استنساخ الجينات والتحديد الوظيفي والتحليل الهيكلي والتعبيري لسينثاز السكروز من Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 تحليل تعبير CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa وفي نظام زراعة الخلايا تحت ضغط الجفاف

4.1 تحليل تعبير CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa

أكدت تجارب تحويل الخلية الكاملة في المختبر وتجارب التفاعل التحفيزي الأنزيمي أن البروتين المشفر بواسطة جين CtSus لديه القدرة على تحفيز تخليق الجلوكوز UDP. من أجل مواصلة استكشاف العلاقة بين هذا الجين والتخليق الحيوي لمركبات الجليكوسيد في Cistanche tubulosa، تم تحديد مستوى التعبير عن هذا الجين في أجزاء مختلفة منسيستانش توبولوساتم تحليلها.

مواد خام سيستانش عالية الجودة للبيع

الخدمة الداعمة لـ Wecistanche-اتصل بنا للحصول على معلومات الخصم:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

إشيناكوسيدهو مركب جليكوسيد الأكثر تمثيلا في Cistanche tubulosa، ويمكن أن يصل محتواه إلى أكثر من 30٪ من الوزن الجاف لنباتات Cistanche tubulosa [23]. قامت المجموعة البحثية سابقًا بقياس محتوى الإكيناكوسيد في أجزاء مختلفة من نباتات Cistanche tubulosa، وكان الأداء المحدد هو: محتوىechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>الجزء الجوي; من بينها، كان محتوى إكيناكوسيد في الهوستوريوم هو الأعلى. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام [كدنا] من أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa كقوالب، وتم تحليل النتائج بواسطة 2- طريقة ΔΔCT وتم إجراء التحليل التفاضلي. وتظهر النتائج في الشكل 4A. كان مستوى التعبير لجين CtSus في الهوستوريوم هو الأعلى، 1.5 مرة من الجزء الموجود فوق سطح الأرض، وكان مستوى التعبير في الجزء الموجود تحت الأرض أعلى بكثير من الجزء الموجود فوق سطح الأرض، وهو ما يتوافق مع نمط تراكم جليكوسيدات فينيل إيثانول. ويمثلها إشيناكوسيد في أجزاء مختلفة منسيستانش توبولوسا.

الشكل 4: مستويات التعبير النسبي لـ CtSus في أجزاء مختلفة من C. tubulosa وفي الخلايا المعلقة المعالجة بواسطة PEG6000. ج: مستوى التعبير النسبي لـ CtSus في أجزاء مختلفة من C. tubulosa؛ B: مستوى التعبير النسبي لـ CtSus في خلايا التعليق C. tubulosa التي تمت معالجتها بواسطة PEG6000 في نقاط زمنية مختلفة n=3، 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05،***P ＜ 0.001

مواد خام سيستانش عالية الجودة

4.2 تحليل تعبير CtSus في خلايا تعليق Cistanche deserticola تحت ظروف إجهاد الجفاف

وأظهرت الأبحاث الأولية للمشروع ذلكإجهاد الجفاف الناجم عن PEG6000يستطيعزيادة كبيرةالتراكم جليكوسيدات الفينيل إيثانولفي خلايا سيستانش المعلقة. من 3 إلى 9 أيام بعد التحريض، زاد محتوى إشنساسيد بشكل ملحوظ. ومن اليوم 12 إلى 15معدل نمو إشنساسيدتباطأ المحتوى ووصل إلى الحد الأقصى للقيمة في اليوم الخامس عشر. ثم، مع زيادة وقت الثقافة، زاد محتوى إشنسا بشكل ملحوظ. محتوى الفركتوسيد انخفض تدريجيا [24]. على أساس هذا البحث، استخدمت هذه الورقة [كدنا] لخلايا تعليق Cistanche deserticola غير المعالجة وخلايا تعليق Cistanche deserticola المستحثة بـ PEG 6000- كقوالب لإجراء اكتشاف PCR كمي مضان في الوقت الحقيقي لفحص جين CtSus في معلق Cistanche deserticola الخلايا تحت ظروف إجهاد الجفاف. التغيرات في مستويات التعبير. وتظهر النتائج في الشكل 4B. في خلايا تعليق Cistanche deserticola المستحثة بـ PEG6000، زاد التعبير عن CtSus بشكل ملحوظ في اليوم السادس بعد التحريض، ووصل إلى أعلى قيمة في اليوم التاسع، ثم انخفض مرة أخرى إلى نفس مستوى التحكم. مجموعات من نفس المستوى. تظهر النتائج المذكورة أعلاه أن إجهاد الجفاف يمكن أن يزيد بشكل كبير من التعبير عن جين CtSus في خط الخلايا المعلقة Cistanche deserticola، وهو ما يتوافق مع نمط تراكم الإشناسيسيد تحت إجهاد الجفاف. ومع ذلك، فإن ذروة التعبير عن جين CtSus تظهر في وقت أبكر من ذروة محتوى الإشنساسيد، لأن المتبرع النشط بالجليكوزيل المُصنَّع بواسطة التحفيز CtSus هو مقدمة مهمة مطلوبة لتفاعل الارتباط بالجليكوزيل متعدد الخطوات في المسار الحيوي اللاحق للإشنساسيد. لذلك من المتوقع أنه بعد تعرضها لإجهاد الجفاف، ستقوم الكائنات الحية بشكل تفضيلي بتعبئة الجينات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي الأولي لتحقيق تراكم الجهات المانحة النشطة، ومن ثم تحقيق تراكم المستقلبات الثانوية المهمة.

مواد خام سيستانش عالية الجودة

5 دراسة بنية ثلاثية الأبعاد لبروتين CtSus وتحليل المواقع النشطة الرئيسية

استنادًا إلى وظيفة CtSus في تحفيز إنتاج الجلوكوز UDP المتبرع بالجليكوزيل، تمت دراسة الأساس الهيكلي للنشاط التحفيزي لـ CtSus. تم استخدام أداة SOPMA عبر الإنترنت للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. أظهرت النتائج أن البنية الثانوية لـ CtSus تحتوي على 55.28% حلزونية، 25.47% لفائف عشوائية، 12.80% خيوط ممتدة، و6.46% لفات (الشكل 5A)، مما يشير إلى أن الحلزونات هي أهم الوحدات الهيكلية الثانوية في بروتين CtSus، تليها الملفات العشوائية، والتي تمثل أيضًا نسبة كبيرة من البروتين. يتم توزيع الخيوط والمنعطفات الممتدة في جميع أنحاء البروتين. وفقا للدراسات الموجودة، عادة ما يوجد سينسيز السكروز في شكل رباعي، والذي يعتبر شكله النشط. لذلك، استخدمت هذه الورقة أيضًا AlphaFold2 للتنبؤ ببنية بروتين CtSus وحصلت على بنيتها ثلاثية الأبعاد لرباعيات البروتين. وجدت مقارنة قاعدة بيانات PDB (بنك بيانات البروتين) أن التشابه التسلسلي بين Arabidopsis thaliana sucrose Synthase AtSus1 (PDBID 3S28) وCtSus يمكن أن يصل إلى 77.93٪. تمت مقارنة هيكل CtSus المتوقع مع هيكل AtSus1 ثلاثي الأبعاد، وكانت قيمة انحراف مربع متوسط ​​الجذر (RMSD) بعد تراكب البروتين 1.11 Å، مما يشير إلى أن الهياكل المكانية للاثنين متسقة للغاية (الشكل 5B).

تم استخدام البنية المعقدة البلورية للبروتين يجند لـ Arabidopsis AtSus1 مع UDP والفركتوز (PDBID3S29) كقالب [16] لتحليل وضع الربط لـ CtSus مع UDP والفركتوز. وتظهر نتائج الالتحام الجزيئي في الشكل 5C. يمكن ملاحظة أن جيوب ربط الركيزة في AtSus1 وCtSus متشابهة جدًا من حيث نوع الأحماض الأمينية والتوزيع المكاني والتكوين، والتداخل مرتفع، مما يثبت أن تسلسل سينسيز السكروز محفوظ بدرجة عالية في النباتات. يظهر الشكل 5D توافقات الرابطين، UDP والفركتوز، في جيب ربط ركيزة البروتين. يتمتع الالتحام الجزيئي الأكثر فائدة لـ UDP وCtSus بتداخل جيد مع تشكيل UDP في مجمع AtSus 1- UDP البلوري، مما يثبت دقة نتائج الالتحام الجزيئي. يظهر التفاعل بين UDP وبقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في جيب ربط ركيزة البروتين في الشكل 5E. يرتبط UDP وCtSus معًا بشكل أساسي بروابط هيدروجينية وتفاعلات كارهة للماء. تشتمل بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في جيب ربط الركيزة على: eu294، وGly301، وMet576، وArg578، وLys583، وGln646، وAsn652، وLeu677، وThr678، وGlu681.

مراجع

[1] سونغ زد إتش، لي إل، تو بي إف. التقدم في أبحاث النشاط الدوائي في نباتات CistancheHoffing. وآخرون الرابط [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药)، 2003، 34: 113-115.

[2] ليو دبليو جيه، ليو واي، سونغ كيو كيو، وآخرون. مقارنة كيميائية بين Cistanchetubulosa المزروعة والبرية باستخدام التحليل الطيفي ¹H-NMR [J]. الصين جي تشين ماتر ميد (中国中药杂志)، 2018، 43:3506-3512.

[3] سونغ واي، تسنغ كي، جيانغ واي، وآخرون. Cistanches Herba، من الأنواع المهددة بالانقراض إلى علامة تجارية كبيرة للطب الصيني [J]. Med Res Rev، 2021، 41: 1539-1577.

[4] ليو واي، وانغ إتش، يانغ إم، وآخرون. يحمي عديد السكاريد Cistanche deserticola خلايا PC12 من الإصابة الناجمة عن OGD/RP [J]. بيوميد فارماكوثر، 2018، 99: 671-680.

[5] يين واي، هوانغ جي، غو إكس، وآخرون. تطور إنزيمات التحويل البيني للنيوكليوتيدات والسكر في النبات [J].PLoS One، 2011، 6: e27995.

[6] بار بيليد م، أونيل إم إيه. تكوين سكر النوكليوتيدات النباتية والتحويل البيني والإنقاذ عن طريق إعادة تدوير السكر [J]. آنو ريف بلانت بيول، 2011، 62: 127-155.

[7] قوه إتش، لي إل، وانغ بي جي. التوصيف الكيميائي الحيوي لـ UDP-GlcNAc/Glc4- epimerase من الإشريكية القولونية O86:B7 [J]. الكيمياء الحيوية، 2006، 45: 13760-13768.

[8] دونغ إس، تشيسنوكوفا أون، تيرنبوغ سي إل جونيور، وآخرون. تحديد إنزيم UDP-N-acetylglucosamine4-epimerase المتورط في غليكوزيل بروتين exosporium في Bacillus anthracis [J]. جي باكتريول،2009، 191: 7094-7101.

[9] لي إل إن، كونغ جي كيو. تحديد النسخ على نطاق واسع لجينات سينسيز السكروز في Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv، 2016، 6: 18778-18792.

[10] شمولزر ك، جوتمان أ، ديريكس إم، وآخرون. سينسيز السكروز: تطوير عملية نقل الغليكوزيل الفريدة من نوعها من أجل التحفيز الحيوي [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11] كارديني CE، ليلوار LF، تشيريبوغا J. التخليق الحيوي للسكروز [J]. جي بيول كيم، 1955،214: 149-155.[12]ستاين أو، جرانوت