توصيف مخاطر رفض الكلى قبل الزرع وما بعد الزرع عن طريق تسلسل الذخيرة المناعية للخلايا البائية

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

توفر دراسة الذخيرة المناعية في سياق زراعة الأعضاء معلومات مهمة حول كيفية مساهمة المناعة التكيفية في رفض الكسب غير المشروع وتعديله. هنا نقوم بتمييز الذخيرة المناعية للدم المحيطي للأفراد قبل وبعدالكلىزرع باستخدام تسلسل مستقبلات الخلايا البائية في دراسة سريرية طولية. الأفراد الذين يصابون بالرفض بعد الزرع لديهم ذخيرة مناعية أكثر تنوعًا قبل الزرع ، مما يشير إلى استعدادهم لخطر الرفض بعد الزرع. بالإضافة إلى ذلك ، أكثر من عامين من المتابعة ، يُظهر المرضى الذين يصابون بالرفض مجموعة محددة من الحيوانات المستنسخة الموسعة التي تستمر بعد الرفض. في حين أن هناك انخفاضًا إجماليًا في تنوع الخلايا البائية المحيطية ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة التعرض العام لكبت المناعة في هذه المجموعة ، فإن اكتشاف استخدام جين IGHV محدد عبر جميع المرضى الرافضين يدعم أن مجموعة مشتركة من المستضدات المناعية قد تؤدي إلى رفض ما بعد الزرع. قد يكون لنتائجنا آثار سريرية على التنبؤ والإدارة السريرية لرفض زرع الكلى.

الكلىالزرع هو العلاج المفضل لمرض الكلى في نهاية المرحلة (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) والمزمنالكلىمرض. على الرغم من وجود تحسينات كبيرة في التقنيات ومطابقة الأنسجة بناءً على اختبار التوافق النسيجي لمضادات الكريات البيض البشرية المانحة / المتلقية (HLA) ، فإن التنبؤ بنتيجة الكسب غير المشروع لا يزال يمثل مشكلة لم يتم حلها. يمكن أن يؤدي عدم تطابق الأنسجة المقاس في مواضع ثانوية أخرى غير HLA أيضًا إلى إصابة جهاز المناعة الخيفي برفض حاد ومزمن ، مما يؤدي إلى نتائج سيئة على المدى الطويل. علاوة على ذلك ، حوالي 50 في المائة منالكلىلا تزال الطعم الخيفي ، مع عدم وجود أي عدم تطابق كبير في مستضدات الكريات البيضاء البشرية ، مفقودة في غضون 10 سنوات من الزرع². لقد افترضنا سابقًا أن المواضع غير HLA قد تؤثر على الاستجابة المناعية للمتلقي ضدهالكلىdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1 0 13 جسمًا مضادًا مختلفًا 0 ، والتي تمكنهم من التعرف على مجموعة كبيرة من المستضدات الأجنبية. تتكون BCRs أو Ig البشرية من سلسلتين ثقيلتين متطابقتين (I) تتكونان من خمسة أنماط متماثلة: IgM ، و IgD ، و IgA ، و IgE ، و IgG ، وسلاسل خفيفة. يحتوي الجسم المضاد السليم على مجال متغير وثابت. يحدث ارتباط المستضد في المجال المتغير ، والذي يتم إنشاؤه عن طريق إعادة تركيب مجموعة من المقاطع الجينية المتغيرة (V) والتنوع (D) والانضمام (J) التي تشكل الذخيرة المناعية للخلايا البائية ، ويتركز تنوعها بشكل أساسي في منطقة التحديد التكميلية 3 (CDR3). أثناء عملية نضج التقارب ، يحدث فرط الحركة الجسدية (SHM) في المنطقة المتغيرة. تعتمد الاستجابة المناعية التكيفية القوية على توسع استنساخ الخلايا البائية وعملية تسمى نضج التقارب ، يتم خلالها إدخال الطفرات الجسدية في عمليات إعادة ترتيب الجين Ig ويتم اختيار الخلايا البائية ذات التقارب العالي لمستضد معين.

تعد دراسة الذخيرة المناعية في زراعة الأعضاء أمرًا بالغ الأهمية لفهم ما الذي يحفز عملية الرفض ويحافظ عليها وكيف يمكن أن تسرع في النهاية المسار نحو فشل الكسب غير المشروع. مع التقدم في تسلسل الجيل التالي والأساليب الحسابية القوية ، يمكننا دراسة منطقة VDJ بتفاصيل دقيقة ، 12. حتى الآن ، تم تحليل الذخيرة المناعية للخلايا التائية فيالكلىتم إجراء عملية الزرع في عدد محدود جدًا من المرضى 3-15 ، وعلى الرغم من تطبيق BCRSeq على أمراض أخرى واستجابات مناعية بشرية ، مثل مرض التصلب المتعدد 6 أو لقاح الأنفلونزا أو اضطرابات نقص المناعة 8 ، إلا أن هناك نقصًا في الدراسات في عملية الزرع الرفض. فيالكلىزرع ، تم إجراء BCRSeq فقط في سياق التسامح ، وحساسية HLAالكلىيخضع المرشحون لعملية الزرع لعلاج إزالة التحسس ، وتسلل الخلايا البائية الذي يقارن التوسع النسيلي في الدم والكسب غير المشروع 2 لتر. تم نشر تطبيق آخر على BCRSeq في عملية الزرع سابقًا في مجموعة صغيرة من 12 متلقيًا لزراعة القلب.

إدراكًا لأهمية الذراع الخلطية للاستجابة المناعية في رفض الزرع المتأخر وفشل الطعم الخيفي المزمن ، قمنا بتمييز الذخيرة المناعية للدم المحيطي باستخدام BCRSeq في دراسة مستقبلية طولية. نجد أن تنوع ذخيرة الجهاز المناعي قبل الزرع أعلى لدى الأفراد الذين يرفضونالكلىيُظهر أيضًا توسع بعض الحيوانات المستنسخة وجينات IGHV على مدار 24 شهرًا من المتابعة. قد تساعد هذه النتائج في التنبؤ بمخاطر الرفض قبل التطعيم وقد يكون لها آثار سريرية في اكتشاف مستضدات معينة تؤدي إلى الرفض.

القسطرة جيدة لوظيفة الكلى

نتائج

المواد الدراسية. أجرينا BCRSeq في 83 عينة دم محيطي من 27 مريضًا فريدًا وقمنا بتنفيذ خط الأنابيب التحليلي الموضح في الشكل 1. تم النظر في ثلاث مجموعات نمط ظاهري سريري ، تم تحديدها بواسطة قراءات علم الأمراض المركزي العمياء لخزعات الطعم المتسلسل التي تم تسجيلها وفقًا لمعايير بانف ودرجة مؤشر تلف الطعم الخيفي المزمن (CADI) في هذه الدراسة: غير مرضى التطور (NP ؛ n =10) حصلوا على درجة CADI منخفضة غير متزايدة دون رفض حاد ، وكان مرضى التطور الذين لم يرفضوا (PNR ؛ n =10) ​​حصلوا على درجة CADI إضافية على مدار عامين دون رفض ، وكان مرضى التطور مع الرفض (PR ؛ n =7) درجات CADI عالية متزايدة على مدار عامين مع نوبات الرفض. التركيبة السكانية ، أسبابالكلىيتم توفير الفشل ، واستخدام كبت المناعة في الجدول 1. ومن المهم إبراز بعض خصائص هؤلاء المرضى. كان لدى دراسة الوالدين التي تم تسجيل هؤلاء المرضى منها معدل منخفض بشكل عام (17 بالمائة) من الرفض الحاد المؤكد الخزعة (يعني {الحد الأدنى ، الحد الأقصى} =12 {6،24} شهرًا من وقت الرفض). كان هؤلاء المرضى جميعًا معرضين لخطر مناعي منخفض للرفض (حالة حساسية الجسم المضاد التفاعلي في لوحة الذروة<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

تسلسل الذخيرة المناعية للخلايا البائية. تم إجراء BCRSeq على عينات الحمض النووي الجيني (gDNA) المستخرجة من جلطات الدم على 81 عينة من 27الكلىمتلقو الزرع في ثلاث نقاط (0 ، 6،24 شهرًا). حصل التسلسل على إجمالي عدد 327703 قراءة (متوسط ​​4045 / عينة) بعد مراقبة الجودة (انظر قسم الطرق). للتحقق من صحة النتائج وتقييم إضافي لكل نمط متساوي ، قمنا أيضًا باستخراج الحمض النووي الريبي من PBMC المتطابق الذي كان متاحًا لـ 55 عينة ، تم جمعها في نفس وقت تجلط الدم ، وإجراء تسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) على عمق أكبر للحصول على 1،773،330 قراءة بالنسبة لـ IgD (متوسط ​​31،667 / نموذج) ، 1،708،227 قراءة لـ IgM (متوسط ​​30،504 / عينة) ، 973،444 قراءة لـ IgA (متوسط ​​17،383 / نموذج) ، 139،7345 قراءة لـ IgG (متوسط ​​24،953 / نموذج) ، و 29 ، {{27 }} يقرأ لـ IgE (يعني 5178 / عينة) (الشكل التكميلي 1). تم تضخيم المكتبات لكل نمط متساوي بشكل منفصل ثم تم تجميعها للتسلسل ؛ لذلك ، فإن تحليل النظائر المشتركة المقارن غير ممكن.

كما هو مبين في الشكل 1 ب ، قمنا بتعريف الاستنساخ على أنه مجموعة من الخلايا المنحدرة من جزيء سلف مشترك له نفس المقطع IGHV و IGHJ ، ونفس طول CDR3 ، وهوية النوكليوتيدات بنسبة 90٪ بين CDR3s كما تم تحديده سابقًا في دراسات التكيف B. -خلية الردود '8. يسمح هذا التعريف بدراسة التنوع ، والأقماع المشتركة أو المشتركة ، والتوسع النسيلي في سياق alloimmunity فيالكلىزرع. يتم عرض عدد المخاريط الفريدة لكل فرد في كل نقطة زمنية على هيئة شريط في المادة التكميلية (الشكل التكميلي 1). من أجل صرامة تحليل البيانات ، قمنا بخصم العينات باستخدام<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">الكلىزرع يتميز بانتشار إبشتاين بار

الشكل 1 خط أنابيب الدراسة الشاملة (أ) تمثيل تخطيطي لبنية الجسم المضاد وعملية تكوين VDJ المسؤولة عن التنوع الناتج في الذخيرة المناعية. التسلسل لـ gDNA و cDNA ، وتحليل التنوع مع مراعاة عدد الحيوانات المستنسخة (الثراء) وتكرار كل استنساخ (شانون إنتروبيا) ، وتحليل الشبكة ، وتحليل النسيلي و IGHVgene

فيروس (EBV) المصاب بالخلايا البائية. لاحظنا زيادة عدد الحيوانات المستنسخة في الوقت 6 في هذا المريض ، مع انخفاض تنوع نسيلي من قبلالكلىزرع وبعد 24 شهرًا من زرع الكلى. نظرًا لأن المكتبات تم تضخيمها من كمية ثابتة من القالب ، فقد يكون الجزء الأكبر من الخلايا البائية في الدم قد أدى إلى عدد أكبر من الأنماط المستنسخة الممثلة في المنتجات المتسلسلة. بسبب العملية المرضية المميزة والفريدة من نوعها في هذا المريض ، تم استبعاد هذه العينة من التحليل المستقبلي.

يرتبط تنوع الخلايا البائية قبل الزرع بالرفض. كما هو مبين في الشكل 1 ج ، قمنا بفحص تنوع الذخيرة المناعية للخلايا البائية مع الأخذ في الاعتبار ثراء الأنواع (عدد النسخ الفريدة) وانتروبيا شانون (المعادلة (1) من الطرق) عبر النقاط الزمنية والنتائج السريرية باستخدام نموذج الانحدار الخطي مع مراعاة العدد المستنسخات أو الانتروبيا كمتغير تابع ونتيجة سريرية أو SHM كمتغير عامل مستقل. ذخيرة من قبلالكلىكان الزرع في العلاقات العامة أكثر تنوعًا بشكل ملحوظ مما كان عليه في NP (الثراء: قيمة P=0. 005 ، إنتروبيا: قيمة P=0. 01) مع استمرار نفس الاتجاه بعد 6 أشهرالكلىزرع (الثراء: قيمة P=0. 0 2 ، إنتروبيا: P-value=0. 02) ، وبدون اختلافات جماعية يمكن تمييزها بعد عامين من الزرع (الشكل 2 أ) والشكل التكميلي 2). أظهرت بيانات تسلسل cDNA بعد الزرع نفس الاتجاه في تنوع ذخيرة أكبر في 6 أشهر بعد الزرع ، في الغالب لنماذج IgD (الثراء: P-value=0. 02 ، إنتروبيا: P-value=0. 03) (الشكل 2 ب والشكل التكميلي 2). لم يكن هناك تأثير مربك على البيانات من المتغيرات الديموغرافية والسريرية المختلفة ، مثل عمر المتلقي ، والجنس ، والعرق ، ومصدر المتبرع ، ونوع كبت المناعة ، وعدم تطابق HLA ، وسبب الفشل الكلوي. نظرًا لأن استجابة الخلية B لعمر 1- عامًا (الحد الأدنى للعمر في البيانات) و 19- عامًا (الحد الأقصى للعمر في البيانات) قد تكون مختلفة تمامًا ، فقد أجرينا حساسية تحليل باستثناء هذين المريضين وظلت النتائج مهمة (NP مقابل PR في الوقت 0: الثراء: P-value=0. 01 ، إنتروبيا: P-value=0. 03). في مقياس آخر لتنوع الذخيرة المناعية ، قمنا بتقييم SHM ، وتم تحديده على أنه تواتر الطفرات في كل مقطع جيني V ، ووجدنا اتجاهًا لعدد أكبر من SHM للعلاقات العامة قبل الزرع ، واتجاهًا ل SHM أعلى في IgD isotype في العلاقات العامة في 6 أشهر بعد الزرع (القيمة الاحتمالية=0. 06).

يتغير تنوع الخلايا البائية بمرور الوقت من خلال النتائج السريرية. لمعرفة ما إذا كان تنوع ذخيرة الجهاز المناعي يتغير بمرور الوقت من خلال النتيجة السريرية ، قمنا بنمذجة البيانات الطولية باستخدام نماذج التأثير المختلط الخطية مع مراعاة التفاعل بين النتيجة السريرية والوقت. لقد وجدنا أن NP و PR يتصرفان بشكل مختلف عبر الوقت بعد الزرع مما يظهر زيادة في التنوع في NP وانخفاض في التنوع في العلاقات العامة ، بينما بالنسبة لـ PNR ، ظل التنوع ثابتًا بمرور الوقت. وقد لوحظ هذا بالنسبة لـ gDNA (الثراء: قيمة P=0. 007 ، الانتروبيا: P-value=0. 001 ، الشكل 3 أ) وجميع الأنماط المتشابهة لـ cDNA ، مع الاختلافات الأكثر أهمية في الكون لأنماط IgM و IgD (IgA: P-value=0. 07، IgD: P-value=0. 02، IgG: P-value=0. 05، IgM: P-value=0. 04 ، الشكل 3 ب). يتم عرض المخططات الخاصة بالثراء بقيم P المقابلة في الشكل التكميلي 3. كما لوحظ في المخططات ، يمتلك فرد واحد عينة إضافية في وقت 32 شهرًا ، مما قد يؤدي إلى انحراف النتائج ، وبالتالي تم إجراء تحليل الحساسية باستثناء هذه العينة من التحليل ومراقبة النتائج المماثلة باستثناء IgG و IgM حيث يتم فقدان الإشارة (gDNA-entropy: P-value=0. 004. cDNA- entropy: IgA: P-value=0. 1 ، IgD: P-value=0. 05، IgG: P-value=0. 08، IgM: P-value=0. 1).

قد تتأثر تدابير التنوع بأخذ العينات البيولوجية والتقنية. يمكن أن يختلف تنوع العينة بشكل ملحوظ عن التنوع العام في المرجع حيث يتم تمثيل جزء بسيط فقط من مليارات الخلايا ، وهو ما يُعرف بمشكلة الأنواع المفقودة. قد يكون أخذ العينات الفنية موجودًا لأن كل عينة قد تختلف في عمق التسلسل ودرجة معينة من الأخطاء التجريبية. للتعامل مع مشكلة الأنواع المفقودة ، استخدمنا أداة Recon (إعادة بناء الحيوانات المستنسخة المقدرة من الأرقام المرصودة) ، والتي تقدر التوزيع الكلي لحجم الاستنساخ. إعادة صياغة تقديرات دقيقة وقوية لمجموعة من مقاييس التنوع ، بما في ذلك الثراء والنتروبيا مما يسمح بإجراء مقارنات قوية للتنوع بين الأفراد. للتعامل مع عمق التسلسل ودرجة معينة من الأخطاء التجريبية ، قمنا بتنفيذ استراتيجية الاختزال ؛ استراتيجية مستخدمة جيدًا في تحليل الذخيرة المناعية 11،17،3 0. في تحليل Recon (الشكل التكميلي S4: A-E) ، تم تكرار كل من الثراء والتنوع لبيانات gDNA. في بيانات cDNA ، يُظهر النمط 6 IgD للوقت الاتجاه ولكنه لم يصل إلى دلالة على الرغم من تكرار النتائج الطولية لنماذج IgA و IgD و IgG. في تحليل الاختزال (الشكل التكميلي S4: F-J) ، يتم تكرار كل شيء ولكن الوقت هو 0 لبيانات gDNA. قد يكون هذا نتيجة للقيود التي يتم الاختزال

الشكل 2: مخططات الكمان التي توضح عدد الحيوانات المستنسخة (الثراء) عبر النتائج السريرية الثلاثة. عدد من الحيوانات المستنسخة في بعض الأحيان 0 و 6 و 24 من عينات gDNA. (ب) عدد الحيوانات المستنسخة في الوقت 6 لنمط IgD من عينات (كدنا). يتم الحصول على قيم P من تعديل نموذج الانحدار الخطي مع الأخذ في الاعتبار عدد الحيوانات المستنسخة كمتغير تابع والنتيجة السريرية كمتغير عامل مستقل (عدد=27 عينات). تمثل مؤامرات الكمان الكثافة الاحتمالية للبيانات عند كل قيمة. تمثل علامة النقطة القيمة المتوسطة مع النطاق بين الشرائح الربعية. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر

الشكل 3 البيانات الطولية المرسومة بخط معادل لكل نتيجة سريرية. (أ) يُقاس التنوع بواسطة إنتروبيا شانون ويتم تمثيله عبر نقاط زمنية من خلال النتائج السريرية الثلاثة (NP ، PNR ، PR) في جدنا. (ب) يُقاس التنوع بواسطة إنتروبيا شانون ويتم تمثيله عبر نقاط زمنية من خلال النتائج السريرية الثلاثة (NP ، PNR ، PR) بواسطة الأنماط النظيرية في cDNA. تتوافق قيم P مع مصطلح التفاعل المحدد بالوقت × النتيجة السريرية التي تعدل نموذج التأثير الخطي المختلط (عدد=27 عينات). تمثل كل نقطة الانتروبيا لكل عينة على طول الوقت بخطها المترابط وفاصل الثقة. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر

استراتيجيات ضمنية ، لا سيما على بيانات جدنا حيث عدد التسلسلات أقل بكثير من لبيانات كدنا. في gDNA ، قصرنا التحليل على الأفراد الذين لديهم ما لا يقل عن 1 0 00 نسخة للحفاظ على التسلسلات الكافية. تم أخذ العينات السفلية إلى ما لا يقل عن 1062 نسخة مقارنة بـ 62173 نسخة في (كدنا). على الرغم من هذا القيد ، لاحظنا الاتجاه بالنسبة للوقت 0 ، وحافظنا على أهمية التحليل الطولي في جدنا ، وقمنا بتكرار جميع الارتباطات في (كدنا). في كلا التحليلين (إعادة التصنيع والاختزال) ، قمنا بتكرار النتائج ، على الرغم من بعض القيود الموضحة هنا ، والتي توضح صحة النتائج التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا.

تظهر شبكات الخلايا البائية اختلافات في التوسع النسيلي. يمكن تمثيل ذخيرة الخلية B بشكل طبيعي كشبكة قائمة على تنوع التسلسل. في بياناتنا ، قمنا بتطوير شبكة بصرية لكل عينة (الشكل 4 والشكل التكميلي 5-7) حيث يمثل كل رأس BCR فريدًا ، وعدد من BCRs المتطابق بناءً على تسلسل النيوكليوتيدات الخاص بهم يحدد حجم الرأس. توجد حافة بين الرؤوس عندما تنتمي إلى نفس الاستنساخ ، لذلك يمكن عرض مجموعات الخلايا البائية كمجموعات من الرؤوس المترابطة التي تشكل استنساخًا. لتقدير الشبكة ، استخدمنا مؤشر جيني ، وهو مقياس تفاوت تم تطبيقه على توزيعات الرأس والعنقود. عند تطبيقه على حجم الرأس ، جيني (V) ، يتم تمثيل الطبيعة النسيليّة الشاملة. إذا كانت جيني (V) أقرب إلى 1 ، فإن الرؤوس تكون غير متساوية تُظهر توسعًا في بعضها ، وأقرب إلى 0 بخلاف ذلك. عند تطبيقه على حجم الكتلة ، جيني (C) ، يتم تمثيل الهيمنة النسيليّة. إذا كانت المجموعات أقرب إلى 1 ، تكون المجموعات غير متساوية وبالتالي تمثل الحيوانات المستنسخة السائدة ، إذا كانت أقرب إلى 0 ، فإن جميع المجموعات متساوية في الحجم.

في الشكل 4 ، نعرض مثالاً للاختلافات المرئية والكمية الملحوظة بين ذخيرة الخلايا B التمثيلية من كل مجموعة من مجموعات النتائج السريرية الثلاث ، عبر ثلاث نقاط زمنية مختلفة (ما قبل الزرع ، وما بعد الزرع 6 و 24 شهرًا) . في ذخيرة العلاقات العامة ، هناك وفرة من متواليات الخلايا البائية لتشكيل مجموعات أكبر وأكبر من الحيوانات المستنسخة مقارنةً بـ NP بينما يقع PNR بينهما. بمرور الوقت ، تُظهر مجموعة العلاقات العامة انخفاضًا في عدد BCR والمستنسخات الفريدة مقارنةً بـ NP. يتم توفير شبكات الخلايا B التفصيلية لكل فرد في الدراسة في الأشكال التكميلية. 5-7. من المثير للاهتمام ملاحظة النمط المتنوع للغاية لشبكة الخلايا البائية لدى الفرد الذي طور PTLD في مجموعة NP (الشكل التكميلي 5) ، مع عدم وجود توسع للخلايا B قبل الزرع ، متبوعًا بزيادة الخلايا البائية بعد 6 أشهر وتوسع نسيلي واضح مصحوب بانخفاض في التنوع في 24 شهرًا بعد الزرع.

عند إجراء مزيد من التقييم لمقياس مؤشر جيني (الشكل 5) ، أظهرت مجموعة العلاقات العامة باستمرار مقاييس أعلى بشكل ملحوظ لكل من الرأس والمجموعة على مجموعة NP ، مما يشير إلى أن مرضى مجموعة العلاقات العامة لديهم توسع نسيلي أعلى في الأساس ،

الشكل 4 شبكات ذخيرة خلايا B من ثلاثة أفراد تمثل النتائج السريرية الثلاث عبر نقاط زمنية. يمثل كل رأس BCR فريدًا كونه حجم الرأس المحدد بواسطة عدد BCRs المتطابقة مع مراعاة تسلسل النيوكليوتيدات. توجد حافة بين الرؤوس عندما تنتمي إلى نفس النسخة التي تم تحديدها من قبل ، لذا فإن المجموعات عبارة عن مجموعات من الرؤوس المترابطة تشكل استنساخًا. تُظهر كل عينة مؤشر جيني الذي تم الحصول عليه لحجم الرأس (جيني (V)) وحجم الكتلة (جيني (ج)). يعكس BCR إجمالي مستقبلات الخلايا البائية لتلك العينة المحددة وتعكس الحيوانات المستنسخة العدد الإجمالي للنسخ الفريدة. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر

والمزيد من التوسع بعد الزرع لمجموعة فرعية من الحيوانات المستنسخة السائدة (P-value [الانحدار الخطي] <0. 0="" 5="" ،="" الشكل="" 5).="" تقع="" مجموعة="" pnr="" بين="" np="" و="" pr="" كما="" هو="" موضح="" سابقًا="" ،="" على="" الرغم="" من="" أن="" هذه="" المرة="" مختلفة="" بشكل="" كبير="" عن="" مجموعة="" np="" في="" الوقت="" 24="" (p-value="" [الانحدار="" الخطي]=""><0.05). على="" الرغم="" من="" أن="" بيانات="" الشكل="" 5="" قد="" تم="" إنشاؤها="" من="" بيانات="" gdna="" ،="" إلا="" أن="" النمط="" النظري="" igm="" لـ="" cdna="" أظهر="" نفس="" الاختلافات="" (قيمة="" p="" [الانحدار="" الخطي]="0." 05)="" (الشكل="" التكميلي="">

بعض المستنسخات وجينات IGHV متورطة في الرفض.

على الرغم من أن تركيزنا الأساسي كان على توصيف ذخيرة الخلايا البائية من خلال مجموعات النتائج السريرية ، مما يوفر صورة عالمية للاستجابة المناعية قبل وبعد الزرع ، فقد مكنتنا بياناتنا أيضًا من إجراء تحليل محدد لتسلسل Ig في الاستنساخ و IGHV مستوى الجين.

بالنسبة للتحليل النسيلي ، قمنا بتقييم ارتباط وجود أو عدم وجود كل نسخة معينة (118223 استنساخًا إجماليًا) مع النتيجة السريرية (PR ، PNR ، NR) في كل نقطة زمنية. بتطبيق اختبار فيشر الدقيق ، وجدنا 8 و 4 و 21 نسخة مرتبطة اسميًا بالنتائج السريرية في كل شهر 0 و 6 و 24 شهرًا على التوالي (الجدول التكميلي 1). على الرغم من عدم اجتياز أي منها لتصحيح الاختبار المتعدد ، ويرجع ذلك أساسًا إلى نقص الطاقة نظرًا لأن لدينا حجم عينة محدود في التحليل مع آلاف المعلمات (النسخ المستنسخة) ، يمكننا أن نلاحظ أن عدد قليل من الحيوانات المستنسخة التي اقتربت من الأهمية (P-value <{{ 11}}.="" 05)="" عبر="" المرضى="" فقط="" في="" مجموعة="" العلاقات="" العامة="" وتم="" إثرائهم="" في="" 24="" شهرًا="" بعد="">

درسنا أيضًا ما إذا كانت بعض الحيوانات المستنسخة استمرت خلال وقت أخذ العينات ، أكثر من غيرها ، في كل نتيجة سريرية (الشكل التكميلي 9). نحن نحسب مقياسين مختلفين: (1) عدد الحيوانات المستنسخة المستمرة و (2) التوسع النسيلي. لاحظنا أن الحيوانات المستنسخة التي كانت ثابتة في العلاقات العامة تم توسيعها بشكل ملحوظ (P-value [الانحدار الخطي]=0. 01 ، PR مقابل NP) وأظهرت اتجاهًا لعدد أكبر من الحيوانات المستنسخة المستمرة (P- القيمة [الانحدار الخطي]=0. 09). لقد درسنا كذلك ما إذا كانت هذه المستنسخات المستمرة قد تمت مشاركتها أيضًا عبر أفراد مختلفين في كل نتيجة سريرية. من 263 استنساخًا مستمرًا تم اكتشافها ، تمت مشاركة 23 مستنسخة عبر الأفراد. تمت مشاركة خمسة داخل نفس PNR وستة داخل مجموعة PR ولم تتم مشاركة أي مستنسخات بين مجموعة NP. في المجموع ، كانت 12 نسخة مشتركة شائعة في كلا المجموعتين من المرضى الذين يعانون من إصابات زرع مزمنة وتليف مع مرور الوقت (PR و PNR). يتم توفير قائمة الحيوانات المستنسخة المشتركة عبر الأفراد في المادة التكميلية (الجدول التكميلي 2).

أجرينا بعد ذلك تحليل الجينات IGHV ، بالنظر إلى استخدام الجينات IGHV لكل عينة ، تم تحديده على أنه عدد مرات استخدام كل جين IGHV ، تم تطبيع

الشكل 5 مؤشر Vertex Gini مرسوم مقابل مؤشر Cluster Gini. يمثل مخطط التبعثر كل عينة في الأوقات 0 و 6 و 24. توضح Boxplots الفروق بين جيني (V) وجيني (C) في الوقت 24. يتم الحصول على قيم P من تعديل نموذج الانحدار الخطي اعتبار جيني (V) وجيني (C) كمتغير تابع ونتيجة إكلينيكية كمتغير عامل مستقل لكل نقطة زمنية (عدد=27 عينات). في boxplot ، يتم عرض الوقت 24 فقط ولكن الوقت 0 و 6 حيث يكون أيضًا مهمًا لـ NP مقابل PR: الوقت 0: P (Gini (V))=0. 1 ، P ( جيني (ج))=0. 05 ؛ الوقت 6 ف (جيني (الخامس))=0. 02، ف (جيني (ج))=0. 01 ؛ الوقت 24: P (Gini (V))=0. 003، P (Gini (C))=0. 01. يمثل النطاق داخل الصندوق القيمة المتوسطة ، ويحدد المربع النطاق الربيعي (IQR) ، والشعيرات تحدد الربع الأول والثالث ± 1.5 × IQR. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر

الجينات (استخدام جينات IGHV> {0}. 0 5 في 1 0 بالمائة على الأقل من العينات) ، وتطبيق نموذج الانحدار الخطي للعثور على تلك الجينات المرتبطة مع كل نتيجة سريرية ، في كل نقطة زمنية. من جينات الـ 27 IGHV التي مرت بمرشح منخفض التعبير ، وجدنا جينات ذات دلالة بين مجموعة PR و NP (القيمة P <0. 05)="" مع="" ثلاثة="" جينات="" في="" الوقت="" 0="" و="" 7="" في="" الوقت="" 6="" و="" 16="" في="" الوقت="" 24="" (الشكل="" 6="" أ-ج).="" من="" هذه="" الجينات="" ،="" 1="" (ighv="" 3-11)="" في="" الوقت="" 0="" ،="" 5="" جينات="" (ighv="" 3-7="" ،="" ighv="" 3-15="" ،="" ighv="" 3-21="" ،="" ighv="" 3-23="" ،="" ighv="" {="" {22}})="" في="" الوقت="" 6="" و="" 16="" جينًا="" (ighv="" 1-8="" ،="" ighv="" 1-18="" ،="" ighv="" 1-46="" ،="" ighv="" 2-="" 5="" ،="" ighv="" 3-7="" ،="" ighv="" {{="" 30}}="" ،="" ighv="" 3-15="" ،="" ighv="" 3-23="" ،="" ighv="" 3-30="" ،="" ighv="" 3-33="" ،="" ighv="" 3-48="" ،="" ighv="" 3-74="" ،="" ighv="" {{37="" }}="" ،="" ighv="" 4-59="" ،="" ighv="" 4-61="" ،="" ighv="" 5-51)="" في="" الوقت="" 24="" مرت="" تصحيح="" الاختبار="" المتعدد="" لمعدل="" الاكتشاف="" الخاطئ="" (fdr).="" ومن="" المثير="" للاهتمام="" ،="" وجدنا="" أن="" ighv="" 3-23="" كان="" الجين="" الأكثر="" أهمية="" ووفرة="" عبر="" جميع="" النقاط="" الزمنية="" الثلاث="" في="" مقارنة="" np="" مقابل="" pr="" (الوقت="" 0:="" p-value="0." 04="" ،="" الوقت="" 6:="" p-="" القيمة="0." 003="" ،="" الوقت="" 24:="" القيمة="" الاحتمالية="0." 02)="" (الشكل="" 6="" د).="" بالإضافة="" إلى="" ذلك="" ،="" قمنا="" بتقييم="" ما="" إذا="" كانت="" متواليات="" ighv="" 3-23="" ممثلة="" تمثيلا="" زائدا="" بين="" التسلسلات="" المشتركة="" من="" التحليل="" النسيلي="" السابق.="" وجدنا="" ،="" باستخدام="" تحليل="" التخصيب="" مع="" اختبار="" فيشر="" الدقيق="" ،="" أن="" متواليات="" ighv="" 3-23="" تم="" تمثيلها="" بشكل="" كبير="" بشكل="" كبير="" في="" كليهما="" ،="" المستنسخات="" الثابتة="" المشتركة="" بين="" الأفراد="" (الجدول="" التكميلي="" 2)="" (قيمة="" p=""><2.2 ×="" 10="" -="" 16)="" )="" ،="" والمستنسخات="" المرتبطة="" بالنتيجة="" السريرية="" في="" الوقت="" 24="" (الجدول="" التكميلي="" 1)="" (قيمة="" p=""><2.2 ×="" 10="" 16).="" لاحظنا="" أن="" الأفراد="" 9="" في="" مجموعة="" nr="" ،="" الذين="" وُجدوا="" يشاركون="" بعض="" الحيوانات="" المستنسخة="" المستمرة="" مع="" مرضى="" التطور="" في="" التحليلات="" السابقة="" ،="" تم="" تصنيفهم="" مع="" مجموعة="" العلاقات="" العامة="" في="" جميع="" النقاط="" الزمنية.="" لم="" يكن="" هناك="" تأثير="" مربك="" على="" البيانات="" من="" المتغيرات="" الديموغرافية="" والسريرية="" المختلفة="" ،="" مثل="" عمر="" المتلقي="" ،="" والجنس="" ،="" والعرق="" ،="" ومصدر="" المتبرع="" ،="" ونوع="" كبت="" المناعة="" ،="" وعدم="" تطابق="" hla="" ،="" وسبب="" الفشل="" الكلوي.="" بالإضافة="" إلى="" ذلك="" ،="" وجد="" أن="" هذا="" الجين="" مهم="" أيضًا="" في="" كل="" من="" igm="" (قيمة="" p="" [الانحدار="" الخطي]="0." 008)="" و="" igd="" (قيمة="" p="" [الانحدار="" الخطي]="0." 05)="" النظائر="" استنادًا="" إلى="" (كدنا)="" في="" 24="" شهرًا="" بعد="" الزرع="" ،="" وفقًا="" للنتائج="" السابقة="" التي="" تُظهر="" الاتساق="" مع="" هذين="" النوعين="" من="" النظائر="" الأكثر="" إثراءً="" في="" مجموعة="" العلاقات="" العامة.="" تم="" العثور="" على="" ثلاثة="" جينات="" أخرى="" فقط="" ذات="" أهمية="" في="" تحليل="" cdna="" ،="" وكانت="" جميعها="" في="" 24="" شهرًا="" بعد="" الزرع="" في="" igd="" و="" igm="" isotypes="" (ighv="" 3-15="" و="" ighv="" 4-="" 61="" في="" igd="" و="" ighv="" 4-39="" في="">

مناقشة

التنوع سمة أساسية لجهاز المناعة ، وفي البشر الأصحاء ، أمر بالغ الأهمية ضد مسببات الأمراض للتعامل مع الأمراض. في زراعة الأعضاء ، يتم إجراء التلاعب العلاجي المتعمد سريريًا للسماح بتجاهل العضو الغريب أو قبوله من قبل الجهاز المناعي للمريض حتى لا يتسبب في حدوث استجابة مناعية خيفية ، مما يؤدي إلى الرفض. تعد الخلايا البائية مكونًا مهمًا في هذه العملية وقد أظهرت مجموعتنا وآخرون أنها محورية في كل من عرض المستضد وإنتاج الأجسام المضادة. في هذا العمل ، استخدمنا تسلسل الخلايا البائية عالي الإنتاجية لفهم تنوع واستنساخ الخلايا البائية بشكل أفضلالكلىالدورة الدموية لمتلقي الزرع ، قبل التطعيم وبعد 24 شهرًا من المتابعة ، مع التقييم الطولي للذخيرة المناعية للخلايا البائية. بشكل عام ، يُظهر تحليلنا تنوعًا أعلى للخلايا B قبل التطعيم ، والاختلافات طوليًا مع انخفاض في التنوع مصحوبًا بتوسع نسيلي ، وزيادة في استخدام بعض جينات IGHV بين أولئك الذين يستمرون في رفض الطعوم.

تتمثل إحدى الاحتياجات السريرية الرئيسية التي لم تتم تلبيتها وهي عملية زرع الأعضاء في الافتقار إلى التنبؤ الدقيق والحساس وغير الجراحي بإصابة الزرع والنتائج السيئة. هذه المهمة معقدة بسبب وجود عوامل متنوعة تؤثر على بقاء الكسب غير المشروع. في هذه الدراسة ، وجدنا أن الأفراد المستقرين لديهم تنوع منخفض في ذخيرة المناعة للخلايا B قبل الزرع مقارنةً بأولئك الذين رفضوا العضو. يجب أن تكون الخطوة التالية هي إظهار القيمة التنبؤية لتنوع ذخيرة الخلايا البائية ، وتوفير مؤشرات حيوية محتملة أفضل للتنبؤ بالرفض قبل التطعيم ، وإمكانية التنفيذ في الرعاية السريرية وخيارات كبت المناعة قبل وبعدالكلىزرع اعضاء. إذا كانت هذه الميزة ناتجة عن أي عامل يساهم في تقليل التنوع في الأفراد المستقرين ، مثل العوامل البيئية أو الجينية ، فلا يمكننا فقط توقع الرفض ولكن أيضًا منعه. في الواقع ، أظهرت النتائج الحديثة جدًا أن التباين في جهاز المناعة مدفوع بعوامل بيئية وعقلية ووراثية. في دراستنا ، لم نتمكن من العثور على أي ارتباط بأي خصائص ديموغرافية أو سريرية أخرى للمريض (العمر ، والجنس ، والعرق ، وكبت المناعة ، ومصدر الأعضاء ، وعدم تطابق HLA ، والداء الكلوي بمراحله الأخيرة). في هذا الصدد ، نحتاج إلى تحليل جديد لتأكيد ما إذا كانت عوامل محددة تؤثر على تنوع ذخيرة الخلايا البائية ونتائج الزرع.

تظهر نتيجة أخرى مثيرة للاهتمام في دراستنا أن الذخيرة المناعية تتصرف بشكل مختلف عبر الزمن اعتمادًا على مجموعة النتائج السريرية. بالنسبة لأولئك الذين يظهرون رفضًا للعضو بعد الزرع ، يكون تنوع الخلايا البائية أعلى في البداية ثم يتناقص بمرور الوقت ، بينما يظهر اتجاه التنوع العكسي في المرضى الذين لا يصابون بالرفض أو إصابة مزمنة بالكسب غير المشروع. على الرغم من أن جميع الأفراد تلقوا نفس الحمل المثبط للمناعة بعد الزرع ، فإن بعض التفسيرات المحتملة لانخفاض التنوع في المرضى الذين يصابون بالرفض قد تتعلق بحقيقة أن هؤلاء المرضى يتلقون مؤقتًا عبءًا متزايدًا بشكل كبير من كبت المناعة لعلاج الرفض ثم يتم الاحتفاظ بها على خط الأساس الأعلى. على الرغم من أن هذا قد يفسر الانخفاض في تنوع الخلايا البائية بمرور الوقت ، ويشرح الفرق في 24 شهرًا بعد الزرع ، فمن غير المرجح أن يكون هذا هو السبب ، حيث أن التنوع المنخفض في مجموعة العلاقات العامة هو

التين. 6 خريطة الحرارة و boxplot لتحليل استخدام جينات IGHV. خريطة التمثيل اللوني توضح جينات IGHV المختارة على أنها ذات دلالة اسمية (قيمة P <0. 0="" 5)="" في="" الوقت="" 0="" (أ)="" و="" 6="" (ب)="" و="" 24="" (ج)="" لـ="" np="" مقابل="" العلاقات="" العامة.="" يمثل="" مقياس="" اللون="" الأحمر="" التعبير="" عن="" كل="" جين="" عبر="" العينات.="" تُظهر="" العصابات="" الموجودة="" في="" الأعلى="" النتيجة="" السريرية="" وسبب="" الداء="" الكلوي="" بمراحله="" الأخيرة.="" يعرض="" boxplot="" تعبير="" ighv="" 3-23="" عبر="" النقاط="" الزمنية="" لـ="" np="" مقابل="" pr="" (الوقت="" 0:="" القيمة="" p="0." 04="" ،="" الوقت="" 6:="" القيمة="" p="0." 003="" ،="" الوقت="" 24:="" p="" -القيمة="0." 02)="" (د).="" يمثل="" النطاق="" داخل="" الصندوق="" القيمة="" المتوسطة="" ،="" ويحدد="" المربع="" النطاق="" الربيعي="" (iqr)="" ،="" والشعيرات="" تحدد="" الربع="" الأول="" والثالث="" ±="" 1.5="" ×="" iqr.="" يتم="" الحصول="" على="" قيم="" p="" من="" تعديل="" نموذج="" الانحدار="" الخطي="" مع="" الأخذ="" في="" الاعتبار="" الجينات="" v="" كمتغير="" تابع="" والنتيجة="" السريرية="" كمتغير="" مستقل.="" (عدد="12" من="" العينات).="" يتم="" توفير="" بيانات="" المصدر="" كملف="" بيانات="">

شوهد أيضًا في 6 أشهر بعد الزرع ، في وقت لم يصاب فيه المرضى بعد بالرفض ، مما يشير إلى احتمال مشاركة عمليات نشطة أخرى. مراقبة التوسع النسيلي الانتقائي مع الحيوانات المستنسخة الأكثر انتشارًا فقط في المرضى الذين يعانون من الرفض و / أو المزمن التدريجيالكلىإصابة الزرع ، تشير إلى اختيار ذي صلة بيولوجيًا ، مدفوعًا بالمستنبطات ، واستمرارية وتوسيع بعض الحيوانات المستنسخة بمرور الوقت ، مما يفسر الانخفاض العام في التنوع الزمني. على الرغم من أننا يمكن أن نفترض أن التوسع في هذه الحيوانات المستنسخة من المحتمل أن يكون مرتبطًا بإصابة جهاز المناعة الخيفي في الكسب غير المشروع ، فإن الدليل المباشر على أن توسع هذه الحيوانات المستنسخة هو مناعي خيفي يتطلب دراسات إضافية في المختبر والحيوان.

يظل الرفض الحاد أقوى عامل سلبي لبقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل على الرغم من التحسينات السريعة في علاجات قمع المناعة. توصلت هذه الدراسة أيضًا إلى ارتباط بين استخدام بعض جينات IGHV مع الرفض ، على الرغم من أنه يجب استكشاف العلاقة السببية في الدراسات المستقبلية. IGHV 3-23 هو الجين الأكثر إثارة للاهتمام في تحليل gDNA لأنه يستخدم بشكل ملحوظ في المرضى الذين يصابون بالرفض عبر جميع النقاط الزمنية المقاسة ويتم تمثيله بشكل مفرط في النسخ المستمرة المشتركة بين الأفراد والمستنسخات المخصبة بين المرضى المرفوضين في 24 شهرًا بعد الزرع. يتم التحقق من صحة هذا الجين أيضًا في 24 شهرًا بعد الزرع في كل من الأنماط النظيرية IgD و IgM في تحليل cDNA. لقد ارتبط IGHV 3-23 على نطاق واسع بالتشخيص السيئ في ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن ، وقد ثبت أن الغالبية العظمى من سلاسل IGHV 3-23 احتفظت بالقدرة على التوسط في تفاعلات المستضدات. يتم إنتاج المستضدات الفائقة للخلايا B عن طريق الفيروسات والبكتيريا ، والمعروف أنها ترتبط بالجلوبيولينات المناعية خارج مواقع الارتباط التقليدية للمستضد. لقد ثبت أن مواجهات الخلايا البائية مع المستضد الفائق تحفز الانتشار والتفعيل والهجرة والحذف. في المزروعالكلى، هناك احتمال للتعرض المستمر للفيروس والمستضدات البكتيرية ، فيما يتعلق إما بمسببات إعادة التدفق الأولي المثاني الحالبي كسبب للدخول الكلوي بمراحله الأخيرة أو إعادة تدفق البول الثانوي بعد إعادة زرع الحالب المزروع ، أو إعادة التدفق بعد عدوى المسالك البولية ، والتي تزداد مع التعرض لتثبيط المناعة المزمن بعد الزرع. قمنا بتعديل نتائج التحليلات لسبب الفشل الكلوي ، من بين عوامل إكلينيكية وديموغرافية أخرى ؛ تظل النتائج التي نوقشت سابقًا مهمة على الرغم من أننا أدركنا أن المريض المصنف بشكل خاطئ في NP في التحليل (الشكل 6) كان مصابًا بمرض عودة. تشنغ وآخرون. سبق أن وجدت سابقًا أن الحيوانات المستنسخة في أنسجة الخزعة لمتلقي زرع الكلى في خلايا B كانت لها غلبة للجين 3-23 من بين آخرين 45. أظهر Grover وزملاؤه 46 أن الأجسام المضادة لهذا الجين المعين لا تتعرف على مستضدات HLA المانحة ، بل كانت محددة للإشريكية القولونية وأظهر مودينا وآخرون .47 أن عبء عدد البكتيريا في البول كان أعلى بكثير في المرضى الذين يعانون من التليف الخلالي والضمور الأنبوبي من أولئك الذين لديهم طعوم كانت تعمل بشكل جيد. لقد قمنا بتوسيع هذه النتائج لتوضيح أن استخدام جين IGHV 3-23 يكون أعلى بشكل ملحوظ في العديد من المرضى الرافضين في الدم المحيطي وقد يشير إلى وجود مستضدات شائعة معينة في قيادة الرفض. في المستقبل ، يمكن استخدام تعبير IGHV 3-23 لمراقبة الاستجابة المناعية تجاه المزروعالكلى.

بتوسيع دراستنا باستخدام تسلسل cDNA ، يمكننا تكرار غالبية نتائجنا في اثنين من الأنماط النظيرية (IgM و IgD) ، مما يُظهر تنوعًا أقل قبل الزرع في NP ، كونهما الأكثر أهمية في التحليل الطولي مع مزيد من التوسع والسيطرة الحيوانات المستنسخة في تحليل الشبكة وأيضًا نسخ جين IGHV 3-23. الأجسام المضادة الأولى التي يتم إنتاجها في استجابة مناعية خلطية هي دائمًا IgM وتتقدم بسرعة إلى إنتاج جميع الأنماط النظيرية المختلفة ، IgD و IgA و IgG و IgE ولكن الاهتمام الخاص يتطلب IgD isotype. يتم التعبير عن IgD بشكل مشترك مع IgM ويوجد IgD المفرز وله وظيفة في الدم والإفرازات المخاطية وعلى سطح الخلايا المناعية الفطرية مثل الخلايا القاعدية. الخلايا القاعدية هي خلايا بيضاء تحتوي على الفيروسات والبكتيريا والطفيليات والفطريات ، وتشارك في أمراض الكلى ورفض الزرع. وبالتالي ، هناك دليل آخر يربط استجابات الخلايا البائية بعملية الرفض بالفيروسات والبكتيريا.

هناك حاجة لدراسات مستقبلية لإثبات أن هذا التنشيط يرجع إلى الاختلافات في الميكروبيوم المتلقي مع آثار في التشخيص والعلاج.

سمحت لنا هذه الدراسة بتحديد أهمية بعض استنساخ BCR ، وتحديد مستنسخات BCR ذات الصلة السريرية برفض الطعم الخيفي ، وإظهار أن هناك صلة محتملة لهذه الحيوانات المستنسخة بالمناعة غير المتجانسة ، بالنظر إلى إثراء هذه الحيوانات المستنسخة في المرضى الذين يعانون من المسالك البولية المستعمرة قبل الزرع وأهميتها البيولوجية لاستجابات مسببات الأمراض. فهم أفضل لسلوك الذخيرة المناعية فيالكلىلم تكن عمليات الزرع ممكنة بدون تطبيق BCRSeq جنبًا إلى جنب مع التنفيذ القوي لخطوط الأنابيب الحسابية والإحصائية. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على نهجنا والتي يجب التعرف عليها: أولاً ، يتم اختيار حجم العينة لدينا بشكل كبير وصغير نسبيًا في مجموعة من مرضى الأطفال ، وعلى الرغم من أننا وصلنا إلى الدلالة الإحصائية في تحليلنا والتحقق من صحتها في مصدرين مختلفين للبيانات ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لتأكيد نتائجنا. ثانيًا ، لا تُستثنى نتائجنا من التأثير الذي قد يكون لأخذ العينات البيولوجية والتقنية في تحليلنا. تعتمد مقاييس التنوع على عدة قضايا: حقيقة أن جزءًا بسيطًا فقط من مليارات الخلايا في ذخيرة ما يتم تمثيله في عينة ، والاختلافات في عمق التسلسل ، والأخطاء التجريبية المحتملة. لقد تحكمنا على نطاق واسع في جميع هذه المشكلات ، أولاً في المختبر ، تشغيل نفس الكمية من الدم لكل عينة في نفس الدفعة والثانية ، من الناحية الحسابية والإحصائية ، باستخدام أداة إعادة لتقدير المخزون الكلي وإجراء الاختزال للتحكم في عمق التسلسل والأخطاء التجريبية. ثالثًا ، لقد أجرينا BCRSeq باستخدام مصدرين مختلفين ، gDNA و cDNA. يسهل تسلسل gDNA تقدير استنساخ تسلسل Ig معين نظرًا لأن عدد قراءات التسلسل سيكون متناسبًا مع عدد جزيئات gDNA. يوفر التسلسل (كدنا) تقديرًا لمستوى التعبير النسبي لتسلسلات Ig المختلفة في المرجع. لقد ثبت أنه بالنسبة لمستقبلات الخلايا التائية ، فإن توصيف النمط النسيلي الذي يتم إجراؤه على cDNA ليس جيدًا كما هو الحال في gDNA مما يدل على أن النسبة النسبية للنسخ الفردية تختلف اختلافًا كبيرًا أو أن تتبع النسخ المستنسخة الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية لا ينجح إلا مع gDNA ، ولكن لا mRNA51. رابعًا ، قد يكون تأثير كبت المناعة عاملاً مربكًا في هذا النوع من التحليل. في هذه الدراسة ، تأتي جميع العينات من تجربة سريرية حيث تم تلقي نفس الحمل المثبط للمناعة من قبل جميع المرضى بعد الزرع. ومع ذلك ، فقد تحكمنا في نوعين من الستيرويد وخالي من الستيرويد للتأكد من أن هذه ليست مشكلة ، مع ملاحظة عدم وجود اختلافات في النتائج. أخيرًا ، المجموعة التي نقدمها هنا هي مجموعة عمليات زرع الأطفال. غالبية الجوانب السريرية المزروعة متشابهة لدى الأطفال والبالغين. يتشابه نظام كبت المناعة والأنظمة المستخدمة ، والكرياتينين هو المرقم الحيوي الرئيسي في المصل ، ويتم تحديد الرفض الحاد بشكل أساسي عن طريق الخزعة باستخدام معايير بانف ، وآليات الرفض الخاصة بالمصل.الكلىالكسب غير المشروع بشكل عام متشابه ، وبالتالي فإن غالبية الأبحاث التي أجريت على البالغين أو الأطفال قد تنطبق على كليهما. ومع ذلك ، هناك جوانب أخرى مثل عدم الامتثال / عدم الالتزام بتثبيط المناعة ، والجوانب المناعية ، وأمراض الكلى الأولية ، مما يؤدي إلى الفشل الكلوي ، وغالبًا ما يرتبط بقضايا المسالك البولية ، والتحصينات المطلوبة قبل الزرع قد تختلف ، لذلك قد يختلف التحليل الإضافي في سيكون السكان البالغون ضروريين لتعميم هذه النتائج.

على الرغم من هذه القيود ، تكشف بياناتنا أنه لوحظ تنوع أعلى قبل الزرع لدى الأفراد الذين يستمرون في رفض العضو ، مما يشير إلى استعداد للرفض ، مما قد يكون له آثار مستقبلية في التنبؤ بخطر الرفض قبل الانغراس ، وخيارات كبت المناعة ، والرعاية السريرية الممارسات. بعد 24 شهرًا من المتابعة ، لوحظ انخفاض عام في التنوع بمرور الوقت مصحوبًا باستمرارية وتوسع بعض الحيوانات المستنسخة وزيادة استخدام العديد من جينات IGHV في مجموعة الرفض ، مما قد يشير إلى وجود مستضدات مشتركة معينة في قيادة الرفض. لوحظ اهتمام خاص بزيادة استخدام جين IGHV 3-23 بين مرضى الرفض لأنه ارتبط سابقًا بـالكلىزرع ويمكن أن يكون مكونًا رئيسيًا لدفع عملية الرفض. يقدم هذا العمل تحليلًا طوليًا للذخيرة المناعية للخلايا البائية في عمليات زرع الأعضاء ، مما يعزز المزيد من الدراسات لتأكيد هذه النتائج حيث قد يكون لها آثار إكلينيكية في التنبؤ والتحكم والمراقبة والعلاج.الكلىالرفض.

طُرق

تصميم الدراسة. درسنا 81 عينة لـ gDNA و 56 عينة مطابقة لـ cDNA طوليًا في الأوقات 0 و 6 و 24 شهرًا من إجمالي 27 متلقيًا من الأطفال تلقوا اختبارًا أوليًا.الكلىزرع اعضاء. تأتي الموضوعات في هذه الدراسة من تجربة سريرية (دراسة متعددة المراكز SNSO1) حيث تم اختيارهم عشوائيًا (1: 1) لنظام كبت المناعة التقليدي بجرعة منخفضة من الستيرويد (المنشطات ، تحريض daclizumab القياسي حتى الشهر الثاني بعد الزرع ، تثبيط المناعة مع tacrolimus (Prograf ، Astellas Pharma) و MMF (CellCept ، Hoffman-La Roche) أو نظام كبت مناعي خالٍ من الستيرويد (تحريض daclizumab لفترات طويلة حتى الشهر السادس بعد الزرع ، tacrolimus ، و MMF). التحق بعد موافقة IRB وحصل على موافقة مستنيرة. في هذه الدراسة ، تلقى 14 مريضًا نظامًا لتفادي الستيرويد ، بينما تلقى 13 مريضًا نظامًا مثبطًا للمناعة قائمًا على الستيرويد 53 ولم يتلق أي من هؤلاء المرضى مثبطًا للمناعة قبل الزرع لأن هذا كان أحد معايير الاستبعاد. علاج الرفض يتألف من ثلاث نبضات من كورتيكوستيرويد في الوريد (10 مجم / كجم) وتكثيف كبت المناعة الأساسي.

كانت جميع العينات المستخدمة في الدراسة مرتبطة بخزعة الطعم الخيفي التسلسلية ، والتي قرأها أخصائي علم الأمراض المركزي ، باستخدام درجات نسيجية شبه كمية. تم تعريف الرفض الحاد السريري على أنه حلقة رفض حادة ، مرتبطة بخلل وظيفة الكسب غير المشروع ، بناءً على زيادة بنسبة تزيد عن 10 في المائة في كرياتينين المصل من القيم الأساسية ، وتم تأكيده من خلال قراءة مرضية مركزية للخزعات وفقًا لتصنيف بانف المحدث. تم تحديد إصابة الطعم الخيفي المزمنة باستخدام درجة مؤشر تلف الطعم الخيفي المزمن (CADI). تم تصنيف المرضى في ثلاث نتائج سريرية تم تحديدها بواسطة درجة CADI ونوبات الرفض كان لدى غير المتقدمين (NP) درجة منخفضة من CADI غير المتزايدة على ثلاث خزعات متسلسلة على مدار عامين ، دون رفض حاد ، وكان مرضى التطور الذين لم يرفضوا (PNR) لديهم CADI أعلى النتيجة على الخزعات التسلسلية الخاصة بهم على مدار عامين وتزايدًا عبر النقاط الزمنية دون الرفض ، وحصل مرضى التطور مع الرفض (PR) على درجات CADI عالية متزايدة في الخزعات التسلسلية على مدار عامين مع نوبات الرفض. تم اختيار هؤلاء المرضى بعناية فائقة من مجموعة أكبر من 120 مريضا ، مطابقة للمتغيرات الديموغرافية ، ولكل NP ، وعدم وجود دليل على وجود دليل على الخزعة أو الإصابة دون الإكلينيكي كما تم قياسه بواسطة الأجسام المضادة المانحة المانحة. لم يكن لدى أي منهم HLA أو الكسب غير المشروع المتطابق لأن هذا كان معيارًا للاستبعاد للالتحاق. تم جمع جميع العينات من 12 برنامجًا مختلفًا لزراعة الأطفال في الولايات المتحدة بين عامي 2004 و 2006 ، بموجب بروتوكولات معتمدة من IRB. تمت الموافقة على الدراسة أيضًا من قبل برنامج حماية البحوث البشرية (HRPP) بجامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، وجامعة ستانفورد للسماح بتحليل عينات البنك الحيوي. قدم جميع المرضى / الأوصياء موافقة مستنيرة للمشاركة في البحث ، مع الالتزام الكامل بإعلان هلسنكي. تتوافق الأنشطة السريرية والبحثية التي يتم الإبلاغ عنها مع مبادئ إعلان اسطنبول كما هو موضح في إعلان اسطنبول بشأن حركة مرور الأعضاء وسياحة زرع الأعضاء.

عزل جدنا و RNA تم جمع عينات الدم (4.5 مل) في أنبوب أحمر سعة 5 مل وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تشكلت الجلطة. تم بعد ذلك طرد العينة عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام دوار دلو متأرجح. تم بعد ذلك نقل الطبقة العليا من المصل إلى أنبوب تجميد آخر وتم تخزين الجلطة في نفس الأنبوب عند درجة حرارة -80 درجة حتى الاستخدام. تم استخراج الحمض النووي الجيني من جلطات الدم الكامل باستخدام سلال Clotspin ومجموعة Gentra PuregeneBlood (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا).

لاستخراج الحمض النووي الريبي منالكلىخزعة إبرة (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) وتخزينها في درجة 80 ؛ تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مزيج رئيسي من 790 ميكرولتر من TRIzol و 10 ميكرولتر جليكوجين. تم تجانس عينات الأنسجة ، وحضنتها عند 15 إلى 25 درجة لمدة 5 دقائق وأضيف 160 ميكرولتر من الكلوروفورم لفصل الطور. تم تحضين الخليط مرة أخرى عند 25 درجة لمدة دقيقتين متبوعًا بالطرد المركزي عند 4 درجات واستخدامه لاستخراج RNA باستخدام RNeasy Micro Kit (كتالوج Qiagen رقم 4004). تم تحديد كمية وسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية والأشعة فوق البنفسجية والمحلل الحيوي Agilent على التوالي.

تسلسل الخلايا البائية. تم تحضير تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينومي DNA

من 1 0 0 ng gDNA aliquots لإنشاء ست مكتبات مستقلة ذات رموز شريطية لكل عينة. تم استخدام البادئات المضاعفة لمناطق إطار عمل IgH J أو FR1 أو FR2 لكل تصميم BIOMED -2. تم استخدام `` تسلسلات الباركود '' المكونة من عشرة نيوكليوتيدات في البادئات للإشارة إلى هوية العينة وتكرار هوية المكتبة لكل تفاعل PCR. تم إجراء PCR باستخدام AmpliTaq Gold (Roche) polymerase مع البرنامج التالي: 94 درجة لمدة 5 دقائق ؛ 35 دورة (94 درجة لمدة 30 ثانية ، 60 درجة لمدة 45 ثانية ، 72 درجة لمدة 90 ثانية) ؛ والتمديد النهائي في 72 درجة لمدة 10 دقائق. تم إجراء تفاعل PCR ثانٍ لضمان عدم تضخيم المكتبات إلى التشبع قبل تنقية الهلام والتسلسل. إجمالاً ، قام 0.4 مايكرولتر من كل منتج من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بتكوين قالب لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام بادئات خارجية محددة لتسلسلات الوصلة 454 ؛ تم إجراء التضخيم مع البرنامج: 94 درجة لمدة 15 دقيقة ، و 12 دورة (94 درجة لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة لمدة 90 ثانية) ، وامتداد نهائي عند 72 درجة لمدة 10 دقائق. يجب أن يكون لمعدل الخطأ في AmpliTaq Gold تأثير ضئيل على تحديد التسلسلات المرتبطة بالنسخة أو تقدير معدلات الطفرات الجسدية في التسلسلات كما تمت مناقشته في مكان آخر. تم تصنيع (كدنا) من إجمالي 300 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مع فتيلة بواسطة السداسيات العشوائية. تم تضخيم القوالب بواسطة PCR باستخدام الاشعال IGHV Biomed في الإطار 1 (FR1) وأشعال isotype-speci الموجود في أول exon للمناطق الثابتة. قامت هذه البادئات أيضًا بترميز ما يقرب من نصف تسلسلات رابط Illumina اللازمة لتوليد الكتلة والتسلسل على أداة MiSeq. تم ترميز هوية العينة بواسطة رموز باركود متعددة النوكليوتيدات متعددة الإرسال في كل تمهيدي. من أجل التعرف على مجموعة Illumina ، تم تشفير أربعة نيوكليوتيدات عشوائية في البادئات مباشرة بعد تسلسل رابط Illumina في بادئات المنطقة الثابتة. تم تضخيم كل نمط نظري للجسم المضاد لكل عينة في تفاعل PCR منفصل ، لمنع تكوين منتجات PCR الكيميرية للنمط المتقاطع. تم تنفيذ PCR باستخدام AmpliTaq Gold (Roche) باتباع إرشادات الشركة المصنعة واستخدم برنامجًا من 94 درجة لمدة 7 دقائق ، و 35 دورة (94 درجة لمدة 30 ثانية ، و 58 درجة لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة لمدة 120 ثانية). التمديد عند 72 درجة لمدة 10 دقائق. تم استخدام خطوة PCR ثانية لإضافة الجزء المتبقي من روابط Illumina إلى amplicons وتم تنفيذها باستخدام مجموعة Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، باستخدام 0.4 ميكرولتر من أول منتج PCR كقالب في تفاعل 30 ميكرولتر. كان برنامج PCR لخطوة PCR الثانية 94 درجة لمدة 15 دقيقة ، و 12 دورة (94 درجة لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة لمدة 90 ثانية) ، وامتداد نهائي عند 72 درجة لمدة 10 دقائق. تم تجميع منتجات كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بكميات متساوية المولية مقدرة ، ورسمت بالكهرباء على مواد هلامية agarose ، وهلام مستخلص بمجموعات QIAquick (Qiagen). تم إجراء تسلسل عالي الإنتاجية لمكتبات الحمض النووي الجيني على منصة 454 (Roche) باستخدام كيمياء التيتانيوم. تم إجراء تسلسل مكتبة (كدنا) على أداة Illumina MiSeq باستخدام 600- مجموعات تسلسل الدورة. يتم تضمين قائمة كاملة من المواد الأولية المستخدمة مع MiSeq (M154 و M155) و 454 Titanium (T7) في البيانات التكميلية 1.

تمت معالجة قراءات التسلسل على النحو التالي: تم دمج قراءات النهاية المزدوجة باستخدام FLASH58 حيث تم فك تعدد الإرسال بعد التسلسل وتقطيعه من الرموز الشريطية وتسلسلات IGHV التمهيدي. تم تحديد المناطق V و D و J وتقاطعات V-D (N1) و D-J (N2) باستخدام برنامج المحاذاة IgBLAST. تم ترشيح التسلسلات لإزالة القطع الأثرية غير IGH ​​، والتسلسلات مع إدخال أو حذف الجين V ، والتسلسلات الكيميرية ، والتسلسلات غير الوظيفية. على مستوى العينة ، استبعدنا من لديهم<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

تحليل التنوع. يقاس التنوع بثراء الأنواع مع الأخذ في الاعتبار عدد الحيوانات المستنسخة لكل عينة. لا يأخذ هذا المقياس في الاعتبار تواتر كل نوع ، لذلك استخدمنا أيضًا إنتروبيا شانون (H) لقياس توفير التنوع

معلومات حول توزيع حجم الأنواع في السكان. يتم تعريف H على النحو التالي:

حيث N هو عدد الحيوانات المستنسخة الفريدة و pi هو تكرار الاستنساخ أنا. يتراوح H من 0 (عينة مع نسخة واحدة فقط) إلى Hmax ¼ log2N (عينة بتوزيع موحد للنسخ المستنسخة).

بعد ذلك ، استخدمنا نموذجًا خطيًا عامًا لإيجاد العلاقة بين الثراء والنتروبيا والنتيجة السريرية في نقاط زمنية مختلفة. قمنا بتعديل هذا النموذج من خلال جميع المتغيرات السريرية المتاحة الموضحة في الجدول 1 للتأكد من أن أيًا من خصائص المريض كانت عاملاً مربكًا.

لنمذجة المكون الطولي للبيانات ، طبقنا نموذج تأثير خطي مختلط مع الأخذ في الاعتبار نموذج النمو الشرطي كما هو موضح في الشكل التكميلي 10. لتطبيق هذا النموذج ، استخدمنا الحزمة lme4 في R مع الأخذ في الاعتبار التفاعل بين النتيجة السريرية والوقت إلى الارتباط العادل بالثراء والتنوع مع الوقت كونه تأثيرًا عشوائيًا.

للتعامل مع حقيقة أن مقاييس التنوع قد تتأثر بمشكلة الأنواع المفقودة (يتم تمثيل جزء بسيط فقط من مليارات الخلايا في ذخيرة) والتسلسل والأخطاء التجريبية ، قمنا بتنفيذ استراتيجيتين بالإضافة إلى تحليل البيانات الكامل. أولاً ، استخدمنا أداة Recon (إعادة بناء الحيوانات المستنسخة المقدرة من الأرقام المرصودة) للتعامل مع مشكلة الأنواع المفقودة. Recon هي طريقة احتمالية قصوى معدلة تنتج التنوع الكلي للمرجع من القياسات على عينة. إعادة صياغة تقديرات دقيقة وقوية لمجموعة من مقاييس التنوع ، بما في ذلك الثراء والنتروبيا مما يسمح بإجراء مقارنات قوية للتنوع بين الأفراد. ثانيًا ، قمنا بتنفيذ إستراتيجية الاختزال بأخذ مجموعة فرعية عشوائية من القراءات لكل عينة مساوية لأصغر حجم للتسلسل ، متبوعة بإعادة حساب استنساخ الخلايا B لضبط عمق التسلسل والتعامل مع الأخطاء التجريبية المحتملة. بالنسبة لـ gDNA ، هناك عينات ذات قراءات منخفضة جدًا (<1000) ،="" ولتجنب="" فقدان="" العديد="" من="" التسلسلات="" وحقيقة="" البيانات="" ،="" استبعدنا="" ما="" مجموعه="" تسع="" عينات="" تحتوي=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

تحليل الشبكات. تتشابه خوارزمية توليد الشبكة إلى حد كبير مع تلك المحددة من قبل. Brie y ، كل قمة تمثل تسلسل خلايا B حيث يتم تحديد الحجم من خلال جميع التسلسلات المتطابقة. تُحسب الحواف باستخدام تعريف الاستنساخ (نفس مقاطع V و J ، ونفس طول CDR3 ، وهوية النوكليوتيدات بنسبة 90 بالمائة بين CDR3s) وتمثل المجموعات كل استنساخ في الذخيرة. تم إجراء التحليل باستخدام حزمة الرسم البياني في R باستخدام التخطيط _ مع خيار _ مخطط بياني لإنشاء المخطط.

لتقدير الشبكة ، قمنا بحساب مؤشر جيني لحجم الرأس وحجم الكتلة. مؤشر جيني هو مقياس للتفاوت يستخدم على نطاق واسع لقياس توزيع الثروة. يقيس عدم المساواة بين قيم توزيع التردد. استخدمنا دالة جيني من حزمة واحدة في R لحساب معامل جيني لحجم الرأس وتوزيع حجم الكتلة. يعبر معامل جيني للصفر عن مساواة تامة ويعبر معامل جيني البالغ 1 عن عدم مساواة قصوى.

تحليل نسيلي. لدراسة الحيوانات المستنسخة المحددة المرتبطة بالنتائج السريرية ، أنشأنا مصفوفة تحتوي على جميع الحيوانات المستنسخة الموجودة في أكثر من عينة (العدد الإجمالي=118 ، 223) من جميع العينات في كل نقطة زمنية. درسنا بعد ذلك الارتباط بالنتيجة السريرية لكل استنساخ محدد لتحديد متغير واحد لكل استنساخ على أنه موجود / غير موجود. أخيرًا ، طبقنا اختبار فيشر الدقيق لحساب الدلالة في جداول 2 × 3 لكل نسخة في كل نقطة زمنية. لقد درسنا أيضًا استنساخ الثبات الذي حددته تلك المستنسخات الموجودة في أكثر من نقطة زمنية واحدة في كل فرد. بعد ذلك ، لحساب الاختلافات حسب النتيجة السريرية ، طبقنا نموذجًا خطيًا يحدد كمتغير تابع عدد الحيوانات المستنسخة (لقياس الاختلافات في الثبات) وعدد التهم لكل استنساخ (لقياس التوسع النسيلي) والنتيجة السريرية مثل متنبئ مستقل.

تحليل استخدام الجين IGHV لدراسة جينات IGHV ، قمنا بتقييم استخدام الجين IGHV لكل عينة حيث تم تطبيع عدد المرات التي يتم فيها استخدام كل جين من خلال عدد الحيوانات المستنسخة لتجنب التمثيل الزائد لبعض جينات IGHV. بالنسبة للتحليل الإحصائي ، قمنا بترشيح تلك الجينات ذات التعبير المنخفض جدًا (استخدام IGHV / الحيوانات المستنسخة <{{0}. 05)="" في="" 10="" بالمائة="" على="" الأقل="" من="" العينات.="" في="" المجموع="" ،="" قمنا="" بتحليل="" 27="" جينة="" ighv="" تتوافق="" مع="" 63="" عينة.="" بعد="" ذلك="" ،="" طبقنا="" نموذجًا="" خطيًا="" للعثور="" على="" تلك="" الجينات="" التي="" ارتبطت="" بالنتيجة="" السريرية="" في="" كل="" نقطة="" زمنية="" وصححنا="" هذه="" النتائج="" باختبار="" متعدد="" باستخدام="" benjamini="" و="" hochberg="" fdr=""><0.05. قمنا="" بتعديل="" هذا="" النموذج="" من="" خلال="" جميع="" المتغيرات="" السريرية="" المتاحة="" الموضحة="" في="" الجدول="" 1="" للتأكد="" من="" أن="" أيًا="" من="" خصائص="" المريض="" كانت="" عاملاً="">

ملخص التقارير. يتوفر مزيد من المعلومات حول تصميم البحث في Nature Research Reporting Summary المرتبط بهذه المقالة.

مراجع

1.Cai، J. & Terasaki، PI مراقبة الأجسام المضادة بعد الزرع و HLA 1. (تحديد حاتمة الجسم المضاد. Curr.Opin.Immunol.20، 602-606 (2008).

2. Sigdel ، TKet al.Non-HLA للأجسام المضادة للمناعة تتنبأ بتطور الإصابة الكلوية المزمن الطعم الخيفي. أكون. شركة Nephrol.23 ، 750-763 (2012).

3. لي ، ل. التوطين الجزئي والأهمية السريرية للأجسام المضادة MICA بعد زرع الكلى. زرع 89 ، 312-319 (2010).

4. Lamb، KE، Lodhi، S. & Meier-Kriesche، H.-U بقاء الطعم الكلوي على المدى الطويل في الولايات المتحدة: إعادة تقييم حاسمة. Am.J. زرع اعضاء. 11 ، 450-462 (2011).

5. السجل العلمي لمتلقي الزرع. متاح على: https: // rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.( تم الوصول في: 24 مايو 2018) Pineda، S. et al. المتغيرات الجديدة غير متطابقة مستضد غير التوافق النسيجي

6. تحسين القدرة على التنبؤ بمخاطر الرفض بوساطة الأجسام المضادة في عمليات زرع الكلى. أمامي. إمونول. 8،1687 (2017).

7. Valuiskikh، A.Baldwin، WM & Fairchild، RL التقدم الحديث ووجهات النظر الجديدة في دراسة استجابات الخلايا التائية للطعم الخيفي. Am.J. زرع 10 ، 117-1125 (2010).

8. Zarkhin، V، Chalasani، G. & Sarwal، MM إن الين واليانغ من الخلايا البائية في رفض الكسب غير المشروع والتسامح. الزرع. Rev.24 ، 67-78 (2010).

9. Georgiou، G.et al. الوعد والتحدي المتمثل في التسلسل عالي الإنتاجية لذخيرة الأجسام المضادة الإضافية. نات. Biotechnol.32 ، 158-168 (2014).

10. شرودر ، HW التشابه والاختلاف في تطوير والتعبير عن الفئران والأجسام المضادة البشرية. ديف. شركات إمونول. 30 ، 119-135 (2006).

11. Yaari، G. & Kleinstein، SH إرشادات عملية لتحليل تسلسل ذخيرة مستقبلات الخلية B. جينوم ميد 7121 (2015).

12. شوجاي ، م وآخرون. VDJtools: توحيد التحليل اللاحق لمستقبلات الخلايا التائية. PLOS Comput. بيول 11 ، إي 1004503 (2015).

13. Alachkar، H. et al. التوصيف الكمي لذخيرة الخلايا التائية والمؤشرات الحيوية في رفض زرع الكلى. BMC Nephrol.17.181 (2 0 16). 14. موريس ، هـ. تتبع الخلايا التائية المتفاعلة مع المانحين: دليل على الحذف النسيلي في مرضى زراعة الكلى المتسامحين. علوم. ترجمة. Med 7،272ral0 (2015).

15. دزيوبياناو ، م. يسمح تحليل ذخيرة TCR عن طريق تسلسل الجيل التالي بالتشخيص التفريقي المعقد للأمراض المرتبطة بالخلايا التائية. أكون. J.Transplant.13 ، 2842-2854 (2013).

16. بالانيشامي ، أ. تشكل الخلايا البائية المتغيرة من فئة الغلوبولين المناعي محورًا مناعيًا نشطًا بين الجهاز العصبي المركزي والمحيط في مرض التصلب المتعدد. علوم. ترجمة. Med.6، 248ra 106-248 ra106 (2014).

17. Strauli، NB & Hernandez، RD الاستدلال الإحصائي لاستجابة ذخيرة الأجسام المضادة المتقاربة للقاح الأنفلونزا. جينوم ميد. 8،60 (2016).

18. روسكين ، KM وآخرون. تكشف تسلسلات IgH في نقص المناعة المتغير الشائع عن تطور وانتقاء الخلايا البائية المتغيرة. علوم. ترجمة. Med.7302ra135 (2015).

19.Massart، A.، Ghisdal، L.، Abramowicz، M. & Abramowicz، D. التسامح التشغيلي في زراعة الكلى والعلامات الحيوية المرتبطة بها. كلين. إكسب. Immunol.189 ، 138-157 (2017).

20. Beausang ، JFet al.B الذخيرة من الخلايا في المرشحين لزرع الكلى الحساسة HLA الخاضعين لعلاج إزالة التحسس. ترجمة. ميد 15 ، 9 (2017).

21. فردمان ، ج. وآخرون. التوسع والتحول الجسدي المفرط لاستنساخ الخلايا البائية في الطعوم الكلوية البشرية المرفوضة. زرع 98 ، 766-772 (2014).

22. فولمرز سي وآخرون. مراقبة التثبيط المناعي المستحث دوائيًا عن طريق تسلسل الذخيرة المناعية للكشف عن رفض الطعم الخيفي الحاد في مرضى زراعة القلب: دراسة دقة تشخيصية لإثبات المفهوم. PLOS Med. 12 ، e1001890 (2015).

23. Solez، K. et al.، Banff'05 تقرير الاجتماع: التشخيص التفريقي لإصابة الطعم الخيفي المزمنة والقضاء على اعتلال الكلية المزمن بطعم خيفي (CAN). أكون. J. Transplant.7، 518-526 (2007). تثبيط المناعة في زراعة الكلى: هل حان الوقت لاعتباره علاجًا قياسيًا؟ Kidney Int.76، 825-830 (2009).

28. Legendre، C. et al. نتائج ثلاث سنوات في مرضى زرع الكلى الذين تم اختيارهم عشوائياً لتثبيط المناعة الخالي من الستيرويد أو الانسحاب من الستيرويد ، مع ميكوفينولات الصوديوم المغلف معوي وسيكلوسبورين: دراسة اللانهاية. J. Transplant.2014، 1-8 (2014).

29. Kaplinsky، J. & Arnaout، R.Robust تقديرات التنوع الشامل للذخيرة المناعية من قياسات عالية الإنتاجية على العينات. نات. Commun.7 ، 11881 (2016).

30. ستيرن ، JNHet al. تنضج الخلايا البائية التي تسكن دماغ التصلب المتعدد في العقد الليمفاوية العنقية. علوم. ترجمة. متوسط ​​6،248ra107 (2014).

31. باشفورد روجرز ، RJMet al. تحدد خصائص الشبكة المستمدة من التسلسل العميق لمستقبلات الخلايا البائية البشرية مجموعات الخلايا البائية. Genome Res.23 ، 1874-1884 (2013).

32. سرول ، ميت آل. عدم التجانس الجزيئي في رفض الطعم الكلوي الحاد

التي تم تحديدها بواسطة التنميط الدقيق DNA. N.Engl.J. Med 349، 125-138 (2003). 33. Zarkhin، V.، Lovelace، PA، Li، L.، Hsieh، S.-C. & Sarwal، MMPhenotypic Evaluation of sub-cell sub rituximab لعلاج رفض الكلوي الحاد للطعم الخيفي في متلقي الأطفال. زرع 91 ، 1010-1018 (201).

34. Clatworthy، MR & Targeting، B. الخلايا والأجسام المضادة في الزرع. Am. J. Transplant.11، 1359-1367 (2011).

35. Dijke ، EIet al.Bcells in transplantation.J. زرع القلب والرئة 35 ، 704-710 (2016).

36. نانكيفيل ، بي جيه وكويبرز ، دكتور التشخيص والوقاية من فقدان الطعم الكلوي المزمن. لانسيت 378 ، 1428-1437 (2011).

37. باتين ، إي وآخرون ، التباين الطبيعي في بارامترات الخلية المناعية الفطرية مدفوع بشكل تفضيلي بالعوامل الوراثية. Nat.Immunol.19، 302-314 (2018). 38. Liston، A. & Goris، A. أصول التنوع في مناعة الإنسان. إمونول. 19 ، 209-210 (2018).

39. Meier-Kriesche، H.-U، Schold، JD، Srinivas، TR & Kaplan، B. نقص التحسن في بقاء الطعم الكلوي على الرغم من الانخفاض الملحوظ في معدلات الرفض الحاد خلال العصر الحديث. Transplant.4، 378-383 (2004).

40. Keith، DS، Vranic، G. & Nishio-Lucar، A. تحسنت وظيفة الكسب غير المشروع والنتائج المتوسطة الأجل لعمليات زرع الكلى في العقد الماضي: تحليل قاعدة بيانات زراعة الكلى في الولايات المتحدة. زرع اعضاء. مباشر 3 ، el66 (2017).

41. Bomben، R. et al. يُحدِّد التعبير عن جينات IGHV 3-23 الطافرة في ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن مجموعة فرعية من المرض ذات سمات إكلينيكية وبيولوجية غريبة. كلين. الدقة السرطان. 16 ، 620-628 (2010).

42. Levinson، AI، Kozlowski، L، Zheng، Y. & Wheatley، L. B-cell superantigens: التعريف والتأثير المحتمل على الاستجابة المناعية. J. Clin.Immunol.15، 26S -36 S (1995.

43. Silverman، GJ & Goodyear، CSA model B-Cell superantigen و البيولوجيا المناعية للخلايا الليمفاوية B. Clin.Immunol.102 ، 117-134 (2002).

44. Silverman، GJ & Goodyear، CS المكونة لدفاعات الخلايا البائية: دروس من المستضدات الفائقة العنقودية. نات. Rev. Immunol.6، 465-475 (2006). 45. Cheng، J.et al. مجموعات الخلايا البائية المنتبذة التي تتسلل إلى الكلى البشرية المزروعة هي نسيليّة. بروك. ناتل أكاد. علوم. 108 ، 5560-5565 (2011).

46. ​​جروفر ، RKet al. يحفز LPS المناعي الكلفي استنساخ الخلايا البائية التي تتسلل إلى الكلى البشرية المزروعة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 109 ، 6036-6041 (2012).

47، مودينا، بدت ال. ترتبط التغييرات في مجموعات الميكروبيوم البولي في عمليات زرع الكلى بالتليف الخلالي والضمور الأنبوبي الموثق في خزعات المراقبة المبكرة. أكون. J. Transpl.17، 712-723 (2017).

48. Chen، K. & Cerutti، A. رؤى جديدة في لغز الغلوبولين المناعي D. Immunol. القس 237 ، 160-179 (2010).

49. Chen، K. et al. يعزز الغلوبولين المناعي D المراقبة المناعية عن طريق تنشيط برامج مضادات الميكروبات والالتهابات وتحفيز الخلايا البائية في الخلايا القاعدية. نات. إمونول. 10 ، 889-898 (2009).

50. Mack، M. & Rosenkranz، AR Basophils and mast cells in renal response.KidneyInt.76، 1142-1147 (2009).

51. نيكسون ، DFet al. التتبع الجزيئي لفيروس نقص المناعة البشرية

يُظهر استنساخ الخلايا التائية السامة للخلايا المحددة من nef استمرارًا في DNA مستقبلات الخلايا التائية الخاصة بالاستنساخ ولكن ليس mRNA بعد العلاج المضاد للفيروسات القهقرية في وقت مبكر. Lett.66 ، 219-228 (1999).

52. Dharnidharka، VR، Fiorina، P. & Harmon، WEKidney transplantation in children.N.Engl. جيه ميد. 371 ، 549-558 (2014).

53. Sarwal، MMet al. يعتبر تجنب الستيرويد الكامل فعالًا وآمنًا في الأطفال الذين يعانون من عمليات زرع الكلى: تجربة عشوائية متعددة المراكز مع متابعة لمدة ثلاث سنوات. Am.J.Transplant.12 ، 2719-2729 (2012).

24. سوليز ، ك وآخرون ، تصنيف بانف 07 لأمراض الطعم الخيفي الكلوي: التحديثات والتوجيهات المستقبلية. Am.J.Transplant.8 ، 753-760 (2008).

54. Li، L et al. كبت المناعة الخالي من الستيرويد منذ عام 1999: 129 عملية زرع كلى للأطفال مع الكسب غير المشروع المستمر وفوائد المريض. Am.J. زرع. 9 ، 1362-1372 (2009).

25. شودري ، أ. التأثير السريري للمناعة الخلطية في زراعة الكلى للأطفال. أكون. Soc.Nephrol.24 ، 655-664 (2013).