المستقلبات الثانوية من البكتيريا الزرقاء كمكونات للتكنولوجيا الحيوية في مستحضرات التجميل الطبيعية المضادة للشيخوخة 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.3 الأنشطة البيولوجية

2.3.1 نشاط الكسح المتكرر

جذري الأنيون الفائق هو جذور حرة فسيولوجية ذات أهمية قصوى لجسم الإنسان. عندما يكون هناك إفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية هذه أثناء التنفس الهوائي ، أو عندما تفشل آليات إزالة السموم الذاتية أو تكون غير كافية ، فهناك خطر متزايد من حدوث أضرار مؤكسدة مع تأثيرات ضارة خطيرة. بهذا المعنى ، فإن إيجاد آليات لتثبيط الآثار الضارة لـ Oz * له أهمية رئيسية ، ليس فقط في مجال مستحضرات التجميل ولكن أيضًا في التفكير في تحسين مجموعة واسعة من الأمراض والوقاية منها. يتم عرض سلوك الكسح O2 لمستخلصات البكتيريا الزرقاء في الشكل 1 ، ويتم تلخيص قيم IC في الجدول 6.

كانت المستخلصات المائية أكثر فاعلية في Oz * - الكسح من مستخلصات الأسيتون (الجدول 6) وقدمت نشاطًا يعتمد على الجرعة (الشكل 1) ، مع سلالات المياه العذبة التي تبرز من السلالات البحرية. كان Cephalothorax lacustris LEGE 15493 هو السلالة الأكثر فاعلية ، حيث قدم أقل قيمة ICso (65.5 ميكروغرام مستخلص جاف / مل ، ص.<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

تعتبر مقارنة القدرات المضادة للأكسدة بين البكتيريا الزرقاء المختلفة أمرًا صعبًا بسبب الأساليب المختلفة المطبقة. قام Morone وزملاؤه بتقييم قدرة الكسح الجذري لمستخلصات الإيثانول (70 بالمائة حجم / حجم) من سلالات مختلفة من البكتيريا الزرقاء [26] ، وكانت أقل قيمة ICso 822.70 ميكروغرام / مل لـ Phormidium sp.LEGE 02 05292 ، بينما لم يكن هناك تم الكشف عن نشاط لـ Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. أبلغ لوبيز وزملاؤه عن نشاط مسح الأكسجين لـ Nodosilinea (Leptolynbbya) أنتاركتيكا LEGE13457 و Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 مستخلصات الأسيتون ، بقيم IC25 تبلغ 319 و 286 ميكروغرام / م. مثل sp.LEGE 13412 [27]. أبلغ المؤلفون أيضًا عن فعالية أعلى في مستخلصات الأسيتون عند مقارنتها بمستخلصات الإيثانول. كشفت دراسة أخرى أجراها Amaro وزملاؤه عن قيم IC50 تبلغ 1394 و 826 ميكروغرام / مل لـ Gloeothece sp. و Scenedesmus obliquus (M 2-1) ، على التوالي [37]. النتائج التي تم الحصول عليها هنا لمستخلصات الأسيتون تبدو أقل واعدة من تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقًا ، على الرغم من أنها في نفس الترتيب من حيث الحجم. من ناحية أخرى ، كشفت المستخلصات المائية عن إمكانات هائلة تستحق المزيد من الاستغلال فيما يتعلق بالتطبيقات التجميلية في مجال شيخوخة الجلد.

2.3.2. تثبيط الإنزيمات

MMPs هي عائلة من الإنزيمات خارج الخلية المعتمدة على الزنك ، وتتمثل وظيفتها الرئيسية في إعادة تشكيل وتحلل ECM [38] ، وهي مادة شبيهة بالهلام ضرورية لتماسك الخلايا معًا وتوفير مسار للمغذيات والأكسجين [39]. التعديلات في مكونات ECM ، مثل الكولاجين والإيلاستين ، التي يسببها MMPs هي أساس تلف الجلد وتشكيل التجاعيد [40]. جنبًا إلى جنب مع هذه الإنزيمات ، المرتبطة ببنية الجلد وتكوين التجاعيد ، يلعب الآخر دورًا مهمًا في عملية الشيخوخة بسبب نشاطه في تكوين الميلانين: التيروزيناز. من بين العوامل الأخرى ، يتسبب التعرض للأشعة فوق البنفسجية في تراكم كمية غير طبيعية من الميلانين ، بسبب زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. تؤثر هذه الأنواع التفاعلية على نشاط الخلايا الصباغية ، مما يزيد من تحويل التيروزين إلى الميلانين عن طريق الأكسدة ، مما يؤدي إلى فرط تصبغ وبقع الجلد غير المنتظمة [41].

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

في البحث عن بدائل طبيعية لمكونات مكافحة الشيخوخة التجارية ، مع التركيز على الإنزيمات المذكورة أعلاه ، تم استكشاف نشاط مستخلصات البكتيريا الزرقاء (الشكل 2). فيما يتعلق بـ HAase ، كانت ثلاث سلالات فقط قادرة على تثبيط هذا الإنزيم ، وتعمل بطريقة تعتمد على الجرعة: المستخلص المائي لـ Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC 50=863 ميكروغرام / مل) ، ومستخلصات الأسيتون من Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 ، الأخيران تصل فقط إلى IC25 (832 و 995 ميكروغرام / مل ، على التوالي). على الرغم من أن هذه القيم تبدو عالية ، إلا أن نطاق نشاطها كان مشابهًا لنطاق نشاط الدواء المرجعي ثنائي كروموجليكات الصوديوم （DSCG） （IC 50=105 ميكروغرام / مل. علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لأعلى تركيز تم اختباره (1 مجم / مل) ، Leptolyngbya cf. قام ectocarpi LEGE 11479 بتثبيط هذا الإنزيم بنسبة 80 بالمائة (الشكل 2) ، مما يجعل هذا المستخلص واعدًا كمكون تجميلي.

أبلغت دراسات قليلة عن التأثير المحتمل لمركبات البكتيريا الزرقاء ومستخلصاتها على نشاط الهيالورونيداز ، وأي مقارنة حول الإمكانات البيولوجية للمستخلصات يجب أن تأخذ في الاعتبار أن التمثيل الغذائي للبكتيريا الزرقاء يعاني من تباين كبير اعتمادًا على ظروف الزراعة ، مما يؤثر على التركيب الكيميائي للمستخلصات. قام Morone وزملاؤه [26] بتقييم تأثير مستخلصات الإيثانول من Tychonema sp. LEGE 07196 و Cyanobium sp. LEGE 07175 على هيالورونيداز ، ووجد نشاطًا مثبطًا أقوى ، حيث بلغت قيم ICso 182.74 و 208.36 ميكروغرام / مل على التوالي. تم الإبلاغ أيضًا عن نشاط مستخلصات الإيثانول لجزء غير قابل للذوبان من سبيرولينا بلاتنسيس ، مع IC5o من 150 ميكروغرام / مل [42]. أظهرت دراسة أخرى ، أجراها Yamaguchi و Koketsu [19] ، أن Nostochopsis lobatus MAC0804NAN أنتج كمية كبيرة من السكريات ذات التأثير المثبط العالي (IC 50=7. 18 ميكروغرام / مل) ، كما تم الإبلاغ عن أن Arthrospira- قد يكون الببتيد المشتق متورطًا في تثبيط الهيالورونيداز [4]. تدعم هذه النتائج معًا إمكانات مركبات البكتيريا الزرقاء ومستخلصاتها كمكونات مضادة للشيخوخة للتطبيقات التجميلية.

بالنظر إلى الإيلاستاز ، فإن مستخلصات الأسيتون فقط هي التي قدمت نشاطًا حيويًا مثيرًا للاهتمام. Leptolyng-bya راجع. كان ectocarpi LEGE 11479 مرة أخرى هو الأكثر نشاطًا (الشكل 2) ، كونه السلالة الوحيدة التي تصل إلى ICso ، بقيمة 391 ميكروغرام / مل. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 و Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Leptolyngbya boryana LEGE 154 86 وصلت فقط إلى IC25 بقيم 126،86 و 99 ug / mL على التوالي. أما بالنسبة للهيالورونيداز ، فقد أظهرت السلالات البحرية أنها الأكثر نجاحًا.

على حد علمنا ، لا توجد تقارير سابقة عن النشاط المثبط للإيلاستاز للسلالات التي تم استكشافها هنا. فيما يتعلق بالسلالات الأخرى ، تم اكتشاف أن Nostoc minutum أنتج الببتيدات من نوع microviridins و nostopeptins ، مع ICso =1. 3 و 11. 0 ميكروغرام / مل [44،45]. كما أن Microviridins B والمحتوى من Microcystis aeruginosa يثبط أيضًا الإيلاستاز بشكل فعال ، مع قيم ICso البالغة 0. 0 44 و 0.084 ميكروغرام / مل [46]. تركز معظم البيانات المتاحة بشأن تثبيط الإيلاستاز على المركبات المعزولة ، لذلك يصعب إجراء مقارنات مع المقتطفات من سلالاتنا.

يظل تصبغ الجلد غير المتكافئ ، المرتبط بالشيخوخة والتعرض للأشعة فوق البنفسجية ، مصدر قلق كبير لشيخوخة السكان وصناعات مستحضرات التجميل. غالبية الدراسات المتاحة تافهة وتستخدم الفطر التيروزينيز كنموذج إنزيمي ، مما يجعل من الصعب ترجمة النتائج إلى البيئة البشرية ، ومع ذلك ، فإن هذا الإنزيم له تشابه كبير وتماثل مع التيروزيناز البشري [47]. وبالتالي ، تم استخدام نفس النموذج الأنزيمي هنا لاستكشاف إمكانات مستخلصات البكتيريا الزرقاء في تثبيط إنزيم التيروزيناز. بالنسبة للإيلاستاز ، فقط مستخلصات الأسيتون كانت قادرة على تثبيط إنزيم التيروزيناز. كانت Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 هي الأكثر فاعلية (الشكل 2) ، كونها السلالة الوحيدة التي وصلت إلى IC # N (989.26 ± 4.3 ميكروغرام / مل) ، أسفل ذلك كان Leptolyngbya boryana LEGE 15486 ، مع IC 25=784 78 ± 4.33 ميكروغرام / مل ، وأخيرًا Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479 ، حيث تم العثور على أكثر النتائج الواعدة للسلالات البحرية.

قام مورون وزملاؤه [26] سابقًا باستكشاف نشاط المستخلصات الإيثانولية للبكتيريا الزرقاء في نفس النموذج ، لكنهم لم يجدوا أي نشاط. أحد الجوانب المثيرة للاهتمام في هذا هو أن إحدى السلالات المدروسة كانت Nodosilinea nodulosa LEGE 06102 ، والتي أظهرت أفضل النتائج هنا ، مع التأكيد مرة أخرى على أهمية مذيبات الاستخلاص في الحصول على المستخلصات النشطة بيولوجيًا المستهدفة. أما بالنسبة للإنزيمات الأخرى التي تم استكشافها ، فإن الدراسات الاستقصائية التي تركز على البكتيريا الزرقاء نادرة أيضًا بالنسبة للتيروزيناز. عمل عير أجراه يابوتا وفريقه [48] ، أفيد أن مستخلص الماء الساخن من Nostochopsis spp. يثبط بشكل كبير نشاط التيروزيناز (IC 50=250 ميكروغرام / مل). هذه نتيجة مثيرة جدًا للاهتمام ، مع الأخذ في الاعتبار أنها ناتجة عن مستخلص مائي ، لم يتم العثور على أي نشاط له في الدراسة الحالية. يعزو المؤلفون النتيجة إلى المركبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض المنبعثة من PBPs عن طريق المعالجة الحرارية ، أي جزء بيلين يعمل كزبال قوي لجذور البيروكسيل. قيمت دراسة أخرى النشاط المثبط للإيثانول Arthrospira platensis (IC 50=14 ، 000 ميكروغرام / مل) والمياه (IC 50 =72 ، 000 ميكروغرام / مل) ، حيث تُعزى القيم إلى وجود المركبات الفينولية مثل حمض الفيروليك وحمض الكافيين في مستخلص الإيثانول [49].

2.3.3. الحماية من الأشعة فوق البنفسجية

على الرغم من أن عددًا متزايدًا من شركات مستحضرات التجميل يدمج واقيات الشمس في منتجاتها ، إلا أنه لا يزال من الصعب إقناع المستهلكين بفوائد استخدامهم اليومي لإبطاء شيخوخة الجلد المبكرة. من ناحية ، إذا كان الاستخدام اليومي لحاصرات الشمس عادة متأصلة قليلاً ، من ناحية أخرى ، هناك خوف معين في استخدام المواد الاصطناعية ، بسبب المخاطر المرتبطة بها غير المرحب بها [50]. بعد ذلك ، ازدادت الأبحاث حول الحماية الضوئية الطبيعية بشكل كبير في السنوات القليلة الماضية ، مع الأخذ في الاعتبار إمكانية التحلل البيولوجي وانخفاض السمية ، مما يجعلها أكثر فائدة للإنسان والبيئة. من أجل استكشاف مستخلصات البكتيريا الزرقاء في هذا المجال ، تم تقييم قدرتها على العمل كواقيات من الشمس في المختبر من أجل UVR-B ، لأنها أكثر الإشعاعات ضررًا. يتم عرض النتائج التي تم العثور عليها لمستخلصات البكتيريا الزرقاء المائية والأسيتون في الجدول 7.

فيما يتعلق بمستخلصات الأسيتون ، تم العثور على القيمة الواعدة (19.2) لـ Leptolyngbya boryana LEGE 15486 ، تليها Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10.7) ، وكلاهما عند أدنى تركيز تم اختباره ، 200 ميكروغرام / مل. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 كان الأقل واعدة بين مستخلصات الأسيتون. في المستخلصات المائية ، تم الحصول على النتائج الواعدة لأعلى تركيز تم اختباره ، حيث تميز Leptolyngbya boryana LEGE 15486 و Cephalothrix lacustris LEGE 15493 بقيم SPF في المختبر تبلغ 17.1 و 14.9 ، على التوالي (الجدول 7).تمديد الحياة cistancheمن خلال مناقشة الدراسات السابقة في هذا المجال ، أفاد حسين وفريقه [51] أن قيمة SPF لمستخلص سيفالوثريكس كوماريكيانا كانت 2.37. وجدت مجموعة أخرى أن عامل الحماية من الشمس (SPF) لمستخلص الميثانول من Aphanizomenon flos-aquae كان 4 [52]. ومع ذلك ، فإن المعلومات حول تركيز المستخلص الذي استخدمه المؤلفون لم تكن متاحة ، مما يجعل المقارنات الممكنة صعبة.

عدد سلالات البكتيريا الزرقاء التي تم اكتشافها في مجال مستحضرات التجميل ، وخاصة فيما يتعلق بعامل الحماية من الشمس ، نادر جدًا ، نظرًا لإمكانيات هذه الموارد. توضح النتائج المعروضة هنا أن الأنواع قيد الدراسة قد تكون خيارات جيدة كواقيات بيولوجية للصور ، وربما تعمل كمعززات لواقيات الشمس الأخرى التي يتم تسويقها حاليًا ، مما يسمح بتقليل تركيز واقيات الشمس الاصطناعية في الصيغ. لذلك ، من الأهمية بمكان زيادة البحث عن هذه الكائنات ، خاصةً المستخلصات النشطة بيولوجيًا ، والتي ، نظرًا لكونها ذات تكلفة أقل بكثير ، وعائد أعلى ، والحصول على أسرع من المركبات المعزولة ، فهي أكثر صداقة للبيئة وأكثر جاذبية من الناحية الاقتصادية.

2.4 تمييز مستخلصات البكتيريا الزرقاء بواسطة تحليل PCA

نما البحث عن المركبات النشطة بيولوجيًا من المصادر الطبيعية ، مع إمكانية استخدامها كمكونات في مجال مستحضرات التجميل في السنوات الأخيرة. بالإضافة إلى كونها أقل سمية وقابلة للتحلل تمامًا ، تتوفر المركبات المشتقة من البكتيريا الزرقاء من مصادر متجددة ويمكن الحصول عليها بتكلفة منخفضة في بيئة خاضعة للرقابة.cistanche nzيمكن أن يكون تصنيف المستخلصات النشطة بيولوجيًا وفقًا لتركيبها الكيميائي وأنشطتها البيولوجية ذا قيمة للإشارة إلى العلاقات المحتملة. في هذا الصدد ، تم تطبيق تحليل المكون الرئيسي (PCA) ، مع مراعاة التركيب الكيميائي لمستخلصات البكتيريا الزرقاء والنشاط الحيوي لأعلى تركيز تم اختباره في كل مقايسة (الشكل 3). كما يمكن ملاحظته ، يمكن تفسير 72.99 بالمائة من التباين من خلال البعدين الأولين: تمثل PCl 5 0. 41 بالمائة من التباين ، بينما كان PC2 مسؤولاً عن 22.58 بالمائة. تم تمييز ثلاث مجموعات (الشكل 3 أ) ): Gl ، بما في ذلك مستخلص الماء Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479 ؛ G2 ، بما في ذلك مستخلصات المياه Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Leptolyngbya boryama LEGE 15486 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 ؛ و G3 ، بما في ذلك جميع مستخلصات الأسيتون. وفقًا للشكل 3 ب ، يتميز Gl كيميائيًا عن العينات الأخرى بسبب محتوى البولي إيثيلين ؛ يتم تجميع مستخلصات المياه Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Leptolyngbya boryana LEGE 15486 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 وفقًا لمحتواها في PC و APC والبروتينات الكلية (G2) ، بينما توجد جميع مستخلصات الأسيتون في نفس المجموعة (G3) بسبب لمحتواها في الكاروتينات ، والكلوروفيل أ ومشتقاته. يتم عرض المركبات خارج الأنشطة الأنزيمية ، مع تشكيل الطائرات مع المحور الإيجابي PCl (الشكل 3 ب). يمكن ملاحظة أن العينات ذات المحتوى العالي من الكلوروفيل أ والكاروتينات ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالإيلاستاز وتثبيط التيروزيناز. يتضح هذا من خلال الارتباط الإيجابي القوي بين الكاروتينات والإيلاستاز (0.725 ، ص<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0 05). بشكل عام ، سمح تحليل PCA بتجميع المستخلصات وفقًا للأنشطة البيولوجية المعروضة في مجال شيخوخة الجلد ، مما أدى إلى استنتاج أن مستخلصات الأسيتون أكثر فعالية في تثبيط الإنزيمات المسؤولة عن التدهور من المصفوفة الجلدية وفقدان بنية الجلد ، في حين أن المستخلصات المائية أكثر فعالية في إزالة الجذور الحرة وحماية الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية.

على حد علمنا ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها إنشاء علاقة بين التركيب الكيميائي والأنشطة البيولوجية للمستخلصات من سلالات البكتيريا الزرقاء.

3. المواد والطرق

3.1. إنتاج الكتلة الحيوية للبكتيريا الزرقاء

أربع سلالات خيطية من البكتيريا الزرقاء ، Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486 ، من النظم الإيكولوجية للمياه العذبة البرازيلية ، و Leptolyngbya راجع. تم استخدام ectocarpi LEGE 11479 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 ، من النظم الإيكولوجية البحرية البرتغالية ، في هذه الدراسة. تم الحفاظ على السلالات في مجموعة Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE CC) في المركز متعدد التخصصات للبحوث البحرية والبيئية (CIIMAR). ظروف خاضعة للرقابة ، تم تحجيمها بالتتابع حتى 4 لترات ، نمت السلالات في وسط Z8 [53] ، مع إضافة 10 ميكروغرام / لتر من فيتامين ب 12 و 25 جم / لتر من السلالات البحرية. تمت المحافظة على الثقافات عند 25 درجة ، مع شدة ضوء مقدارها 10 فوتونات ميكرومتر -2 م -4 ، مع فترة ضوئية 14 ساعة من الضوء: 10 ساعات مظلمة. تم جمع الكتلة الحيوية الطازجة بعد 120 أو 150 يومًا من النمو (اعتمادًا على السلالة) عن طريق الترشيح ، وتم تجميدها وتجفيفها بالتجميد وتخزينها في درجة -20 حتى تحضير المستخلص.

3.2.Extracts Preparation

تم تحضير مستخلصين مختلفين بالتتابع من كل سلالة: الأسيتون والمائي. أولاً ، تم تحضير مستخلص الأسيتون باستخدام 2 جم من الكتلة الحيوية الجافة. تم تعليق الكتلة الحيوية في الأسيتون واستخلاصها لمدة 10 دقائق في حمام فوق صوتي (Fisherbrand [FB15053 ، Loughborough ، المملكة المتحدة). بعد استخلاص الأسيتون ، تُترك الحبيبات الناتجة لتجف في غطاء الدخان ، ثم تُستخرج بـ 70 مل من الماء المقطر ، باتباع نفس الإجراء. تمت إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 10 ، 00 ×× g Gs لمدة 5 دقائق عند 4 درجات ، في جهاز الطرد المركزي الصغير HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). presure (BUCHIR -210 مبخر دوار) (مستخلص الأسيتون) ، أو مجمدة ومجففة بالتجميد (مستخلص مائي). تكرر الاستخراج مع supernat المقابل 3 مرات. تم حفظ المستخلصات الجافة بدرجة -20 حتى إجراء المزيد من التحليل الكيميائي والبيولوجي.

3.3 فحوصات الخلية

3.3.1 ثقافة الخلية

تم استخدام الخلايا الكيراتينية البشرية HaCAT (ATCC) ، والأرومات الليفية للفأر 3L1 (ATCC) ، والخلايا البطانية البشرية hCMEC (التي قدمها الدكتور POCouraud (INSERM)) لتقييم السموم الخلوية. تمت زراعة خطوط الخلايا في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM GlutaMAXTM ، Gibco ، Glasgow ، المملكة المتحدة) ، مكملًا بنسبة 1 0 بالمائة (v) من مصل بقري جنيني (Gibco) ، 1 بالمائة بنسلين ستربتومايسين (Pen-Strep 100 IU / مل و 10 مجم / مل على التوالي) (Gibco) و 0.1 بالمائة Amphotericin B (Gibco). تم إجراء صيانة الخلايا والفحوصات عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، وتم تجديد وسط الاستزراع كل يومين. عند التقاء الخلايا بنسبة 80-90 في المائة ، تم غسل الخلايا الملتصقة بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS ، Gibco) ، وفصلها باستخدام إنزيم TrypLEX Express (1 ×) (Gibco) ، وتم تمريرها للصيانة ، وتم زرعها للمقايسات المخططة.

3.3.2. السمية الخلوية - فحص MTT

تم تقييم صلاحية الخلوية من خلال الانخفاض في {0} (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTI، Sigma-Aldrich ، ألمانيا) ، كما تم إعادة تدويره سابقًا [26]. تم زرع جميع خطوط الخلايا (الخلايا البطانية ، والأرومات الليفية ، والخلايا الكيراتينية) في 96- ألواح جيدة ، بكثافة 1.0 × 10 خلايا / مل ، و 3.3 × 104 خلية / مل ، و 2.5 × 104 خلايا / مل ، على التوالي.cistanche حجم القضيببعد 24 ساعة من التصاق الخلية ، تمت إزالة وسط المزرعة ، وتم تعريض الخلايا لمدة 24 و 48 ساعة إلى وسط جديد يحتوي على مستخلصات البكتيريا الزرقاء المختلفة في خمسة تراكيز متسلسلة ، من 12.5 إلى 200 ميكروغرام / مل. بالنسبة لمستخلصات الأسيتون ، تم تحضير محاليل المخزون في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (Gibco) ، وتم تخفيفها باستخدام DMEM قبل تعرض الخلايا بحيث لا يتجاوز تركيز DMSO الأقصى 1 بالمائة. تم تحضير المستخلصات المائية في برنامج تلفزيوني وتم تخفيفها باستخدام DMEM قبل تأكيد الخلايا. كان التحكم السلبي هو PBS ، وكان التحكم في موت الخلية DMSO 20 بالمائة. بعد الحضانة ، تم إجراء فحص السمية الخلوية MIT. باختصار ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة ، تمت إزالة الوسط بعناية ، وتم إذابة أملاح فورمازان ذات اللون الأرجواني في DMSO. تمت قراءة الامتصاصية عند 550 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعدد الكشف Synergy HT (Biorek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) الذي يتم تشغيله بواسطة برنامج GEN51M. تم إجراء الاختبار في أربع مرات ومتوسط. من أجل التكاثر ، تم تكرار كل مقايسة بشكل مستقل ثلاث مرات على الأقل. تم التعبير عن السمية الخلوية كنسبة مئوية من صلاحية الخلية ، مع الأخذ في الاعتبار قابلية البقاء بنسبة 100 في المائة في التحكم في المذيبات.

3.4. التنميط الكيميائي لمستخلصات البكتيريا الزرقاء

3.4.1 إجمالي محتوى الفينول (TPC)

لتحديد TPC للمستخلصات ، تم استخدام اختبار قياس الألوان ، بناءً على منهجية Folin-Ciocalteu [54] مع تعديلات طفيفة. تمت إذابة مستخلصات الأسيتون في DMSO والمستخلصات المائية في الماء. باختصار ، تم خلط 25 ميكرولتر من كل مستخلص （1 0 مجم / مل） تمامًا مع 25 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu （Sigma-Aldrich） 2 0 {{2 {26}}}} ميكرولتر من محلول NagCO3 و 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. بالنسبة للفراغ ، تم استبدال كاشف Folin-Ciocalteu بالماء منزوع الأيونات. تم قياس امتصاص المنتج الملون عند 725 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعددة الكشف Synergy HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، Germany) يعمل عبر برنامج GEN51M. تم الحصول على المنحنيات القياسية لتقدير TPC باستخدام سبع تركيزات من حمض الغال (GA) (0.025 إلى 0.5 مجم / مل) ، تم تحضيرها في نفس المذيب مثل المستخلصات المراد اختبارها (y =2. 097x ＋ 0.01560 R² {{ 22}}. 9989 ، للأسيتون ، و y =2. 204x ＋ 0.01401 ، R 2=0. 9982 ، للمياه ، حيث يشير "y" إلى الامتصاص و "x" يشير إلى التركيز) . تم تنفيذ ثلاثة قرارات مستقلة في نسختين. تم التعبير عن المحتوى الفينولي الكلي كمكافئات ميكروغرام GA (GAE) لكل مجم من المستخلص الجاف.

3.4.2 إجمالي البروتينات

تم تحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA (# 23227 ، Thermo-Scientific). تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، بينما تم تحضير مسارات الأسيتون السابقة في DMSO. تم خلط 25 ميكرولتر من كل مستخلص (1 مجم / مل) مع 200 ميكرولتر من كاشف العمل. تم قياس الامتصاصية عند 562 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعددة الكشف Synergy HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، Ger-many) يعمل عبر برنامج GEN5IM. منحنى قياسي (y =-126. 87x3 547.73. 353 -10. 017 ؛ R 2=0. 999 و y =162. 87x 3-248. 51x² ＋ 932.13x -11. 715 ؛ R 2=0. 99 ، حيث تشير "y" إلى الامتصاص و "x" تشير إلى التركيز) تم الحصول عليها لكل مستخلص ، باستخدام تسعة تركيزات من الألبومين (BSA) (25 إلى 2000 ميكروغرام / مل) لتحديد البروتينات. أجريت ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ. تم التعبير عن محتوى البروتين الكلي في صورة ميكروغرام من معادلات ألبومين المصل البقري (BSA) لكل مجم من المستخلص الجاف.

3.4.3. الأصباغ

تم تحديد الأصباغ الموجودة في كل من المستخلصات المائية والأسيتون من حيث المواصفات الكمية. تم قياس كمية الكلوروفيل أ ومشتقاته باستخدام منحنى المعايرة الذي تم الحصول عليه بالمعيار التجاري (Sigma-Aldrich): y =8. 0 791x -0. 0 {{19} } 22 (R 2=0. 996) ، حيث تشير "y" إلى الامتصاصية و "x" تشير إلى التركيز. تم قياس كمية الكاروتينات الكلية على أنها -كاروتين (Sigma-Aldrich) ، من خلال منحنى المعايرة （y =17. R² =0 990 ، حيث يشير الحرف "y" إلى الامتصاص ويشير الحرف "x" إلى التركيز). تم التعبير عن التركيز الكلي للكاروتين على شكل ميكروغرام من-كاروتين لكل ملجم من المستخلص الجاف. تم الحصول على منحنيات المعايرة لكلا المعيارين باستخدام خمسة تراكيز مختلفة (0.001 إلى 0.025 مجم / مل). تم تشكيل التحديدات الطيفية الضوئية في 96- ألواح بئر ، عند 450 نانومتر للكاروتين و 663 نانومتر للكلوروفيل أ ، باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعدد الكشف Synergy HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) يتم تشغيله عبر برنامج GEN5TM.

تم تحديد محتوى PBP طيفيًا عن طريق قياس امتصاص المستخلصات المائية بأطوال موجية مختلفة (562،615 ، و 645 نانومتر) ، وتطبيق الصيغ المقابلة ، كما هو موضح سابقًا بواسطة Pagels et al. [34]: تمت إعادة تعليق المستخلصات المائية لتركيز نهائي قدره 0 .5 مجم / مل. تم إجراء التجربة في ثلاث نسخ ، وتم التعبير عن النتائج في ميكروغرام / ملغ من المستخلص الجاف. 3.5 الأنشطة البيولوجية

3.5.1 سوبيروكسيد الأنيون الراديكالي (O2 * -) الكسح

تم إجراء اختبار مسح الجذور الحرة لـ Oz * - لتقييم إمكانات مضادات الأكسدة لمستخلصات البكتيريا الزرقاء ، وفقًا لباربوسا وزملاؤه [55] ، مع تعديلات طفيفة. تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، بينما تم تحضير مستخلصات الأسيتون في DMSO. تم تحضير خمسة تخفيفات متسلسلة لكل مستخلص واختبارها من أجل تقييم سلوك المستخلصات وقيم IC. تم إذابة جميع الكواشف في محلول الفوسفات （19 ميكرومتر ، الرقم الهيدروجيني 7.4）. تم خلط حجم 50 ميكرولتر من كل تخفيف مع 50 ميكرولتر من 166 ميكرولتر من محلول أدينين ثنائي النوكليوتيد المختزل (NADH) و 150 ميكرولتر من 43 ميكرولتر من كلوريد أزرق نيتروترازوليوم (NBT) في لوحة بئر 96-. بعد إضافة 50 ميكرولتر من 2.7 ميكرومتر من ميثوسلفات الفينازين （PMS ، تمت مراقبة نشاط المسح الجذري للعينات باستخدام قارئ الصفيحة الصغرى Synergy HT Multi-Detection (Biotek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) الذي يعمل عبر برنامج GEN51M ، في الوظيفة الحركية ، في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 562 نانومتر. تم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة في ثلاث نسخ. تم استخدام GA كعنصر تحكم إيجابي. تم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من الكسح الجذري مقارنة بالسيطرة غير المعالجة. تم التعبير عن نتائج قيم IC المحسوبة على أنها متوسط ​​± SD (ug / mL) لثلاثة فحوصات مستقلة على الأقل تم إجراؤها في نسختين. تم حساب قيم IC ومنحنيات الاستجابة للجرعة المقابلة باستخدام برنامج Graphpad Prism @ (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ الإصدار 9 ، لنظام التشغيل MacOS).

3.5.2. تثبيط الهيالورونيداز

تم تعديل مقايسة تثبيط الهيالورونيداز بشكل طفيف من ذلك الذي اقترحه Ferreres et al. 【56】. باختصار ، 25 ميكرولتر من كل مستخلص （9 مجم / مل ، 175 ميكرولتر من حمض الهيالورونيك （HA） （0. 7 مجم / مل） ، و 25 ميكرولتر من هيالورونيداز （HAase） （9 0 {{ 14}} تم خلط U / mL في كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9 بالمائة） في أنبوب تفاعل. تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، وحضرت مستخلصات الأسيتون في DMSO. بعد 30 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة ، تم إيقاف التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من رباعي الصوديوم ثنائي الصوديوم 0.8 متر في الماء） ، متبوعًا بالحضانة لمدة 3 دقائق عند 90 درجة في حمام مائي. تم تبريد أنابيب التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 375 ميكروليتر من محلول DMAB [4- (ديميثيلامينو) بنزالديهايد]. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة ، تم قياس امتصاص المنتج الملون عند 560 نانومتر ، في قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الاكتشاف التآزر HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) الذي يتم تشغيله عبر برنامج GEN5IM. تم إجراء التحكم السلبي في حالة عدم وجود خلاصة. تم استخدام كروموجليكات ثنائي الصوديوم (DSCG) كعنصر تحكم إيجابي.

تم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة في ثلاث نسخ ، وتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من تثبيط الإنزيم مقارنةً بالضوابط غير المعالجة.

3.5.3. تثبيط الإيلاستاز

تم إجراء مقايسة تثبيط إيلاستاز البنكرياس الخنازير وفقًا لـ Mota وزملائه [57] مع تعديلات طفيفة. تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، بينما تم تحضير مستخلصات الأسيتون في DMSO. باختصار ، في 96- صفيحة جيدة ، تم خلط 5 0 ميكرولتر من المستخلص مع 90 ميكرولتر من محلول HEPES (0.1 M) ، 10 ميكرولتر من ركيزة N-succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide （100 ميكرومتر） ، 70 ميكرولتر من محلول أسيتات 200 ملي مولار ، و 30 ميكرولتر من الإيلاستاز （1 وحدة / مل تم تحضين اللوحة عند 37 درجة لـ 10 دقائق ، وتم قياس امتصاص منتج التفاعل عند 405 نانومتر ، في قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الكشف Synergy HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) يعمل عبر GEN51M. تم إجراء التحكم السلبي في حالة عدم وجود المستخلص ، واستخدم حمض الأسكوربيك كعنصر تحكم إيجابي.مسحوق cistancheتم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة في ثلاث نسخ. تم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية لتثبيط الإنزيم بالمقارنة مع السيطرة غير المعالجة.

3.5.4 تثبيط إنزيم التيروزيناز

تم إجراء مقايسة تثبيط التيروزيناز وفقًا لـ Adhikari et al. [58] مع تعديلات طفيفة. باختصار ، في 96- صفيحة بئر ، تم خلط 2 0 ميكرولتر من كل مستخلص مع 1 0 0 ميكرولتر من التيروزيناز （30 وحدة / مل في المخزن المؤقت للفوسفات）. تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، بينما تم تحضير مستخلصات الأسيتون في DMSO. تم تحضين الخليط عند 30 درجة لمدة 8 دقائق. بعد ذلك ، تمت إضافة 80 ميكرولتر من L-DOPA - L -3 ، 4- محلول ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين （2.5 ملي مولار في محلول الفوسفات) ، وتم الامتصاص (T0 ، الامتصاصية في وقت "صفر") على الفور تم القياس باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الكشف Synergy HT (Biotek ، Bad Friedrichshall ، ألمانيا) الذي يتم تشغيله عبر برنامج GEN5TM ، بسرعة 475 نانومتر. سمح تحديد الامتصاصية عند T0 (قبل تكوين منتج التفاعل) بإزالة التداخلات المحتملة بسبب اللون الطبيعي للمستخلصات قيد الدراسة. بعد 8 دقائق من الحضانة عند 30 درجة ، تم قياس الامتصاصية مرة أخرى (T8). تم حساب النسبة المئوية لتثبيط التيروزيناز في وجود مستخلصات البكتيريا الزرقاء بالمقارنة مع التحكم (السالب) غير المعالج ، حيث تم حساب الفرق بين الامتصاص (T). {21}} T0) يتوافق مع 100 بالمائة من نشاط الإنزيم. تم إجراء التحكم السلبي في حالة عدم وجود المستخلص ، واستخدم حمض الكوجيك كعنصر تحكم إيجابي. تم إجراء ثلاث فحوصات مستقلة في ثلاث نسخ. تم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية لتثبيط الإنزيم بالمقارنة مع السيطرة غير المعالجة.

3.5.5 عامل الحماية من الشمس (SPF)

تم تحديد عامل الحماية من الشمس في المختبر وفقًا لرور وزملائه [59] مع تعديلات طفيفة. تم تحضير المستخلصات المائية في الماء ، بينما تم تحضير مسالك الأسيتون الخارجية في الأسيتون. باختصار ، تم قياس امتصاص 2 مل من كل مستخلص (20 و 1000 ميكروغرام / مل) في مقياس طيف ضوئي (من 290 إلى 320 نانومتر ، 5 في 5 نانومتر). تم حساب عامل الحماية من الشمس باستخدام الصيغة التي اقترحها منصور [60]: حيث EE A هو طيف التأثير الحمامي ، I （A هو طيف كثافة الشمس ، Abs （λ） هو امتصاص المستخلص ، و CF هو التصحيح تم تحديد العامل (28) باستخدام واقي من الشمس تجاري بقيمة SFP معروفة تبلغ 30.

3.6 التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج إحصائيات IBM SPSS (الإصدار 23. 0 لنظام التشغيل macOS ، شركة IBM ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2015). تم تحليل البيانات من أجل الوضع الطبيعي وتجانس التباينات بواسطة Kolmogorov-Smirnov و Leven's الاختبارات ، ثم يتم إرسالها إلى ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام Tukey's HSD (فرق مهم بصدق) كاختبار ما بعد المستند ، أو لاختبار t غير مقيد. تم استخدام اختبار ارتباط بيرسون لمقارنة بيانات التعبير المقيسة بين الملامح الكيميائية والأنشطة البيولوجية لمستخلصات البكتيريا الزرقاء.

3.7 تحليل المكونات الرئيسية (PCA)

تم استخدام PCA لتحويل عدد من المتغيرات المرتبطة المحتمل إلى عدد من المتغيرات المستقلة نسبيًا ، والتي يمكن تصنيفها بناءً على مساهمتها في شرح تباين مجموعة البيانات بأكملها [61]. يمكن تحديد المكونات المهمة نسبيًا للأنماط عالية الأبعاد بنجاح. يمكن تعيين البيانات الأصلية عالية الأبعاد على مساحة ذات أبعاد أقل ، وبالتالي يتم تقليل تعقيد مشكلة تصنيف النمط عالي الأبعاد بشكل كبير [62]. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إجراء التعرف على الأنماط استنادًا إلى PCA باستخدام برنامج إحصائيات IBM SPSS (الإصدار 23. 0 لنظام التشغيل macOS ، و IBM Corporation ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2015). تتكون مصفوفة البيانات من المستقلبات الموجودة في المستخلصات المائية والأسيتون لسلالات البكتيريا الزرقاء الأربعة ، ونشاطها عند أعلى تركيز تم اختباره.

4 - نتائج

ثبت أن النشاط البيولوجي الذي تعرضه مستخلصات البكتيريا الزرقاء التي تم تحليلها هنا مرتبط بشكل واضح. وفقًا لوجود PBPs النشطة بيولوجيًا ، كانت المستخلصات المائية هي الأكثر فعالية للحماية من الأشعة فوق البنفسجية والتي ، جنبًا إلى جنب مع قدرتها على الكسح الجذري ، تشير إلى أنها مكونات واعدة لاستخدامها في تركيبات مكافحة الشيخوخة التي تهدف إلى منع شيخوخة الجلد التي تتفاقم بسبب العوامل الخارجية. من ناحية أخرى ، أثبتت مستخلصات الأسيتون أنها أكثر فاعلية في تثبيط نشاط الإنزيمات المسؤولة عن تدهور المصفوفة الجلدية وفقدان بنية الجلد ، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة لشيخوخة الجلد المرتبطة بالعمر.استخراج الصلصا cistancheيمكن أن يكون مخطط الاستخراج المتسلسل الذي نقترحه مفيدًا ، مما يسمح بالحصول على مستخلصات نشطة بيولوجيًا مختلفة كيميائيًا من خلال تسييل الكتلة الحيوية للبكتيريا الزرقاء ، مما يجعل العملية أكثر استدامة وجاذبية من الناحية الاقتصادية. إجمالاً ، أثبتت مستخلصات البكتيريا الزرقاء أنها تستحق المزيد من الاستغلال في مجال شيخوخة الجلد ، مستهدفة البحث عن مكونات طبيعية وآمنة ومستدامة لتركيبات مستحضرات التجميل.

تم اقتباس هذا المقال من Mar. Drugs 2022، 20، 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs