Cistanche Tubulosa يحمي الخلايا العصبية الدوبامينية من خلال تنظيم موت الخلايا المبرمج والعامل العصبي المشتق من الخلايا الدبقية: في الجسم الحي وفي المختبر Ⅰ

مقدمة

مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكس عصبي شائع يحدث عند كبار السن مع المظاهر المرضية لفقد الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء (SN) بسبب التنكس. ترتبط شدة المرض بفقد الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في SN، وهو ما يتوافق مع الرأي القائل بأن عملية التنكس العصبي تتقدم على مدى سنوات عديدة قبل ظهور أي أعراض (ساول ومايرز، 1993). تشير الطبيعة التقدمية للمرض إلى إمكانيات مثيرة للاهتمام للتدخل العلاجي عن طريق منع عملية التنكس العصبي الأساسية. إن البحث عن إجراءات قوية ومحددة ناجمة عن العلاج لعوامل التغذية العصبية على بقاء الخلايا العصبية DA أمر ذو أهمية كبيرة.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لحماية الخلايا العصبية الدوبامينية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

عوامل التغذية العصبية هي بروتينات أساسية، بما في ذلك عامل نمو الأعصاب (NGF)، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)، وعامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF)، والتي تعزز نمو الأعصاب، والتطور العصبي، والتوجيه المحوري، والوظيفة العصبية. من بين جميع عوامل التغذية العصبية التي تحمي وتعزز إصلاح الخلايا العصبية الدوبامينية، فإن GDNF له أقوى التأثيرات (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). لقد ثبت أن GDNF يمتلك تأثيرات عصبية قوية على الخلايا العصبية DA في المختبر (Lin et al.، 1993) ولممارسة تأثيرات وقائية عصبية في الجسم الحي. لقد ثبت أن GDNF ينقذ الخلايا العصبية DA النيجيرية من موت الخلايا الناجم عن الآفة بعد بضع الخلايا الناجم عن الجراحة أو السم في الفئران (Beck et al.، 1995؛ Kearns and Gash، 1995؛ Sauer et al.، 1995) وجزئيًا أيضًا بعد الإدارة النظامية لN-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP)في الفئران (توماك وآخرون، 1995). إن زيادة معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية وانخفاض التأثيرات الوقائية لعوامل التغذية العصبية، والتي يحتمل أن تكون ناجمة عن عوامل مرضية مختلفة، تكمن وراء انحطاط الخلايا العصبية الدوبامينية (هولدن وآخرون، 2006).

C. tubulosa هو دواء عشبي ينشأ من عدة نباتات من جنس Cistanche. وهو خيار علاجي رئيسي لمتلازمة نقص الكلى الذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بهرمونات الأندروجين في الطب الصيني التقليدي (TCM). حتى الآن، أظهرت الكثير من الأبحاث السريرية والأساسية حول C. tubulosa أنشطة الأمراض التنكسية العصبية. إن تحديد وصفات TCM لتقوية الكلى في علاج PD قد يوفر علاجًا سريريًا بديلاً لـ PD.إشيناكوسيد (ECH)هو مكون نشط بيولوجيًا رئيسيًا موجود في العشبة الطبية C. tubulosa. وقد أظهرت الدراسات التأثيرات العلاجية للجليكوسيدات من Cistanche وECH،com.verbascoside(VER)، وicariin (ICA) على مرض الزهايمر (AD)، PD، ومرضى الخرف الوعائي الآخرين (Urano and Tohda، 2010؛ Wang et al.، 2013؛ Wu et al.، 2014). وو وآخرون. (2014) اقترح أن مستخلصات C. tubulosa التي تحتوي على ما يكفي من ECH والأكتيوسيد خففت من الخلل المعرفي الناجم عن A -42 عن طريق منع ترسب الأميلويد وعكس وظيفة الخلايا العصبية الدوبامينية الكولينية والحصين. تاو وآخرون. (2015) وجد ذلكجليكوسيدات فينيليثانويدمن C. tubulosa (Ph Gs-Ct) منعت الوذمة الدماغية على ارتفاعات عالية عن طريق تقليل تعبير البروتين وmRNA لـ AQP4 في أنسجة المخ لنماذج الفئران.

مستخلص السيستانش توبولوسا الطبيعي يعمل على تحسين الذاكرة PHGS75% ECH 30% ACT 12%

أظهرت الدراسات السابقة أن المركبات العشبية الصينية، بما في ذلك المكونات الثلاثة لـ C. tubulosa، و epimedium، و rhizoma polygonati، خففت من الأضرار التي لحقت بالخلايا العصبية الدوبامينية وزيادة مستويات الدوبامين عن طريق تنظيم التعبير عن عوامل التغذية العصبية (وو وآخرون، 2013). وبالتالي ، ليس من المعروف حتى الآن ما إذا كانت التأثيرات الوقائية العصبية الناجمة عن C. tubulosa طويلة الأمد وإلى أي مدى يمكن أن يوفر إنقاذ الخلايا العصبية DA النيجيرية عن طريق إدارة GDNF الحفاظ بشكل كبير على السلوكيات الحركية ذات الصلة بأعراض حيوانات PD. استخدمت هذه الدراسة وصفة TCM لتقوية الكلى، C. tubulosa nanopowder، التي حصلت على براءة اختراع وطنية (رقم براءة الاختراع: 2011103028541) في الصين وأظهرت سابقًا تأثيرًا علاجيًا معينًا في مرض باركنسون. لذلك، تم تصميم الدراسة الحالية لدراسة التأثيرات الوقائية للأعصاب والتجدد لعلاج C. tubulosa والتحقيق في موت الخلايا المبرمج على خلايا MES23.5 والفئران السلوكية النهائية، وتنظيم GDNF، كما تم قياسه بواسطة مجموعة من الاختبارات المستهدفة. .

المواد والأساليب

المواد والكواشف والمعدات

تم شراء C. tubulosa من Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd.، بكين، الصين. جاءت ECH وVER وICA من المعاهد الوطنية لمراقبة الأغذية والأدوية في الصين. كان خط الخلايا العصبية الدوبامينية MES23.5 هدية من البروفيسور بياو تشن، مختبر البيولوجيا العصبية، جامعة العاصمة الطبية، بكين، الصين. تم شراء خمسين فأرًا ذكرًا من طراز C57BL/6 (يزن كل منها 20-25 جم) من شركة Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (رقم الترخيص: SCXK 2012-0002)، شنغهاي، الصين.

تم شراء MPP + وMTT والجلوتامين من Sigma-Aldrich (Carlsbad، CA، USA)؛ تم شراء مصل الأبقار المتوسط ​​والجنين DMEM/F12 من شركة Gibco (Life Technologies، Carlsbad، CA، USA)؛ وتم شراء معيار MPTP و DA ومعيار حمض الهوموفانيليك (HVA) من Sigma-Aldrich (كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء -actin و Bax و Bcl2 و GDNF و GDNF alpha (GFR 1) والأجسام المضادة Ret من Cell Signaling Technology، Inc. (Beverly، MA، USA)؛ تم شراء مجموعة كاشف تلطيخ 3،3'-diaminobenzidine (DAB) من Fuzhou Maixin Biotech.، Ltd. (فوجيان، الصين)؛ وتم شراء مجموعة أدوات تحضير عينة الهلام SDS-PAGE ومجموعة الكشف عن اللمعان الكيميائي المعزز فائق الحساسية (ECL) ومقايسة حمض البيكينكونيك (BCA) من معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية (بكين، الصين).

استخدمت هذه الدراسة الأدوات التالية: قارئ الألواح الدقيقة ELX800 (Bio Tek Winooski، VT، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ حاضنة ثاني أكسيد الكربون (هيرايوس، هاناو، ألمانيا)؛ نظام تحليل التصوير الهلامي Gel DOC 2000 وخلية الرحلان الكهربائي وخزان الرحلان الكهربائي (Bio-Rad، Hercules، CA، USA)؛ محلل البروتين DU-650 (Beckman Coulter، Inc.، Fullerton، CA، USA)؛ 5417R جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة (إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا)؛ مطحنة الكرة الكوكبية المزدوجة SXQM (Changsha، Tencan Powder Technology Co., Ltd، Hunan، China)؛ مطحنة الخلاط MM400 (Retsch GmbH، هان، ألمانيا)؛ Agilent 1200 كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC؛ Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA)؛ PowerPac Basic الكهربائي، نظام نقل الغشاء PowerPac Basic، جهاز تصوير التألق الكيميائي Universal Hood II، نظام النسخ العكسي S1000 Thermal Cycler RNA (Bio-Rad)؛ نظام تحليل صور الأنسجة والخلايا Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd، شيامن، الصين).

إعدادجيم توبولوسامسحوق النانو

تم وزن C. tubulosa، ثم تنقيته وتجفيفه. بعد السحق التقليدي، تم تمرير مسحوق C. tubulosa الناعم من خلال منخل شبكي 200-ثم تجفيفه بالتجميد. تم استخدام فراغ يتم التحكم في درجة حرارته وطاحونة كروية عالية الطاقة لتحضير مسحوق النانو C. tubulosa. أولاً، تم وضع مسحوق النانو C. tubulosa الخام في خزان طحن كروي مفرغ تم تحميله بكرات طحن كربيد. تراوحت النسبة بين كرات الطحن والمسحوق النانوي C. tubulosa من 15:1 إلى 5:1. للحصول على مسحوق ناعم، تم ضبط سرعة ومدة طاحونة الكرات عالية الطاقة على 300 دورة في الدقيقة و20 دقيقة، على التوالي. تم وزن المسحوق الناعم لمعالجة المواد النانوية ومعالجته في مطحنة الخلاط بتردد 25/ثانية وتذبذب 20 ثانية لثلاثة تكرارات. تم استخدام PBS لحل وتحضير محلول مخزون 25 مجم / مل، متبوعًا بـ 30 دقيقة من الموجات فوق الصوتية، والتعقيم، وأخيراً التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

مراقبة جودة المكونات النشطة لـجيم توبولوسابواسطة HPLC

يحتوي ECH وVER على شطف متدرج مع سيليكا مرتبطة بأوكتاديسيلسيلان كحشو، وميثانول كمرحلة متنقلة A، و0.1% محلول حمض الفورميك كمرحلة متنقلة B. وكان الطول الموجي للكشف 330 نانومتر. يحتوي ICA على شطف متدرج مع السيليكا المرتبطة بأوكتاديسيلسيلان كحشو وماء أسيتونيتريل (30:70) كمرحلة متنقلة. كان الطول الموجي للكشف 270 نانومتر. تم قياس العينة والتحكم والتحكم السلبي بـ 10 ميكرولتر لكل اختبار.

ثقافة الخلية وفحص MTT لقياس جدوى MPP+-الخلايا المعالجة

تم تلقيح خلايا MES23.5 باستخدام 5% من مصل العجل الجنيني، و1% جلوتامين، و2% 50× محلول ساتو، ووسيط DMEM/F12 مع 2% بنسلين/ستربتوميسين. تم تحضينها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة 5% ثاني أكسيد الكربون مع رطوبة مشبعة. تم عزل الخلايا وتمريرها باستخدام التربسين بنسبة 0.25٪ وتم حصاد تعليق الخلية في مرحلة النمو اللوغاريتمي. تم زرع الخلايا المعزولة ذات الكثافة 1 × 105 في صفائح بئر 96- مغلفة بالبوليليسين، متبوعة بإضافة تركيزات نهائية مختلفة (6.25، 12.5، 25، 50، 100، 200، 400 و 800 ميكرومول / لتر) ) من وسائط MPP+. تم استخدام خلايا MES23.5 التي تم تحضينها بوسط زراعة طبيعي لمدة 24 ساعة و48 ساعة كعناصر تحكم سلبية في التجارب المختبرية. تم تحضين الخلايا من مجموعات العلاج المختلفة بكاشف MTT لمدة 4 ساعات. تم بعد ذلك التخلص من المحلول الموجود في الآبار وأضيف 150 ميكرولتر من DMSO وتأرجح لمدة 10 دقائق. تم قياس امتصاصية كل عينة عند طول موجة 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروية تلقائي. النسبة المئوية لبقاء الخلية (٪)=يعني الامتصاص للمجموعة التجريبية / يعني الامتصاص للمجموعة الضابطة السلبية × 100٪.

تمت إضافة التركيزات ذات الصلة من وسط MPP+ للمعالجة لمدة 24-ساعة في خلايا MES23.5 باستخدام نفس النهج المتبع في الثقافة المختبرية. بعد العلاج، تم التخلص من الحل في البئر. تمت إضافة الوسائط التي تحتوي على تركيزات مختلفة (10، 50، 100، 200، 250، 500، و 1000 ميكروغرام / مل) من C. tubulosa nanopowder إلى خلايا MES23.5 في آبار مختلفة وتركت لاحتضانها لمدة 24 ساعة و48 ساعة. تم استخدام خلايا MES23.5 التي تم تحضينها بوسط الاستزراع الطبيعي لمدة 24 ساعة و48 ساعة كعناصر تحكم سلبية. تم استخدام خلايا MES23.5 التي تم تحضينها بوسط MPP+ كوسيلة. تم إجراء القياسات في ثلاث نسخ لكل عينة. تم قياس امتصاص مجموعات العلاج والسيطرة المقابلة لحساب بقاء الخلية.

مستخلص سيستانش توبولوسا طبيعي مضاد للتعب PHGS75% ECH 30% ACT 12%

التعبير TH يقاس بالكيمياء المناعية

عندما كان C. tubulosa nanopowder في 100، 200، و250 ميكروغرام/مل، زاد معدل بقاء الخلية بشكل ملحوظ (الشكل 2G). وهكذا، في تجارب لاحقة، قمنا باختبار التركيزات الثلاثة: مجموعات الجرعة المنخفضة، والجرعة المتوسطة، والجرعة العالية. تم اختبار ثلاث مكررات لكل مجموعة من مجموعات C. tubulosa. تم وضع ساترة معقمة ومغطاة بالبوليليسين في 6- صفائح جيدة. بعد ذلك، تم زرع 5 × 10 خلايا في كل بئر واحتضانها لمدة 24 ساعة. تم استبدال الوسط الطازج التقليدي في مجموعة التحكم الطبيعية وتم استبدال التركيز النهائي بمقدار 100 ميكرومول/لتر MPP+ في مجموعات العلاج المتبقية لاحتضانها لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك استبدال الوسائط الجديدة التقليدية في مجموعات التحكم والمركبات العادية، وتم تحضين التركيزات النهائية البالغة 100 و200 و250 ميكروغرام/مل C. tubulosa nanopowder مع الخلايا لمدة 24 ساعة في الجرعات المنخفضة والمتوسطة والعالية. مجموعات العلاج C. tubulosa، على التوالي. تم غسل خلايا MES23.5 في المجموعات المختلفة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لإزالة الطاف وتثبيته بشكل أكبر في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني، تم تحضين الخلايا باستخدام مانع البيروكسيديز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم غسلها مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني. تم استخدام محلول 0.2% Triton X-100 لنفاذية الخلية لمدة 10 دقائق، يليه الغسيل باستخدام PBS. تمت إضافة مصل الماعز الطبيعي إلى كل عينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تمت بعد ذلك إزالة مصل الماعز الطبيعي وتم إضافة الجسم المضاد الأولي المخفف بنسبة 1: 400 في برنامج تلفزيوني إلى كل عينة واحتضانه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. تم تحضين الخلايا الموجودة في المجموعة الضابطة السلبية باستخدام برنامج تلفزيوني عند درجة حرارة 4 درجات مئوية خلال الليل. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني، تم تحضين الخلايا بأجسام مضادة ثانوية تحمل علامة البيوتين في غرفة الرطوبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم بعد ذلك غسل كل عينة في برنامج تلفزيوني وتم تصنيفها باستخدام اتحادات بيروكسيداز-ستربتافيدين الفجل (محلول العمل C) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني، تم تلوين الخلايا بكاشف DAB في الظلام لمدة 1-10 دقائق تقريبًا وتم رصد تطور اللون البني تحت المجهر الضوئي. تم بعد ذلك غسل كل عينة مرتين في الماء المقطر لمدة 1-2 دقيقة وتمت مقاومة النوى بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 0.5-1 دقيقة. بعد شطف كل عينة جيدًا في الماء، تم غمر الخلايا في 1% من كحول حمض الهيدروكلوريك للتمايز و1% من الأمونيا المائية، يليها غسل الخلايا جيدًا في الماء. تم بعد ذلك تجفيف الخلايا من كل عينة في 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين، و80٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين، و90٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مرتين، و95٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مرتين، و100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مرتين. تم بعد ذلك غمر الخلايا في محلول الزيلين لمدة دقيقتين مرتين وتثبيتها على شريحة زجاجية براتنجات محايدة. تحت المجهر الضوئي، خضعت كل عينة لالتقاط الصور واختيار عشوائي لـ 5-10 مجالات بصرية فعالة لتحديد التعبير عن البروتينات المحددة في الخلايا العصبية الدوبامينية المشار إليها بكثافة الجزيئات البنية ولتحديد محتوى البروتين بشكل شبه كمي بمتوسط ​​قيمته الرمادية .

معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا MES23.5 يقاس بالتدفق الخلوي

تم غسل الخلايا الملتصقة مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. لعزل الخلايا، تمت إضافة كمية مناسبة من محلول التربسين الخالي من EDTA في درجة حرارة الغرفة وتم تمرير المحلول بلطف للسماح للخلايا الملتصقة بالانفصال. ثم تمت إضافة وسط زراعة الخلايا لإيقاف عملية التربسين. تم نقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي جديد ثم طرده لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة لتجميع الخلايا المعزولة. بعد التخلص من طاف، تم إعادة تعليق بيليه الخلية بلطف باستخدام برنامج تلفزيوني، وتم حساب الخلايا. تم طرد ما يقرب من 1 × 105 إلى 5 × 105 من الخلايا المعلقة لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة وتم التخلص من الطاف. تمت إضافة خمسة ميكروليتر من محلول ربط Annexin V-FITC إلى بيليه الخلية لإعادة تعليق الخلايا بلطف. تمت إضافة 5 ميكرولتر أخرى من Annexin V-FITC وخلطها جيدًا. تم استخدام خمسة ميكروليتر من محلول يوديد البروبيديوم لتلوين الخلايا عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل وقت قصير من قياس التدفق الخلوي.

تحليل لطخة غربية لفي المختبر

تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة طبيعية، مجموعة علاج MPP+، بجرعة منخفضةجيم توبولوسامجموعة العلاج، مجموعة العلاج بجرعة متوسطة من C. tubulosa، ومجموعة العلاج بجرعة عالية من C. tubulosa. تم قياس التعبير عن Bcl2 وBax في كل منهما. تم استخدام إجمالي 1 × 1 0 5 خلايا لكل بئر في لوحة البئر 6- للنمذجة والعلاج في كل مجموعة قبل حصاد الخلايا. تمت إضافة محلول مختلط، يحتوي على محلول RIPA ومثبط الأنزيم البروتيني ومثبط الفوسفاتيز، لتحلل الخلايا لمدة 3 0 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي، تم استخدام طاف لتحليل البروتين. تم قياس كمية البروتين الكلي باستخدام اختبار BCA وفصلها بنسبة 10٪ SDS-PAGE. تم نقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء واحتضانها باستخدام محلول مانع للحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تم بعد ذلك تحضين الغشاء في الجسم المضاد الأولي (Bcl-2 0.34 مجم/مل، باكس 0.11 مجم/مل، تخفيف 1:200) عند درجة حرارة 4◦م طوال الليل. بعد خطوة الغسيل، تم تحضين الغشاء في جسم مضاد ثانوي (0.5 مجم / مل، تخفيف 1: 5000) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ثم في مطور ECL لمدة دقيقتين للتطوير التقليدي. تم استخدام برنامج الكمية واحد للتحليل شبه الكمي للتعبير البروتين.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لمكافحة التعب وحماية الكبد PHGS75% ECH 30% ACT 12%

النمذجة الحيوانية التجريبية وإدارة الأدوية

تم تقسيم خمسين فأرًا ذكرًا 8-خالية من مسببات الأمراض بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات: مجموعة عادية، مجموعة علاج MPTP (مركبة)، مجموعة علاج بجرعة منخفضة من بكتيريا C. tubulosa، ومجموعة علاج بجرعة متوسطة من C. tubulosa مجموعة العلاج بجرعة عالية من C. tubulosa. تم إيواء الحيوانات في درجة حرارة 20-22 درجة مئوية مع إمكانية الحصول على الطعام والماء مجانًا. تم حقن الفئران في المجموعة الطبيعية داخل الصفاق بكمية متساوية من المحلول الملحي الطبيعي لمدة سبعة أيام متتالية. تم حقن الفئران في مجموعات العلاج الأخرى داخل الصفاق بـ MPTP (30 مجم / كجم / يوم) لمدة سبعة أيام متتالية لإنشاء المركبات.

أثناء نمذجة PD، كانت الفئران في مجموعات علاج C. tubulosa بجرعات منخفضة ومتوسطة وعالية الجرعة تدار داخل المعدة بكميات سريرية مكافئة تبلغ 4 جم / كجم / يوم، و8 جم / كجم / يوم، و16 جم / يوم. كجم / دجيم - مسحوق نانوي توبولوساعلى التوالي لمدة 14 يوما متتالية. تم إعطاء الفئران في مجموعات التحكم والمركبة كميات مكافئة من المياه المالحة الطبيعية داخل المعدة لمدة 14 يومًا متتالية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة فوجيان في الطب الصيني التقليدي وتم تنفيذها وفقًا للمبادئ المقبولة دوليًا لاستخدام ورعاية الحيوانات في المختبر. تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات في هذه الدراسة.