تعميم MiRNAs في مرضى السكري من النوع 2 مع وبدون بيلة زلالية في ماليزيا

خلاصةمقدمة: مرض الكلى السكري(DKD) لا يزال السبب الرئيسي لمرض الكلى المزمن. تم الإبلاغ عن خلل في تنظيم miRNAs المنتشرة، مما يشير إلى أدوارها المرضية في DKD. تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في miRNAs المعبر عنها تفاضليًا في الأمصال لمرضى داء السكري من النوع 2 (T2DM) الذين يعانون من أو بدون بيلة ألبومينية في مجموعة مختارة من السكان الماليزيين.طريقة:تم تقسيم واحد وأربعين مريضًا من مرضى T2DM الذين يخضعون للمتابعة في عيادة مجتمعية إلى مجموعات عادية (NA)، وصغيرة (MIC)، وبيلة ​​ألبومينية كبيرة (MAC). تم تحديد المستويات التفاضلية لـ miRNAs في 12 عينة باستخدام صفيف miScript miRNA qPCR الذي يركز على المسار (التليف البشري) وتم التحقق من صحته في 33 عينة ، باستخدام صفيف qPCR المخصص miScript (CMIHS02742) (Qiagen GmbH ، Hilden ، ألمانيا).نتائج:اتجاهات تنظيم 3 miRNAs في المصل ، وهي miR -874-3 p و miR -101-3 p و miR -145-5 p لمرضى T2DM الذين يعانون من MAC مقارنة مع أولئك الذين يعانون من NA. تنظيم ذو دلالة إحصائية لـ miR- 874-3p (p= 0.04) ومير-101-3p (p= 0.01) تمت مشاهدته في مجموعة التحقق من الصحة. ارتباطات سلبية كبيرة بين معدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR) و miR-874-3p (p= 0.05)، مير-101-3ص (p= 0.03)، وmiR-145-5p (p= 0.05) بالإضافة إلى الارتباط الإيجابي بين miR-874-3p والعمر (p= 0.03) تم عرضها من خلال تحليل معامل ارتباط بيرسون.خاتمة:تم العثور في هذه الدراسة على تنظيم miRNA المعروف مسبقًا، أي miR-145-5p، وربما تلك الجديدة، وهي miR-874-3p وmiR-101-3p في مصل مرضى T2DM. . كان هناك ارتباط كبير بين eGFR وهذه miRNAs. قدمت نتائج هذه الدراسة أدلة مشجعة لمواصلة التحقيق في الأدوار المفترضة لهذه miRNAs المعبر عنها تفاضليًاد.ك.د.

انقر لcistancheherba لأمراض الكلى

مقدمة

يمثل مرض الكلى السكري (DKD) 39% من حالات الإصابة بمرض الكلى في المرحلة النهائية في الولايات المتحدة الأمريكية [1]. وبالمثل، لا يزال مرض الكلى المزمن (DKD) هو السبب الرئيسي لمرض الكلى المزمن (CKD) في ماليزيا، حيث ساهم في 69٪ من مرضى غسيل الكلى الجدد في عام 2018 [2]. يُعتقد أن مرض DKD يكون مدفوعًا بشكل أساسي بارتفاع السكر في الدم، مما يؤدي إلى تنشيط مسارات الإشارات داخل الخلايا والتليف الكلوي في النهاية [3]. على الرغم من التقدم في الإدارة، فإن المؤشرات الحيوية والعلاجات الحالية تفشل في منع تطوره إلى مرض الكلى في المرحلة النهائية [3]. ومن ثم، هناك حاجة ماسة إلى فهم أفضل لوسطاء وآليات DKD.

الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNA) عبارة عن عائلة من الحمض النووي الريبي (RNA) الصغير غير المشفر والتي ظهرت كمنظمين مهمين لما بعد النسخ للتعبير الجيني [4]. وقد لوحظ تعبير Aber rant عن miRNAs ومشاركتها في الآلية الخلوية لـ DKD [3]. تهدف هذه الدراسة إلى التعرف على نمط التعبير عن miRNAs مختارة في الأمصال لمرضى داء السكري من النوع 2 (T2DM) الذين يعانون من أو بدون بيلة الألبومين. في جميع أنحاء العالم، تم إجراء دراسات مماثلة على مجموعات سكانية مختلفة، كما تمت مراجعته سابقًا [5-7]. نحن نهدف إلى دراسة نمط التعبير التفاضلي لمجموعة مختارة من miRNAs المرتبطة بالمسارات الليفية لدى مرضى T2DM، والتي تمت دراسة بعضها مسبقًا في DKD. وقد اقترحت الدراسات السابقة الاختلافات العرقية في التعبير ميرنا [8، 9]. لذلك، بالإضافة إلى القدرة على تأكيد النتائج السابقة، قد تكشف هذه الدراسة عن جزيئات miRNA جديدة، ربما يتم التعبير عنها بشكل فريد بين السكان الماليزيين.

المواد والأساليب

دراسة السكان

شملت هذه الدراسة المقطعية 41 مريضًا حاليًا من مرضى T2DM قيد المتابعة في عيادة مجتمعية، في الفترة من يناير إلى أبريل 2019. تضمنت هذه الدراسة 2-إجراء خطوة: (1) miRNAs في أمصال 12 مريضًا (مجموعة الفحص ) تم تحديد لمحة عنها و (2) تم التحقق من صحة miRNAs الأكثر صلة باستخدام الأمصال من 33 مريضًا (يشار إليها باسم مجموعة التحقق من الصحة). وشمل ذلك 4 مرضى من مجموعة الفحص. تم الحصول على موافقة كتابية من المرضى الأفراد. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من لجنة البحوث والأخلاقيات الطبية (MREC)، وزارة الصحة الماليزية. وكانت معايير الاشتمال مرضى T2DM والمعلومات السريرية والمختبرية المتاحة. المرضى الذين يعانون من النوع 1 DM. غير DKDs؛ الأمراض المصاحبة مثل السرطان، أو مرض الحمى الحاد، أو حالات العدوى الأخيرة؛ حمل؛ وتم استبعاد فترة ما بعد الولادة.

تم استرداد المعلومات المتعلقة بما يلي من السجلات الطبية للمريض: (1) البيانات الديموغرافية بما في ذلك العمر والجنس؛ (2) البيانات السريرية مثل ضغط الدم والوزن ومدة T2DM والعلاج ومضاعفات مرض السكري الأخرى؛ (3) البيانات المخبرية بما في ذلك الجلوكوز في بلازما الصيام، والهيموجلوبين السكري A1c (HbA1c)، ونسبة الألبومين إلى الكرياتينين، والكرياتينين في الدم. تم تقسيم المرضى إلى 3 مجموعات وفقًا لمستويات بيلة الألبومين لديهم، بيلة ألبومينية طبيعية (NA)، بيلة ألبومينية دقيقة (MIC)، وبيلة ​​ألبومينية كبيرة (MAC).

تعريف

في هذه الدراسة،

تم تعريف NA وMIC وMAC على أنها نسبة الألبومين إلى الكرياتينين<30, between 30 and 300 and >300 ملغم/غم من الكرياتينين، على التوالي، في 2 من 3 مجموعات بول موضعية على الأقل [10]. تم حساب معدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR) بناءً على معادلة الكرياتينين لأمراض الكلى المزمنة وبائيات الأمراض.

تحضير المصل

تم جمع عينات من الدم الكامل الصيامي (أقل من أو يساوي 8 ساعات) في أنابيب 10- مل BD ®SSTTM (بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30- دقيقة التخثر قبل 10- دقيقة من الطرد المركزي عند 1,900 جم. تم حصاد المرحلة العليا، وتصفيتها باستخدام مرشح Minisart®PES بحجم 0.22- ميكرومتر (سارتوريوس، جوتنجن، ألمانيا)، وتم تقسيمها إلى أنابيب طرد مركزي صغير للتخزين عند درجة -80 درجة حتى التحليل.

مجموع ميرنا

تم عزل Total miRNA باستخدام مجموعة miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen GmbH) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تمت إضافة كاشف Qiazol Lysis إلى قسامة قدرها 200 ميكرولتر من المصل من أجل تمسخ الطبيعة متبوعًا بـ miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA mimic (Qiagen GmbH) لمراقبة استعادة الحمض النووي الريبي (RNA) وعكسه. كفاءة النسخ. تمت إضافة الكلوروفورم لفصل الطور متبوعًا بإضافة 100% إيثانول إلى الطور المائي العلوي. تم تحقيق خطوات الشطف بواسطة Buffer RWT وBuffer RPE و80% من الإيثانول. تمت إزالة الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق إضافة 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى غشاء عمود الدوران RNeasy MinElute. تم تحديد كمية ونوعية الحمض النووي الريبي (RNA) بواسطة مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific، Inc.، Wilmington، DE، USA) قبل التخزين عند درجة حرارة -80 درجة حتى الاستخدام. تم إجراء النسخ العكسي (RT) من miRNA إلى cDNA والتضخيم المسبق باستخدام مجموعة miScript RTII (Qiagen GmbH) وmiScript PreAMP PCR Kit (Qiagen GmbH)، على التوالي، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، باستخدام قالب RNA 6 ميكرولتر و5 ميكرولتر من المخفف. [كدنا]، على التوالي

تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

تم التعرف على miRNAs المنتشرة في مصل مجموعة الفحص من خلال صفيف miScript miRNA qPCR الذي يركز على المسار (Qiagen GmbH) ، وتم التحقق من صحة miRNAs المحددة لاحقًا في مجموعة التحقق من الصحة باستخدام صفيف miScript miRNA qPCR المخصص (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تضمن كل تفاعل قالب cDNA، و2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix، و10x miScript Universal Primer، و10x miScript Primer Assay، ومياه خالية من RNase، وقالب cDNA مخفف لتكوين حجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي الكمي على Eppendorf Mastercycler ep realplex 4، والذي تمت برمجته على النحو التالي: 15 دقيقة عند 95 درجة، 15 ثانية عند 94 درجة، 30 ثانية عند 55 درجة، و 30 ثانية عند 70 درجة مع 40 دورة.

الكمي النسبي للميرنا

تم إجراء تحليل بيانات PCR في الوقت الحقيقي باستخدام برنامج Qiagen Gene Globe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/). تم اشتقاق التعبير النسبي (RE) بواسطة طريقة 2−∆Ct، حيث تم تطبيع التعبير عن كل ميرنا إلى التعبير الخاص بجين التدبير المنزلي SNORD95 أو Global Ct Mean. تم حساب تغيير الطية من تعبير ميرنا الطبيعي في كل مجموعة (MIC أو MAC) مقسومًا على تعبير ميرنا الطبيعي في المجموعة الضابطة (NA). تم حساب قيم p بناءً على اختبار t للعينات المستقلة لقيم RE (2−∆Ct) المكررة لكل جين في مجموعة التحكم ومجموعات الاختبار. تم إجراء مزيد من التحقق من تحليل بيانات qPCR يدويًا باستخدام Microsoft Excel وIBM SPSS (الحزمة الإحصائية للعلوم الاجتماعية؛ IBM Corp، Ar Monk، NY، USA) الإصدار 25 لبرنامج Microsoft Windows.

اختيار miRNAs في مجموعة الفحص للتحقق من الصحة

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >تم اعتبار 30 تعبيرًا سلبيًا، على النحو الموصى به من قبل مركز تحليل بيانات Qiagen GeneGlobe (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/). يُظهر الجدول التكميلي 1 عبر الإنترنت (للاطلاع على جميع المواد الإضافية عبر الإنترنت، راجع www.karger.com/doi/10.1159/000518866) RE من 84 miRNAs في مجموعة الفحص التي تم تطبيعها إلى متوسط ​​Ct العالمي. تم اختيار MiRNAs مع ±2.0- تغييرات كبيرة وذات نوعية جيدة للتحقق من صحتها، كما هو محدد بواسطة البرنامج. بالإضافة إلى ذلك، تم اختيار miRNAs الأخرى بناءً على تصنيف قيم p الخاصة بها ومشاركتها في الدراسات السابقة في DKD والمسارات المرتبطة بـ DKD، حيث تم اختيار miRNAs التي تحتوي على أكبر عدد من أهداف messenger RNA المفترضة. يُظهر الجدول التكميلي 2 عبر الإنترنت المعايير الإضافية المستخدمة لاختيار miRNAs للتحقق من الصحة. في تحليل التحقق من الصحة، تم تطبيع تعبير miRNA إلى SNORD95 نظرًا لأن طريقة متوسط ​​Ct العالمية لم تكن مناسبة واعتبر Ct > 35 تعبيرًا سلبيًا. لتوحيد المعايير، قمنا بإعادة تحليل الطاقة المتجددة لـ miRNA المحدد في مجموعة الفحص بناءً على تطبيع SNORD95، وتم استخدام هذا للتحليل اللاحق بالمقارنة مع مجموعة التحقق من الصحة.

تحليل احصائي

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >تم إجراء مجموعتين مستقلتين باستخدام اختبار كروسكال واليس للعينات المستقلة (الجدول 1). تمت مقارنة المتغيرات الفئوية باستخدام اختبار χ2 للطوارئ أو اختبار فيشر الدقيق (الجدول 1). تم إجراء الارتباط بين miRNA RE المحدد والمتغيرات المستمرة (البيانات الديموغرافية والسريرية) باستخدام معامل الارتباط بيرسون. تم استخدام اختبار الانحدار المتعدد لتحليل العلاقة الخطية بين miRNA RE المحدد والمتنبئين المهمين به. تم إجراء الحسابات الإحصائية باستخدام الإصدار 25 من IBM SPSS (الحزمة الإحصائية للعلوم الاجتماعية؛ IBM Corp) لنظام التشغيل Microsoft Windows وحزمة البرامج الإحصائية Prism 8 (GraphPad، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعريف الأهمية الإحصائية على أنها p <0.05.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى