تخفف السكريات Cistanche Deserticola من التدهور المعرفي وتحسن الذاكرة لدى الفئران النموذجية المسنة
Mar 30, 2022
جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com
يوان Gao1 ، * ، Bing Li1 ، * ، Hong Liu1 ، Yajuan Tian2 ، Chao Gu1 ، Xiaoli Du1 ، Ren Bu1 ، Jie Gao1 ، Yang Liu1 ، Gang Li1
نبذة مختصرة
تشير الدلائل الحديثة إلى أن التغييرات في محور ميكروبيوتا الأمعاء قد تؤدي إلى ضعف الإدراك. في هذه الدراسة ، لاحظنا أن الإعطاء المطول لـ D-galactose للفئران تسبب في التدهور المعرفي ، وخلل الجراثيم المعوية ، والتهاب المحيط ، والإجهاد التأكسدي. في هذا النموذج من التدهور المعرفي المرتبط بالعمر ، قام Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) بتحسين الوظيفة الإدراكية في الفئران المعالجة بالجالاكتوز D عن طريق استعادة التوازن الجرثومي المعوي ، وبالتالي تقليل الإجهاد التأكسدي والالتهاب المحيطي. تم القضاء على الآثار المفيدة لـ CDPS في هذه الفئران النموذجية الشيخوخة من خلال استئصال الميكروبات المعوية بالمضادات الحيوية أو كبت المناعة باستخدام السيكلوفوسفاميد. أظهرت ملامح المصل الأيضية أن مستويات الكرياتينين ، الفالين ، L-methionine ، o-Toluidine ، N-ethylaniline ، حمض اليوريك ، والبرولين قد تم تغييرها في الفئران النموذجية الشيخوخة ، ولكن تم استعادتها بواسطة CDPS. أظهرت هذه النتائج أن CDPS تعمل على تحسين الوظيفة الإدراكية في نموذج الشيخوخة الذي يسببه D-galactose في الفئران عن طريق استعادة التوازن في محور ميكروبيوتا الأمعاء ، مما خفف من اختلال توازن الأحماض الأمينية والالتهاب المحيطي والإجهاد التأكسدي. يُظهر CDPS الإمكانات العلاجية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الذاكرة والتعلم ، وخاصة تلك المتعلقة بخلل التنسج المعوي.
المقدمة
يؤدي التناول المطول لـ D-galactose (D-gal) وأملاح البريليوم إلى حدوث الشيخوخة في النماذج الحيوانية التجريبية وفي مزارع الخلايا الأولية في المختبر ، ويتم استخدامه لتحديد الآليات الكامنة وراء عملية الشيخوخة الطبيعية [1-4]. تشير الدراسات السابقة إلى أن الانخفاض المعرفي في الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها D-galactose مرتبط بانخفاض مستويات بروتين عامل نمو الأعصاب (NGF) وزيادة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الدماغ ، وكلاهما يسبب انحطاط الخلايا العصبية الحُصينية ويقلل تكوين الخلايا العصبية [3 ، 4]. أظهرت الدراسات الحديثة أيضًا أن تكوين وعدد الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البشرية يتغير بشكل كبير خلال عملية الشيخوخة [5].
Cistanche deserticola هو عشب ينمو بشكل رئيسي في المنطقة الصحراوية الشمالية الغربية من الصين ويستخدم في الطب الصيني التقليدي. ومن المعروف عادة باسم "الجينسنغ الصحراء". تحتوي مستخلصات Cistanche deserticola على العديد من المركبات النشطة دوائيًا ، بما في ذلك جليكوسيدات الفينيثانويد ، والأيريويد ، والليغنوز ، والسكريات قليلة السكاريد ، والسكريات المتعددة ، والأحماض الأمينية ؛ ترتبط هذه المركبات بخصائص مضادة للالتهابات ، ومضادة للأكسدة ، ومضادة للشيخوخة ، وقائية للأعصاب ، وخصائص مناعية [6 ، 7]. على سبيل المثال ، تم استخدام السكريات المستخرجة من Cistanche deserticolahave في الطب الصيني التقليدي لعلاج سرطان القولون والمستقيم [8]. تم عزل مجموعة واسعة من السكريات ضعيفة السمية ذات الأنشطة الحيوية المفيدة من العديد من الكائنات الحية ، مثل عديد السكاريد Chuanqiong و Ganoderma lucidum polysaccharide و Lycium barbarum polysaccharide [9-11]. CDA 0. 05 عبارة عن galactoglucan المعزول من Cistanche deserticola الذي يعزز نمو العديد من البكتيريا المعوية المفيدة ، بما في ذلك العديد من أنواع Bacteroides و Lactobacillus [12].
إن الآليات الأساسية لعملية الشيخوخة الطبيعية متورطة أيضًا في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان مثل الاضطرابات العصبية التنكسية وتصلب الشرايين التاجية والسكري من النوع 2 (T2DM) وارتفاع ضغط الدم [13 ، 14]. أظهرت الدراسات الحديثة أن التغيرات في الجراثيم المعوية تلعب دورًا مهمًا في شيخوخة الإنسان [15]. أظهرت العديد من الدراسات أن إعطاء D-galactose لفترات طويلة في الفئران والجرذان التجريبية يحاكي عملية الشيخوخة الطبيعية وهو نموذج مفيد لدراسة الأنماط الظاهرية المرتبطة بالشيخوخة مثل تدهور الإدراك [16]. علاوة على ذلك ، تظهر الفئران النموذجية الشيخوخة التي يسببها D-galactose تغيرات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء [17]. لذلك ، افترضنا أن التغييرات في تركيبة ميكروبيوتا الأمعاء قد تسبب تدهورًا معرفيًا في الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها الجالاكتوز ، وبحثنا فيما إذا كان Cistanche Deserticola Polysaccharides (CDPS) قد يخفف من التدهور المعرفي عن طريق استعادة دسبيولوجيا الأمعاء الدقيقة.
الجذع cistanche
النتائج
تُظهر الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها D-galactose تدهورًا معرفيًا و dysbiosis الجرثومية المعوية
قمنا بتحليل الأداء السلوكي للفئران من النوع البري (WT) وتلك التي عولجت بـ 150 مجم من D-gal لكل كيلوغرام من وزن الجسم لمدة شهرين (نموذج أو Mod) باستخدام التعرف على الأشياء الجديدة واختبارات Morris Water maze (MWM). تم تخفيض قيم الفهرس التفضيلية في اختبار التعرف على الكائن الجديد بشكل كبير في مجموعة الفئران Mod مقارنة بفئران مجموعة WT (الشكل 1A ، 1B). أظهرت نتائج اختبار MWM أن وقت استجابة الهروب بعد اليوم السادس قد زاد بشكل كبير في مجموعة Mod مقارنة بمجموعة WT (الشكل 1C ، 1D). علاوة على ذلك ، تم تقليل معابر المنصة المستهدفة وأوقات السباحة داخل الربع المستهدف بشكل كبير في مجموعة Mod مقارنة بمجموعة WT (الشكل 1E ، 1F). أظهرت هذه النتائج انخفاضًا كبيرًا في قدرات التعلم والذاكرة لفئران نموذج الشيخوخة التي يسببها القانون.
قمنا بعد ذلك بتحليل الاختلافات في وفرة وتكوين الكائنات والأجناس والأنواع الميكروبية في الأمعاء في عينات البراز لمجموعتي Mod و WT من الفئران باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي 16S (rRNA) من عينات البراز. كانت الفلورا المعوية السائدة في فئران مجموعة WT و Mod هي Firmicutes و Bacteroides. ومع ذلك ، تم تقليل وفرة Bacteroides بشكل كبير وزادت وفرة Firmicutes بشكل كبير في مجموعة Mod مقارنة بمجموعة WT (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، أجرينا تحليل تمييزي خطي (LDA) لتحديد درجات حجم تأثير LDA (LEfSe) متبوعًا باختبارات Kruskal-Wallis و Wilcoxon لتقييم الوفرة النسبية لأصناف مختلفة في فئران مجموعة WT و Mod. يتم عرض نتائج LDA في الشكل 2 ب. علاوة على ذلك ، قمنا ببناء cladograms التي تظهر الإثراء التفاضلي لمختلف الأجناس والأنواع التي تنتمي إلى Bacteriodes and Firmicutes phyla في WT ومجموعات النماذج (الشكل 2C). بشكل عام ، أظهرت نتائجنا ضعف القدرة المعرفية و dysbiosis الجرثومية المعوية في الفئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D- الجالاكتوز.
الفوائد الصحية cistanche: مضادات الأكسدة
يحسن علاج CDPS القدرة المعرفية في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal
قمنا بتحليل ما إذا كان علاج CDPS يخفف من التدهور المعرفي في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal. خلال شهرين من الإعطاء ، تم قياس وزن الجسم كل يوم. كانت أوزان جسم النموذج ومجموعات CDPS من الفئران متشابهة (الشكل 3 أ). إجراء تجارب سلوكية بعد آخر جرعة. أظهر التعرف على الأشياء الجديدة ونتائج اختبار متاهة موريس المائية أن الذاكرة قصيرة المدى كانت أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات CDPS من الفئران مقارنة بمجموعة الفئران النموذجية. كانت الذاكرة طويلة المدى في مجموعة الفئران CDPS أعلى ولكنها غير ذات أهمية إحصائية مقارنة بفئران النموذج (الشكل 3 ب ، 3 ج). هذا يشير إلى أن علاج CDPS ألغى فقدان ذاكرة التعرف على الأشياء على المدى القصير في الفئران المعالجة بـ D-gal.
تم تقييم التعلم المكاني والذاكرة لهذه الفئران من خلال اختبار Morris Water Maze ، وأظهرت النتائج أن أوقات زمن الهروب لمجموعة CDPS من الفئران كانت مماثلة لمجموعة WT من الفئران وأقصر بكثير من الفئران الجماعية Mod (الشكل ثلاثي الأبعاد) . علاوة على ذلك ، كانت أوقات الهروب أقل بشكل ملحوظ في اليوم السادس بعد إدارة CDPS مقارنة بمجموعة النموذج (الشكل 3E). كان وقت السباحة داخل الربع المستهدف أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات CH و CM مقارنة بمجموعة النموذج. مجموعة CL أعلى من مجموعة النموذج ولكن ليس لها دلالة إحصائية (الشكل 3F). علاوة على ذلك ، كان عدد معابر المنصة أعلى بشكل ملحوظ في مجموعتي CM و CL مقارنة بمجموعة الطراز. ومع ذلك ، فإن مجموعة CH أعلى من مجموعة النموذج وليس لها دلالة إحصائية (الشكل 3G). أظهرت هذه النتائج أن علاج CDPS يحسن التعلم المكاني والذاكرة في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal.
الشكل 1. الإدارة المطولة لـ D-galactose تحفز التعلم وضعف الذاكرة في الفئران.
الشكل 2. الإدارة المطولة لـ D- الجالاكتوز يستحث الأمعاء الميكروبية dysbiosis في الفئران.
يستعيد علاج CDPS التوازن لتكوين ميكروبيوتا الأمعاء في الفئران النموذجية D-galactose-Ageing
السكريات الأحادية والسكريات هي العناصر الغذائية الأساسية اللازمة لنمو البكتيريا [18-21]. يُذكر أيضًا أن CDPS ينظم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء [22]. لذلك ، قمنا بتحليل ما إذا كانت علاجات CDPS قد خففت من خلل التنسج الجرثومي المعوي في فئران المجموعة النموذجية من خلال تقييم بيانات تسلسل الرنا الريباسي 16S لعينات البراز من مجموعات الفئران WT والنموذج و CDPS.
أولاً ، قمنا بحساب مؤشرات تنوع ألفا لتقييم الثراء الكلي للجراثيم البرازية والاختلاف الهيكلي بين هذه المجموعات. قمنا بتحليل فهارس تنوع ألفا (-التنوع) مثل الأنواع المرصودة ، قيم شانون ، تشاو 1 ، إيس ، وسيمبسون لتحديد التغييرات في تكوين الأنواع البكتيرية المختلفة في عينات البراز من مجموعات مورين مختلفة. كانت مؤشرات التنوع (الأنواع المرصودة ، شانون ، تشاو 1 ، مؤشرات ACE ، وسيمبسون) أعلى في مجموعات الفئران WT و CDPS مقارنة بمجموعة النموذج ، ولكن لوحظت الأهمية الإحصائية فقط لقيم مؤشر Chao 1 بين CM المجموعة ومجموعة وزارة الدفاع. أشارت إلى أن الإدارة مع CDPS يزيد ثراء الميكروبيوم (الشكل 4A-4E). بعد ذلك ، قمنا بتحليل فهارس التنوع لتحديد الاختلافات في الأنواع الميكروبية المعوية بين مجموعات الفئران WT ، والنموذج ، و CDPS باستخدام مقياس متعدد الأبعاد غير متري (NMDS) ، وتحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) ، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA) . أظهر PCA اختلافات في التركيب الميكروبي في القناة الهضمية لفئران المجموعة النموذجية أثناء عملية الشيخوخة ، بما في ذلك تقليل الأبعاد والحفاظ على الأنماط والاتجاهات (الشكل 4 و). تم تحديد الاختلافات في الجراثيم البرازية بين مجموعات WT والنموذج و CDPS بناءً على PCoA لمسافات UniFrac غير الموزونة لجينات الرنا الريباسي 16S (الشكل 4G). أظهر تحليل المجموعات اختلافات كبيرة في NMDS بين مجموعة النموذج ومجموعات WT و CDPS (الشكل 4H).
قمنا بتقييم أفضل 10 شعب من الكائنات الحية الدقيقة في القناة الهضمية ووجدنا أن وفرة مجموعة Bacteroides كانت أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات CH و CM و CL مقارنة بالمجموعة النموذجية (الشكل 4I). هذا يشير إلى أن CDPS أعاد التوازن لميكروبات الأمعاء في الفئران المعالجة بـ D-gal. أظهرت cladograms إثراءًا تفاضليًا لمختلف الأجناس والأنواع التي تنتمي إلى Bacteriodes و Firmicutes phyla في WT والنموذج ومجموعات CDPS (الشكل 4J). كما هو موضح في خرائط الحرارة ، قللت علاجات CDPS من الوفرة النسبية من Thermoplasmata ، و Bacilli ، و Actinobacteria غير محددة ، و Fusobacteriia ، و Elusimicrobia غير محدد ، وزادت الوفرة النسبية من Methanobacteria ، Spirochaetia ، Deltaproteobacteria ، مجهول الهوية _. ، Erysipelotrichia ، والبكتيريا الزرقاء غير المحددة _ مقارنة بمجموعة النموذج (الشكل 4K). أظهرت هذه النتائج أن علاج CDPS أعاد بشكل كبير التوازن لميكروبات الأمعاء في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal.
الشكل 3. علاج CDPS يحسن التعلم والذاكرة في الفئران نموذج الشيخوخة D-gal.
يخفف علاج CDPS من التنكس العصبي في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي
قمنا بعد ذلك بتحليل تأثيرات CDPS على الالتهاب عن طريق تحليل مستويات المصل من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (IL -2 و TNF-) والسيتوكينات المضادة للالتهابات (IL -4 و IL -10 ) في مجموعات مختلفة من الفئران. كانت مستويات المصل لـ IL -2 و TNF- أقل بشكل ملحوظ وكانت مستويات المصل من IL -4 و IL -10 أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات CH و CM و CL مقارنة بالنموذج مجموعة. يتضح أن CDPS له تأثيرات مضادة للالتهابات (الشكل 5A-5D).
ينتج الإجهاد التأكسدي عن زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وهو أحد العوامل الرئيسية التي تعزز الشيخوخة [23]. لذلك ، قمنا بتحليل تأثيرات CDPS على الإجهاد التأكسدي في نموذج الماوس الشيخوخة الذي يسببه D-gal من خلال تقييم مستويات المصل من إنزيم مضادات الأكسدة ، SOD ، ومنتج بيروكسيد الدهون ، malondialdehyde (MDA). كانت مستويات مصل MDA أعلى بشكل ملحوظ وانخفضت مستويات SOD في مصل الدم بشكل كبير في مجموعة Mod مقارنة بمجموعة WT ، لكن علاج CDPS عكس هذه التأثيرات (الشكل 5E ، 5F). أظهرت هذه النتائج أن الإجهاد التأكسدي كان مرتفعًا في الفئران النموذجية التي يسببها D-gal للشيخوخة ، ولكن تم تقليله بواسطة علاج CDPS.
علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم مستويات الإجهاد التأكسدي في أنسجة المخ من خلال تحليل مستويات منتج البروتين المؤكسد المتقدم (AOPP) ، وبيروكسيد الدهون المباشر (LPO) ، و MDA بالإضافة إلى أنشطة إنزيمات مضادات الأكسدة مثل الجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px). ) وديسموتاز الفائق (SOD) في متجانسة أنسجة المخ. أظهرت أدمغة فئران مجموعة Mod انخفاضًا ملحوظًا في أنشطة SOD و GSH-PX وزيادة كبيرة في مستويات AOPP و LPO و MDA مقارنة بمجموعة WT ، ولكن تم عكس هذه التأثيرات في مجموعة CH و CM و CL (الشكل 6A- 6E).
علاوة على ذلك ، أجرينا تلطيخًا نسيجيًا لأقسام الدماغ باستخدام بقع H&E و Nissl لتقييم التأثيرات الوقائية لـ CDPS على أدمغة فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal. أظهرت فئران مجموعة Mod انخفاضًا كبيرًا في أعداد وحجم الخلايا العصبية ، وزيادة الفجوة بين الخلايا العصبية ، والترتيب غير المنتظم للخلايا العصبية ، والتضخم النووي في منطقة الحصين CA1 مقارنة بمجموعة WT ، ولكن تم تقليل هذه التغييرات المرضية بشكل كبير بواسطة علاجات CDPS ( الشكل 6F). أظهرت هذه النتائج أن علاجات CDPS قللت بشكل كبير من الإجهاد التأكسدي وأمراض الدماغ في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D gal.
الشكل 4. علاج CDPS يعيد التركيب الجرثومي المعوي في الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها الجالاكتوز.
يقلل علاج CDPS من الالتهاب المحيطي والإجهاد التأكسدي عن طريق الحفاظ على التوازن الجرثومي المعوي في الفئران النموذجية التي يسببها D-gal
بعد ذلك ، قمنا بتحليل ما إذا كانت التغييرات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء مرتبطة بزيادة الالتهاب المحيطي والإجهاد التأكسدي أثناء الحمل. لتحقيق ذلك ، استخدمنا كوكتيلًا ثلاثيًا من المضادات الحيوية (مجموعة ABX) أو سيكلوفوسفاميد (مجموعة Cy ؛ راجع أيضًا المواد والطرق) لإزالة ميكروبيوتا الأمعاء أو تحفيز كبت المناعة في الفئران النموذجية المُعالجة بالـ CDPS. ألغى العلاج بالمضادات الحيوية الآثار المفيدة للعلاج CDPS في الفئران النموذجية الشيخوخة. لاحظنا ضعف التعلم والذاكرة (الشكل 7 أ) ، والتعديلات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء (الشكل 7 ب ، 7 ج) في مجموعة الفئران ABX مقارنة بالمجموعة المعالجة بـ CDPS. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أنه حتى إدارة CDPS لا يمكنها زيادة قدرة الفئران على التعلم والذاكرة بعد تغيير الجراثيم المعوية. علاوة على ذلك ، لاحظنا زيادة مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في الدماغ ومصل الفئران مجموعة ABX مقارنة بمجموعة CDPS (الشكل 7D-7N). أظهرت نتائج مجموعة ABX ومجموعة CY أنه بعد تدمير الجراثيم المعوية ووظيفة المناعة ، حتى إدارة CDPS لم تستطع تحسين قدرة الفئران على التعلم والذاكرة. تشير هذه النتائج إلى أن علاج CDPS قلل من الالتهاب المحيطي ، والإجهاد التأكسدي ، والتدهور المعرفي في الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها القانون عن طريق منع dysbiosis الأمعاء.
ثم استخدمنا عقار سيكلوفوسفاميد المثبط للمناعة [24] لتحديد دور الالتهاب في التأثيرات المفيدة لـ CDPS. أظهرت الفئران CDPS المعالجة بسيكلوفوسفاميد (مجموعة Cy) ضعفًا في التعلم والقدرة على الذاكرة ، وتغيرات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء ، ومستويات شاذة من السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات في الدماغ والمصل مقارنة بالفئران البرية ومجموعة CDPS. ومع ذلك ، لا توجد أهمية مقارنة بالنموذج ومجموعة ABX. (الشكل 7A-7N). توضح هذه البيانات أن التعديلات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء تزيد من الالتهاب المحيطي في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal.
الشكل 5. يُعدِّل علاج CDPS المستويات المتداولة من السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات والعوامل المرتبطة بالإجهاد التأكسدي في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-galactose.
يمنع CDPS الشيخوخة التي يسببها D-gal عن طريق تنظيم استقلاب الأحماض الأمينية
يتأثر الجهاز المناعي للمضيف بالمستقلبات التي تولدها ميكروبيوتا الأمعاء [25]. تمثل المستقلبات البرازية قراءة وظيفية لعملية التمثيل الغذائي الميكروبي في الأمعاء والتكوين الميكروبي للأمعاء [26]. علاوة على ذلك ، تدخل مستقلبات ميكروبيوتا الأمعاء الدورة الدموية وتؤثر على التمثيل الغذائي للعائل والصحة [26 ، 27]. تم تحديد ما مجموعه 1058 مستقلبات في عينات مصل من فئران FWT و Mod و CDPS. بعد ذلك ، قمنا بتحليل هذه المستقلبات باستخدام BioCyc وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) وقاعدة بيانات المستقلب البشري (HMDB) ووجدنا أنه تم التعبير عن 65 مستقلبًا بشكل مختلف في مجموعة Mod مقارنة بمجموعة WT. علاوة على ذلك ، وجدنا أن مستويات 8 مستقلبات (الكرياتينين ، الفالين ، L - (-) - الميثيونين ، o-Toluidine ، N Ethylaniline ، حمض اليوريك ، البرولين ، والفينيل ألانين) تختلف اختلافًا كبيرًا بين مجموعات WT و Mod و CDPS. أظهر تحليل إثراء المسار لهذه المستقلبات الثمانية باستخدام MetaboAnalyst [28 ، 29] أن هذه المستقلبات كانت مرتبطة باستقلاب الأرجينين والهيستيدين والأرجينين والبرولين والبيورين (الشكل 8 أ ، 8 ب). 7 مستقلبات مختلفة من مجموعة MOD ومجموعة CDPS في مجموعة WT.
ثم قمنا بتحليل ما إذا كانت التغييرات في استقلاب الأحماض الأمينية مرتبطة بالتغيرات في تكوين ميكروبيوتا الأمعاء. لاحظنا أن 7 مستقلبات مختلفة من مجموعات WT و Mod و CDPS (الكرياتينين ، فالين ، L - (-) - ميثيونين ، o-Toluidine ، N-Ethylaniline ، حمض البوليك ، والبرولين) انخفضت بشكل ملحوظ في ABX ، Cy ، ومجموعات Mod مقارنة بمجموعات WT و CDPS. علاوة على ذلك ، لا توجد أهمية بين مجموعات ABX و Cy (الشكل 8C). أخيرًا ، من أجل استكشاف هناك علاقة بين التمثيل الغذائي التفاضلي والأمراض الأخرى المرتبطة بالشيخوخة. قمنا بتحليل العلاقة بين هذه المستقلبات السبعة المعبر عنها تفاضليًا والأمراض البشرية باستخدام قاعدة بيانات MetaboAnalyst ووجدنا أن هذه المستقلبات كانت مرتبطة بمرض الزهايمر (ص =0 00173 ؛ الشكل 8 د ، 8 هـ). بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن CDPS يحمي من الشيخوخة التي يسببها D-gal عن طريق تنظيم استقلاب الأحماض الأمينية.
الشكل 6. يقلل علاج CDPS من الإجهاد التأكسدي في أدمغة فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-galactose
نقاش
يعد التدهور التدريجي في الوظيفة المعرفية سمة مميزة للشيخوخة. أظهرت الدراسات السابقة أن علاج CDPS أدى إلى تحسن كبير في التعلم والذاكرة في الفئران النموذجية الشيخوخة [30-33]. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن علاج CDPS يحسن الوظيفة الإدراكية عن طريق تثبيط الالتهاب المحيطي والإجهاد التأكسدي من خلال استعادة التوازن الجرثومي المعوي في الفئران النموذجية للشيخوخة التي يسببها D-gal (الشكل 9). أظهرت فئران Sprague-Dawley التي تتغذى على عديد السكاريد Cistanche نموًا متزايدًا لبكتيريا الأمعاء المفيدة وتنوعًا جرثوميًا محسّنًا في الأمعاء [34]. CDA -0. 05 ، عديد السكاريد المتعادل Cistanche ، يحسن نمو العصيات اللبنية بروبيوتيك [22]. تشير هذه البيانات إلى أن عديدات السكاريد Cistanche حسنت التوازن في بكتيريا الأمعاء.
في هذه الدراسة ، أظهرنا أن CDPS له تأثيرات مضادة للالتهابات ويحسن القدرة المعرفية لفئران نموذج الشيخوخة عن طريق تعديل وفرة الأجناس البكتيرية المعوية مثل Bacteroidetes و Firmicutes و Proteobacteria. وبالتالي ، قد تكون CDPs مفيدة علاجياً للأمراض المرتبطة بالشيخوخة من خلال إعادة تشكيل تركيبة ميكروبيوتا الأمعاء [35 ، 36]. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أن مستويات السيتوكينات الالتهابية في المصل والقولون مرتبطة بالوفرة النسبية للأجناس البكتيرية مثل Bacteroidetes و Firmicutes و Proteobacteria [37 ، 38]. علاوة على ذلك ، فإن التركيب الميكروبي للأمعاء ينظم وظائف المخ عن طريق تعديل مستويات الدورة الدموية للعديد من السيتوكينات [39-43]. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن علاج CDPS قلل من الوفرة النسبية للثيرموبلازما ، العصيات ، البكتيريا الشعاعية غير المحددة ، البكتيريا المغزلية ، و Elusimicrobia غير المحددة ، وزادت الوفرة النسبية للميثانوبكتيريا ، Spirochaetia ، Deltaproteobacteria ، مجهول الهوية _ مولود البكتيريا. Erysipelotrichia ، والبكتيريا الزرقاء غير المحددة _.
يتم إطلاق المستقلبات الميكروبية المعوية في مجرى الدم وتنظم صحة واستقلاب العائل [26 ، 27]. يمكن تقدير المستقلبات الميكروبية في الأمعاء عن طريق تقييم تكوين المستقلب البرازي ، والذي يتغير مع التغيرات في تكوين ميكروبات الأمعاء [44]. أظهرت الدراسات الحديثة أن مستويات البلازما من سيترولين ، برولين ، أرجينين ، أسباراجين ، فينيل ألانين ، وثريونين مرتبطة بالاضطرابات التنكسية العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر [45 ، 46]. أظهرت دراستنا أن مستويات المصل من الكرياتينين ، والفالين ، و L-methionine ، و o-Toluidine ، و N ethylaniline ، وحمض البوليك ، والبرولين كانت مرتبطة بالشيخوخة التي يسببها D-gal في الفئران.
مستخلص Cistanche: مضاد لمرض الزهايمر
تلعب الأذرع الفطرية والتكيفية للجهاز المناعي دورًا مهمًا في الحفاظ على التوازن الجرثومي المضيف في السطح اللمعي المعوي [47]. تلعب الجراثيم المعوية أيضًا دورًا مهمًا في تنظيم الجهاز العصبي المركزي (CNS) والمناعة من خلال إطلاق السيتوكينات والمستقلبات في مجرى الدم [48 ، 49]. تلعب السيتوكينات المؤيدة للالتهابات دورًا رئيسيًا في العديد من الأمراض العصبية التنكسية [50-52]. على سبيل المثال ، يرتبط التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) والزرق بالتراكم خارج الخلية للأميلويد (A) والترسب داخل الخلايا لمادة تاو مفرطة الفسفرة والحديد في الخلايا العقدية للشبكية (RGC) [44]. علاوة على ذلك ، يلعب الالتهاب دورًا مهمًا في التسبب في الإصابة بالجلوكوما [53]. ضعف البصر هو أحد الأعراض المبكرة لمرض الزهايمر (AD) ويتجلى قبل بداية التدهور المعرفي [54]. أظهرت دراستنا أن CDPS يحمي من التدهور المعرفي والالتهاب المحيطي من خلال الحفاظ على التوازن في ميكروبيوتا الأمعاء.
وهناك العديد من القيود المفروضة على هذه الدراسة. أولاً ، العلاقة بين استقلاب الأحماض الأمينية وتكوين ميكروبيوتا الأمعاء غير معروفة جيدًا. ثانياً ، التركيب والتركيب الجزيئي لـ CDPS غير معروفين. لذلك ، هناك حاجة لدراسات مستقبلية لمواصلة استكشاف الدور التنظيمي لـ CDPS في التخفيف من مرض الزهايمر من خلال محور إشارات الأحياء الدقيقة في الأمعاء.
في الختام ، أوضحت دراستنا أن CDPS حسنت القدرة الإدراكية في فئران نموذج الشيخوخة التي يسببها D-gal من خلال استعادة التوازن في ميكروبيوتا الأمعاء ، وبالتالي استعادة عدم توازن الأحماض الأمينية ، والالتهاب المحيطي ، والإجهاد التأكسدي. تشير هذه النتائج إلى أن CDPS هو علاج محتمل للمرضى الذين يعانون من اضطرابات التعلم والذاكرة ، وخاصة تلك المرتبطة بخلل التنسج الهضمي.
المواد والأساليب
تحضير CDPS
حوالي 1. 0 كلغ من Cistanche deserticola النظيف تم تجفيفه بالهواء في الفرن عند 40 درجة مئوية وسحقه إلى مسحوق خام. تم استخلاص المسحوق في إيثانول ساخن لمدة 3 ساعات. يرشح المتبقي من خلال شاش لإزالة المرشح ثم يخفف بالماء (8X) ويرجع بالتتابع لمدة ساعتين و 1.5 ساعة و 1 ساعة عند 90 درجة مئوية. جنبا إلى جنب مع الترشيح البني والأحمر. بعد ذلك ، تم تركيز ناتج الترشيح تحت ضغط منخفض ، وتم تبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، وإضافته ببطء إلى 95 بالمائة من الإيثانول (3X) ، وتركه للوقوف عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم الطرد المركزي للمحلول عند 6000 دورة / دقيقة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم جمع الراسب بعد تكرار استخلاص الماء وترسيب الكحول ثلاث مرات. تمت إعادة تكوين الراسب في الماء ، ونزع البروتينات ، وغسيله ، وتجفيفه بالتجميد للحصول على عديد السكاريد الخام Cistanche deserticola (CDPs). كان محتوى السكاريد أكثر من 90 في المائة كما تم تقييمه بواسطة القياس الطيفي فوق البنفسجي.
استخراج cistanche
مجموعات الحيوانات والعلاجات
تم شراء فئران كونمينغ من الذكور يبلغ عمرها ثمانية أسابيع (رقم ترخيص SCXK. 2019-0010) من شركة SPF Biotechnology Co. Ltd (بكين ، الصين) ، وتم وضعها في غرفة خفيفة ودرجة الحرارة يتم تغذيتها بالطعام والماء. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة منغوليا الطبية الداخلية. تم إجراء التجارب وفقًا لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام حيوانات المختبر.
بعد أسبوع واحد من التكيف مع البيئة الجديدة ، تم تقسيم 120 فأرًا إلى المجموعات السبع التالية: (1) التحكم في النوع البري (WT) ؛ مجموعة النماذج (150 مجم / كجم / يوم D-gal ؛ Mod) ؛ (3) CH: D-gal plus 100 مجم / كجم CDPS ؛ (4) سم: D-gal plus 50 مجم / كجم CDPS ؛ (5) CL: D-gal plus 25 مجم / كجم CDPS ؛ (6) مجموعة ABX: المضادات الحيوية بالإضافة إلى D-gal plus 50 mg / Kg CDPS ؛ (7) مجموعة Cy: cyclophosphamide plus D-gal plus 50mg / kg CDPS.
تلقت الفئران من مجموعات النموذج ، ABX ، Cy ، و CDPS حقنًا تحت الجلد من محلول ملحي 15 0 مجم / كجم D-gal يوميًا لمدة شهرين. تم حقن مجموعة WT تحت الجلد بكمية متساوية من المحلول الملحي لمدة شهرين. تم أيضًا إعطاء فئران مجموعة CDPS يوميًا بحقن داخل المعدة تحتوي على 1 0 0 مجم / كجم ، 5 0 مجم / كجم أو 25 مجم / كجم CDPS لمدة شهرين. تلقت فئران مجموعة ABX مياه الشرب مع 0. 1 مجم / مل من الأمبيسلين و 0.5 مجم / مل من الستربتومايسين لمدة شهرين بالإضافة إلى حقن D-gal و CDPS. قبل إعطاء D-gal ، تلقت الفئران حقنًا تحتوي على 0.1 مجم / مل من الأمبيسيلين ، و 0.5 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 0.1 مجم / مل من الكوليستين لمدة 7 أيام في مجموعة ABX. تلقت الفئران مجموعة Cy حقن داخل الصفاق من 20 ملغ / كغ سيكلوفوسفاميد كل يومين (qod) لمدة شهرين بالإضافة إلى الحقن اليومية من D-gal و CDPS.
اختبار التعرف على الأشياء الجديدة
إجراء تجارب سلوكية بعد آخر جرعة. اشتمل اختبار التعرف على الأشياء على مراحل التعرف والتدريب والاختبار. خلال مرحلة التعارف ، تم تعويد الفئران في غرفة اختبار فارغة لمدة 10 دقائق لمدة يومين. بعد ذلك ، في اليوم الثالث (يوم التدريب) ، تم وضع جسمين من نفس الحجم والشكل واللون (A1 و A2) على طرفي نقيض من الغرفة. ثم تم إعطاء كل فأر 10 دقائق لاستكشاف الشيئين المتشابهين. بعد 1- ساعة (في اليوم الثالث) و 24- ساعة (في اليوم الرابع) فواصل زمنية من التدريب إلى الاختبار ، تم استبدال أحد العناصر المتشابهة (A1 أو A2) بـ B أو C كائن مختلف في الحجم واللون والشكل في يوم الاختبار. أثناء مرحلة الاختبار ، تم اختبار كل ماوس لمدة 5 دقائق وتم حساب الفهرس التفضيلي لتحديد ذاكرة التعرف على كائن جديد (B أو C) باستخدام الصيغة التالية: الفهرس التفضيلي=الوقت على الكائن B أو C / (الوقت المستغرق في الكائن B أو C بالإضافة إلى الوقت على الكائن A) × 100 بالمائة.
اختبار متاهة موريس المائية
تم إجراء اختبار متاهة موريس المائية في بركة دائرية بعمق 45 سم وقطرها 90 سم. البروتوكول الذي وصفه Ruediger S ، وآخرون. (2011) [55] وود آر إيه وآخرون. (2018) [56] كان يعمل هنا. كان عمق الماء في البركة 30 سم ودرجة حرارة الماء 20 ± 1 درجة مئوية وكان قطر المنصة 6 سم و 1 سم تحت الماء. كان وقت التدريب والاختبار 60 ثانية لكل منهما. للتدريب ، أجرينا أربع تجارب كل منها 60 ثانية بمنصة خفية كل يوم لمدة خمسة أيام متواصلة. إذا لم يتم اكتشاف المنصة بواسطة الفئران في 60 ثانية ، فقد تم توجيهها إلى المنصة ووضعها على المنصة لمدة 5 ثوانٍ. خلال مرحلة الاختبار ، تم تسجيل وتحليل زمن الوصول للوصول إلى المنصة المخفية في جلسات التدريب والتحقيق ، وعدد العبور فوق موقع المنصة الذي تمت إزالته ، والوقت الذي يقضيه في الربع المستهدف (المنصة).
فحوصات ELISA
تم تحليل مستويات المصل من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل IL -2 () و IL -4 و IL -10 و TNF- لكل مجموعة من الفئران باستخدام مجموعات ELISA المشتراة من Shanghai Yi Li شركة التكنولوجيا البيولوجية المحدودة (شنغهاي ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحليل نشاط إنزيم مضادات الأكسدة ، ديسموتاز الفائق (SOD) ، ومستويات منتج بيروكسيد الدهون ، malondialdehyde (MDA) ، في مصل كل مجموعة من الفئران عن طريق مجموعات الفحص التي تم شراؤها من معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing ، الصين) . تم تقدير مستويات منتجات بروتين الأكسدة المتقدمة (AOPP) في عينات قرن آمون الفئران باستخدام مجموعة ELISA من Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (شنغهاي ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تقدير الإجهاد التأكسدي في أدمغة الفئران
قمنا بتجانس 1 0 من نسيج قرن آمون مع 0.9 مل من محلول ملحي مبرد بالثلج وتم الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تحليل محتوى البروتين في المادة الطافية باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA ( Beyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصين). تم تحليل مستويات بيروكسيد الدهون (LPO) و malondialdehyde (MDA) ، وأنشطة GSH-Px و SOD في عينات الحصين عن طريق قياس الألوان باستخدام مجموعات من معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.
تكوين ميكروبيوتا الأمعاء
تم جمع عينات البراز من جميع الفئران وتخزينها فورًا عند درجة -80 C. تم تسلسل المنطقة V3 plus V4 من جين 16S rRNA باستخدام Illumina MiSeq (شركة Beijing Novogene Co. Ltd. ، بكين ، الصين) وتم تحليلها باستخدام QIIME منصة مفتوحة لتحديد ملامح الأمعاء الدقيقة.
تحليل LC / MS لمستقلبات المصل
تم تحضين عينات المصل لمدة 0 دقيقة باستخدام ميثانول مبرد مسبقًا بنسبة 1: 3 لترسيب البروتينات. تم طرد العينات عند 12 {14}} 00r / min لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تحليل المواد الطافية بواسطة Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography و QExactive الكتلي. يتم عرض الظروف الكروماتوغرافية في الجدول 1. تم فصل المواد التحليلية في عمود كروماتوجرافي XBridge BEH Amide (2.1 × 100 مم ؛ شركة ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام 0.1 بالمائة من حمض الفورميك والأسيتونتريل كمرحلتين متحركتين A و B ، على التوالى. تم ضبط معدل التدفق عند 0.4 مل / دقيقة ، وكان حجم الحقن 5 ميكرولتر ، وتم ضبط درجة حرارة العمود عند 25 درجة مئوية (الجدول 1). تم الحصول على إشارات الطيف الكتلي باستخدام أوضاع مسح الأيونات الموجبة والسالبة. يتم عرض جهد رش الأيونات ومعلمات MS المحددة الأخرى في الجدول 2.
تحليل احصائي
Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1 - 0 وص< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">
