تنسيق تنظيم استقلاب التربتوفان الجهازي والكلى بواسطة شركات نقل الأدوية OAT1 و OAT3

جيفري سي جرانادوس¹، آن ريشيل²، جاهر م. جوتيريز¹، باتريك تشانغ³شينليان تشانغ⁴، فيبها بهاتناغار⁵ناثان إي لويس^1,2,6، وسانجاي ك.نيغام^2,7,*

^{اتصال:joanna.jia@wecistanche.com}

تجربة cistanche

كيف تشعر الأعضاء بالمستقلبات المنتشرة هو سؤال أساسي. هنا ، نوضح أن ناقلات الأنيون العضوية متعددة النوعية للأدوية ، OAT1 (SLC22A6 أو NKT) و OAT3 (SLC22A8) ، تلعب دورًا في الإحساس بالأعضاء. كشفت تحليلات الأيض في مصل الفئران الشوفان 1 و Oat3 عن تغييرات في مشتقات التربتوفان المشاركة في التمثيل الغذائي والإشارات. العديد من هذه المستقلبات مشتق من ميكروبيوم الأمعاء وهي متورطة كسموم اليوريمي فيمزمنالكلىمرض. تم دعم التفاعل المباشر مع الناقلات بمقايسات النقل المستندة إلى الخلية. لتقييم تأثير فقدان وظيفة OAT1 orOAT3 على الكلى ، العضو الذي يتم فيه التعبير عن ناقلات الامتصاص هذه بشكل كبير ، تم تعيين البيانات النسخية بالضربة القاضية على نموذج حسابي قائم على "مهمة التمثيل الغذائي" والذي يقيم أكثر من 150 وظيفة خلوية. على الرغم من التغيرات في مستقلبات التربتوفان في كلا الضربة القاضية ، فقط في Oat1 بالضربة القاضية زادت الوظائف الخلوية المتعددة المرتبطة بالتريبتوفان. وبالتالي ، فإن الكلى ، التي تُحرم من القدرة على تناول الكينورينين ، والكينورينات ، والأنثرانيلات ، و N-for-mylanthranilate من خلال OAT1 ، تستجيب عن طريق تنشيط مسارات التخليق الحيوي الخاصة بها المتعلقة بالتريبتوفان. تدعم النتائج نظرية الاستشعار عن بعد والتشوير ، التي تصف كيف تساعد ناقلات "الأدوية" في تحسين مستويات الأيضات وإشارات الجزيئات من خلال تسهيل الحديث المتبادل للأعضاء. نظرًا لأن العديد من الأدوية تثبط OAT1 و OAT3 ، فإن البيانات تشير إلى إمكانية تفاعل الأدوية مع المستقلبات. في الواقع ، علاج البشر بالبروبينسيد ، مثبط الشوفان OAT المستخدم لعلاج النقرس ، يؤدي إلى ارتفاع مستقلبات التربتوفان المتداولة. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى أن الهيئات التنظيمية أوصت باختبار الأدوية للربط أو النقل OAT1 و OAT3 ، يتبع ذلك أنه يمكن استخدام هذه المستقلبات كمؤشرات حيوية داخلية لتحديد ما إذا كان الدواء المرشح يتفاعل مع OAT1 و / أو OAT3.

تم العثور على ناقلات الأنيون العضوي OAT1 (SLC22A6 ، في الأصل NKT (1)) و OAT3 (SLC22A8 ، في الأصل ROCT (2)) في النبيبات القريبة منالكلىوالضفيرة المشيمية للدماغ والتحكم في التوزيع الفسيولوجي والتخلص من العديد من الأدوية والسموم البيئية وكذلك المستقلبات الذاتية مثل-كيتوجلوتارات والبروستاجلاندين واليورات (3 ، 4). بالإضافة إلى ذلك ، تساعد OAT في تنظيم مستويات المنتجات الطبيعية المبتلعة والمركبات المشتقة من ميكروبيوم الأمعاء (على سبيل المثال ، epicatechin ، 3- كبريتات الإندوكسيل ، كبريتات p-cresol) (5 ، 6).

OAT1 و OAT3 ، أعضاء في عائلة SLC22 ، من بين أشهر ناقلات الأدوية متعددة الأنواع. تتضمن هذه المجموعة من ناقلات الأدوية أعضاءً آخرين في SLC (ناقل مذاب) وعائلات فائقة ABC (شريط ربط ATP) (7 ، 8). هناك مؤلفات واسعة حول الأدوار الصيدلانية والسمية لهذه الناقلات ، ومع ذلك فإن الوظائف الذاتية لهذه البروتينات المحفوظة تطوريًا ، وكذلك الشبكة التنظيمية التي تشارك فيها ، بدأت للتو في التوصيف (9). تؤثر هذه الناقلات متعددة الأنواع على العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية ، ومن المحتمل أن تعمل بالاشتراك مع ناقلات أحادية أو قليلة النوعية. ثلاثة أمثلة فسيولوجية مرضية جيدة التوصيف هي أدوار OAT1 و OAT3 و URAT1 و ABCG2 في النقرس (10) ، ودور OAT1 و OAT3 في تراكم السموم اليوريمية المرتبطة بالأمراض المزمنة.الكلىالمرض (CKD) (11 ، 12) ، وعائلة SLC22 في الحالات الحادةالكلىإصابة (13).

نظرًا للمجموعة الواسعة من مركبات الأنيون العضوية الصغيرة المنقولة بواسطة OAT1 و OAT3 ، يمكن أن تتنافس مجموعة كبيرة من الكائنات الغريبة الحيوية والجزيئات الذاتية على الوصول والتصفية الكلوية بواسطة ناقلات OAT (14 ، 15). هذا له آثار مهمة لأن العديد من المستقلبات ، بما في ذلك تلك الناشئة من ميكروبيوم الأمعاء والتي يتم نقلها بواسطة OAT1 و OAT3 ، تنظم علم وظائف الأعضاء الذاتية وقد ارتبطت بتطور الاضطرابات السريرية ، مثل CKD ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، ومرض السكري (14 ، 16 ، 17). على سبيل المثال ، كمية CMPF (3- carboxy -4- methyl -5- propyl -2- furan propanoic acid) ، وهي ركيزة من OAT3 ، في الدورة الدموية لها علاقة بمرض السكري. CMPF هو مستقلب من الأحماض الدهنية فيوران موجود في زيوت الأسماك والزيوت النباتية والزبدة والأطعمة الأخرى ويؤدي إلى اضطراب وظيفة خلايا البنكرياس ، مما يؤدي إلى عدم تحمل الجلوكوز (18 ، 19). تشمل العواقب المحتملة للتنافس على مستوى الناقل بين الدواء والمستقلب الداخلي المنشأ المنقول (أ) تغير تركيزات المستقلبات داخل الخلايا لأن الدواء المنقول يمنع دخول المستقلب إلى الخلية ؛ (ب) تغير تركيزات الدواء أو المستقلب أو كليهما في مصل الدم ، مما يؤدي إلى زيادة فترات نصف العمر و / أو مستويات المستقلب ؛ و (ج) الأيض الجهازي المتغير الناتج عن التأثيرات المتتالية البعيدة على مسارات التمثيل الغذائي المتعددة التي تعتمد على OAT1 أو OAT3 أو كليهما.

طبقنا نهج بيولوجيا الأنظمة الذي استخدم عمليات التمثيل الغذائي وبيانات النسخ من الفئران Oat1 و Oat3knockout (KO) لتحليل وظائف التمثيل الغذائي الرئيسية التي تتأثر بـ OAT1 و OAT3. تمثل البيانات الأيضية في الدم من الفئران Oat1 و Oat3 KO تأثير هذه الناقلات على التمثيل الغذائي الجهازي الداخلي. استخدمنا البيانات الترانسكربتومية منالكلى، وهو موقع التعبير عن جينات ناقل الترميز ، لتقييم نشاط مئات الوظائف الأيضية باستخدام تحليل المهام الأيضية. من خلال القيام بذلك ، تمكنا من استكمال فهم تغيرات المستقلب خارج الخلية بسبب فقدان ناقل OAT1 أو OAT3 بتحليل المسارات الأيضية داخل الخلايا المتأثرة.

معًا ، يوفر نهج متعدد omics وتحليل بيولوجيا الأنظمة المستخدمة هنا صورة لمسارات التمثيل الغذائي والإشارات المحلية والنظامية التي تم تعديلها بشكل منفصل ومشترك بواسطة OAT1 و OAT3. لقد أظهرنا أن OAT1 لا ينظم استقلاب التربتوفان بشكل منهجي فحسب ، بل يلعب أيضًا دورًا رئيسيًا في مسارات استقلاب التربتوفان داخل الأنسجة التي يوجد بها. وهكذا ، تشير نتائجنا إلى أن الدراسات التي أجريت على كيانات دوائية جديدة يجب ألا تأخذ في الاعتبار تأثيرات التفاعل بين الدواء والمستقلب (DMI) في المصل فحسب ، بل يجب أيضًا تقييم التحولات المحتملة في التمثيل الغذائي الخلوي بسبب فقدان تدفق المستقلب من خلال المنافسة على مستوى الناقل. لدعم الأهمية البشرية لعملنا ، نظهر أن العديد من التغييرات في مستويات المصل من مستقلبات التربتوفان التي شوهدت في الفئران بالضربة القاضية لوحظت أيضًا في البشر بعد إعطاء البروبينسيد ، وهو دواء يستخدم لعلاج النقرس الذي يثبط OAT1 و OAT3.

\

فوائد الذكور cistanche

نتائج

ملخص النهج الشامل

تشفر عائلة الجينات SLC22 (OATs ، OCTs ، OCTNs) للناقلات التي تشارك في امتصاص العديد من المركبات الفريدة عبر العديد من الأنسجة ، على الرغم من أن الكثير من البحث قد ركز على مجموعة من الأعضاء (SLC22A1 ، SLC22A2 ، SLC22A6 ، SLC22A8) التي تتعامل مع العديد من الأدوية الشائعة (20 ، 21). ومع ذلك ، فإن هذه الجينات محفوظة بشكل كبير ، مع وجود أخصائيي تقويم العظام في الذباب والديدان والأسماك وقنفذ البحر (22) ؛ هذا يعني أن لديهم أدوارًا فسيولوجية مهمة تتجاوز التعامل مع الأدوية. لتحديد الأدوار الذاتية لكل من OAT1 و OAT3 في التحكم في مستوى الأنسجة والتمثيل الغذائي على مستوى الكائن الحي بشكل مستقل عن أدوارها المعروفة كناقلات الأدوية والسموم ، قمنا بتحليل بيانات النسخ الخاصة بالأنسجة وبيانات التمثيل الغذائي في المصل (الشكل 1). قارنا البيانات المأخوذة من الفئران الناقصة وراثيًا في Oat1 أو Oat3 وعناصر التحكم من النوع البري. تم فحص مجموعات البيانات هذه سابقًا من منظور المعلومات الكيميائية (23) ولتقديم نظرة عامة واسعة على المسارات المتأثرة (24) ، ولكننا هنا نركز على دورها المحدد في التخلص من مستقلبات التربتوفان. لأن هذين الناقلين موجودان فيالكلى، قمنا بتحليلهاالكلىالبيانات النصية باستخدام تحليل المهام الأيضية ، وهي طريقة بيولوجيا للأنظمة تجمع الجينات وفقًا لأدوارها المنسقة في التخليق الحيوي لمجموعة محدودة من المستقلبات الرئيسية الوسيطة من مدخلات الأيض المتنوعة (انظر قسم الطرق لمزيد من التفاصيل). دعمنا هذه الدراسات في فحوصات النقل في المختبر. نحن ندعم أيضًا الأهمية السريرية لنتائجنا مع بيانات الأيض البشري.

الخصائص المعروفة لفئران Oat1 KO و Oat3 KO تقريبًا جميع خصائص الفئران التي تعاني من نقص في Oat1 أو Oat3 تشبه تلك الموجودة في الفئران البرية (25-27) (الجدول 1). فالفئران التي خرجت منها الضربة القاضية قادرة على البقاء على قيد الحياة مع بقاء على قيد الحياة يضاهي تلك الموجودة في الفئران البرية. علاوة على ذلك ، فإنها لا تظهر أي تشوهات نمو أو نمو غير طبيعي ، والفحص النسيجي والفسيولوجي لهذه الضربات القاضية المختلفة (التي تتراوح أعمارها من 2 إلى 8 أشهر) كشفت عن اختلافات طفيفة أو معدومة عن النوع البري ، بخلاف فئران Oat3 KO التي لديها ضغط دم منخفض قليلاً ( 28). كما لوحظ وجود اتجاه نحو ترسب الدهون الكبدية في Oat1 KO ولكن فقط بالنسبة للفئران القديمة جدًا (29).

تم تمييز الفئران الناقلة بالضربة القاضية أيضًا من وجهة نظر دوائية وسمية (الجدول 2). يلعب OAT1 و OAT3 دورًا مهمًا في التعامل مع العديد من الأدوية والسموم ، سواء البيئية أو المنتجة محليًا (30-38). لقد غيَّر كل من الفئران المصابة بالضربة القاضية استجابته لمدرات البول الحلقية والثيازيدية بسبب عدم قدرة هذه الأدوية على الوصول إلى تجويف النيفرون - وهي عملية تعتمد على امتصاص الشوفان OAT 1- أو OAT 3- في خلية الأنابيب القريبة . حيوانات Oat1 KO محمية ضد السمية الكلوية التي يسببها الزئبق بسبب نقصالكلىامتصاص تقارن الزئبق. تراكمت كل من الفئران السموم اليوريمية في مصل الدم وأظهرت انخفاض إفراز حمض البوليك. يُظهر تحليل خارج الجسم الحي للأنسجة من الفئران Oat1 KO أو Oat3 KO انخفاض امتصاص العديد من مضادات الفيروسات.

لقد أبلغنا أن الحيوانات الناقصة في Oat 1- ربما تكون قد قللت من التعبير عن OAT3 (39). ومع ذلك ، فقد أشار عدد من الدراسات إلى أن التأثير الوظيفي لهذا متواضع في أحسن الأحوال في الحالة القاعدية. على سبيل المثال ، الضربة القاضية Oat1الكلىخفضت بشكل ملحوظ انتقال الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ، ولكن لم يحدث فقد واضح في نقل ركيزة OAT3 ، كبريتات الإسترون (26). حدد التحليل الكيميائي للمعلومات مجموعات من الخصائص الجزيئية التي تميز المستقلبات التي تم تغييرها في Oat1 مقارنة بالفئران التي تعاني من نقص Oat3 (23). علاوة على ذلك ، جنينيةالكلىنقلت مزارع الأعضاء من كلا سلالتي الفئران مجموعات مختلفة من مضادات الفيروسات (36-38). هناك أيضًا اختلافات في أنواع السموم اليوريمية الموجودة في Oat1 مقابل Oat3 KO (34).

يتم تغيير استقلاب التربتوفان بشكل منهجي في الفئران Oat1 و Oat3 KO

تشير التحليلات الأيضية المنشورة لفئران Oat1 KO و Oat3 KO إلى تغييرات مهمة من الناحية الفسيولوجية في التعامل مع المستقلبات الذاتية ومنتجات ميكروبيوم الأمعاء ، بما في ذلك بعض السموم اليوريمية (34 ، 35). هنا ، قمنا بتحليل 731 مستقلبًا لهوية معروفة في مصل الدم تم جمعها من مجموعة السيطرة وفئران Oat1 KO. وبالمثل ، تم الكشف عن 611 ميتابوليتات معروفة الهوية في المصل من مجموعة السيطرة وفئران Oat3 KO.

بالنسبة لفئران Oat1 KO ، وجدنا أن 63 مستقلبًا في مسار الأحماض الأمينية الفائق (الجدول التكميلي S1) قد زاد بشكل كبير (p أقل من أو يساوي 0. 0 5 ، 54 نواتج أيضية ، من بينها 12 نواتج أيضية تغيرات أضعاف أعلى من 3) أو تتجه نحو زيادة ملحوظة (0. 05 أقل من أو يساوي p أقل من أو يساوي 0.10 ، تسعة نواتج أيضية) ، مما يشير إلى أنها إما ركائز OAT1 أو أن تركيزاتها في المصل تعتمد على OAT1. بالنسبة لفئران Oat3 KO ، وجدنا أن عشرة مستقلبات في مسار الأحماض الأمينية الفائقة قد زادت بشكل ملحوظ ، في حين أن 11 كانت تتجه نحو زيادة كبيرة (الجدول التكميلي S2). كمكمل للقيم p ، قمنا أيضًا بحساب Cohen's d ، والتي أظهرت أحجامًا كبيرة للتأثير (تتراوح من 1.76 إلى 4.17) لمستقلبات التربتوفان. تمشيا مع البيانات الدوائية والفسيولوجية الأخرى التي تم الحصول عليها من الفئران OAT1 و OAT3 أو أنسجتها التي تشير إلى اختلافات وظيفية مهمة (23 ، 36 ، 38) ، مقارنة التغيرات في مستقلبات المصل في طريقة Superpath للأحماض الأمينية بين Oat1 KO (63 مستقلب) و كشفت الفئران Oat3 KO (21 مستقلبًا) عن عشرة مستقلبات متداخلة فقط في هذه المجموعات الفرعية (الجدول التكميلي S3).

تم تصنيف كل مستقلب باستخدام برنامج Metabolon في واحد من ثمانية مسارات Superpathways (الأحماض الأمينية ، والكربوهيدرات ، والعوامل المساعدة ، والفيتامينات ، والطاقة ، والدهون ، والنيوكليوتيد ، والببتيد ، والزينوبيوتيك) وواحد من 90 مسارًا فرعيًا. من بين المستقلبات السبعة عشر التي تراكمت بشكل كبير في مصل كل من Oat1 KO و Oat3 KO ، أربعة تنتمي إلى مسار استقلاب التربتوفان الفرعي ، مما يشير إلى أن هذين الناقلين لهما دور مشترك مهم في تنظيم استقلاب التربتوفان الجهازي (الشكل 2) . بشكل مستقل ، كان استقلاب التربتوفان من بين المسارات الفرعية الأكثر إثراءً لكلا النموذجين بالضربة القاضية (الشكل 3). الشكل رقم ستة عشر 3. استقلاب التربتوفان هو أحد أكثر المسارات التي تم تغييرها في كل من الفئران بالضربة القاضية. تُظهر مؤامرة البركان لـ Oat1 KO (n=5) ​​نواتج التربتوفان مقابل جميع المستقلبات المقاسة الأخرى. ب ، استقلاب التربتوفان هو ثاني أكثر المسارات إثراءً للمستقلبات المرتفعة بشكل ملحوظ. C ، مؤامرة بركان لـ Oat3 KO (ن=3) تُظهر مستقلبات التربتوفان مقابل جميع المستقلبات المقاسة الأخرى. D ، استقلاب التربتوفان هو المسار الأكثر إثراءً للمستقلبات المرتفعة بشكل ملحوظ بناءً على تحليل مسار الأيض الفرعي. دور OAT1 و OAT3 في استقلاب التربتوفان 4 J. Biol. تشيم. (2021) 296 100575 تم قياس مستقلبات التربتوفان في مصل كلا الفئران ، وتم تغيير 12 بشكل كبير في مجموعة واحدة على الأقل. كان لدى الفئران Oat1 KO 11 مستقلبًا مرتفعًا ، بما في ذلك واحد (N-formylant hranilate) لم يتم قياسه في مصل Oat3 KO (الجدول 3). كشف تحليل Oat3 KO أن ستة من المستقلبات الـ 16 كانت بشكل كبير أو تتجه نحو التغيير بشكل كبير. من المعروف أن بعض هذه المستقلبات ، بما في ذلك تلك الناشئة عن البكتيريا الموجودة في الأمعاء الدقيقة ، لها تأثيرات بعيدة على العديد من الأعضاء الأخرى. على سبيل المثال ، يرتبط 3- كبريتات الإندوكسيل بتطورالكلىمرض ومتلازمة اليوريمي (12 ، 40). تشير البيانات إلى أن OAT1 و OAT3 يعملان معًا لتنظيم استقلاب التربتوفان الجهازي ، ومع ذلك فإن لهما أيضًا وظائف محددة في استقلاب التربتوفان من خلال التعامل مع مجموعات متميزة من المستقلبات التي تؤثر على التفاعلات الكيميائية الحيوية المختلفة.

تقييم التفاعلات الدوائية مع المستقلبات في البشر التي تتضمن عقار مثبط للـ OAT ومستقلبات التربتوفان

تم إعطاء عقار بروبينيسيد ، وهو دواء يستخدم لعلاج النقرس ، للبشر لتحديد التأثير قصير المدى لعقار مرتبط بالـ OAT عالي التقارب على مستويات المستقلبات المنتشرة. يحتوي البروبينسيد على ثلاثة أهداف راسخة: SLC22A12 (URAT1 ، Rst) ، OAT1 ، و OAT3 ، وكلها جينات مرتبطة ارتباطًا وثيقًا في مجموعة ناقل الأنيون العضوي لعائلة SLC22 من ناقلات المواد المذابة. URAT1 هو ناقل لحمض اليوريك يقع على الغشاء القمي (الجانب المواجه للبول) للنبيب القريب ، لذلك من المتوقع أن يمارس OAT1 و OAT3 ، وهما متعددان النوعية ويعبران عن الجانب المواجه للدم من الأنبوب القريب ، تأثير أكثر عمقا على التمثيل الغذائي في المصل. تظهر مقارنات القياسات الأيضية في الدم قبل وبعد 5 ساعات من الجرعة تغييرات كبيرة في مسار استقلاب التربتوفان الفرعي (الجدول 4). بسبب المنصات المختلفة ، كان هناك 22 مستقلبًا في هذا المسار الفرعي ، تم تغيير 16 منها بشكل كبير. تم قياس أربعة عشر مستقلبًا عبر جميع المنصات الثلاثة وكشف عن العديد من القواسم المشتركة بين الفئران بالضربة القاضية والبشر المعالجين بالبروبينسيد (الشكل 4). على سبيل المثال ، لوحظت زيادات في 3- كبريتات الإندوكسيل ، والكينورينين ، و N-acetylkynurenine ، ولاكتات الإندول في كل من مجموعات الفئران التي خرجت منها ضربة قاضية والبشر. ومع ذلك ، كان هناك المزيد من التداخل بين فأر Oat1 KO والبشر المعالجين بالبروبينسيد. جميع المستقلبات الثمانية التي تم رفعها بشكل ملحوظ في Oat1 KO كانت مرتفعة أيضًا بشكل كبير في البشر المعالجين بالعقاقير. فقط السيروتونين ، الذي كان مرتفعًا في فأر Oat3 KO ، لم يتغير في البشر.

تظهر الفئران التي عولجت بعقار مثبط للـ OAT تغيرات في استقلاب التربتوفان

كوسيط بين نماذج الفئران لدينا والبشر ، عالجنا الفئران من النوع البري بالبروبينسيد ، وهو عقار راسخ مثبط للـ OAT. أدى هذا العلاج الدوائي إلى ارتفاع ستة مستقلبات التربتوفان ، بما في ذلك كينورينين ، كينورينات ، وإندولاكتات (الشكل 5). تم رفع هذه المستقلبات في إحدى تجارب خروج المغلوب أو كليهما والبشر المعالجين بالبروبينسيد.

وبالتالي ، فإن النتائج الإجمالية في البشر والفئران المعالجين بالبروبينسيد ، وكذلك الفئران بالضربة القاضية ، تدعم دور OAT1 و OAT3 في تنظيم مستويات دوران مستقلبات التربتوفان.

تتفاعل مستقلبات التربتوفان مع OAT1 و OAT3 البشريين في فحوصات النقل في المختبر لتأكيد النتائج التي توصلنا إليها ، أجرينا فحوصات النقل في المختبر باستخدام الخلايا التي تفرط في التعبير البشري عن OAT1 و OAT3. تم اختبار العديد من المستقلبات في هذا المسار الفرعي مقابل هذه الناقلات (الجدول 3) ، لكن الأيضات الأخرى تظل غير مستكشفة. كشفت فحوصات النقل لحمض الإندوليتيك (ILA) أن ILA يتفاعل مع OAT1 و OAT3 (IC 50=229. 1 ± 74.56 ميكرومتر ، 74.49 ± 23.29 ميكرومتر على التوالي) (الشكل 6). علاوة على ذلك ، تفاعل السيروتونين ، الذي ارتفع بشكل فريد في Oat3 KO ، مع OAT3 فقط في المختبر (IC 50=288. 2 ± 167. 0 ميكرومتر) (البيانات غير معروضة). ثم تم دمج قيم IC50 مع قيم Km المعروفة لحساب الثوابت المثبطة. كان الثابت المثبط (Ki) لـ ILA مع OAT1 هو 119.3 ميكرومتر.

يشير تحليل المهمة الأيضية للكلى بالضربة القاضية إلى دور محوري لـ OAT1 في استشعار الأنابيب القريبة من نواتج التربتوفان

استخدمنا بيانات ميكروأري منالكلىOat1 KO و Oat3 KO وضوابطها من النوع البري لتحديد كيفية تأثير تعديلات الناقل علىالكلىوظائف التمثيل الغذائي. تحقيقًا لهذه الغاية ، استخدمنا طريقة بيولوجيا الأنظمة (تحليل المهام الأيضية (41) من أداة CellFie) التي تتنبأ بكيفية تأثير التغييرات في التعبير الجيني على قائمة محددة مسبقًا من 175 مهمة أيضية (الجدول التكميلي S4) ، والتي تغطي أنظمة التمثيل الغذائي العامة لـ الخلية (الطاقة ، النوكليوتيدات ، الكربوهيدرات ، الأحماض الأمينية ، الدهون ، الفيتامينات والعامل المساعد ، وأيض الجليكان). كما هو موضح في الطرق ، فإن حساب "نتيجة مهمة التمثيل الغذائي" يأخذ بيانات النسخ ويعزو نتيجة نشاط الجين لكل جين. يتم استخدام نموذج الأيض على نطاق الجينوم لتجميع قائمة بالتفاعلات المطلوبة لإنجاز كل مهمة من مهام التمثيل الغذائي البالغ عددها 175 مهمة. وبالتالي ، يمكن استخدام التحليل النسبي مباشرة للمقارنة الكمية للنشاط النسبي لكل وظيفة أيضية في ظل الظروف المختلفة (على سبيل المثال ، النوع البري مقابل Oat1 KO ، النوع البري مقابل Oat3 KO).

وجدنا أن مهام التمثيل الغذائي المرتبطة بالتريبتوفان كانت شائعة بين أولئك الذين لديهم فرق كبير بين Oat KO والفئران البرية. ما كان غير متوقع ، مع ذلك ، هو أنالكلىكانت المهام الأيضية المتعلقة بالتريبتوفان تعتمد على OAT1 ولكن ليس OAT3. في الفئران Oat1 KO ، أدى تخليق kynurenine و kynurenate و anthranilate و N-for-mylanthranilate من التربتوفان إلى زيادة درجات المهام الأيضية ، في حين أن كل من هذه المهام كان لها نتيجة مهمة استقلابية منخفضة في Oat3 KO. هذا يتوافق مع تحليلات المصل الأيضي ، والتي تظهر ارتفاعات كبيرة في مستويات الكينورينين ، والكينورينات ، والأنثرانيلات ، و N مقابل mylanthranilate في Oat1 KO.

مناقشة

تم التعرف على OAT1 و OAT3 لدورها في القضاء على مئات الأدوية (42). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر على OAT1 و OAT3 أن هذه البروتينات تشارك في نقل العديد من المستقلبات الداخلية والمشتقة من الميكروبات ، والسموم البوليسية ، وجزيئات الإشارة ، والمغذيات المبتلعة ، والسموم الصناعية ، والمنتجات الطبيعية (9 ، 24 ، 26 ، 34 ، 35 ، 43). يبدو أن هذا هو الحال أيضًا بالنسبة لناقلات الأدوية الأخرى متعددة الأنواع ، مما يشير إلى أن مساهمتها في التمثيل الغذائي الداخلي لا تحظى بالتقدير إلى حد كبير (44).

يتم التعبير عن ناقلات الأدوية متعددة الأنواع هذه بشكل كبير في جميع الأنسجة تقريبًا وتلعب دورًا حاسمًا بشكل خاص في الشكل 4. تم رفع مستقلبات التربتوفان في فئران الشوفان التي خرجت من قاضيتها والبشر المعالجين بالبروبينسيد. مخطط Venn لمستقلبات التربتوفان المتغيرة بشكل كبير في الفئران بالضربة القاضية والبشر المعالجين بالبروبينسيد. من بين 14 مستقلبًا مشتركًا في جميع المنصات الثلاثة ، تم رفع 12 مستقلبًا بشكل ملحوظ في واحدة على الأقل من التجارب. تم رفع أربعة مستقلبات بشكل ملحوظ في كل تجربة. ب ، ارتفاع التراكيب الكيميائية للمستقلبات في كل تجربة: 3- كبريتات إندوكسيل ، إندوليلاكتات ، كينورينين ، وأسيتيل كينورينين. C ، boxplots لكل مستقلب في البشر المعالجين بالبروبينسيد (n=20) ، الفئران Oat1 KO (n=5) ، وفئران Oat3 KO (n=3). تشير الخطوط في boxplots إلى الوسيط. دور OAT1 و OAT3 في استقلاب التربتوفان. بيول. تشيم. (2021) 296 100575 7 الحواجز الظهارية والبطانية بين الدم وسوائل / حجرات الجسم الأخرى (على سبيل المثال ، حاجز الدم في الدماغ ، حاجز الدم في شبكية العين ، حاجز الدم - السائل النخاعي ، حاجز الأنف - الدماغ ، حاجز الدم والبول). كمنظمين لعملية التمثيل الغذائي الجهازي ، وكذلك التمثيل الغذائي المحلي داخل أنسجة التعبير الخاصة بهم ، فإن نوع الدراسات والتحليلات التي وصفناها هنا إذا تم إجراؤها لجميع ناقلات "الأدوية" ، قد تغير بشكل جذري وجهات نظرنا الفسيولوجية لهذه البروتينات المحفوظة تطوريًا.

إن الأهمية الصيدلانية الإكلينيكية لهذه الناقلات هائلة ، وقد أوصت الهيئات التنظيمية بفحص كيانات الأدوية الجديدة ضد سبعة على الأقل من ناقلات الأدوية متعددة الأنواع (OAT1 ، OAT3 ، OATP1B1 ، OATP1B3 ، OCT2 ، P-GP ، BCRP) للحد من إمكانية استخدام الأدوية- التفاعلات الدوائية (DDI) - الحالات التي يتنافس فيها دواءان أو أكثر للوصول إلى نفس الناقل. يمكن أن تغير DDIs بوساطة الناقل تركيز الأدوية في الدم ، مما قد يؤدي إلى آثار سريرية ضارة (45). بالنظر إلى عدد ركائز OAT1 و OAT3 ، قد تحدث ظاهرة مماثلة بين الأدوية والمستقلبات المتداولة. تمتلك DMIs أيضًا القدرة على التأثير على وظيفة الأنسجة ، حيث قد لا تتمكن المستقلبات وجزيئات الإشارة من دخول الخلية وممارسة تأثيرها على فسيولوجيا الخلية الطبيعية. الدراسة الحالية تدعم هذا الاحتمال.

في تحليلات الأيض الخاصة بنا لمصل فئران Oat1 و Oat3 ، كانت هناك تغييرات ملحوظة في المستقلبات المرتبطة بالتريبتوفان. الزيادات في المستويات الجهازية من المستقلبات ، بسبب عدم وجود هذه الناقلات في واجهة الدم معالكلى، أثار احتمال تناقص التركيز داخل الخلايا فيالكلىخلايا الأنابيب القريبة. كيف يمكن لهذه الخلايا بدورها أن تستجيب؟ استخدمنا تحليل المهام الأيضية القائم على النسخ لمعالجة هذا السؤال. حددنا العديد من المهام الأيضية المحلية (الكلوية) المرتبطة بالتريبتوفان والتي تتأثر بغياب الناقلات. هذه التغييرات في درجات المهام الأيضية ناتجة عن الزيادات التعويضية في التعبير عن الجينات المرتبطة بمهمة التمثيل الغذائي في سياق نقص OAT1. في حين تم مسح العديد من المسارات الأيضية من خلال تحليل المهام الأيضية المستند إلى علم الأيض والنسخ ، فقد زودنا استخدام كلا النهجين برؤى فريدة حول كيفية مشاركة بعض ناقلات الأدوية في التواصل بين الأنسجة والبيئة خارج الخلية. وهكذا ، في حين تم تنظيم مستقلبات التربتوفان بواسطة كلا الناقلين على المستوى الجهازي ، كانت المهام الأيضية المرتبطة بالتريبتوفان داخل الكلى تعتمد بشكل أساسي على OAT1.

تشير النتائج إلى أن النبيبات القريبة منالكلى، حيث توجد OATs ، ليس مجرد قناة للتخلص الكلوي من نواتج التربتوفان ؛ يستشعر مستقلبات التربتوفان ويستجيب للتغيرات في وفرتها داخل الخلايا. بشكل جماعي ، دعمت البيانات وجهة النظر القائلة بأن OAT1 يلعب دورًا رئيسيًا ليس فقط في إزالة المستقلبات المرتبطة بالتريبتوفان من الدورة الدموية من خلال تعزيز امتصاصها بواسطةالكلىولكن أيضًا أن هذا الناقل ينظم التمثيل الغذائي داخل الخلايا ، ولا سيما استقلاب التربتوفان.

يدعم هذا الرأي القائل بأن النقل الوسيط لـ OAT 1- للكينورينين ، والكينورينات ، والأنثرانيلات ، و N-for-mylanthranilate مهم لـالكلىوظيفة (الشكل 8). تنتمي هذه المستقلبات الأربعة إلى مسار kynurenine الفرعي لتحلل التربتوفان ، وباستثناء kynurenate ، فإنها تشارك في إنتاج الطاقة الخلوية من خلال تخليق NAD plus (46). وبالتالي ، من الممكن أن يؤدي نقص OAT1 إلى ضعف التمثيل الغذائي الخلوي الذي يمكن ، على الأقل جزئيًا ، استعادته من خلال إنتاج هذه المستقلبات.

يتم استقلاب جميع التربتوفان المبتلع تقريبًا إلى ثلاثة مسارات فرعية رئيسية: كينورينين وسيروتونين وإندول (47 ، 48). بالإضافة إلى دوره في إنتاج NAD plus ، ينتج مسار kynurenine الفرعي نواتج أيضية لها وظائف متنوعة في كل من الحالات الصحية والمرضية (46 ، 49). ينتج مسار السيروتونين الناقل العصبي ، السيروتونين ، الذي له دور في العديد من العمليات الفسيولوجية ، وعلى الأخص كمنظم لوظيفة الجهاز العصبي المركزي (50). ينتج مسار الإندول الفرعي ، الذي يتوسط فيه ميكروبيوم الأمعاء ، جزيئات إشارات تشارك في الاتصال الميكروبي بين المضيف (51). بشكل منهجي ، يعدل OAT1 و OAT3 التوافر البيولوجي لمستقلبات التربتوفان من كل من المسارات الفرعية الثلاثة ، على الرغم من أن معظم المستقلبات تأتي من مسارات فرعية كينورينين وإندول.

بالنظر إلى عدد لا يحصى من أدوار الإشارة التي تتمتع بها المستقلبات المرتفعة ، هناك احتمال أن يؤثر OAT1 و OAT3 في العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء. على سبيل المثال ، ينشط kynurenate GPR35 ، وهو هدف دوائي ، و GPCR يشارك في الاستجابات الالتهابية وأمراض القلب والأوعية الدموية (52). يتم أيضًا إنشاء العديد من مستقلبات التربتوفان التي تم تغييرها بشكل كبير أو روابط مفترضة لمستقبلات أريل الهيدروكربونية (AhR) (الجدول 3) ، وهو منظم نسخ يتم التعبير عنه في جميع الأنسجة تقريبًا التي تستجيب لمضادات الأكسدة الحيوية (53).

أظهرت دراسات الأيض للفئران التي خرجت من قوتها أن الوظيفة الداخلية الرئيسية لكل من OAT1 و OAT3 هي تنظيم المستويات النظامية لمستقلبات التربتوفان. وبالتالي ، من المتوقع أن يكون للعقار الذي يستهدف OAT1 و OAT3 تأثير مماثل على المستقلب. كما كان متوقعا ، فإن الإمكانات الانتقالية لفئراننا التي خرجت من المغلوب كنماذج من DMIs كانت مدعومة بقوة بالنتائج من البشر الذين عولجوا بالبروبينسيد ، وهو عقار مثبط لل OAT يستخدم في جميع أنحاء العالم لعلاج النقرس. تم رفع العديد من مستقلبات التربتوفان في كل من مصل البشر والفئران بالضربة القاضية.

وبالتالي ، هناك إمكانية لاستخدام المركبات المرتفعة في الدراسات البشرية والقوارض كمؤشرات حيوية للكيانات الدوائية الجديدة التي قد تمنع OAT1 و OAT3. في حين أن نماذج الفئران بالضربة القاضية (التي لها متوسط ​​عمر طبيعي) والبشر المعالجين بالبروبينسيد كانوا أصحاء ، فإن بعض المستقلبات المرتفعة معروفة بسموم اليوريمية التي تزداد في مصل البشر الذين يعانون من الفشل الكلوي المزمن والمرتبط بنتائج سلبية (54) ، 55). تداخل المستقلبات المتورطة في جوانب مرض الكلى المزمن ودراساتنا اقترحت أن OATs قد تلعب دورًا رئيسيًا في مظاهر CKD أو تطوره ، على الرغم من أنه من الممكن أيضًا أن تزداد تركيزات المستقلب بسبب فقدان الإفراز نتيجة للأنسجة الضرر (56 ، 57). يمكن أن يؤدي مرض الكلى المزمن أيضًا إلى فشل العديد من الأعضاء ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى تراكم السموم البوليسية ، وقد يكون هذا جزئيًا بسبب الامتصاص في الأنسجة الأخرى عبر ناقلات الأدوية SLC و ABC (12 ، 58).

يتطلب مسار استقلاب التربتوفان الوظيفة المنسقة للعديد من الأعضاء. يتم امتصاص التربتوفان عن طريق القناة الهضمية ، ويتم تعديله بواسطة الكبد أو الأعضاء الأخرى ، ويتم نقل المستقلبات في النهاية بواسطةالكلى، جزئيًا من خلال وظيفة OAT1 و OAT3. تقليديًا ، يُنظر إلى هذا ببساطة على أنه مسار للتخلص. النتائج التي توصلنا إليها والتي تشير إلى أن خلاياالكلىالاستجابة لغياب هذه المستقلبات وإشارات الجزيئات عن طريق الاستعداد لإنتاجها ، واقترح خلاف ذلك. على الرغم من أن دورهم المحدد فيالكلىالنبيب القريب غير محدد بشكل جيد ، ومن الواضح أن العديد من المركبات الوسيطة المنتجة عبارة عن نواقل عصبية ولها دور مهم في وظيفة الجهاز العصبي المركزي (46 ، 49 ، 59 ، 60). بالإضافة إلى التواصل بين الأعضاء ، فإن استقلاب التربتوفان يعكس أيضًا التواصل بين الكائنات الحية بين المضيف وميكروبيوم الأمعاء. في الواقع ، أدى مصل الفئران الخالية من الجراثيم إلى خفض مستويات 3- كبريتات الإندوكسيل ، والإندوليبروبيونات ، والسيروتونين (61). علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه داخل الخلايا الإيجابية للشفاه OAT 1- الكلوية ، تعمل 3- كبريتات الإندوكسيل في إرسال الإشارات الخلوية عن طريق تنشيط AhR وتنظيم إفرازها من خلال OAT1 (62). النتائج التي توصلنا إليها والتي تشير إلى زيادة المستقلبات المشتقة من الأمعاء في مصل فئران Oat1 KO و Oat3 KO - جنبًا إلى جنب مع إثباتنا أن بعضها عبارة عن روابط في المختبر ، توفر دعمًا إضافيًا لأهمية هذه الناقلات في تنظيم الاتصال بين المضيف والمعايش. الكائنات الحية. إجمالاً ، تتوافق نتائجنا مع نظرية الاستشعار عن بعد والتشوير ، والتي تقترح أن ناقلات الأدوية وإنزيمات استقلاب الدواء تشارك في التواصل بين الأعضاء وبين الكائنات الحية من خلال نقل وتعديل الجزيئات الصغيرة للحفاظ على التوازن (63 ، 64). وبالتالي ، من الأهمية بمكان فهم سلسلة الوظائف الفسيولوجية الذاتية لناقلات الأدوية بشكل منهجي ومحلي.

من خلال بيانات الأيض المحسّنة ، حددنا المستقلبات المتأثرة بغياب OAT1 و OAT3 في نماذج القوارض ونواتج الأيض المتأثرة بتثبيط OAT1 و OAT3 في البشر الذين عولجوا بأدوية مثبطة لل OAT. استخدمت مجموعتنا سابقًا شبكات إعادة بناء التمثيل الغذائي للتنبؤ بوظيفة التمثيل الغذائي وأبلغت عن العديد من المسارات المشتركة والفريدة التي ينظمها OAT1 و OAT3 (43 ، 65). ومع ذلك ، كانت هذه الدراسات محدودة بالإصدارات المبكرة من أدوات إعادة البناء وبيانات قليلة جدًا عن الأيض. هنا ، باستخدام نهج مختلف ، وضع تحليل المهام الأيضية تركيزًا أكبر بكثير على دور OAT1 في استقلاب التربتوفان داخل الخلايا فيالكلى. يمكن تطبيق نهجنا للتحقيق في الوظائف الذاتية لأفراد عائلة SLC و ABC الآخرين وبناء شبكات منفصلة ولكنها متداخلة لجميع ناقلات الأدوية هذه ، والتي لا توجد فقط في الفئران ولكن أيضًا بشكل كامل والديدان (20 ، 66). ستسهل مثل هذه التمثيلات أيضًا فهم النطاق الكامل لـ DMIs للأدوية التي تتفاعل مع OAT1 أو OAT3 أو كليهما ، والتي من المحتمل أن تتجاوز المنافسة البسيطة على مستوى الناقل.

الإجراءات التجريبية

الحيوانات

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) في جامعة كاليفورنيا. تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقًا للإرشادات المؤسسية بشأن استخدام الحيوانات الحية في البحث. تم إيواء الذكور البالغين من WT و Oat1 KO و Oat3 KO بشكل منفصل بموجب 12- دورة مظلمة فاتحة وتم تزويدهم بإمكانية الوصول إلى الطعام والماء. تم وصف هذه الحيوانات في المنشورات السابقة (26 ، 27). تم إعطاء الفئران المعالجة بالبروبينسيد حقنة يومية داخل الصفاق بمقدار 200 مجم / كجم من البروبينسيد أو PBS لمدة 3 أيام قبل التضحية. تم إعطاء الحقنة النهائية قبل ساعتين من التضحية. كما تم وصف مجموعات البيانات المستخدمة لهذا التحليل جزئيًا (23 ، 24). تمت دراسة مجموعة بيانات Oat1 KO جزئيًا من منظور المعلومات الكيميائية ، ولكن لم يتم إجراء تحليل تفصيلي للمسار (23). تم إعادة تحليل مجموعة بيانات Oat3 KO وتمت مقارنة مجموعتين فقط (24).

الدراسات البشرية مع البروبينسيد

تمت مراجعة جميع البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية والالتزام بإعلان مبادئ هلسنكي الأخلاقية. جمعت عينات الدم الكامل من 20 فردا (14 إناث وستة ذكور). كان متوسط ​​العمر 30.85 ± 10.98 ، ومتوسط ​​مؤشر كتلة الجسم كان 24.18 ± 3.52. المشاركون الذين لم يتناولوا أي أدوية وكانوا على نظام غذائي نباتي طوال مدة الدراسة. تم إعطاء جرعة فموية قدرها 1 جرام من البروبينسيد ، وبعد 5 ساعات ، تم جمع الدم الكامل مرة أخرى. تم تجميد كل عينة عند درجة حرارة -80 درجة حتى التحليل الأيضي.

عمليات التمثيل الغذائي تم تخزين عينات مصل الإنسان على الفور عند درجة 80- وشحنها على الجليد الجاف إلى شركة Metabolon Inc. وتم جمع عينات مصل الفأر وتحليلها ، على النحو الموصوف سابقًا (23 ، 24). لتلخيص موجز ، لكل عينة ، تم إجراء التنميط الأيضي المستهدف بواسطة شركة Metabolon Inc.. تم استخدام نظام MicroLab STAR من شركة Hamilton لإعداد كل عينة ، وتمت إضافة العديد من معايير الاسترداد لمراقبة الجودة. تم ترسيب المصل بالميثانول وتقليبها باستخدام Glen Mills GenoGrinder 2000 لإزالة البروتينات من المصل وإطلاق الجزيئات المرتبطة بهذه البروتينات. تم فصل المحلول الناتج إلى أربع عينات أصغر. تم تحليل اثنين من خلال الطور العكسي (RP) اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) مطياف الكتلة (MS) مع التأين الكهربائي لوضع الأيونات الموجبة (ESI). تم تحليل عينة واحدة بواسطة RP / UPLC-MS / MS بوضع الأيونات السالبة ESI. تم تحليل عينة واحدة بواسطة HILIC / UPLC-MS / MS. تمت إزالة المذيب العضوي عن طريق وضع كل عينة على TurboVap (Zymark).

إحصائيات

لكل من عينات الإنسان والماوس ، تم تطبيع القيم الأولية إلى الحجم ، وتحويل السجل ، واستبدال القيم المفقودة بأقل قيمة ملحوظة لكل مركب. في عينات المصل البشري ، تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تباينات ANCOVA التي تتضمن مؤشر كتلة الجسم والعمر. بالنسبة لعينات مصل الفئران ، تم تحديد الأهمية باستخدام اختبار ويلش المكون من عينتين مع المستقلبات التي حققت أهمية إحصائية (p أقل من أو تساوي 0. 0 5) ، بالإضافة إلى تلك التي تقترب من الأهمية ( 0. 05 أقل من أو يساوي p أقل من أو يساوي 0.10) مدرجة في التحليلات اللاحقة. تم تحديد التخصيب باستخدام المعادلة 1 ، حيث k هو عدد المستقلبات التي تم تغييرها بشكل كبير في مسار فرعي ، m هو عدد المستقلبات في مسار فرعي ، n هو عدد المستقلبات التي تم تغييرها بشكل كبير في مجموعة البيانات الإجمالية ، و N هو عدد قياس المستقلبات في مجموعة البيانات الإجمالية.

تحليل مهمة التمثيل الغذائي

استخدمنا تحليل المهام الأيضية ، كما هو مطبق في وحدة CellFie في GenePattern ، لتحديد نطاقالكلىوظائف التمثيل الغذائي وتأثير تغييرات ناقل OAT من بيانات التعبير الجيني (41) (أي بيانات ميكروأري من كليتي Oat1 KO و Oat3 KO وعناصر التحكم من النوع البري). يتنبأ هذا التحليل بنشاط مجموعة منسقة من مئات المهام التي تغطي سبعة أنشطة استقلابية رئيسية للخلية (توليد الطاقة ، والنيوكليوتيدات ، والكربوهيدرات ، والأحماض الأمينية ، والدهون ، والفيتامينات والعامل المساعد ، والتمثيل الغذائي للجليكان) مباشرة من البيانات النسخية باستخدام الجينوم- نماذج مصغرة من التمثيل الغذائي البشري. وبشكل أكثر تحديدًا ، يعتمد حساب النشاط النسبي لمهمة التمثيل الغذائي (أي درجة مهمة التمثيل الغذائي) أولاً على المعالجة المسبقة لبيانات النسخ المتاحة وإسناد درجة نشاط الجين لكل جين (67). يتم استخدام نموذج مقياس الجينوم لعملية التمثيل الغذائي البشري أيضًا لتحديد قائمة التفاعلات المطلوبة لإنجاز كل مهمة أيضية ، وبذلك ، لتحديد قائمة الجينات التي قد تساهم في اكتساب وظيفة التمثيل الغذائي بناءً على قواعد GPR (أي. ، قواعد تفاعل البروتين الجيني). لذلك ، يتم حساب نتيجة مهمة التمثيل الغذائي على أنها متوسط ​​درجة النشاط لجميع الجينات المساهمة في وظيفة التمثيل الغذائي. عند القيام بذلك ، يمكن استخدام بيانات النسخ مباشرة لتحديد النشاط النسبي لكل وظيفة أيضية في حالة معينة.

فحوصات النقل في المختبر

جنيني بشريالكلى(HEK) -293 نمت الخلايا التي تفرط بثبات في التعبير عن OAT1 البشري و OAT3 (S Volvo Biotechnology) لتلتقي في Dulbecco's Modified Eagle'sMedium (Invitrogen) مع 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين والمحافظة عليها في 5 النسبة المئوية لثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تم اختيار الخلايا المعبرة عن OAT 1- في وجود البلاستيدين ، وتم اختيار الخلايا المعبرة عن OAT 3- في وجود بوروميسين. تم اختبار كلا خطي الخلايا سلبيًا لتلوث الميكوبلازما. قبل المقايسات الوظيفية ، تم طلاء الخلايا على لوحات بئر 96- ، وحضنت لمدة 24 ساعة ، واستكملت بوسائط. تم إجراء تجارب امتصاص تنافسية عن طريق حضانة الخلايا في محلول منظم بتركيز ثابت قدره 10 ميكرومتر 6- كربوكسي فلورسين وتركيز مخفف تسلسليًا للركيزة المقترحة بدءًا من 2 مم. تمت إزالة المخزن المؤقت بعد 10- دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، وشطفت الخلايا بـ DPBS ثلاث مرات. ثم تم تقييم مضان FL باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت FL. تم تحديد قيم IC50 باستخدام GraphPad Prism 8.

تمت تسوية قيم شدة الفلورسنت بحيث تم تعيين أدنى قيمة على {{0} بالمائة وتم تعيين أعلى قيمة على 100 بالمائة. بعد التطبيع ، كانت البيانات مناسبة لنموذج غير خطي ، وتم تحديد IC باستخدام المعادلة 2.

تم حساب Ki بعد ذلك لكل مستقلب باستخدام معادلة Cheng-Prusoff (المعادلة 3) ، باستخدام Km لخلايا hOAT1 HEK293 المشتقة من التجارب السابقة (68).

توافر البيانات

يتم تضمين جميع البيانات الأيضية ذات الصلة في المقالة والمواد التكميلية. البيانات النصية متاحة عند الطلب من snigam@health.ucsd.edu. الفرضية ، والإشراف على المشروع ، وتصميم التجارب ، وكتابة وتحرير المقال.

التمويل والمعلومات الإضافية—تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) إلى SKN من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) (R01GM132938). يأتي دعم JCG من منحة التدريب الممنوحة من المعهد الوطني للتصوير الطبي والهندسة الحيوية (NIBIB) (T32EB009380) وملحق لـ R01GM132938. تم تمويل هذا العمل جزئيًا بتمويل سخي من NIGMS إلى NEL (R35GM119850) ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) إلى NEL (UH2AI153029) ، وزمالة LIFA للواقع المعزز ، وزمالة JMG من حكومة المكسيك ( CONACYT) ومعهد جامعة كاليفورنيا للمكسيك والولايات المتحدة (UC-MEXUS). المحتوى هو المسؤول الوحيد عن المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء بعض الأرقام باستخدام Biorender. هذه المقالة مخصصة لذكرى Vibha Bhatnagar، MD، MPH.

تضارب المصالح- يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

الاختصارات- الاختصارات المستخدمة هي: AhR ، مستقبل هيدروكربون أريل ؛ كد ـ مزمنالكلىمرض؛ DMI، تفاعل الدواء مع المستقلب؛ ESI ، التأين بالرش الكهربائي ؛ HEK ، جنيني بشريالكلى؛ ILA ، حمض الخليك الإندول ؛ KO بالضربة القاضية RP / UPLC / MS ، كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء بمرحلة عكسية - قياس طيف الكتلة.

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

من 1 قسم الهندسة الحيوية ، 2 قسم طب الأطفال ، 3 قسم البيولوجيا ، 4 قسم الإحصاء الحيوي والمعلوماتية الحيوية ، قسم طب الأسرة والصحة العامة ، 5 قسم الأسرة والطب الوقائي ، مركز مؤسسة نوفو نورديسك للاستدامة الحيوية في جامعة كاليفورنيا سان دييغو ، و 7 قسم الطب ، جامعة كاليفورنيا سانديغو ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

بواسطة مايك شيبستون

مراجع

1. LopezNieto، CE، You، GF، Bush، KT، Barros، EJG، Beier، DR، and Nigam، SK (1997) الاستنساخ الجزيئي وتوصيف NKT ، وهو منتج جيني مرتبط بعائلة ناقل الكاتيون العضوي الذي يكاد يكون حصريًا أعرب فيالكلى. J. بيول. تشيم. 272 ، 6471-6478

2. Brady، KP، Dushkin، H.، Fornzler، D.، Koike، T.، Magner، F.، Her، H.، Gullans، S.، Segre، GV، Green، RM، and Beier، DR (1999 ) خريطة ناقلة مفترضة جديدة لطفرة تصلب العظم (oc) ولا يتم التعبير عنها في الماوس المتحولة OC. علم الجينوم 56 ، 254-261

3. Riedmaier، AE، Nies، AT، Schaeffeler، E.، and Schwab، M. (2012) ناقلات الأنيون العضوية وآثارها في العلاج الدوائي. فارماكول. القس 64 ، 421 - 449

4. Ahn، SY، and Bhatnagar، V. (2008) تحديث في الفسيولوجيا الجزيئية لناقلات الأنيون العضوية. بالعملة. رأي. نفرول. هيبيرتينز. 17 ، 499-505

5. Nigam ، SK (2018) عائلة ناقل SLC22: نموذج لتأثير ناقلات الأدوية على المسارات الأيضية ، والإشارات ، والمرض. Annu. القس فارماكول. 58 ، 663-687

6. Lowenstein، J.، and Grantham، JJ (2016) إنبعاث الاهتمام بوظيفة الأنبوب الكلوي. أكون. J. Physiol. الكلوي 310 ، F1351-F1355

7. Govindarajan، R.، and Sparreboom، A. (2016) ناقلات المخدرات: التقدم والفرص. كلين. فارماكول. هناك. 100 ، 398-403

8. You، GF، and Morris، ME (2014) مقدمة. في التوصيف الجزيئي لناقلات الأدوية ودورها في التخلص من المخدرات ، الإصدار الثاني. قرص المخدرات وايلي سير ، هوبوكين ، نيوجيرسي. التاسع عشر

9. Nigam، SK، Wu، W.، Bush، KT، Hoenig، MP، Blantz، RC، and Bhatnagar، V. (2015) التعامل مع الأدوية والمستقلبات والسموم البوليسية بواسطةالكلىناقلات المخدرات الأنابيب الدانية. كلين. جيه. شركة نفرول. 10 ، 2039-2049

10. Bhatnagar، V.، Richard، EL، Wu، W.، Nievergelt، CM، Lipkowitz، MS، Jeff، J.، Maihofer، AX، and Nigam، SK (2016) تحليل ABCG2 وناقلات اليورات الأخرى في حمض اليوريك الاستتباب المزمنالكلىالمرض: الدور المحتمل للاستشعار عن بعد والتشوير. كلين.الكلىJ. 9، 444-453 دور OAT1 و OAT3 في استقلاب التربتوفان

12 جيه بيول. تشيم. (2021) 296 100575

11. Nigam، SK، and Bhatnagar، V. (2018) بيولوجيا أنظمة ناقلات حمض البوليك: دور الاستشعار عن بعد والإشارات. بالعملة. رأي. نفرول. هيبيرتينز. 27 ، 305-313

12. Nigam، SK، and Bush، KT (2019) متلازمة يوريا المزمنةالكلىالمرض: تغير في الاستشعار عن بعد والإشارات. نات. القس نفرول. 15 ، 301-316

13. سايتو ، هـ. (2010) التنظيم المرضي للناقلات المنظمة الكلوية SLC22A في الحالات الحادةالكلىالإصابة: الآثار الدوائية والسمية. فارماكول. علاج. 125 ، 79-91

14. Lepist، EI، and Ray، AS (2017) ما وراء التفاعلات الدوائية: آثار تثبيط الناقل على المضادات الحيوية والمغذيات والسموم. رأي الخبراء. ميتاب المخدرات. توكسيكول. 13 ، 1075-1087

15. Duan، P.، Li، SS، Ai، N.، Hu، LQ، Welsh، WJ، and You، GF (2012) مثبطات قوية لناقلات الأنيون العضوي البشري 1 و 3 من مكتبات الأدوية السريرية: الاكتشاف والتوصيف الجزيئي . مول. صيدلية. 9 ، 3340–3346

16. Evers، R.، Piquette-Miller، M.، Polli، JW، Russel، FGM، Sprowl، JA، Tohyama، K.، Ware، JA، de Wildt، SN، Xie، W.، Brouwer، KLR، and Consortium، IT (2018) قد تؤثر التغييرات المرتبطة بالأمراض في ناقلات الأدوية على الحرائك الدوائية و / أو سمية الأدوية: ورقة بيضاء من اتحاد شركات النقل الدولي. كلين. فارماكول. هناك 104 ، 900-915

17. Masereeuw، R.، Mutsaers، HA، Toyohara، T.، Abe، T.، Jhawar، S.، Sweet، DH، and Lowenstein، J. (2014) Theالكلىوإزالة السموم اليوريمية: الكبيبة أو النبيبات؟ سيمين. نفرول. 34 ، 191–208

18. Liu، Y.، Prentice، KJ، Eversley، JA، Hu، C.، Batchuluun، B.، Leavey، K.، Hansen، JB، Wei، DW، Cox، B.، Dai، FHF، Jia، WP ، and Wheeler، MB (2016) قد يكون الارتفاع السريع في CMPF بمثابة نقطة تحول في تطور مرض السكري. ممثل الخلية 14 ، 2889-2900

19. Prentice، KJ، Luu، L.، Allister، EM، Liu، Y.، Jun، LS، Sloop، KW، Hardy، AB، Wei، L.، Jia، WP، Fantus، IG، Sweet، DH، Sweeney ، G. ، Retnakaran ، R. ، Dai ، FF ، and Wheeler ، MB (2014) يرتفع مستقلب حمض الفوران الدهني CMPF في مرض السكري ويؤدي إلى اختلال وظيفي في خلايا بيتا. ميتاب الخلية. 19 ، 653 - 666

20. Engelhart، DC، Granados، JC، Shi، D.، Saier، MH، Jr.، Baker، ME، Jr.، Abagyan، R.، and Nigam، SK (2020) يكشف تحليل بيولوجيا الأنظمة عن ثماني مجموعات فرعية للنقل SLC22 ، بما في ذلك OATs و OCTs و OCTNs.Int. J. مول. علوم. 21 ، 1791