الإمكانات التجميلية للمستخلصات المشتقة من مخلفات صناعة مصايد الأسماك: نفايات السردين وأطر سمك القد ، الجزء الأول

خلاصة: تنتج صناعة صيد الأسماك كميات كبيرة من النفايات (2 0 - 75 بالمائة (وزن / وزن) من إجمالي وزن الأسماك المصطادة). يمثل استرداد المركبات النشطة بيولوجيًا من المخلفات وإدراجها في مستحضرات التجميل فرصة سوق واعدة وقد تساهم في تثمين مستدام للقطاع. في هذا العمل ، تم تمييز المستخلصات الغنية بالبروتين التي تم الحصول عليها بتقنيات الضغط العالي (ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج والمياه دون الحرجة) من نفايات السردين (Sardina pilchardus) وأطر سمك القد (Gadus morhua) فيما يتعلق بإمكانياتها التجميلية. تم تقييم الأنشطة المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات والمضادة للبكتيريا من خلال مقايسة كيميائية (ORAC) والإنزيمية (تثبيط الإيلاستاز والتيروزيناز) وقابلية مضادات الميكروبات (Klebsiella pneumoniae و Staphylococcus aureus و Cutibacterium acnes) والمقايسة القائمة على الخلايا (في الخلايا الكيراتينية) . قدمت مستخلصات السردين أعلى نشاط مضاد للجراثيم ، وأظهر القسم الذي تم الحصول عليه باستخدام درجات حرارة استخراج أعلى (25 0 درجة مئوية) وبدون خطوة إزالة الدهن أدنى قيم تركيز مثبط (1.17 ؛ 4.6 ؛ {{24} } .59 مجم / مل لـ K. الرئوية و S. aureus و C. acnes على التوالي). كانت عينات سمك القد المستخرجة في درجات حرارة منخفضة (90 درجة مئوية) هي أكثر العوامل المضادة للالتهابات فعالية (بتركيز 0.75 مجم / مل قلل من مستويات IL -8 و IL -6 بنسبة 58 بالمائة و 47 بالمائة على التوالي ، نسبة إلى السيطرة الإيجابية). تم تسليط الضوء على Threonine و valine و leucine و arginine ومحتوى البروتين الكلي في المستخلصات لربطها بشكل كبير بالنشاطات الحيوية المبلغ عنها (R2 أكبر من أو تساوي 0.7). تدعم هذه النتائج التطبيق المحتمل للمستخلصات من نفايات صناعة الأسماك في منتجات مستحضرات التجميل ذات الأنشطة الحيوية.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ولديه القدرة على البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر فوق ملحق Cistanche Tubulosa

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】

الكلمات الدالة: تثمين مجاري مخلفات الأسماك؛ النشاط المضاد للأكسدة؛ نشاط مضاد للالتهابات نشاط مضادات الميكروبات؛ مكافحة الشيخوخة. مضاد فرط تصبغ. مستحضرات التجميل

1 المقدمة

مع البحث المستمر عن الابتكار ، خاصةً بالنسبة للمكونات النشطة ، تنمو صناعة مستحضرات التجميل وأظهرت النية لاستبدال المكونات المشتقة من البترول والمضي قدمًا نحو المركبات الطبيعية [1]. يمكن أن تساعد الخصائص المضادة للأكسدة للمكونات النشطة الطبيعية في الوقاية من العديد من مشاكل البشرة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي والشيخوخة [2،3]. يمكن أن يكون سبب شيخوخة الجلد عوامل داخلية (مثل الالتهاب أو تقصير التيلومير) وعوامل خارجية (بيئية) [4]. تؤدي شيخوخة الجلد إلى فقدان الكولاجين الناضج وتغيرات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) مما يضر بوظيفة الحاجز ، مما يؤدي إلى مظهر جاف وقابلية للتأثر بالعوامل الخارجية ، مما يزيد من خطر الإصابة باضطرابات الجلد [5]. يمكن تسريع هذه العملية عن طريق العديد من الإنزيمات ، مثل الإيلاستازات ، والبروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) ، و hyaluronidases التي يمكن أن تحفز تدهور ECM [6] ، أو حتى عن طريق تراكم أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) التي يمكن أن تضر بوظيفة الخلية الطبيعية [7]. تؤدي العوامل البيئية ، مثل التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، إلى توليد كميات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية التي تحفز نفس الاستجابات الجزيئية والخلوية مثل الشيخوخة الذاتية ، ولكن مع تأثيرات مضخمة. الأهم من ذلك ، يمكن لـ ROS تكثيف نشاط الإنزيمات المتعلقة بشيخوخة الجلد أو عمليات تصبغ الجلد [8،9] ، وبالتالي فإن وجود مضادات الأكسدة n يلعب دورًا مهمًا في مجال التجميل.

في عام 2018 ، قدرت منظمة الأغذية والزراعة الاستهلاك العالمي من الأسماك بنحو 20.5 كجم للفرد [10] ، مما يؤدي إلى كميات كبيرة من المنتجات الثانوية ، معظمها الجلد والعظام. البقايا المتولدة تتوافق مع 20-75 في المائة (وزن / وزن) من إجمالي وزن الأسماك المصطادة ، مما قد يؤدي إلى مشاكل بيئية [11 ، 12]. ومع ذلك ، لا تزال هذه البقايا تحتوي على كمية كبيرة من الدهون والبروتينات والمعادن ويجب تقييمها بشكل كافٍ. في السنوات الأخيرة ، أظهرت المقتطفات من النفايات الناتجة عن صناعة الأسماك خواصًا فعالة مثل خافضات ضغط الدم ، ومضادات الأكسدة ، ومضادات الميكروبات ، ومضادة للأعصاب ، وخافضة لنسبة السكر في الدم ، ومضادة للشيخوخة ، ومضادة للالتهابات [13-19]. تعتبر أسماك القد الأطلسية (Gadus rhea) والسردين (Sardina pilchardus) من بين الأسماك الأكثر استهلاكًا في البرتغال ، وقد أظهرت المسالك المشتقة من بقاياها إمكانات غذائية واعدة ، مثل مضادات الأكسدة أو مضادات التكاثر أو الأنشطة المضادة للالتهابات [11 ، 20-22]. ومع ذلك ، نظرًا لأن استغلال نفايات صناعة الأسماك وتثمينها لا يزالان في مرحلة مبكرة ، فهناك مجال كبير لاستكشاف فرص الصناعة لتحويل هذه النفايات إلى منتجات حيوية سوقية عالية القيمة ، بما في ذلك مكونات مستحضرات التجميل.

في العمل السابق ، استكشفنا استخدام تقنيات الضغط العالي (ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج والمياه دون الحرجة) ، لعزل الأجزاء النشطة بيولوجيًا من نفايات السردين وأطر سمك القد ذات الفوائد الصحية الواعدة [11 ، 22]. بالنسبة لنفايات السردين ، أوضحنا أنه من خلال تطبيق الخطوة الأولى باستخدام الكربون فوق الحرج (ScCO2) (لإزالة جزء الدهون) متبوعًا بعملية الاستخلاص بالماء دون الحرج (SW) ، كان من الممكن الحصول على تحلل بروتيني مع إمكانات عالية لمضادات الأكسدة وتأثير مضاد للتكاثر في خلايا سرطان القولون والمستقيم [22]. استخلاص المياه / التحلل المائي دون الحرج طبقنا أيضًا للحصول على البروتينات - والببتيدات - والأحماض الأمينية المخصبة من إطارات سمك القد وأظهرنا أن درجات حرارة المعالجة المنخفضة (90 درجة مئوية) تفضل استخراج المركبات ذات الإمكانات المضادة للالتهابات في الخلية الظهارية المعوية البشرية نموذج [11]. معظم البروتينات الموجودة في مستخلصات إطار سمك القد هي أجزاء من الكولاجين والكولاجين. تشتمل المركبات الأخرى على كميات قليلة من الدهون والرماد وبعض السكريات. كانت مستخلصات السردين غنية بالببتيدات والأحماض الأمينية ، كما تواجدت الدهون والرماد والسكريات. نظرًا لأن البروتينات والببتيدات المشتقة من الأسماك قد تصبح موردًا مهمًا لصناعات مستحضرات التجميل ، تهدف الدراسة الحالية إلى مزيد من التقييم للإمكانات النشطة لهذه المستخلصات المشتقة من نفايات معالجة الأسماك والمنتجات الثانوية الناتجة عن تقييم إمكاناتها التجميلية [23] . لهذا الغرض ، تم تطبيق مجموعة من الاختبارات الكيميائية والإنزيمية والقائمة على الخلايا لاستكشاف التأثيرات المضادة للأكسدة والمضادة للشيخوخة ومضادة فرط التصبغ والمضادة للالتهابات ومضادات الميكروبات للعينات المستخرجة. تم إجراء دراسات الارتباط أيضًا لتحديد المكونات النشطة بيولوجيًا ذات الإمكانات التجميلية.

2. المواد والأساليب

2.1. الكواشف

3 ، 4- dihydroxy-l-phenylalanine (L-DOPA) ، فطر tyrosinase ، إيلاستاز بنكرياسي الخنازير (PPE) النوع الثالث ، N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) ، Tris ({ {11}} أمينو - 2- هيدروكسي ميثيل بروبان -1 ، 3- ديول) ، 2 ، 20 - أزوبيس (2- ميثيل بروبيوناميدين) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH) ، و 20 ، 70 - ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلورسين (DCFH-DA) تم شراؤه من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مرق Mueller Hinton المعدل بالكالسيوم (CAMHB) من BD (Sparks ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء ضخ الدماغ والقلب (BHI) من Avantor (Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء أكياس AnaeroGen ™ المدمجة من Oxoid (هامبشاير ، المملكة المتحدة). تم الحصول على PrestoBlue ™ و Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ومصل بقر الجنين المعطل بالحرارة (FBS) والبنسلين الستربتومايسين من Invitrogen (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على خط خلايا الخلايا الكيراتينية غير الورمية الخاملة البشرية HaCaT من Cell Line Service (Eppelheim ، ألمانيا). تم الحصول على Human IL -8 و IL -6 Mini TMB ELISA Development Kits من Peprotech (لندن ، المملكة المتحدة). كانت جميع الكواشف والمذيبات الأخرى المستخدمة في الدراسة الحالية من الدرجة التحليلية وتم شراؤها من الموردين المتاحين.

2.2. عينات

المقتطفات المستخدمة في هذا العمل هي تلك التي تم تطويرها في دراساتنا السابقة التي ركزت على تحسين العملية [11 ، 22]. باختصار ، تم توفير إطارات سمك القد من قبل Pascoal و Filhos SA (Gafanha da Nazaré ، البرتغال) وتتكون من العمود الفقري للأسماك والعضلات الملتصقة. تم توفير نفايات السردين المصنوعة من الرؤوس والأشواك والأحشاء من قبل Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim ، البرتغال). تم عرض التركيب التقريبي للمواد الخام المستخدمة في أعمالنا السابقة [11 ، 22]. كان البروتين (47 بالمائة) والرماد (39 بالمائة بالوزن) المكونين الرئيسيين لإطارات سمك القد ، مع كميات صغيرة من الدهون والكربوهيدرات (2 بالمائة بالوزن و 0. 3 بالمائة بالوزن ، على التوالي). تم العثور على الكولاجين ليكون البروتين الرئيسي في إطارات سمك القد ، وفي هذه الحالة ، فإنه يمثل كاليفورنيا. 65 في المائة من محتوى البروتين الكلي للنفايات الأصلية. في المقابل ، يعتبر السردين سمكة زيتية ، وبالتالي فإن نفاياته تكون أكثر ثراءً في الدهون من إطارات سمك القد. أظهرت مخلفات السردين محتوى دهني بنسبة 26 بالمائة ومحتوى بروتيني بنسبة 52 بالمائة ، والباقي عبارة عن رماد (17 بالمائة بالوزن) وكربوهيدرات (3 بالمائة بالوزن).

تم الحصول على مقتطفات من إطارات سمك القد (Cf1 و Cf2 و Cf3 و Cf4) ومخلفات السردين (S1 و S2 و S3) المختارة لهذا العمل عن طريق تقنية الضغط العالي في جهاز مقياس معمل كما هو موضح سابقًا [11،22 ، 24] باستخدام الشروط الملخصة في الجدول 1. باختصار ، تم تحميل 60 جم ​​من إطارات سمك القد المطحون أو نفايات السردين (منزوعة الدهن أو غير منزوعة الدهن) في مفاعل عالي الضغط تم وضعه داخل فرن. تم تشغيل مضخة الماء عند معدل التدفق المطلوب (حوالي 10 مل / دقيقة) وتم ضبط الضغط على 100 بار. بمجرد وصول الضغط إلى هذه القيمة ، تم تشغيل الفرن الكهربائي وبدأت التجربة. جمعت المستخلصات المختلفة لمدة 30 دقيقة عند درجات حرارة مختلفة (90 - 250 درجة مئوية). تم الحصول على مستخلصات S1 و S3 بعد عملية إزالة الدهن من نفايات السردين بواسطة ScCO2 قبل استخراج SW. تم تكرار تجارب استخراج المياه دون الحرجة. لكل عينة مستخرجة ، تم أخذ 25 مل في ثلاث نسخ ، مجففة بالتجميد ، ووزنها لحساب محصول الاستخراج المقابل. يتم التعبير عن البيانات التحليلية - محتوى البروتين - على أنها تعني ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث نسخ. تم وصف المعلومات المتعلقة بتوصيف هذه المقتطفات من حيث محتوى البروتين أو ملف الأحماض الأمينية أو المركبات المعدنية الرئيسية أو المعادن السامة والثقيلة في أعمالنا السابقة [11 ، 22].

تم تحضير محاليل مخزون Cf1 و Cf2 و Cf3 و Cf4 و S2 في Milli-Q H2O بتركيز 100 مجم / مل. تم إذابة العينات الأخرى ، وهي S1 و S3 ، في DMSO (300 و 550 مجم / مل ، على التوالي) بسبب انخفاض قابليتها للذوبان في الماء. تم تجميد العينات وحفظها عند -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. بالنسبة للمقايسات الخلوية ، تم تعقيم العينات مسبقًا بالحرارة (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة) في الأوتوكلاف (Tuttnauer 3870 el ، Breda ، هولندا).

2.3 فحص قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC)

تم إجراء اختبار ORAC لتقييم قدرة مضادات الأكسدة للعينات تجاه جذور البيروكسيل (ROO •) ، باتباع الطريقة التي طورها Huang et al. [25] ، مع بعض التعديلات كما ورد سابقًا [26]. باختصار ، في صفيحة ميكروية سوداء جيدة 96- ، تمت إضافة 15 0 ميكرولتر من فلورسين ثنائي الصوديوم (0.3 ميكرومتر) إلى 25 ميكرولتر من تخفيف العينة واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، بدأ التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من 2 ، 20 - Azobis (2- ميددينوبروبان) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH ، 153 ملي مولار) ، ومضان (Ex / Em 485 ± 20/528 ± 20 نانومتر) لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في قارئ الصفيحة الدقيقة FLx800 الفلورية (FL800 Bio-Tek Instruments ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير منحنى قياسي باستخدام 5 ، 10 ، 20 ، 30 ، 40 ميكرومتر من (6- هيدروكسي -2 ، 5،7 ، 8- رباعي ميثيل كرومان -2- حمض الكربوكسيل (ترولوكس) )). تم تحضير جميع المحاليل في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) ، 75 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.4. يتم التعبير عن النتائج على شكل ميكرومولات من قدرة مضادات الأكسدة المكافئة لترولوكس لكل جرام من المستخلص (µ جزيء جرامي من TEAC / جم مستخلص).

2.4 المقايسات الأنزيمية

2.4.1. مقايسة تثبيط Elastase

استند هذا الاختبار إلى عمل Wittenauer et al. [27] مع بعض التعديلات كما هو موضح سابقًا [6]. يتم تحديد النشاط المثبط للإيلاستاز بواسطة طريقة قياس الطيف الضوئي باستخدام إيلاستاز البنكرياس الخنازير (PPE) و N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) باعتباره الركيزة الإنزيمية ، عن طريق مراقبة إطلاق p-nitroaniline عند 41 { {19}} نانومتر. تم إذابة معدات الوقاية الشخصية في 1 0 0 ملي تريس (2- أمينو -2- هيدروكسي ميثيل بروبان -1 ، 3- ديول) - HCl عازلة (pH=8. 0) بتركيز 1 مجم / مل ومخزن عند 20 درجة مئوية في قسامات. في يوم الفحص ، تم أخذ قسامة وتخفيفها في المخزن المؤقت بتركيز 0.03 وحدة / مل ، وتم تحميل 10 ميكرولتر في آبار لوحات ميكروتر مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-HCl ، و 30 ميكرولتر من كل عينة. بعد 20 دقيقة من الحضانة المسبقة عند 25 درجة مئوية ، بدأ التفاعل بإضافة 40 ميكرولتر من الركيزة AAAPVN (0.55 ملي مولار). تم قياس الامتصاصية لمدة 20 دقيقة بعد إضافة AAAPVN في قارئ صفيحة ميكروسكوبية لمقياس الطيف الضوئي BioTek Instruments EPOCH 2. تم إجراء الحسابات كما هو موضح في المعادلة (1) ، حيث يمثل عنصر التحكم والعينة الامتصاصية عند 410 نانومتر في غياب العينة أو وجودها ، على التوالي. نظرًا لاستخدام DMSO في إذابة العينات S1 و S3 ، تم أيضًا اختبار هذا المذيب واستخدامه كعنصر تحكم لهذه العينات. تم تقييم إمكانات المستخلصات لتثبيط الإيلاستاز بتركيزات متزايدة ، لتحديد العلاقات المعتمدة على الجرعة وتحديد قيم التراكيز المثبطة نصف القصوى (IC50) ، مما يشير إلى قدرة كل عينة في تثبيط النشاط الأنزيمي إلى حد 50 بالمائة.

يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها قيم متوسطة لـ IC50 بحدود أدنى وأعلى من فاصل ثقة 95 بالمائة ، تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.

2.4.2. مقايسة تثبيط التيروزيناز

تم تقييم القدرة المثبطة للتيروزيناز للمستخلصات بطريقة طيفية باستخدام الفطر التيروزيناز و L-DOPA كركيزة [28]. يقوم Tyrosinase بتحويل L-DOPA إلى dopaquinone ، والذي سوف يتدحرج بالتتابع لتشكيل dopachrome. يمكن ملاحظة تكوين الدوباكروم بقياس الامتصاصية عند 475 نانومتر. تمت إضافة الركيزة إلى الإنزيم في وجود التخفيفات العينة ، إلى تركيز نهائي قدره 3 0 U / mL tyrosinase و 2.5 ملي L-DOPA. نظرًا لاستخدام DMSO في إذابة العينات S1 و S3 ، تم أيضًا اختبار هذا المذيب واستخدامه كعنصر تحكم لهذه العينات. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تم قياس الامتصاصية عند 475 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي الصفيحي EPOCH 2 من BioTek Instruments. تم تحضير جميع الكواشف في محلول فوسفات الصوديوم (SPB ؛ 0.1 M ، pH 6.8) ، تم تحضيره بخلط ثنائي هيدرات ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم مع فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات ، وتم إجراء الحسابات كما هو موضح في المعادلة (1). يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها قيم متوسطة لـ IC50 بحدود أدنى وأعلى من فاصل ثقة 95 بالمائة ، تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.

2.5 اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات

كانت الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة التي تم اختيارها لفحوصات النشاط المضاد للبكتيريا هي البكتيريا سالبة الجرام Klebsiella pneumoniae CECT 8453 والبكتيريا إيجابية الجرام Staphylococcus aureus ATCC 6538 و Cutibacterium acnes ATCC 6919T. بالنسبة إلى K. الرئوية CECT 8453 و S. aureus ATCC 6538 ، تم إجراء الاختبارات وفقًا لطريقة التخفيف الدقيق للمرق لإرشادات CLSI M 07- A10 كما تم وصفها سابقًا بواسطة Rodrigues et al. [29]. باختصار ، تم توزيع محاليل خلاصة المخزون في صفيحة بئر مستديرة ذات قاع دائري 96- و 2- طيها بشكل متسلسل في مرق مولر هينتون المعدل بالكالسيوم (CAMHB ؛ BD ، Sparks ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) للحصول على نطاق تركيز الحلول. تم تحضير اللقاح باستخدام طريقة النمو للحصول على معلق متجانس في محلول ملحي. تم تخفيف اللقاح المعدل بشكل إضافي في CAMHB لضمان احتواء كل بئر ، بعد التلقيح ، على حوالي 5 × 104 CFU. تم تحضين الصفائح تحت ظروف هوائية عند 37 ْم لمدة 16 إلى 20 ساعة. بالنسبة إلى C. acnes ، تم إجراء الاختبارات كما هو موضح سابقًا باستخدام مرق ضخ قلب الدماغ (BHI) (Avantor ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بدلاً من CAMHB وعن طريق احتضان لوحات microtiter لمدة 70-74 ساعة عند 37 درجة مئوية. C في أوعية لاهوائية تحتوي على نظام توليد الغلاف الجوي AnaeroGen ™ Compact (Oxoid ، هامبشاير ، المملكة المتحدة).

لكل محلول مخزون تم تحليله ، عنصر تحكم إيجابي (CAMHB أو BHI ولقاح مخفف) ، عنصر تحكم متوسط ​​في العقم (CAMHB أو BHI غير مُلقح) ، والتحكم في تعقيم المستخلص (2- محلول مستخلص أضعاف في CAMHB أو BHI) وفقا لذلك. كانت قيم التركيز المثبط الأدنى (MIC) هي أقل تركيز للعينة التي تمنع نمو الميكروبات بشكل واضح بعد الحضانة. عند الحاجة ، تم تأكيد قيم MIC باستخدام كاشف صلاحية الخلية PrestoBlue ™ (Invitrogen ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم أيضًا إنشاء قيمة MIC إضافية ، المعينة MIC * ، وتعريفها على أنها أقل تركيز لعينة تأثر فيها النمو البكتيري بصريًا وتفاضليًا مقارنةً بالتحكم الإيجابي. تم الإبلاغ عن قيم تركيز مبيد الجراثيم الأدنى (MBC) على أنها أقل تركيز للعينة مما أدى إلى انخفاض بنسبة 99.9 في المائة على الأقل في التعداد البكتيري القابل للحياة مقارنةً بالتلقيح الأولي ولوقت حضانة متساوٍ. تم التعبير عن النتائج كمتوسط ​​للقيم التي تم الحصول عليها بعد ثلاث مكررات بيولوجية. نظرًا لاستخدام DMSO في إذابة العينات S1 و S3 ، تم اختبار هذا المذيب أيضًا للتأكد من أن التركيز النهائي المستخدم لا يتداخل مع الكائن الدقيق المستهدف ، ومن ثم الفحص.

2.6. فحوصات المستندة إلى الخلية

2.6.1. زراعة الخلايا

تمت تربية خط خلايا الكيراتين البشرية HaCaT (CLS ، ألمانيا) في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10 بالمائة (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1 بالمائة (ت / ت) بنسلين ستربتومايسين. تم الحفاظ على الخلايا بشكل روتيني كطبقات أحادية في قوارير استزراع 75 سم 2 وحضنت عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون في جو رطب.

2.6.2. السمية الخلوية في المختبر

تم إجراء فحوصات السمية الخلوية وفقًا للأعمال السابقة [6]. باختصار ، تم زرع خلايا HaCaT بكثافة 1.4 × 1 0 5 خلايا / سم 2 في 96 طبقًا جيدًا. بعد 3 أيام ، تم تحضين الخلايا بتركيزات مختلفة لكل عينة (Cf1 ؛ Cf2 ؛ Cf3 ؛ Cf4 ؛ S2-5 0 ، 25 ، 12.5 ، 6.25 ، 3.13 ، 1.56 ، {{3 0} } .78 ، 0. 39 ؛ S1–3 ، 1.5 ، 0. 75 ، 0. 38 ، {{4 0}}. 19 ، {{51 }}. 0 9 ، 0. 0 5 ، 0. 0 2 ؛ S3—5.5 ، 2.75 ، 1.38 ، 0.69 ، 0.34 ، 0.17 ، 0.09 ، 0.04 مجم / مل) مخفف في وسط المزرعة (وسط DMEM يحتوي على 0.5 بالمائة FBS). تم استخدام الآبار المحتوية على الخلايا المحتضنة فقط مع وسط زراعة مكمل بنسبة 0.5 في المائة (حجم / حجم) من FBS كعنصر تحكم. تم أيضًا إجراء ضوابط المذيبات مع 50 في المائة من الماء أو 1 في المائة من DMSO في وسط ثقافة لاستبعاد سمية المذيب. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام PrestoBlue® (5 بالمائة حجم / حجم في وسط المزرعة) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ذلك ، تم قياس مضان كل بئر (Ex./Em.560 ± 20/590 ± 20 نانومتر) في قارئ الصفيحة الدقيقة FLx800 (BioTek Instruments ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن صلاحية الخلية كنسبة مئوية من الخلايا القابلة للحياة بالنسبة إلى عنصر التحكم. أجريت ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ.

2.6.3. نشاط مضادات الأكسدة الخلوية

تم تقييم نشاط مضادات الأكسدة الخلوية باتباع الطرق الموصوفة سابقًا [6،3 0] ، مع بعض التعديلات. باختصار ، تم زرع خلايا HaCaT بكثافة 1.4 × 1 0 5 خلايا / سم 2 في 96 طبقًا جيدًا وتمت مراقبة تكوين ROS داخل الخلايا باستخدام 2 0 ، 70 - ثنائي كلورو فلورسين ثنائي الأسيتات ( DCFH-DA) كمسبار فلورسنت. 72 ساعة بعد البذر ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS واحتضانها بتركيزات غير سامة للعينات (0.1875 مجم / مل ؛ 0.375 مجم / مل ؛ 0.75 مجم / مل) بالإضافة إلى 25 ميكرومتر DCFH-DA في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضانها باستخدام محفز الإجهاد (600 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني) لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تم قياس التألق في قارئ مضان FL800 صفيحة ميكروسكوبية (Bio-Tek Instruments ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية) (Ex / Em 485 ± 20/528 ± 20 نانومتر). يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية لـ ROS بالنسبة إلى عنصر التحكم غير المعالج (الخلايا المعالجة بـ DCFH-DA و AAPH). أجريت ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ.

2.6.4. تقييم إفراز IL -6 و IL -8

تم إجراء التجارب كما هو موضح سابقًا [31] ، مع العديد من التعديلات. باختصار ، تم زرع خلايا HaCaT بكثافة 1 × 1 0 5 خلايا / سم 2 في 12 طبقًا جيدًا. بعد 3 أيام ، تم تحفيز الخلايا باستخدام 15 ميكروغرام / مل من عديدات السكاريد الدهنية (LPS) من Escherichia coli واحتضانها معًا بثلاثة تركيزات مختلفة من كل مستخلص ({{1 0}}. 1875 مجم / مل ؛ {{{{1} 0}}}}. 14}} .375 مجم / مل ؛ 0.75 مجم / مل) مخفف في وسط المزرعة (وسط DMEM يحتوي على 0.5 بالمائة FBS). تم استخدام الخلايا المحتضنة فقط مع LPS والخلايا المحتضنة بوسائط الثقافة فقط كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي. بعد 24 ساعة ، تم جمع المواد الطافية وطردها لمدة 10 دقائق عند 2000 جم وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. تم تقييم مستويات IL -6 و IL -8 عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، باستخدام مجموعات متاحة تجاريًا (PeproTech ، لندن ، المملكة المتحدة) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، مع قياس الامتصاص عند 450 نانومتر مع تصحيح الطول الموجي الذي تم ضبطه عند 620 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة (EPOCH 2 ، BioTek Instruments ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية IL -6 أو IL -8 نسبة إلى عنصر التحكم الإيجابي (الخلايا التي يتم تحفيزها باستخدام LPS). أجريت ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ.

2.7. تحليل احصائي

يتم التعبير عن نتائج الفحص المستندة إلى الخلية و ORAC على أنها القيمة المتوسطة ± SD ، التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. بالنسبة للمقايسات الأنزيمية والسمية الخلوية ، تم تحديد قيم IC5 0 من منحنيات الاستجابة للجرعة من خلال مخططات log10 باستخدام GraphPad Prism 8.4.3. البرمجيات (GraphPad Software، Inc. ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم تقديم النتائج على شكل IC50 بفاصل ثقة 95 بالمائة. تم إجراء التحليل الإحصائي للنتائج باستخدام البرنامج السابق. عندما تم التحقق من التباين المتجانس والتوزيع الطبيعي للبيانات ، تم تحليل النتائج من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Tukey لإجراء مقارنات متعددة. في حالة التباينات غير المتجانسة أو إذا لم يتم توزيع البيانات بشكل طبيعي ، تم إجراء اختبار t مناسب غير متزاوج للطالب لتحديد ما إذا كانت الوسائل مختلفة بشكل كبير. تم قبول قيمة p أقل من أو يساوي 0.05 باعتبارها ذات دلالة إحصائية في جميع الحالات. يتم التعبير عن نتائج اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات على أنها القيمة المتوسطة ، التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.

3. النتائج والمناقشة

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45.7 جم / 100 جم). يتم عرض النتائج المتعلقة بمحتوى البروتين الكلي لكل مستخلص في الجدول 1.

3.1. الأنشطة المضادة للأكسدة ، ومكافحة الشيخوخة ، ومضادة لفرط التصبغ

تم فحص التأثير التجميلي المحتمل للمستخلصات مبدئيًا باستخدام المقايسات الكيميائية والإنزيمية لتقييم آثارها المضادة للأكسدة ومضادة للشيخوخة ومضادة لفرط التصبغ. بالنسبة للقدرة المضادة للأكسدة ، تم اختيار مقايسة ORAC لأنها تقيس قدرة العينات على البحث عن أنواع ROS ذات الصلة بيولوجيًا ، وهي جذور البيروكسيل ، والتي تعتبر أحد المحرضات الرئيسية لشيخوخة الجلد [2،32]. تم تقييم التأثير المضاد للشيخوخة أيضًا من خلال تثبيط الإيلاستاز حيث تم الإبلاغ عن أن هذا الإنزيم مسؤول عن تحلل الإيلاستين وبروتينات ECM الأخرى [6]. للتأثير المضاد لفرط التصبغ ، تم استخدام اختبار التيروزيناز لتقييم قدرة العينات على تثبيط إنتاج الميلانين. يلخص الجدول 2 قيم ORAC و IC لجميع المقتطفات.

تظهر نتائجنا أن مستخلصات السردين وسمك القد قدمت نشاطًا مضادًا للأكسدة وتأثيرات تثبيط على نشاط إنزيمات الإيلاستاز والتيروزيناز. من بين عينات السردين ، أظهر S1 أعلى قيمة ORAC (1.94 ± 0. 08 ميكرو مول من مستخلص TEAC / mg) يليه S3 و S2. تم الحصول على هذه النتائج من خلال تقييم سابق لمضادات الأكسدة من خلال طريقة بديلة (2 ، 2- اختبار ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل- DPPH) حيث قدم المستخلص S1 أقل قيم IC50 [22]. يمكن اشتقاق قدرة الكسح العالية تجاه جذور البيروكسيل لعينة S1 من الببتيدات ذات تسلسلات الأحماض الأمينية المختلفة الموجودة في المستخلصات لأن التفاعلات فيما بينها يمكن أن تؤثر على قدرة الكسح الجذري [33]. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر المركبات المتولدة في Maillard أو تفاعلات الأكسدة الحرارية الأخرى على نشاط مضادات الأكسدة في العينات [34]. على الرغم من أقل قيمة ORAC ، كانت العينات S2 و S3 هي ذات السعة الأعلى في تثبيط أنشطة التيروزيناز والإيلاستاز ، على التوالي.

من بين مستخلصات سمك القد ، تبين أن Cf4 يحتوي على أعلى أنشطة مضادات الأكسدة ومضادة للتصبغ. أظهر تحليل SEC-GPC للمستخلصات أنه تم الحصول على الببتيدات ذات الوزن الجزيئي المتناقص عند زيادة درجة حرارة الاستخراج حتى 250 درجة مئوية [11]. تقع قدرة تثبيط الإيلاستاز لهذه العينة ضمن نطاق القيم الموجودة لمستخلصات Cf الأخرى ، وهي Cf1 و Cf3. ومع ذلك ، بالنسبة للتركيزات المختبرة ، لم يظهر هذان المستخلصان أي نشاط تثبيط تجاه التيروزيناز.

في الأدبيات ، تُظهر بعض التقارير أن المقتطفات من المنتجات الثانوية البحرية تقدم نشاطًا مضادًا للأكسدة ذي صلة وتثبيط إنزيم التيروزيناز. على سبيل المثال ، المستخلصات المشتقة من المنتجات الثانوية البحرية (Scophthalmus maximus) عن طريق التحلل المائي القلوي ، أظهرت نشاطًا مضادًا للأكسدة تم الوصول إليه عن طريق مقايسات كيميائية مختلفة: 1 ، 1- ثنائي فينيل -2- بيكريل هيدرازيل (DPPH) قدرة على الكسح الجذري ( 36.12 بالمائة حول مجموعة التحكم) ، ABTS (2 ، 20 - azinobis - (3- ethyl-benzothiazoline -6- حمض السلفونيك) طريقة (12.81 ميكروغرام BHT / مل) ومقايسة التبييض الكروسين (8. { {28}} 3 ميكروغرام ترولوكس / مل) [35]. في دراسة أخرى ، أظهر الاستخراج الإنزيمي لقنديل البحر المملح بالشبة (Lobonema smithii) أنه ينتج تحلل مائي مع نشاط مضاد للأكسدة عالي (IC {{2 0}}. 9 مجم / مل لمقايسات ABTS e DPPH) وإمكانية تثبيط التيروزيناز ، مع قيم IC5 0 تتراوح بين 14.1 و 24.5 مجم / مل [36] ، والتي هي بنفس الترتيب من حيث الحجم مثل تلك التي تم الحصول عليها في هذا العمل بالإضافة إلى ذلك ، تم الحصول على مستخلصات ذات قيم مضادة للأكسدة مماثلة (قيم ORAC - 0. 4 إلى 3.5 ميكرو مول من TEAC / mg) من نوع آخر من مخلفات صناعة الأغذية ، وهي مجاري نفايات صناعة النبيذ [6]. ومع ذلك ، فإن مستخلصات مخلفات النبيذ هذه قدمت قدرات مثبطة للتيروزيناز (IC50 من 4.0 إلى 0.14 مجم / مل) والإيلاستاز (IC50 من 3.4 إلى 0.1 مجم / مل) من تلك التي تم الحصول عليها في هذا العمل ، وربما يرجع ذلك إلى وجود المركبات الفينولية من المعروف أن لديها العديد من الأنشطة الحيوية. من المهم أن نذكر أنه في دراستنا استخدمنا فطر التيروزيناز لفحص التأثير المضاد لفرط تصبغ المستخلصات ، حيث تم استخدام هذا الإنزيم على نطاق واسع في المقايسات عالية الإنتاجية [37]. ومع ذلك ، نظرًا لوجود بعض الجدل حول التشابه والتماثل بين هذا الإنزيم مع التيروزيناز الثديي / البشري [38-40] ، ينبغي النظر في الدراسات المستقبلية التي تتضمن خطوط خلايا الثدييات لتقييم التأثير المحتمل المضاد لفرط التصبغ لمستخلصات السردين وسمك القد.

لتحديد المركبات التي يمكن أن تكون مسؤولة عن الاستجابة النشطة بيولوجيًا للمستخلصات ، تم إجراء دراسات الارتباط بين بيانات النشاط الحيوي وتكوين الأحماض الأمينية للمستخلصات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا [11،22] (الجدول S1). بالنسبة للنشاط المضاد للأكسدة ، تم الحصول على أعلى الارتباطات (R2 أكبر من أو يساوي 0. 7) بين قيمة ORAC وإجمالي ثريونين ، والفالين الحر ، بالإضافة إلى الليوسين الحر والكامل لجميع المستخلصات. في حالة عينات السردين ، تم الحصول على ارتباط عالي (R2 أكبر من أو يساوي 0. 94) لمحتوى التربتوفان المجاني والكلي. وفقًا لذلك ، تم الإبلاغ سابقًا عن احتواء جميع هذه الأحماض الأمينية على خصائص مضادة للأكسدة في العديد من الأنظمة النموذجية [41-43]. بالنسبة لأنشطة تثبيط الإيلاستاز والتيروزيناز ، تم الحصول على أعلى معاملات الارتباط (R2 أكبر من أو يساوي 0 .8) لمحتوى البروتين الكلي والأرجينين الحر ، على التوالي ، مما يشير إلى أن هذه المركبات يمكن أن يكون لها دور مهم في الإمكانات. تأثير مضاد للشيخوخة ومضاد لفرط التصبغ لمستخلصات مجاري نفايات صناعة الأسماك.

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】