خلاصة

مقدمة: البروبوليس مادة طبيعية صمغية يجمعها نحل العسل من براعم وإفرازات الأشجار والنباتات المختلفة. من المقبول على نطاق واسع أن تكوين البروبوليس يعتمد على الخصائص الجغرافية النباتية لموقع التجميع.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ويمكنه البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ، ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر فوق ملحق Cistanche Tubulosa

【لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】

أهداف: هدفت هذه الدراسة إلى تحديد التركيب الكيميائي النباتي للمستخلصات الإيثانولية من ثماني دفعات من البروبوليس تم جمعها في مناطق مختلفة من بنين (الشمال والوسط والجنوب) والكونغو وأفريقيا.

المواد والطرق:تم إجراء توصيف عينات البروبوليس باستخدام طرق كروماتوجرافيا متعددة الواصلة مع إزالة التكرار بالرنين المغناطيسي النووي (13C NMR) باستخدام برنامج MixONat. تم بعد ذلك تقييم نشاط المنتج النهائي المضاد للأكسدة أو المضاد للجليكشن المتقدم (مضاد AGE) باستخدام مقايسات ثنائي فينيل بيكريل هيدرازيل وألبومين المصل البقري ، على التوالي.

نتائج: أظهرت التحليلات الكروماتوغرافية جنبًا إلى جنب مع إزالة النسخ 13C NMR أن عينتين من وسط بنين عرضت ، بالإضافة إلى كمية كبيرة من ترايتيربينس خماسي الحلقات ، ستلبينويدات ميثوكسيلات أو فينانثرين ، المسؤولة عن النشاط المضاد للأكسدة للمستخلص لأول واحد. من بينها ، قد يكون كومبريتاستاتين سامًا للخلايا. بالنسبة للنوع الثاني ، كانت مركبات الفلافانون المعروفة في دنج من نوع Macaranga مسؤولة عن نشاطها المهم في مكافحة الشيخوخة. تتكون العينة من الكونغو من العديد من مشتقات ترايتيربين التي تنتمي إلى أنواع Mangifera indica.

خاتمة: لذلك ، يبدو أن البروبوليس من وسط بنين له أهمية خاصة ، نظرًا لخصائصه المضادة للأكسدة والمضادة للشيخوخة. ومع ذلك ، نظرًا لأن توحيد معايير البروبوليس أمر صعب في المناطق الاستوائية نظرًا لتنوعه الكيميائي الكبير ، يلزم إجراء تحليل كيميائي نباتي منهجي قبل الترويج لاستخدام البروبوليس في المنتجات الغذائية والصحية في إفريقيا.

الكلمات الدالة

13C NMR dereplication ، stilbenoids methoxylated or phenanthrenes ، pentacyclic triterpenes ، flavanones prenylated ، Propolis

1 المقدمة

البروبوليس هو مادة راتينجية طبيعية يجمعها النحل من براعم وإفرازات الأشجار والنباتات المختلفة ، ممزوجًا بشمع العسل والإنزيمات اللعابية .1 يستخدمه النحل لحماية المدخل من المتسللين ، وثقوب السد ، والجدران الداخلية الملساء ، وتحنيط الحيوانات النافقة. (الحشرات الصغيرة) داخل الخلية ، وتوازن بين الرطوبة الشديدة أو ظروف الجفاف .2،3 وقد استخدم العكبر على نطاق واسع في الطب الشعبي منذ العصور القديمة بسبب مجموعة واسعة من الخصائص العلاجية. والشمع (30 في المائة) والزيوت (10 في المائة) وحبوب اللقاح (5 في المائة) والمركبات الفينولية الإضافية مثل الفلافونويدات. 5.6 من المعروف أن التركيب الكيميائي للعكبر معقد ويختلف باختلاف أنواع النباتات التي تنمو حول الخلية من الذي يجمع النحل الإفرازات. يؤثر استغلال البروبوليس على التركيب الكيميائي للعكبر .8،9 هناك أنواع مختلفة من البروبوليس ، اعتمادًا على المنطقة الجغرافية للإنتاج ، والمصدر النباتي ، والتركيب الكيميائي. الأنواع الأكثر شيوعًا من البروبوليس هي المناطق المعتدلة ، والبتولا ، والاستوائية ، والبحر الأبيض المتوسط ​​، والمحيط الهادئ. Salicaceae) وبالتالي فهي غنية بالفلافونويد والأحماض الفينولية وإستراتها ؛ ومع ذلك ، فإن البروبوليس المداري ، الذي نشأ في المناطق التي لا ينمو فيها الحور ولا البتولا ، غني بالمشتقات السابقة لأحماض الكوماريك أو البنزوفينون أو التربينويدات. ، اليابان ، وجزر سليمان ، ودنج البتولا تم العثور عليها على وجه التحديد في روسيا .12 وقد أدت دراسة العكبر من آسيا الاستوائية إلى اكتشاف Macaranga denarius L. و Mangifera indica L. كمصادر نباتية للعكبر الإندونيسي .13 على ال من ناحية أخرى ، تعد الأنواع الصنوبرية من عائلة Cupressaceae المصدر النباتي الرئيسي للعكبر في مناطق البحر الأبيض المتوسط. كشفت التحليلات الكيميائية أن البروبوليس يحتوي على أكثر من 300 منتج طبيعي مختلف (NPs) ، بما في ذلك مشتقات حمض الفينول ، الكومارين ، الفلافونويد ، سيسكيتيربين ، ديتيربين ، ترايتيربين ، ستيرويدات ، قشور ، أو بنزينوفينونات سابقة التخمير .15 تم وصف التأثيرات البيولوجية للعكبر بشكل أساسي ليس فقط بمضادات الأكسدة ، 16-18 المضادة للشيخوخة (أي تثبيط تكوين المنتج النهائي للجليكشن المتقدم [AGE]) ، 19 مضاد - الالتهابات ، 20 والتأثيرات المضادة للورم ، 21-23 ولكن أيضًا مضاد للجراثيم ، 24-26 مضادًا للفطريات ، 15 نشاطًا مضادًا للفيروسات ، 27 نشاطًا مضادًا للطفيليات. من المعروف أيضًا أن البروبوليس يحفز إنتاج الأجسام المضادة ، مما يوحي باستخدامه المحتمل كعامل مساعد في اللقاحات .29 إن الاستخدام المتزايد لهذه المادة الطبيعية ذات التكوين المتنوع وبالتالي الأنشطة البيولوجية المتنوعة في الصناعات الدوائية والتجميلية والغذائية تولد اهتمامًا خاصًا في البحث العلمي ، خاصة عندما يتعلق الأمر بتعريف تركيبته الكيميائية. أجريت معظم الدراسات على عينات من أوروبا 19،30-33 وأمريكا اللاتينية ، وتحديداً البرازيل ، 20،23،34-36 بينما أجريت دراسات قليلة في إفريقيا.

وبالتالي ، هدفت هذه الدراسة إلى توصيف المركبات الرئيسية من عينات البروبوليس التي تم جمعها في مناطق جغرافية نباتية مختلفة في بنين والكونغو (إفريقيا) باستخدام 13 درجة مئوية لإزالة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مع برنامج MixONat. 43،44 دراسة أولية باستخدام قاعدة بيانات (DB) تحتوي على NPs التي تم الإبلاغ عنها سابقًا من البروبوليس مع التحولات الكيميائية المتوقعة (C) 13 درجة مئوية لم تسفر عن أي بيانات قابلة للاستخدام مقارنة بالنتائج المرضية التي يتم الحصول عليها عادةً من المستخلصات النباتية. على النباتات المحلية ، مما يجعل من المستحيل بناء قاعدة بيانات كيميائية. وبالتالي ، لفك تشفير المركبات الرئيسية من البروبوليس البنيني والكونغولي ، أجرينا في العمل الحالي كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء مقترنة بمطياف الكتلة للكشف عن تشتت الضوء التبخيري والأشعة فوق البنفسجية (HPLC-UV-ELSD-MS) وكروماتوجرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي ( GC-MS) على مستخلصات البروبوليس الخام لتحديد سماتها الهيكلية الرئيسية وبناء قواعد بيانات مقابلة لـ NPs مناسبة لبرنامج MixONat. وبعد ذلك ، بعد تجزئة تقريبية لعينات البروبوليس المختارة وفقًا لملفها الكيميائي ، سمح بإزالة النسخ المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي 13C تحديد NPs الرئيسية دون مزيد من التنقية. كما تم إجراء فحوصات مضادات الأكسدة ومضادات الشيخوخة.

2. الإجراءات التجريبية

2.1 المواد الكيميائية

تم شراء 1 ، 1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) ، وكاشف Folin-Ciocalteu ، وحمض الفورميك ، وحمض الغاليك ، وجميعها من الدرجة التحليلية ، من Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier ، فرنسا). 6- هيدروكسي -2 ، - 5 ، 7 ، 8- رباعي ميثيل كرومان -2- حمض الكربوكسيل (ترولوكس®) و 50 - حمض كافويلكوينيك (حمض الكلوروجينيك) تم الحصول عليها من Acros Organics (جيل ، بلجيكا).

2.2 عينات البروبوليس

تم جمع ثماني عينات دنج بنين عن طريق الكشط من خلايا النحل في ثلاث مناطق جغرافية نباتية (الجدول 1 والشكل SI -1). تم جمع عينة من البروبوليس الكونغولي في الغابة الاصطناعية لأشجار الأكاسيا في هضبة باتيكي في وسط جمهورية الكونغو (الجدول 1).

2.3 استخراج البروبوليس

تم تحضير المستخلصات الإيثانولية للعكبر (EEPs) مبدئيًا باستخدام بروتوكول الاستخراج التالي .19 تم سحق البروبوليس الخام بشكل متجانس أولاً في وجود النيتروجين السائل. بالنسبة لجميع العينات ، تم نقع 1 جم من مسحوق البروبوليس في 20 مل من 95 بالمائة EtOH. بعد التقليب لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، يرشح الخليط باستخدام مرشح قمع قرص زجاجي ملبد (حجم مسام 16-40 ميكرومتر). تمت إعادة استخلاص البقايا مرتين باستخدام نفس الخطوات. بعد ذلك ، تم الحفاظ على الفلاتر الثلاثة المجمعة عند 18 درجة مئوية طوال الليل ، وترشيحها لإزالة الشمع ، وتبخرها تحت ضغط منخفض (40 درجة مئوية ، 10 بار) لإعطاء EEPs.

كميات 8. 0 جم من مسحوق البروبوليس من BC1 (1) و BC2 (2) أو 10.3 جم من CG (3) تم استخلاصها مرة أخرى باستخدام EtOH 95 بالمائة (الإمارات العربية المتحدة ، 4 80 مل ، 15 دقيقة) لمزيد من كروماتوغرافيا الفلاش.

2.4 تقدير المحتوى الفينولي الكلي

تم تحديد إجمالي محتوى الفينول من خلال طريقة Folin-Ciocalteu اللونية كما تم وصفها سابقًا ، 19 وتم تكييفها مؤخرًا للاستخدام المباشر في الألواح الدقيقة. باختصار ، 1 0 ماي من كل مستخلص دنج في MeOH (3.5 مجم / مل لـ BC1 و 5 مجم / مل لـ BN2 و BC2 و CG و 7.5 مجم / مل لـ BN1 و BS1a و BS1b و BS2 و تم خلط 1 0 mg / ml for BS3) مع 2 0 ul من الماء المقطر و 10 ul من كاشف Folin-Ciocalteu في 96- صفيحة ميكروية للبئر. بعد 3 دقائق ، تمت إضافة 120 ميكرولتر من الماء المقطر و 40 مايكرولتر من 20 بالمائة من كربونات الصوديوم المائية. تم قياس الامتصاصية على مقياس الطيف الضوئي TECAN® (V6.5) عند 760 نانومتر بعد 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضير فراغ بنفس الطريقة باستخدام MeOH بدلاً من محلول الاستخلاص ، واستخدم حمض الغاليك لحساب منحنى المعايرة (0.04 - 0.328 مجم / مل ؛ ص=2. 7241 × 0.0039 ؛ ص 2=0 .9982). تم تحليل كل عينة في ثلاث نسخ. تم التعبير عن إجمالي محتوى الفينول من حيث معادلات حمض الجاليك (مجم) لكل جرام من المستخلص (مجم GAE / جم).

2.5 التحليلات الكروماتوغرافية الأولية

2.5.1 TLC التحليلي

تم إجراء تحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على TLC Alugram Xtra SIL G / UV254 (Macherey-Nagel ، Düren ، ألمانيا) ، باستخدام خليط من cyclohexane: AcOEt as eluant. تم تصور البقع في الكروماتوجرام أولاً تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) ثم عن طريق الرش بكاشف الفانيلين - حمض الكبريتيك (2 مل من حمض الكبريتيك المركز في 98 مل من فانيلين 1:99 وزن / حجم: 95 بالمائة محلول إيثانول) و تسخين الكروماتوجرام إلى 110 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

2.5.2 إجراء GC-MS

تم إجراء تحليل GC-MS على عينات غير مشتقة باستخدام كروماتوجراف غاز شيمادزو GCMS-QP2 0 1 0 SE (نويزيل ، فرنسا) بجهد تأين 7 0 eV (إلكتروني تأثير). تم تحضير العينات في ثنائي كلورو ميثان (DCM) بمعدل 2 مجم / مل للمستخلصات و 1 مجم / مل للكسور. تم إجراء عمليات الفصل باستخدام عمود Phenomenex ZB5 (قطر داخلي 30 م * 0.250 مم بسمك فيلم 0.25 مم ؛ Phenomenex ، Le Pecq ، فرنسا). تمت برمجة درجة الحرارة على النحو التالي: 180 درجة مئوية (3 دقائق) ، 180-280 درجة مئوية بمعدل 10 درجات مئوية / دقيقة ، و 280 درجة مئوية (27 دقيقة). تم استخدام الهيليوم كغاز حامل بمعدل تدفق 2.0 مل / دقيقة. تم ضبط درجة حرارة الحاقن والكاشف عند 250 درجة مئوية و 280 درجة مئوية على التوالي. تم تحديد المستقلبات من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ بها (Rt) والكتلة الاسمية و / أو أنماط التجزئة مع تلك الخاصة بالعينات الأصلية و / أو تلك الموجودة في مكتبات أنماط التجزئة للمعدات (NIST11 و NIST11s و FFNSC2).

2.5.3 إجراء HPLC-DAD-ELSD

أجريت التحليلات الكروماتوجرافية باستخدام كروماتوجراف سائل Shimadzu 2030C 3D (نويزيل ، فرنسا) مجهز بمصفوفة ديودكاشف (DAD) و ELSD (Sedere®) مع عمود Lichrospher® 1 {{1 {14}}} 0 RP -18 (125 مم * 4 مم معرف ، 5 ميكرومتر ، ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا ) محمية بخرطوشة Lichrocart® 4–4 واقية (4 مم * 4 مم معرف) ، باستخدام معدل تدفق 1 مل / دقيقة. يتكون الطور المتحرك من 0.1 بالمائة حمض الفورميك في الماء (المذيب أ) والميثانول (المذيب ب) ، وتم إجراء الفصل بواسطة التدرج الخطي التالي: 25-100 بالمائة ب (0-40 دقيقة) ، 100 بالمائة (40-45) دقيقة). تم تسجيل أطياف UV-vis في حدود 190-600 نانومتر ، وتم الحصول على مخططات كروماتوجرام عند 254 و 280 نانومتر. تم تسخين ELSD عند 30درجةC ، وتم تطبيق كسب 4 على الإشارة. تم تحضير العينات بتركيز 10 مجم / مل في MeOH وطردها عند 13 ، 000 جم لمدة 10 دقائق قبل الحقن (10 مايكرولتر) لإزالة آثار المواد المعلقة.

2.5.4 إجراء HPLC-UV-MS

تم إجراء تحليلات HPLC-UV-MS باستخدام وحدة فصل المياه 2795 (Guyancourt ، فرنسا) المجهزة بكاشف المياه المزدوج λ 2487. كان العمود والمراحل المتنقلة والتدرج هي نفسها كما هو موضح أعلاه لـ HPLC-DAD-ELSD. تم الحصول على Chromatograms عند 254 و 28 0 نانومتر. تم إجراء تحليلات الكتلة على بروكر (بريمن ، ألمانيا) التأين بالرش الكهربائي / التأين الكيميائي للضغط الجوي (ESI / APCI) Ion Trap Esquire 3 000 بالإضافة إلى الوضعين الموجب والسالب على النحو التالي: تصادم الغاز ، He؛ سعة طاقة الاصطدام ، 1.3 فولت ؛ البخاخات وغاز التجفيف ، N2 ، 7 لتر / دقيقة ؛ ضغط غاز البخاخات ، 3 0 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة حرارة جافة ، 340 درجة مئوية ؛ معدل التدفق ، 1.0 مل / دقيقة ؛ نسبة تقسيم المذيب ، 1: 9 ؛ نطاق المسح ، م / ع 100–1 ، 000. تم تحضير العينات بتركيز 10 مجم / مل في MeOH ، وطردها عند 13000 جم لمدة 10 دقائق ، وتم ترشيحها من خلال مرشح حقنة غشائية بقيمة 0. 45- ميكرومتر قبل الحقن (20 ميكرولتر) لإزالة الآثار. من المواد المعلقة.

2.6 تجزئة EEP بواسطة كروماتوغرافيا الفلاش

أولاً ، تمت إذابة 3.8 جم من BC1 (1) أو 3.5 جم من BC2 (2) أو 4. 0 جم من CG (3) EEPs في حجم أدنى من DCM والأسيتون وخلط مع هلام السيليكا (السيليكا) هلام: نسبة الاستخراج ، 2: 1). بالنسبة لهم جميعًا ، تم السماح للمذيب بالتبخر حتى يتم الحصول على مسحوق جاف ناعم. لكل EEP ، تم إجراء التجزئة باستخدام جهاز CombiFlash Teledyne ISCO (لينكولن ، شمال شرق الولايات المتحدة) مع عمود هلام السيليكا (Chromabond® Flash RS 4 {{2 0}} SiOH ، 4 {{83} } g ، Macherey-Nagel ، Hoerdt ، فرنسا) بمعدل تدفق 25 مل / دقيقة مع الهكسان الحلقي (المذيب A) وخلات الإيثيل (EtOAc) (المذيب B) باستخدام شطف التدرج التالي: (1) لـ BC1 EEP ، 5 بالمائة ب (0-10 دقائق) ، 5-20 بالمائة ب (10-30 دقيقة) ، 20-30 بالمائة ب (30-60 دقيقة) ، 30-50 بالمائة ب (60-85 دقيقة) ، 50-100 بالمائة ب (85-110 دقيقة) ؛ تم جمع 160 أنبوبًا سعة 20 مل ودمجها في 14 جزءًا (BC 1_ F1 إلى BC 1_ F14) على أساس ملفات تعريف كروماتوغرافيا TLC (الهكسان الحلقي: نسبة EtOAc ، 90:10 إلى 50:50 ) ؛ (2) لـ BC2 EEP ، 5 بالمائة ب (0-10 دقائق) ، 5-10 بالمائة ب (10-20 دقيقة) ، 10-30 بالمائة ب (20-40 دقيقة) ، 30-40 بالمائة ب (40-55 دقيقة) دقيقة) و 40-100 بالمائة ب (55-70 دقيقة) ؛ تم جمع 100 أنبوب سعة 20 مل ودمجها في 8 كسور (BC 2_ F1 إلى BC 2_ F8) على أساس ملفات تعريف كروماتوجرافية TLC (الهكسان الحلقي: نسبة EtOAc ، 90:10 إلى 60:40 ) ؛ (3) لـ CG EEP ، 5 بالمائة ب (0-10 دقائق) ، 5-10 بالمائة ب (10-30 دقيقة) ، 10-20 بالمائة ب (30-50 دقيقة) ، 20-40 بالمائة ب (50-70 دقيقة) دقيقة) ، 40-60 بالمائة ب (70-80 دقيقة) ، 60-100 بالمائة ب (80-90 دقيقة) ؛ تم جمع 135 أنبوبًا سعة 20 مل ودمجها في 23 جزءًا (CG _ F1 إلى CG _ F23) على أساس ملفات تعريف كروماتوجرافي TLC (الهكسان الحلقي: نسبة EtOAc ، 80:20 إلى 60:40 ).

تم إجراء خطوة تجزئة إضافية على جزء BC {0} F7: تم إذابة 200 مجم في حجم أدنى من MeOH وخلطها مع C {3}} هلام السيليكا (C 18- سيليكا هلام: نسبة الاستخراج ، 2: 1). تم تحقيق الفصل على عمود C18 (Interchim® PF-C18HP ، 4 جم ، Montluçon ، فرنسا) بمعدل تدفق 15 مل / دقيقة بالماء (المذيب A) و MeOH (المذيب B) باستخدام شطف التدرج التالي: 50– 70 بالمائة ب (0-30 دقيقة) و 70-100 بالمائة ب (30-40 دقيقة) ؛ تم جمع 80 أنبوبًا سعة 8 مل ودمجها في 5 أجزاء (BC 2_ F 7-1 إلى BC 2_ F 7-5) بناءً على ملفات تعريف HPLC-UV (280 نانومتر) .

2 - 7 1 تحليلات H و 13 C NMR

تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي (1D و 2D) لكسور البروبوليس (7-58 مجم) أو أحيانًا NPs في الكلوروفورم المذاب (CDCl3) أو الميثانول المذاب (CD3OD) (500 مايكرولتر) على مطياف JEOL NMR عند 400 ميجاهرتز لمدة 1 ساعة و 100 ميغاهيرتز ل 13 درجة مئوية. تم إجراء تجارب الرنين المغناطيسي النووي (1 H NMR و 13 C NMR و DEPT -135 و DEPT -90 و 2D NMR) على الكسور و NPs الخالصة عند 298 كلفن على مقياس طيف JEOL 400 ميجاهرتز H (JEOL Europe ، Croissy -Sur-Seine ، فرنسا) مزودة بمسبار عكسي 5- مم (ROYAL RO5). يتم التعبير عن التحولات الكيميائية (δH و C) بقيم جزء في المليون و J في هرتز.

بالنسبة إلى أطياف 13C NMR (1 00 MHz) ، تم استخدام تسلسل فصل WALTZ -16 بوقت اكتساب يبلغ 1.04 ثانية (32768 نقطة بيانات معقدة) وتأخير استرخاء قدره 2 ثانية. بين 1500 و 11 ، تم جمع 000 عمليات مسح للحصول على نسبة S / N مُرضية. تم تطبيق مرشح توسيع الخط الأسي 1 هرتز على كل تسوس حثي حر (FID) قبل تحويل فورييه. تم تقسيم الأطياف يدويًا إلى مراحل وتصحيح خط الأساس باستخدام برنامج MestReNova (Mestrelab Research ، سانتياغو دي كومبوستيلا ، إسبانيا) وتمت الإشارة إليها على الرنين المركزي للمذيب المذاب عند δC 77.16 جزء في المليون (CDCl3) و C 49.00 جزء في المليون (CD3OD). من أجل التحسين الخالي من التشويه عن طريق تجارب نقل الاستقطاب (DEPT) ، كانت هناك حاجة إلى ما بين 512 و 5500 عملية مسح وتم إجراء محاذاة مع أطياف 13 درجة مئوية باستخدام درجة مئوية معينة. تم بعد ذلك استخدام حد أدنى من الشدة لتجميع إشارات موجبة 13C NMR و DEPT -90 وإشارات DEPT الإيجابية والسلبية -135 يدويًا مع تجنب تأثيرات الضوضاء المحتملة.

تم بناء Propolis DB1 لأول مرة من خلال البحث عن المركبات الموصوفة في دنج على SciFindern ، مما أدى إلى DB من 1،471 NPs ؛ تم توقع قيم δC باستخدام تنبؤات NMR للتطوير الكيميائي المتقدم (ACD) (C ، H). من قواعد البيانات هذه التي تحتوي على NPs مع قيم δC-SDF الخاصة بها ، أنشأ روتين CTypeGen المتضمن في MixONat قاعدة بيانات مناسبة: يقرأ ملف البيانات المكانية (SDF) ويصنف التحولات الكيميائية حسب نوع الكربون. تم بعد ذلك إنشاء SDF المطلوب من النوع c ، أي نوع C Propolis DB1.43،44

تم إنشاء Stilbenoids _ Phenanthrenoids DB2. سمح البحث عن المواد باستخدام الكلمات الرئيسية stilbenoids و phenanthrenes في LOTUS DB التي تحتوي على 276،518 NPs48 (LOTUS ، 2022) بالحصول على Stilbenoids _ Phenanthrenoids DB2 من 2،681 NPs كـ SDF. تم إنشاء Flavanones DB3 بعد ذلك: بحث على SciFindern47 باستخدام 2- phenylchroman -4- سمح بنية فرعية واحدة بتحديد 56679 جزيء. تم تخفيضها أيضًا إلى 2893 إشارة إلى "ظهور المنتجات الطبيعية" باستخدام تحليل المواد مع "الدور المرجعي" للمرشح الذي اقترحه SciFindern. بعد تكرير إضافي بواسطة خطوة ترشيح بناءً على الوزن الجزيئي المتوقع (MW) (أي ، 340 إلى 424 Da) ، تم تصدير جميع مركبات الفلافانونات ذات الصلة لاحقًا على أنها SDF للحصول على NPs من Flavanones DB3 (684 NPs). لكل NPs من DB2 و DB3 ، تم توقع قيم δC-SDF باستخدام برامج تنبئ ACD NMR (C ، H) بالإضافة إلى المنهجية الموصوفة سابقًا بواسطة Nuzillard للحصول على SDF من النوع c مباشرة جاهزة للاستخدام بواسطة MixONat. يحتوي الأخير لكل مركب من DB على قيم δC المتوقعة المنظمة على هيئة ميثيل أو ميثيلين أو ميثين أو كربون رباعي.

تم إنشاء Triterpenes DB4 من PNMRNP3 DB49،50 الذي تم استيراده باعتباره SDF في برنامج تنبؤات NMR ACD (C ، H) من خلال البحث عن triterpenes باستخدام MW بين 100 و 500 Da (أي بيانات البحث: triterpenes ؛ البحث MW: 100 إلى 500) للحصول مباشرة على DB من 6،623 triterpenes بتنسيق الملف المطلوب من النوع c.

تم بناء Alk (en) yl resorcinol ومشتقات الفينول DB5 من PNMRNP3 DB49،50 الذي تم استيراده باعتباره SDF في برنامج تنبؤات الرنين المغناطيسي النووي ACD (C ، H) من خلال البحث عن NPs باستخدام سقالة m-alk (en) yl الفينول وتصنيفها على أنها الفينولات (على سبيل المثال ، 3- (hexadec -8- en -1- yl) phenol Substructure search ؛ Search Classyfire class: phenol) للحصول مباشرة على قاعدة بيانات من 44 NPs في تنسيق ملف c-type المطلوب.

2. 8 13 إزالة النسخ المعتمد على الرنين المغناطيسي النووي باستخدام برنامج MixONat

تم تصدير قائمة الذروة وبيانات الكثافة التي تم الحصول عليها من كل طيف تجريبي (13C NMR و DEPT -135 و DEPT -90) كملف. csv باستخدام برنامج Microsoft Excel (Microsoft 16.45) ويستخدم كملف إدخال في برنامج MixONat. تتكون هذه الملفات من قائمة قيم C مرتبة بترتيب تنازلي مرتبط بكثافتها على نفس السطر ، مفصولة بفاصلة.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0 70. بعد ذلك ، تمت مقارنة البيانات التجريبية لـ NPs مع أفضل الدرجات مع الأدبيات.

2.9 التنقية

2.9.1 HPLC التحضيري

تم إجراء تنقية الكسور BC {0}} F6 و BC 1_ F8 (4 0 مجم في 2 مل من MeOH) باستخدام تحضيري AP من Shimadzu LC -20 كروماتوجراف سائل مزود بكاشف UV-vis SPD -40 (Noisiel ، فرنسا) ، حلقة حقن سعة 2 مل ، ومجمع الكسور FRC -10 A ، باستخدام عمود تحضيري C18 (25 {{39 }} مم 21.2 مم معرف ، 5 ميكرومتر) (Pursuit XRs 5 ، Agilent ، Les Ulis ، فرنسا) بمعدل تدفق 21.24 مل / دقيقة. تتكون الطور المتحرك من 0.1 بالمائة من حمض الفورميك في الماء (المذيب أ) والميثانول (المذيب ب) وتم إجراء الفصل باستخدام التدرج التالي: (1) لـ BC 1_ F6 ، 40 بالمائة ب (0-5) دقيقة) ، 40-70 بالمائة ب (5-20 دقيقة) ، 70-90 بالمائة (20-30 دقيقة) ؛ (2) لـ BC 1_ F8 ، 40-70 بالمائة ب (0-15 دقيقة) و 70-90 بالمائة (15-25 دقيقة). تم الحصول على Chromatograms عند 254 و 280 نانومتر.

2.9.2 استخراج المرحلة الصلبة (SPE)

للحصول على الجزء الأكثر قطبية من BC {0}} EPP (200 مجم في 5 مل من MeOH مختلطة مع 350 مجم من C 18- هلام السيليكا بعد التبخر) ، تم إجراء التنقية باستخدام عمود استخلاص المرحلة الصلبة C18 (2 جم / 15 مل ، Thermo Scientific ™ ، Villebon-sur-Yvette ، فرنسا) بالماء: MeOH 7: 3 (10 مل) والماء: MeOH 6: 4 (10 مل). تم دمج الأنابيب من 4 إلى 10 لتشكيل الجزء القطبي لـ BC2 (BC 2_ SPE) بناءً على ملامح HPLC-UV (330 نانومتر).

2.10 فحوصات مضادات الأكسدة ومضادات الشيخوخة

2.10.1 الكسح من جذور DPPH

تم إجراء تقييم الكسح الجذري لـ DPPH لـ EEPs البنينية كما هو موضح سابقًا .51 باختصار ، تم تخفيف العينات المختبرة في EtOH المطلق عند 0. 0 2 مجم / مل من محاليل المخزون عند 1 مجم / مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تم وضع قسامات (100 مايكرولتر) من هذه المحاليل المخففة في 96- أطباق جيدة في ثلاث نسخ. تمت إضافة حوالي 25 ميكرولتر من محلول DPPH المحضر حديثًا (1 مم) إلى 75 مايكرولتر من EtOH المطلق باستخدام حاقن قارئ الصفيحة الدقيقة (Infinite® 200 ، Tecan ، فرنسا) للحصول على حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر. بعد 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة ، تم تحديد الامتصاصية عند 517 نانومتر. تم استخدام EtOH كمحلول فارغ ، في حين تم استخدام 10 و 25 و 50 و 75 ميكرومتر من حلول Trolox (التناظرية المحبة للماء - توكوفيرول) لمنحنى المعايرة. تم استخدام عينة من محلول حمض الكلوروجينيك الإيثانولي (0.02 مجم / مل) كمعيار لمراقبة الجودة. تم التعبير عن النتائج كمكافئات ترولوكس (ميكرومولات من TE لكل غرام من المستخلص).

2.10.2 المقايسة المضادة للشيخوخة

تم تحديد تأثيرات مستخلصات البروبوليس ومشتقات النارينجين المعزولة الخمسة الرئيسية على تكوين AGE كما هو موضح سابقًا .51 باختصار ، تم تحضين ألبومين مصل البقر (BSA) (1 0 مجم / مل) باستخدام D-ribose ({{ 13}}. 5 م) مع المركب المختبَر (3 ميكرومتر إلى 3 ملي مولار) أو المستخلص (1 ميكروغرام إلى 1 مجم) في محلول فوسفات 50 ملي مولار عند الرقم الهيدروجيني 7.4 (NaN3 ، 0.02 بالمائة). تم تحضين المحاليل في 96- ألواح ميكروترية جيدة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في نظام مغلق قبل قياس التألق AGE. تم طرح الإسفار من العينة المحتضنة في ظروف متطابقة بدون D-ribose لكل قياس. شبيه بنتوسيدين (الإثارة عند 335 نانومتر ، الانبعاث عند 385 نانومتر) تم قياس مضان العمر عن طريق قياس التألق. تم تعريف قيم IC50 على أنها كمية المستخلص (ميكروغرام / مل) أو التحكم الإيجابي (ميكرومتر) المطلوب لتقليل تكوين العمر بنسبة 50 في المائة نسبة إلى السيطرة السلبية. وفقًا لاختبار التحقق الإحصائي ، 53 تحليل واحد كافٍ لتحديد دقيق لـ IC50.

3. النتائج والمناقشة

3.1 التنميط الكروماتوغرافي

أظهر التنميط العام لـ LC لثماني بنين و EPP الكونغولي باستخدام كاشف ELSD شبه العالمي أن جميع العينات تحتوي على مركبات غير قطبية ، تم التصفية منها في نهاية مخططات الكروماتوجرام (الشكل 1). قدم BC1 أيضًا كمية كبيرة من المركبات القطبية أكثر ، وأظهر BC2 بعض المركبات القطبية المتوسطة بكميات أصغر. يبدو أن المركبات غير القطبية في CG EEP مختلفة تمامًا عن المركبات البنينية.

وهكذا ، أدى التنميط ELSD إلى ثلاث عينات مختلفة ومبتكرة تم فحص تكوينها بشكل أكبر: BC1 و BC2 و CG.

أولاً ، تم إجراء تحليلات GC-MS ، بمقارنة تجزئة MS مع NIST DB ، لتوصيف الفئات الكيميائية ، وعند الإمكان ، لتحديد المكونات. يتم عرض التعريف المفترض (استنادًا إلى النسبة المئوية للتوافق مع NIST DB) والفئات الكيميائية للمركبات في الجدول 2 (يتم عرض بيانات تحديد مواصفات التيار الأيوني الكلي [TIC] في الشكل SI -2).

قدمت جميع EEPs في بنين نفس الملفات الشخصية للمركبات غير القطبية ، المسمى بالحرف A إلى F ، ولكن قد تختلف مقاديرها. تم تحديدها افتراضيًا على أنها - أو -أمرينون (أ) ، -أمرين (ب) ، لوبينون (ج) ، -أميرين (د) ، - أو -أميرين أسيتات (E) ، ولوبيول أسيتات (F) (راجع الشكل SI -3) ، التي سبق وصفها بأنها NPs الرئيسية في العكبر المكسيكي .54 Zhang et al. (2014) و Tamfu et al. وصف (2020) أيضًا triterpenoids على أنها amyrin / lupeol و amyrin / lupeol acetates في عينات دنج أفريقية مختلفة .41،55 فقط BC1 قدمت NPs إضافية مذوبة بين Rt 10 و 15 min واقترحت على أنها stilbenoids methoxylated أو phenanthrenes وفقًا لأنماط التجزئة الخاصة بها. أظهر EEP الكونغولي صورة مختلفة عن تلك البنينية ، مع C16 و C18 إسترات حمض الإيثيل كمركبات متطايرة مرتبطة بدرجة مطابقة جيدة تبلغ 94 في المائة ، مشتق الفينول عند 13.1 دقيقة Rt ، ثلاثة مشتقات ريزورسينول في نطاق 14- 17 دقيقة ، وأنواع مختلفة من مشتقات ترايتيربين بعد 21 دقيقة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل EPPs بواسطة HPLC-DAD-MS لتصور NPs غير المتطايرة (راجع الشكل SI -4). أظهر التنميط المختلف أن BC1 EEP أظهر كمية كبيرة من المركبات القطبية المتوسطة مع كروموفور يمتص عند 280 نانومتر ، وكذلك BC2 بنسب أصغر ، وكان CG يمتلك ملف تعريف UV ضعيف للغاية عند 280 نانومتر.

3.2 التركيب الكيميائي لـ BC1 و BC2

لتحديد NPs الرئيسية الخاصة بهم باستخدام 13C NMR dereplication استنادًا إلى MixONat و DBs المناسبة ، تم بعد ذلك تحقيق تجزئة تقريبية لـ BC1 و BC2 EEP بواسطة كروماتوجرافيا الفلاش. في الواقع ، بالنسبة إلى BC1 ، كشف تحليل GC-MS عن وجود stilbenoids أو الفينانثرينات الميثوكسيلية ، والتي وجهتنا لبناء Stilbenoids المحددة _ Phenanthrenoids DB2. بالنسبة لـ BC2 ، باستثناء المركبات الأكثر قطبية عند 3.8 دقيقة Rt ، أظهرت جميع المركبات أطياف الأشعة فوق البنفسجية من مركبات الفلافانون-ثنائي هيدرو الفلافونول ، مما اقترح إنشاء Flavanones DB3.

كما هو مبين في الجدول 3 ، تم اقتراح dihydrophenanthrenes 1 و 3-5 ، و phenanthrenes 2 و 6 ، و dihydro stilbene 7 (الشكل 2) في BC1 EEP بواسطة MixONat وتم التحقق من صحتها عن طريق المقارنة مع بيانات الأدبيات (راجع المعلومات الداعمة). عند الضرورة ، تم استخدام مرشح MW بناءً على بيانات HPLC-MS.

بتعبير أدق ، من بين 9 ، 10- مشتقات ديهيدروفينانثرين من أصل 2،681 NPs في DB2 ، اقترح MixONat 6- methoxycoelonin (2 ، 7- ثنائي هيدروكسي -3 ، 5- dimethoxy { {1 0} ، 10- ثنائي هيدروفينانثرين ؛ 3 ، الترتيب 1 ، النتيجة 0. 75 ، الأشكال SI -13 و SI -14) في كولومبيا البريطانية {{ 18}} تم تأكيد F5 ووجودها من خلال المقارنة مع بيانات NMR المنشورة. تم التعرف عليه حتى الآن من الأنواع Combretaceae وفي السحلبية Bulbophyllum vaginatum ؛ 57 و 2 ، 7- ثنائي هيدروكسي -3 ، 4 ، 6- تريميثوكسي - 9 ، 10- ثنائي هيدروفينانثرين (4 ، الترتيب 1 ، النتيجة 0.88 ، الأشكال SI {{33 }} و SI -16) في BC 1_ F2. تم بالفعل وصف المركب 4 في البروبوليس السنغالي 58 وتم التحقق من صحة وجوده بناءً على البيانات المبلغ عنها بواسطة Pettit et al. من الشجرة الأفريقية Combretum caffrum59 وبواسطة Lu et al. من ديوسكوريا نيبونيكا ماكينو 60

تنبأت عملية إزالة التكرار المستندة إلى 13C NMR أيضًا بـ 2 ، 6- ثنائي هيدروكسي -3 ، 4 ، 7- ثلاثي ميثوكسي -9 ، 10- ثنائي هيدروفينانثرين (5 ، الترتيب 8 ، النتيجة 0. 76 ، الأشكال SI -15 و SI -16) في كولومبيا البريطانية 1_ F2 و 2.6 ، 7- ثلاثي هيدروكسي {{2 0 }} و 4- dimethoxy -9 و 10- dihydrophenanthrene (1 ، الترتيب 2 ، النتيجة 0. 5 ، الأشكال SI -5 و SI -6 ) في كولومبيا البريطانية {{3 0} F 6-1 عندما تم استخدام مرشح جزيئي عند MW 288 Da. بالنسبة لـ 1 ، كانت النتيجة منخفضة جدًا (0. 5) ؛ لذلك ، فإن تجارب 2D NMR الإضافية (الارتباطات الكمية المتعددة غير المتجانسة [HMQC] ، والاتصال متعدد الروابط غير المتجانسة [HMBC] ، والتحليل الطيفي لتأثير Overhauser النووي [NOESY] ، راجع الأشكال SI -7 - SI -10) كانت أجريت لتأكيد الهيكل ؛ بالنسبة لـ 5 ، كانت النتيجة 0.76 ، أي أعلى من 0.70. تم ذكر هذين NPs (1 و 5) لأول مرة بواسطة Letcher et al. في أنواع Combretum ، تم العثور بالفعل على 61،62 و 1 في دنج السنغالي

من بين مشتقات الفينانثرين ، يُفترض MixONat 2،6 ، 7- ثلاثي هيدروكسي -3 ، 4- dimethoxyphenanthrene (2 ، الترتيب 1 ، النتيجة 0. 88 ، الأشكال SI -11 و SI {{1 0}) في كولومبيا البريطانية 1_ F 8-1 ، والتي تم تأكيدها من خلال المقارنة مع بياناتها الطيفية التي وصفها Letcher et al. في Combretum apiculatum. 61 2 ، 7- Dihydroxy -3 ، 4 ، 6- trimethoxyphenanthrene (6 ، الترتيب 5 ، النتيجة 0.94 ، الأشكال SI -17 و SI -18) تم عزله سابقًا عن Photolida Chinensis63 في BC 1_ F4.

تم اقتراح Combretastatin B {{0} (7) ، وهو ثنائي هيدرو ستيلبين ، بواسطة MixONat في المرتبة الأولى (النتيجة 1.0 ، الأشكال SI -17 و SI -19) في BC1 EPP عند الاستخدام مرشح MW (MW 304 Da) وتم التحقق من صحته بالمقارنة مع بيانات NMR التي وصفها Pettit et al. في Combretum caffrum. 59

تم بالفعل تحديد المركبات 2 و 6 و 7 في البروبوليس السنغالي

تتوفر بيانات 1 H و 13 C NMR من 1-7 في المعلومات الداعمة.

بالنسبة إلى BC2 ، تم تحديد سبعة مركبات تنتمي إلى فئتين بنيويتين من البوليفينول ، ومشتقات الكرومون- C- الجلوكوزيد والبرينيلفلافانون (8-14) ، تم وصف بعضها لأول مرة في البروبوليس (الشكل 3).

لم تقدم العملية المستندة إلى 13C NMR باستخدام MixONat و DB1 إلى DB5 النتائج ذات الصلة التي تشير إلى NPs الأصلي. تم وصف منتجين رئيسيين (8-9) بشكل كامل على أنهما خليط باستخدام أطياف الكتلة وبيانات NMR أحادية وثنائية الأبعاد (1 H ، 13C ، HMQC ، HMBC ، راجع الشكل SI -20 - SI -23) وتم تحديدهما على أنهما فلورين (8) وإيزوبيفلورين (9) ، وهما كرومانون-سيجلوكوزيدات موصوفان حديثًا في دنج ، موصوف سابقًا في Pancratium biflorum64 والقرنفل من Eugenia caryophyllata ، على التوالي .65

فيما يتعلق بمشتقات الفلافانون ، من بين 688 NPs في DB3 ، اقترحت MixONat 6- prenylnaringenin (1 0 ، الترتيب 1 ، النتيجة 0. 95 ، الأشكال SI - 24 و SI {{8 }}) موصوف بالفعل في Propolis66 الأحمر النيجيري في BC {{1 0}} F 7-1. 6 ، 8- Diprenylaromadendrin (12 ، الترتيب 1 ، النتيجة 1. 0 ، الأشكال SI -28 و SI -29) و 6 ، 8- diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13 ، المرتبة 1 0 ، النتيجة 0.84 ، الأشكال SI -30 و SI -31) ، وجدت سابقًا في عينات دنج الكاميرون ، تم التحقق من صحة 42 في كولومبيا البريطانية 2_ F { {30}} و BC 2_ F5 على التوالي. 6- Geranylnaringenin (14 ، الترتيب 1 ، النتيجة 0.84 ، الأشكال SI -32 و SI -33) ، الموصوفة سابقًا في دنج من جزر سليمان ، 67 تم افتراضها وتأكيدها في كولومبيا البريطانية {{41 }} و 7-5. أخيرًا ، تم اقتراح 6- dimethylallyl naringenin (11) في المركز الثاني بواسطة MixONat في BC 2_ F6 (المرتبة 2 ، النتيجة 0.65 ، الأشكال SI -26 و SI - 27). تم اقتراح الأيزومر في الموضع 8 في الموضع الأول ، لكن المقارنة مع بيانات الأدبيات 68،69 أظهرت أنه الأيزومر في الموضع 6. كان المركب 11 جديدًا في البروبوليس ولكنه موصوف بالفعل في المستخلصات العضوية من Monotes africanus. 70 1 تتوفر بيانات H و 13 C NMR من 8 إلى 14 في المعلومات الداعمة.

【لمزيد من المعلومات: david.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】