوروبية لجودة الأدوية ، دستور الأدوية ، الطبعة العاشرة ، ستراسبورغ ، فرنسا) واستخدمت في دراسة نشاط الإنزيم المتبقي ، وكذلك في حركية التعطيل. تم استخدام التستوستيرون (Sigma-Aldrich) و 6 - hydroxytestosterone (Cayman Europe ، Tallinn ، Estonia) للمقايسات في التثبيط الزائف الذي لا رجعة فيه. تم الحصول على Troleandomycin و diltiazem من وكالة المنتجات الطبية والأجهزة الطبية (زغرب ، كرواتيا). تم استخدام Pyridine (pa) (Semikem doo) ، بقري hemin (Sigma-Aldrich) ، و dimethylsulfoxide (Semikem doo) في فحص hemochromopyridine. تم استخدام سداسي فرات البوتاسيوم (Siegfried AG ، Zofingen ، سويسرا) في دراسة التثبيط القابل للعكس والعكس الزائف. تم استخدام ديسموتاز الفائق (SOD) (Sigma-Aldrich) ، الكاتلاز (CAT) (Sigma-Aldrich) ، وحمض الهيدروكلوريك (36 بالمائة ، باسكال) (Semikem doo) في مقايسة خصوصية الربط. تم إجراء حضانات الإنزيم في حمام مائي (Inkolab ، زغرب ، كرواتيا). تم إجراء فحص نشاط الإنزيم المتبقي وحركية تثبيط الفلافونويد باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مقترنة باكتشاف الأشعة فوق البنفسجية (HPLC UV-Vis ، Agi-lent 1100 ، Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء حسابات النشاط المتبقي ومعلمات حركية التثبيط باستخدام البرنامج R (مشروع R للحوسبة الإحصائية ، فيينا ، النمسا) و Microsoft Excel (Microsoft ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية).

4.2 الطرق

4.2.1. تحديد حركية الإنزيم والنشاط المتبقي

أجريت حضانات الإنزيم في ثلاث نسخ ، مع التقليب الميكانيكي في حمام مائي عند 37 درجة. تم إذابة قسامات من مركبات الفلافونويد بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر في ميثانول ، ونقلها إلى أنابيب زجاجية ، وتبخرها حتى تجف ، إلا في عينات التحكم بدون المانع (الفلافونويد). بعد تبخر المذيب ، تم تحضير خليط حضانة إلى حجم 1 0 0 ميكرولتر ، يتكون من 5pmol CYP3A4 إنزيم ، 5 0 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم (pH7.4) والماء عالى النقاء. تم تحضير نظام توليد NADPH المكون من 0.1 M G6P: 10 مجم / مل NADP بالإضافة إلى: 1000 IU / mL G6PDH =50: 25: 1 (v / v / v) على الفور قبل الاستخدام. يحتوي نظام التوليد هذا على الجلوكوز -6- نازع هيدروجين الفوسفات الذي يعيد توليد NADP إلى NADPH ، مما يحافظ على ثبات تركيز إنزيم السيتوكروم P450 (NADPH) في الحضانة. أدت إضافة نظام التوليد (15 بالمائة من الحجم في الحضانة النهائية ، v / v) إلى بدء التفاعل. تم استخدام نيفيديبين لاختبار نشاط الإنزيم المتبقي بتركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر. تم إيقاف التفاعل باستخدام 1 مل من محلول مثلج بارد بنسبة 1 بالمائة من حمض الفورميك في ثنائي كلورو ميثان. تم خلط العينات ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 1900 جم (Rotofix32 ، Westfalia ، ألمانيا). بعد الطرد المركزي ، تم تكوين طبقتين (الماء والطبقة العضوية） 850 ميكرولتر من الطبقة العضوية تم نقلها إلى الأكواخ وتبخيرها. ثم تم إذابة المادة التحليلية في 30 ميكرولتر من الميثانول. عمود Agilent Zorbax SB C18 4.6 × 250 مم ، تم استخدام 3 ميكرومتر ، Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية） لتحليل العينات بواسطة HPLC. يتكون الطور المتحرك من الميثانول والماء بنسبة 64:36. كان التحليل متساويًا. تم ضبط التدفق عند 1.0 مل دقيقة - تم ضبط حجم الحقن عند 10 ميكرولتر.استخدم نيفيديبين كركيزة علامة.تمثل التفاعل الملحوظ في أكسدة النيفيديبين.تم تسجيل كروماتوجرامس عند 254 نانومتر. تم تحديد مدة التحليل عند 25 دقيقة. الاحتفاظ وقت النيفيديبين 7.1 دقيقة ووقت النيفيديبين المؤكسد 10.8 دقيقة [42]. في كلتا الحالتين ، تمت ملاحظة كمية المنتج التي تم الحصول عليها كمساحة تحت المنحنى (AUC) بالنسبة لعينة التحكم. لجميع مركبات الفلافونويد ، تركيز مثبط نصف الحد الأقصى (ICs0) ، ثابت تم تحديد تثبيط (K ؛) ، ثابت سرعة التثبيط (Kinect) ، وفعالية التثبيط (التأثير / K ؛). تم استخدام Troleandomycin كعنصر تحكم إيجابي -- مثبط لا رجعة فيه لتركيز السيتوكروم P 450 3 A4.25 ميكرومتر من troleandomycin قلل من نشاط الإنزيم إلى 35 ± 5 بالمائة.

4.2.2. فحص Hemochromopyridine

تم استخدام اختبار Hemochromopyridine لتقييم التدمير المحتمل للهيم بواسطة الشكل الوسيط التفاعلي في دورة السيتوكروم P45 0 وتم إجراؤه وفقًا للطريقة التي وصفها Flink and Watson [43] وبول وآخرون [44] ، مع بعض التعديلات. تم إنشاء منحنى المعايرة باستخدام الهيمين المذاب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (0. 6 إلى 0. 1 ميكرومتر）. تم تسجيل الأطياف بطول موجة من 5 0 0 إلى 600 نانومتر. خليط الحضانة مع تم تحضير 25 ميكرولتر من مثبطات الفلافونويد إلى حجم 200 ميكرولتر.بدأ التفاعل بإضافة نظام مولِّد لـ NADPH (للتركيب ، انظر القسم 4.2.1) ، واستمرت الحضانات لمدة 30 دقيقة. توقف التفاعل بعد ذلك. نصف ساعة بإضافة بيريدين (التركيز النهائي 0.83 م) وهيدروكسيد الصوديوم (التركيز النهائي 0.06 م). تم تسجيل العينات على مقياس الطيف الضوئي (الأشعة فوق البنفسجية -1280 ، شركة شيمادزو ، كيوتو ، اليابان) في غضون دقيقة واحدة من إضافة محلول قلوي بسبب عدم استقرار هيموكروموجين بيريدين تحت الظروف الأساسية [44]. تم حساب تركيز الهيم في العينات بناءً على منحنى المعايرة المحضر. تم إجراء هذا الاختبار في ثلاث نسخ. تم تكرار الحضانات باستخدام الكاتلاز والفائق الأكسيد. ديسموتاز (5 وحدة دولية لكل منهما) في خليط الحضانة لمنع توليد بيروكسيد الهيدروجين من خلال الدورة التحفيزية غير المجدية.

4.2.3. مقايسة تثبيط زائف لا رجوع فيه

الهدف من هذا المقال هو اختبار تكوين المجمعات التساهمية مع الحديدوز (Fe-) ، من خلال تقييم استعادة نشاط الإنزيم بعد غسيل الكلى مع أو بدون إضافة مادة مؤكسدة. تم إجراء ثلاثة أنواع من التجارب لكل فلافونويد: خليط الحضانة بدون مركبات الفلافونويد (تحكم) ، خليط الحضانة مع الفلافونويد ، خليط الحضانة مع الفلافونويد الذي أضيف إليه المؤكسد بعد الحضانة. تم إجراء كل حضانة بالمثبط لمدة 30 دقيقة باستخدام نفس الإعدادات التجريبية كما هو موضح أعلاه (القسم 4.2.1). بعد الحضانة ، تم نقل العينات إلى خراطيش غسيل الكلى. مؤكسد أأ - تمت إضافة محلول 20 ملي مولار من هيكساسيانوفيرات البوتاسيوم إلى إحدى الحضانات قبل غسيل الكلى [45]. تم غمر الكاسيتات (Slide-A-Lvzer Dialysis Cassettes، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) في 50 ملي مولار من محلول فوسفات البوتاسيوم (pH7.4) لمدة 30 دقيقة (تم استبدال محلول غسيل الكلى ثلاث مرات). بعد غسيل الكلى ، تم نقل العينات من الكاسيت إلى الأنبوب الزجاجي ، وتم تقييم نشاط الإنزيم المتبقي باستخدام التستوستيرون كركيزة علامة 200 ميكرومتر تركيز نهائي）. نظرًا لأنه تم أيضًا غسيل نظام توليد NADPH ، تمت إضافته مرة أخرى إلى الحضانات لبدء تفاعلات الإنزيم. تم تحضين العينات لمدة 30 دقيقة بنفس الإعدادات (الموضحة في القسم 4.2.1). تم إنهاء التفاعل بإضافة محلول جليدي بارد من حمض الفورميك في ثنائي كلورو ميثان. تم تحليل العينات بواسطة HPLC. تم استخدام الديلتيازيم ، وهو مثبط زائف لا رجعة فيه للسيتوكروم P 450 3 A4 ، كعنصر تحكم إيجابي لتقييم الأكسدة إلى شكل حديديك (لوحظ استعادة نشاط إنزيم كامل).

4.2.4 معالجة النتائج

سيتم استخدام اختبار t أحادي الجانب لتقييم الأهمية الإحصائية للاختلافات بين العينات وعناصر التحكم ، بناءً على قياسات النشاط المتبقي. تم استخدام معادلة غير خطية لحساب قيمة IC. تم استخدام معادلة Michaelis-Menten لتحديد ثابت التعطيل ومعدل تثبيط المانع. تمت المعالجة الإحصائية وإعدادات الرسم البياني باستخدام البرنامج R (مشروع R للحوسبة الإحصائية ، فيينا ، النمسا) و Microsoft Excel (Microsoft ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية).

5. الاستنتاجات

يمنع Acacetin و apigenin و chrysin و pinocembrin نشاط إنزيم CYP3A4 في المختبر. يعتبر الكريسين من أكثر مثبطات الإنزيم فاعلية ، حيث يحتوي على أقل نسبة من IC50، K ؛ قيم Kinect وأعلى فعالية في التثبيط. خفضت جميع مركبات الفلافونويد تركيز الهيم للإنزيم ، مما يؤكد أن هذا تثبيط لا رجعة فيه عن طريق وسيط تفاعلي لا يمكن منعه عن طريق إضافة SOD و CAT. لا تعمل أي من مركبات الفلافونويد المختبرة كمثبطات عكوسة أو شبه لا رجعة فيها من إنزيم CYP3A4 بتركيز 25 ميكرومتر ، حيث لا يمكن استعادة نشاط الإنزيم بغسيل الكلى مع إضافة سداسي فرات البوتاسيوم وبدونه. نظرًا لأنه يمكن العثور على مركبات الفلافونويد هذه بكثرة في العديد من الأطعمة مثل الفواكه والخضروات والتوابل والشاي والنبيذ الأحمر ، فهناك احتمال أنها يمكن أن تتداخل مع العديد من الكائنات الحية الحيوية التي هي ركائز CYP3A4. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات في الجسم الحي للتحقيق الكامل في إمكانيات مثل هذه التفاعلات بين الغذاء والدواء ، بالإضافة إلى المساهمة المحتملة للإنزيمات والناقلات الأخرى في التفاعلات.

تم استخراج هذه المقالة من جزيئات 2021 ، 26 ، 3018