Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides تحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الخلايا الكبدية H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan و Jinyu Li و Adila Aipire و Yi Yang و Lijie Xia و Xinhui Wang و Yijie Li و Jinyao Li

الملخص

خلفية:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight هو دواء صيني تقليدي يتطفل على جذور نبات Tamarix ويستخدم لعلاج الضعف الجنسي والعقم وضعف الجسم وكمقوي. ومع ذلك ، فإن تأثيره المضاد للأورام على سرطان الخلايا الكبدية لا يزال بعيد المنال. هنا ، قمنا بالتحقيق في التأثير المضاد للورمC. tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) على خلايا سرطان الخلايا الكبدية H22 في المختبر وفي الجسم الحي وآلياته. الطريقة: تم تحليل التشكل ، والبقاء ، وموت الخلايا المبرمج ، ودورة الخلية ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) لخلايا H22 عن طريق الفحص المجهري المقلوب ، ومقايسة MTT ، وقياس التدفق الخلوي ، على التوالي. تم الكشف عن تعبير وتنشيط البروتينات في مسار موت الخلايا المبرمج بواسطة لطخة غربية. تم تقييم التأثير المضاد للورم في الجسم الحي في نموذج فأر للورم تم إنشاؤه باستخدام ذكور فئران كونمينغ. النتائج: أدى علاج CTPG إلى تثبيط نمو خلايا H22 بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت ، والتي ارتبطت بزيادة موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية في مرحلتي G 0 / G1 و G2 / M. علاوة على ذلك ، لوحظ تكاثف الكروموسومات في خلايا H22 المعالجة بـ CTPG. أدى علاج CTPG إلى زيادة كبيرة في نسبة Bax / Bcl -2 ، وخفض ميكرومتر ، وتعزيز إطلاق السيتوكروم ج. تم زيادة مستويات caspase المشقوق -8 و caspase -9 في كل من مسارات الإشارات الخارجية والداخلية بشكل كبير عن طريق caspase التي يتم تنشيطها بالتتابع -7 و -3 لتقسيم PARP. أخيرًا ، CTPG (سيستانشتوبولوساجليكوسيدات فينيلثانويد) منع نمو خلايا H22 في الفئران وتحسين معدل بقاء الفئران المصابة بالورم. الاستنتاجات: تشير هذه النتائج إلى أن CTPG يثبط نمو خلايا H22 من خلال مسارات موت الخلايا المبرمج الخارجية والداخلية.

خلفية

يحتل سرطان الكبد المرتبة السادسة في حالات الإصابة بالسرطان والرابعة في الوفيات الناجمة عن السرطان على مستوى العالم. علاوة على ذلك ، فقد احتلت المرتبة الرابعة من حيث الإصابة بالسرطان والأول من حيث الوفيات بالسرطان في البلدان ذات المؤشر الاجتماعي الديموغرافي المنخفض [1]. يُعد سرطان الكبد في الصين ثالث سبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في عام 2015 [2]. أكثر من 90 بالمائة من سرطانات الكبد الأولية هي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) في العالم [3]. حاليًا ، يعتبر الاستئصال الكبدي هو الخيار الرئيسي لعلاج سرطان الكبد. ومع ذلك ، فإن أقل من 30 في المائة من المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد يستوفون معايير الاستئصال الكبدي العلاجي ، ولا يزال معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5- عامًا منخفضًا مثل 35-50 في المائة بسبب معدل التكرار المرتفع [4 ، 5 ]. إن توفر خيارات العلاج لمرضى سرطان الكبد (HCC) من المستوى المتوسط ​​إلى المتقدم محدود للغاية. تمت الموافقة على سورافينيب ، وهو دواء موجه جزيئيًا ، من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية كخط العلاج الأول لمرض سرطان الكبد (HCC) المتقدم. ومع ذلك ، فإن سورافينيب يطيل فقط حوالي 3 أشهر من البقاء على قيد الحياة ومعدل الاستجابة أقل من 4 في المائة [6 ، 7]. من الضروري تطوير عقاقير أو استراتيجيات جديدة ضد سرطان الكبد. تم استخدام الطب الصيني التقليدي (TCM) بمفرده أو مع استراتيجيات أخرى لعلاج سرطان الكبد وأظهر الفوائد السريرية بما في ذلك فترة البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة ، وتحسين نوعية الحياة ، وتقليل التفاعلات الضائرة ، وما إلى ذلك [8 ، 9].سيستانش، وهو نوع من الطب الصيني التقليدي ، له وظائف بيولوجية مختلفة ، مثلمضاد للأكسدة ، مضاد للالتهابات ، مضاد للشيخوخة ،وحماية الأعصاب [10 ، 11]. تعتبر جليكوسيدات فينيلثانويد المكونات النشطة الرئيسية لـسيستانش، والتي لها أنشطة متنوعة بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومكافحة الالتهاب ، وحماية الكبد ، وحماية الأعصاب [12-15]. لقد أبلغت مجموعتنا عن ذلكCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الميلانيني B 16- F10 ويثبط نمو الأورام في الفئران [16]. في هذه الدراسة ، قمنا بقياس التأثير المضاد للورم لـ CTPG على خلايا HCC H22 في المختبر وفي الجسم الحي وبحثنا في آلياته. وجدنا أن CTPG تسبب في موت الخلايا المبرمج في خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية وقمع نمو أورام H22 في الفئران.

طُرق

خط الخلية

تم الحصول على خلايا سرطان الخلايا الكبدية للفأر H22 من مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية بجامعة شينجيانغ (أورومكي ، شينجيانغ ، الصين) وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 (Gibco) مع 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، ومصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10 في المائة (جيبكو) عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

فحص MTT

تم شراء CTPG من Hetian Dichen Biotech Co.، Ltd. (Hetian، Xinjiang، China) وتم تأهيل المركبات الرئيسية لـ CTPG وقياسها بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء [16]. تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- yl) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) (Sigma، St. ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تلقيح خلايا H22 في 96- ألواح بئر بكثافة 2 × 1 0 4 خلايا في وسط 1 0 مايكرولتر لكل بئر وتم تربيتها عند 37 درجة. بعد 24 ساعة ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 100 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO (يساوي 400 ميكروغرام / مل CTPG) لمدة 24 ، 48 و 72 ساعة ، على التوالي. . بعد الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق ، تم التخلص من المادة الطافية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT (5 مجم / مل في PBS) إلى كل بئر. تم تحضين الصفائح عند 37 درجة لمدة 4 ساعات وأضيف 100 مايكرولتر DMSO لإذابة بلورات فورمازان المتكونة. تم الكشف عن قيم OD490 بواسطة 96- قارئ جيد للصفيحة الدقيقة (مختبرات Bio-Rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب صلاحية الخلية وفقًا للصيغة: قابلية بقاء الخلية (النسبة المئوية)=(معالجة OD / معالجة OD غير معالجة) × 100 بالمائة.

الكشف عن موت الخلايا المبرمج

تمت معالجة خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 1 0 0 ، 200 ، 300 ، و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة ، ثم تم تلوينها باستخدام Annexin V FITC / طقم اكتشاف موت الخلايا المبرمج يوديد البروبيديوم (PI) (YEASEN ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية).

الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا

عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، و 200 ، و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، ثم تلطخت بصبغة JC -1 المنفذة للغشاء (بيوتايم ، الصين) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة. بعد الغسيل مرتين باستخدام محلول JC -1 ، تم تعليق العينات باستخدام 300 مايكرولتر من محلول JC -1 وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل دورة الخلية

تم تلقيح خلايا H22 في أطباق زراعة بحجم 6 0 مم وتم معالجتها بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 1 0 0 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لـ 24 ساعة تم جمع جميع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تثبيت الخلايا في 70 في المائة من الإيثانول المثلج عند - 20 درجة لمدة ساعتين وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم أعيد تعليقها في محلول تلطيخ يوديد بروبيديوم / RNase 300 ميكرولتر (BD Biosciences). بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تم جمع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحليل توزيع دورة الخلية باستخدام برنامج ModFit LT 3.0.

Hoechst 33258 تلطيخ

تم تحليل التغيرات المورفولوجية لنواة خلية H22 بواسطة صبغة Hoechst 33258 التي يمكن نفاذها بالغشاء. تم زرع خلايا H22 في 6- صفيحة بئر بتركيز 1 × 1 0 5 خلايا / بئر في وسط 2 مل. بعد التقاء 60 في المائة ~ 70 في المائة ، عولجت الخلايا بـ CTPG (0 ، 100 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة. تم جمع الخلايا وتثبيتها باستخدام 4 في المائة من بارافورمالدهيد جليدي بارد عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم تلوين الخلايا بـ Hoechst 33258 (Beyotime ، الصين) عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. تمت ملاحظة العينات بواسطة مجهر مضان مقلوب (Nikon Eclipse Ti-E ، اليابان).

لطخة غربية

تم شراء Anti-caspase -3 و anti-cleaved caspase -3 و Anti-Bcl -2 و anti-Bax من Beyotime Biotech Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين). Anti-caspase -7، anti-cleaved-caspase -7، anti-caspase -8، anti-cleaved-caspase -8، anti-caspase -9، anti تم شراء-caspase -cleaved-caspase -9 و anti-PARP و anti-cleaved PARP و IgG-HRP المضاد للفأر و IgG-HRP المضاد للأرانب من Cell Signaling Technology. تم شراء Anti - - actin من شركة Beijing ComWin Biotech Co.، Ltd. (بكين ، الصين).

عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 1 0 0 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة. تم جمع الخلايا وفصلها باستخدام Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co. ، Ltd) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم تدوير العينات (12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات) لجمع المواد الطافية وتم قياس تركيزات البروتين بواسطة مجموعة BCA (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عزل كمية متساوية من البروتين في كل عينة بنسبة 12 بالمائة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF (Biosharp ، الصين). بعد الحجب باستخدام محلول TBST يحتوي على 5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم ، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الأولية المقابلة والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل (HRP) ، على التوالي. بعد الغسل باستخدام TBST ، تم اكتشاف البروتينات المستهدفة بواسطة مجموعة اختبار ECL (Beyotime ، الصين).

بيان الحيوانات والأخلاق

تم شراء 6-8 أسبوع من فئران كونمينغ من الذكور من مركز مختبر الحيوان بجامعة شينجيانغ الطبية (أورومتشي ، شينجيانغ ، الصين). تم الاحتفاظ بالفئران في منشأة حيوانية قياسية يتم التحكم في درجة حرارتها ودورة ضوئية في جامعة شينجيانغ. تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة شينجيانغ. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية (BRGE-AE001) ، جامعة شينجيانغ.

دراسة ورم الفأر

لتحريض نموذج فأر الورم ، تم حقن ذكور فئران كونمينغ تحت الجلد باستخدام 1 × 1 0 6 خلايا H22 في 1 0 0 ماي PBS في الجناح الأيمن. بعد 3 أيام ، تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى 3 مجموعات (7 فئران / مجموعة). تم حقن مجموعة التحكم بـ 0.1 مل DMSO تحت الجلد حول الورم. تم حقن مجموعات CTPG -200 و CTPG - 400 تحت الجلد باستخدام 200 أو 400 مجم / كجم من CTPG في 0.1 مل DMSO حول الورم. تم علاج الفئران كل يومين لمدة تصل إلى 21 يومًا. تم قياس أحجام الورم باستخدام الفرجار حتى 25 يومًا وتم حساب حجم الورم وفقًا للصيغة: حجم الورم (مم 3)=(الطول × العرض 2) / 2. بعد 25 يومًا ، تمت مراقبة بقاء الفئران المصابة بالورم يوميًا حتى نهاية هذه الدراسة.

تحليل احصائي

تم حساب الدلالة الإحصائية من خلال تحليل أحادي الاتجاه للتباين بين العلاج ومجموعات المراقبة. تم التعبير عن جميع البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري (SD). p <0. 05="" اعتبرت="" ذات="" دلالة="">

نتائج

قلل CTPG من صلاحية خلايا H22 في المختبر

من أجل استكشاف التأثير المضاد للورم لـ CTPG على HCC ، عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 100 ، 200 ، 300 ، 400 ميكروغرام / مل) في المختبر. بعد 24 ساعة ، لوحظ شكل خلايا H22 باستخدام مجهر مقلوب. وجدنا أن مورفولوجيا خلايا H22 قد تغيرت بشكل كبير من خلال علاج CTPG. مع زيادة تركيز CTPG ، أصبحت الخلايا صغيرة ومستديرة وانخفض عدد الخلايا أيضًا بشكل كبير (الشكل 1 أ). تم استخدام اختبار MTT لتحليل صلاحية خلايا H22 بعد علاج CTPG لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. قلل CTPG بشكل كبير من قابلية بقاء خلية H22 بطريقة تعتمد على الجرعة وتعتمد على الوقت (الشكل 1 ب). وصل CTPG عند 300 ميكروغرام / مل إلى أفضل معدل مثبط (الشكل 1 ج). قيم IC50 من CTPG لخلايا H22 هي 236 ميكروغرام / مل عند 24 ساعة و 169.8 ميكروغرام / مل عند 48 ساعة.

تسبب CTPG في موت الخلايا المبرمج في خلايا H22

لاستكشاف ما إذا كان انخفاض قابلية خلايا H22 يتم توسطه عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج ، تمت معالجة خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، و 100 ، و 200 ، و 300 ، و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة وملطخة مع PI و Annexin V. أظهرت نتائج قياس التدفق الخلوي أن CTPG تسبب بشكل كبير في موت الخلايا المبرمج لخلايا H22 (بما في ذلك موت الخلايا المبرمج المبكر والمتأخر) بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 2 أ). على الرغم من أن الجرعة العالية من CTPG أدت أيضًا إلى زيادة نخر خلايا H22 بشكل كبير ، إلا أن النخر يلعب دورًا ثانويًا في تثبيط نمو خلايا H22 نظرًا لانخفاض نسبته (8.3 بالمائة) مقارنةً بنسب موت الخلايا المبرمج (52.6 بالمائة). علاوة على ذلك ، تم عزل البروتينات الكلية لخلايا H22 بعد علاج CTPG وتم الكشف عن تعبيرات سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا B المضادة للاستماتة (Bcl -2) والبروتين X المرتبط (Bax) المؤيد للاستماتة -2- بواسطة لطخة غربية. أظهرت بيانات المسح بتدرج الرمادي أن مستويات التعبير عن Bax و Bcl -2 قد زادت وانخفضت على التوالي. تمت زيادة نسبة Bax / Bcl -2 بشكل ملحوظ (الشكل 2 ب). تشير هذه النتائج إلى أن CTPG يحرض موت الخلايا المبرمج في خلايا H22.

يؤدي CTPG إلى تكثيف الكروموسومات وتوقف دورة الخلية في خلايا H22

تم الإبلاغ عن أن تلف الحمض النووي وتوقف دورة الخلية الناجم عن الأدوية يمكن أن يمنع نمو الخلايا السرطانية ويسبب موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية [17 ، 18]. للكشف عن مورفولوجيا النوى في خلايا H22 بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة ، تم تلوين خلايا H22 بواسطة Hoechst 33،342 وتمت ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري الفلوري المقلوب. أظهرت الخلايا المعالجة بـ CTPG زيادة تعتمد على الجرعة للكروماتين المكثف الزاهي للنواة ، بينما أظهرت الخلايا غير المعالجة نوى ملطخة بشكل متجانس (الشكل 3 أ). تم تحليل توزيع دورة الخلية في خلايا H22 بشكل أكبر عن طريق تلطيخ PI بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، أدى علاج CTPG إلى زيادة كبيرة في نسبة خلايا G 0 / G 1- وخلايا G2 / M-phase وقلل بشكل كبير نسبة خلايا المرحلة S ، مما يشير إلى أن CTPG تسبب في حدوث G 0 إيقاف طور G1 و G2 / M في خلايا H22. كما أدت الجرعة العالية من CTPG إلى زيادة كبيرة في نسبة خلايا G1 الفرعية.

قلل CTPG من إمكانات غشاء الميتوكوندريا وزاد من إطلاق السيتوكروم ج

يلعب المسار المعتمد على الميتوكوندريا دورًا مهمًا في تحريض موت الخلايا المبرمج [19 ، 20]. يمكن مراقبة التغيرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) بواسطة تلطيخ JC -1 بسبب JC -1 الركام (التألق الأحمر) يمكن أن يتفكك إلى مونومر (مضان أخضر) مع تقليل ميكرومتر [21]. بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة ، تم تلوين خلايا H22 بصبغة JC - 1. أظهرت بيانات قياس التدفق الخلوي أن التألق الأحمر في قناة FL -2 والتألق الأخضر في قناة FL -1 قد انخفض بشكل كبير وزاد عند علاج CTPG. تمت زيادة نسبة خلايا PE− FITC plus بشكل كبير (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن CTPG خفض ميكرومتر في خلايا H22. وهذا يتوافق مع نسبة Bax / Bcl المتزايدة -2. نتيجة لذلك ، لاحظنا زيادة كبيرة في إطلاق السيتوكروم ج عند علاج CTPG (الشكل 4 ب). أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG قد يؤدي جزئيًا إلى موت الخلايا المبرمج في خلايا H22 عبر مسار (جوهري) يعتمد على الميتوكوندريا.

قام CTPG بتنشيط مسار caspase ومنع إصلاح الحمض النووي

بعد ذلك ، تم تحليل تنشيط كاسباس الناجم عن CTPG عبر مسارات الإشارات الخارجية والداخلية. بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة ، تم عزل البروتينات الكلية من خلايا H22 وتم الكشف عن مستويات الكاسبيسات المؤيدة والمشقوقة بواسطة لطخة غربية. مقارنةً بالتحكم غير المعالج أو DMSO ، فإن علاج CTPG قد أدى إلى زيادة التنظيم بشكل كبير ليس فقط في مستوى الكاسبيز المشقوق -8 (المسار الخارجي) ولكن أيضًا مستوى الكاسبيز المشقوق -9 (المسار الداخلي) (الشكل. 5). بالتتابع ، قام caspase المنشط -8 و -9 بتقسيم pro-caspase المصب {11}} و -7 اللذان تم ملاحظتهما في الشكل 5. caspase المنشط -3 شق الحمض النووي إصلاح إنزيم بوليميريز بولي (ADP-ribose) (PARP) لمنع إصلاح الحمض النووي وتراكم تلف الحمض النووي كما لوحظ في الشكل 3 أ.

أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG تسبب في موت الخلايا المبرمج في خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية.

يمنع CTPG نمو H22 HCC في الجسم الحي ويحسن معدل بقاء الفئران المصابة بالورم

أخيرًا ، تم تقييم التأثير المضاد للورم لـ CTPG على HCC في نموذج فأر الورم ، والذي تم إنشاؤه عن طريق الحقن تحت الجلد لخلايا H22. بعد 3 أيام من حقن الخلايا H22 ، عولجت الفئران السرطانية بـ CTPG 8 مرات. تمت مراقبة وزن جسم الفئران وأحجام الورم في النقاط الزمنية المحددة. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، لا يوجد فرق كبير في وزن جسم الفئران في كل مجموعة ، مما يشير إلى أن الجرعات المختارة من CTPG ليس لها آثار جانبية واضحة. ومن المثير للاهتمام ، أن نمو الورم في الفئران التي عولجت بـ 2 {12}} 0 ملغم / كغم و 400 ملغم / كغم من CTPG قد تم تثبيطه بشكل كبير (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، حسنت الجرعتان من علاج CTPG بشكل كبير بقاء الفئران الورمية (3/7 ، 3/7) مقارنةً بالمجموعة الضابطة (0/7) في نهاية التجربة (الشكل 6 ب). وجدنا أيضًا أن CTPG عزز بشكل كبير تكاثر الخلايا الطحالية المعزولة من فئران كونمينغ الذكرية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6 ج) ، مما يشير إلى أن CTPG له تأثير تحفيز مناعي.

مناقشة

تم استخدام الطب الصيني التقليدي لعلاج أمراض مختلفة بما في ذلك السرطانات على مدى تاريخ طويل. تم الإبلاغ عن أن الطب الصيني التقليدي يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية من خلال كل من مسارات الإشارات الخارجية (التي تعتمد على مستقبلات الموت) والداخلية (المعتمدة على الميتوكوندريا) لممارسة التأثيرات المضادة للورم [22-25]. يمكن للمسارين تنشيط caspase -8 و -9 على التوالي [24 ، 26]. هنا ، وجدنا أن CTPG قمع بشكل كبير نمو خلايا H22 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية. تم تنظيم مستويات الكاسبيز المشقوق -8 و -9 بشكل كبير من خلال علاج CTPG ، مما يشير إلى أن كلا من مسارات الإشارات الخارجية والداخلية كانت متورطة في تحريض موت الخلايا المبرمج. أظهرت دراستنا السابقة أن CTPG تسبب في موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الميلانيني B 16- F10 عن طريق المسار المعتمد على الميتوكوندريا الذي زاد من مستوى الكاسبيز المشقوق -9 ولكن ليس الكاسبيز -8 [16]. قد ينشط CTPG مسارات إشارات مميزة في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية.

يتم تنظيم سلامة غشاء الميتوكوندريا بإحكام من قبل أعضاء عائلة بروتين BCL {{0} بما في ذلك Bax و Bcl -2 [27 ، 28]. تلعب نسبة Bax إلى Bcl -2 دورًا مهمًا في مسار موت الخلايا المبرمج المعتمد على الميتوكوندريا [29]. في خلايا H22 المعالجة بواسطة CTPG ، تم تنظيم نسبة Bax / Bcl -2 بشكل كبير ، مما قد يتسبب في تقليل ميكرومتر وإطلاق السيتوكروم ج الذي لوحظ في هذه الدراسة. نتيجة لذلك ، تم شق وتفعيل pro-caspase -9. أخيرًا ، قام منشئو caspase النشط -8 و -9 بتنشيط منفذ تنفيذ caspase -3 لشق PARP لمنع إصلاح الحمض النووي. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن CTPG تسبب في موت الخلايا المبرمج في خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية.

في نموذج الفأر الورمي ، قام CTPG بقمع نمو H22 HCC بشكل كبير وحسن بشكل كبير من بقاء الفئران المصابة بالورم. ومن المثير للاهتمام ، أن CTPG عزز بشكل يعتمد على الجرعة تكاثر الخلايا الطحالية من فئران كونمينغ ، وهو ما يتوافق مع دراستنا السابقة [16].

تشير هذه النتائج إلى أن CTPG قد يثبط نمو H22 HCC في الفئران من خلال التأثير المباشر المضاد للورم وتعزيز المناعة غير المباشر.

الاستنتاجات

قام CTPG بقمع نمو خلايا H22 في كل من المختبر وفي الجسم الحي وموت الخلايا المبرمج المستحث في خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية. أشارت هذه البيانات إلى أن CTPG قد يكون مرشحًا محتملاً لعلاج سرطان الكبد.