يمارس Cyclopentanone أنشطة مضادة لتكوين الميلانين ومضادة للتجاعيد في سرطان الجلد B16F10

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

هي جين جونغ 1 ، أ كيونغ لي 1 ، 2 ، يو جين بارك 1 ، 2 ، سانغ وون لي 1 ، 2 ، دونغوان كانغ 1 ، 2 ، يونغ سوك جونغ 1 ، 2 ، هاي يونغ تشونغ 1 ، 2 وهيونغ ريونغ مون 1 ، 2 ، *

الملخص:التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) هو السبب الرئيسي لشيخوخة الجلد الخارجية ، مما يؤدي إلى فرط تصبغ الجلد والتجاعيد. في هذه الدراسة ، درسنا التأثير المبيض لـ (2E ، 5E) -2 ، 5- مكرر (3- هيدروكسي -4- ميثوكسي بنزيليدين) سايكلوبنتانون (BHCP) على سرطان الجلد B16F10 ومضاداته نشاط التجاعيد على خلايا الخلايا الليفية Hs27. تم العثور على BHCP لتثبيط التيروزيناز بشكل فعال ، مع قيم تركيز تثبيط 50 بالمائة (IC50) تبلغ 1.10 ميكرومتر و 8.18 ميكرومتر فورميكوفينولات (L-tyrosine) و diphenolase (L-DOPA) ، وكشفت دراسة حركية الإنزيم أن BHCP هو مثبط من النوع التنافسي للتيروزيناز . علاوة على ذلك ، قام BHCP بتثبيط نشاط الميلانين ونشاط التيروزيناز الخلوي بشكل كبير وقلل من مستويات عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم (MITF) ، ومستويات الفسفرة من بروتين ارتباط عنصر استجابة cAMP (CREB) ، وهرمون التيروزيناز في هرمون تحفيز الخلايا الصباغية (-MSH). خلايا سرطان الجلد B16F10. علاوة على ذلك ، منع BHCP فسفرة p65 والتعبير عن البروتينات المعدنية المصفوفة (MMP -1 ، MMP -9 ، MMP -12 ، و MMP -13) في الخلايا الليفية Hs27 تحفيزه بالأشعة فوق البنفسجية ، لذلك ، أظهرت نتائجنا أن BHCP قد يكون مرشحًا جيدًا لتطوير عوامل علاجية للأمراض المرتبطة بفرط التصبغ والتجاعيد.

الكلمات الرئيسية: (2E، 5E) -2، 5- Bis (3- hydroxy -4- methoxybenzylidene) cyclopentanone (BHCP)؛ مثبطات التيروزيناز ؛ مكافحة تجعد

Cistanche هومضاد للتجاعيد.

1 المقدمة

شيخوخة الجلد هي عملية معقدة وتدريجية تؤدي إلى تغيرات وظيفية وجمالية في الجلد ، مع وجود عوامل داخلية وخارجية مسؤولة [1]. تنجم شيخوخة الجلد الخارجية عن العوامل البيئية الضارة ، مثل الأشعة فوق البنفسجية أو الإجهاد أو التدخين. ومع ذلك ، فهو ناتج بشكل أساسي عن التعرض المتكرر للأشعة فوق البنفسجية من الشمس ، وهو ما يسمى بالشيخوخة الضوئية. يتميز شيخوخة الجلد بالتجاعيد الخشنة والعميقة ، والسماكة ، والخشونة ، وخلل التصبغ ، والتغيرات النسيجية [2-4].

التيروزيناز (EC 1.14.18.1) ، المعروف أيضًا باسم بوليفينول أوكسيديز ، هو أحد الإنزيمات متعددة الوظائف التي تحتوي على النحاس والتي تشارك في تخليق الميلانين ، وهي موجودة على نطاق واسع في الطبيعة [5]. يوجد التيروزيناز عادةً في غالبية الكائنات الحية الدقيقة والنباتات ، والحيوانات. في النباتات ، يعمل التيروزيناز عن طريق أكسدة مونوفينولات إلى ديفينول (نشاط ميكوفينولات) ويشارك في أكسدة أو-ديفينول إلى أو-كينونات (نشاط ديفينولاز) ، متبوعًا بأكسدة الكينونات إلى أصباغ بنية داكنة [6].

تكوين الميلان هو تحول L-tyrosine إلى 3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA) ، حيث يتم تحويل L-DOPA إلى كينين DOPA [7]. ومن ثم ، يلعب التيروزيناز دورًا مهمًا في إنتاج الميلانين في الخلايا الصباغية ، ويعد تثبيط إنزيم التيروزيناز هدفًا جذابًا لتحسين الاضطرابات المرتبطة بالتصبغ ولتطوير عوامل التبييض [8،9]. يتم تحفيز تخليق الميلانين عن طريق العديد من المحفزات ، مثل الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية بما في ذلك أيزوبوتيل ميثيل زانثين (IBMX) وهرمون تحفيز الخلايا الصباغية ألفا (-MSH). يرتبط MSH بمستقبل الميلانوكورتين 1 لمستقبله (MC1R) ، مما يؤدي إلى زيادة مستوى AMP الدوري السيتوبلازمي (cAMP). ينشط مستوى cAMP المتزايد بروتين كيناز A (PKA) ، والذي يحفز التعبير عن عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم (MITF) عبر فسفرة بروتين ارتباط cAMP (CREB). يستحث MITF التعبير عن التيروزيناز ، والبروتين المرتبط بالتيروزيناز (TRP) -1 ، و TRP -2 ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة تخليق الميلانين [10]. يعتبر MITF عامل نسخ رئيسي لتكوين الميلانين. لذلك ، تم إجراء العديد من الدراسات للتحكم في تعبير MITF لتثبيط تكون الميلانين [11].

من المعروف أن تكوين التجاعيد يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتدهور النسيج خارج الخلوي للجلد ، وتنشط الأشعة فوق البنفسجية العامل النووي κB (NF-κB) ، مما يزيد من إنتاج تجزئة الكولاجين وإنزيمات المصفوفة المعدنية (MMPs) [2]. MMPs هي ببتيدات تعتمد على الزنك وهي مهمة في إعادة تشكيل بنية المصفوفة خارج الخلية في الجلد. لذلك ، فإن التحلل المفرط للكولاجين والمصفوفة بفعل الأشعة فوق البنفسجية المحرضة هي سمة مميزة للجلد المصاب بالتلف الضوئي ، وتستخدم MMPs كعلامة رئيسية للتشيخ الضوئي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية وكذلك التهاب الجلد [12].

تشتمل مشتقات الهيكل العظمي diarylheptanoid الشبيهة بالكركمين على مضادات الأكسدة ، والسرطان المتوقع ، والأنشطة. (BHCP) (الشكل 1) ،لإظهار مجموعة واسعة من مضادات الالتهاب ، ومضادة لتكوين الميلانين ، على وجه الخصوص ، Leow et al. [19] تم الإبلاغ عنها في الأنشطة الحيوية ، ومضادات التيروزيناز [13-18] ديبنزيليدين-سيكلوبنتانون 2014 التي قد تساهم في التأثيرات الوقائية على ساركوما العظام البشرية عن طريق تنظيم مسار Wnt / -cateninsignaling. ومع ذلك ، فإن التأثيرات المضادة لتكوين الميلانين والمضادة للتجاعيد لـ BHCP لا تزال قيد الاكتشاف ، ولم يتم بعد تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء نشاطها بشكل واضح.

الشكل 1. هيكل (2E ، 5E) - مكرر (3- هيدروكسي -4- ميثوكسي بنزيليدين) سيكلوبنتانون (BHCP).

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في القدرة المضادة لتكوين الميلانين ومقاومة التجاعيد لـ BHCP ، وسعينا إلى تحديد الآلية المعنية ، خاصة فيما يتعلق بمحتوى الميلانين ونشاط التيروزينات الخلوية ، والتي تم استكشافها باستخدام مقايسة تثبيط التيروزيناز وتحليل حركية الإنزيم. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن BHCP يمارس تأثيرًا مثبطًا على تكوين الميلانين والتجاعيد المرتبطة بتقليل تنظيم CREB / MITF / tyrosinase في خلايا سرطان الجلد B16F10 المستحثة بـ MSH وتثبيط فسفرة تعبير p65 و MMP في الخلايا الليفية البشرية Hs27 المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية.

التنين الأعشاب cistanche

2. النتائج والمناقشة

2.1. توليف (2E ، 5E) -2 ، 5- مكرر (3- هيدروكسي -4- ميثوكسي بنزيليدين) سيكلوبنتانون (BHCP)

محلول من {0} هيدروكسي -4- ميثوكسي بنزالديهيد (1 0 0 مجم ، 0. 66 ملي مول ، أيزوفانيلين) وسيكلوبنتانون (0.03 مل ، 0.33 مليمول) في محلول 1 N HCl- حمض الخليك (0.02 مل) تم تقليبها عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الوقوف لمدة يوم واحد ، تمت معالجة خليط التفاعل بالماء البارد في وجود كمية قليلة من الميثانول ، ثم تمت تصفيته وغسله بماء بارد لإنتاج BHCP (65.9 مجم) في محصول 56.9 بالمائة. 1H و 13 C-NMR ، وكذلك عن طريق المقارنة مع البيانات الطيفية المنشورة وتحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) [19]. يظهر الهيكل في الشكل 1.

BHCP: مسحوق أصفر غير متبلور (CHCl3) ؛ 1H-NMR (5 0 0 ميجاهرتز ، DMSO-d6) δ: 9.25 (ثانية ، 2 س ، 2 × أوه) ، 7.28 (ث ، 2 س ، 2 × فينيليك) ، 7.14 (يوم ، 2 س ، J=2. 0 هرتز ، 2 × 2- ارتفاع) ، 7.11 (يوم ، 2 ساعة ، J=8. 5 ، 2.0 هرتز ، 2 × 6- H) ، 7.01 (d ، 2H ، J=8. 5 هرتز ، 2 × 5- ارتفاع) ، 3.81 (ثانية ، 6 ساعات ، 2 × أوم) ، 3.01 (ثانية ، 4 ساعات ، 2 × CH2) ؛ 13C-NMR (100 ميجا هرتز ، DMSO-d6) δ: 195.5 ، 149.9 ، 147.2 ، 136.0 ، 133.1 ، 129.1 ، 124.3 ، 117.5 ، 112.8 ، 56.3 ، 26.6 ؛ ESI-MS: m / z 351 (M - H) -.

2.2. التأثير المثبط لـ BHCP على نشاط الفطر التيروزينيز

كما هو مبين في الجدول 1 ، قام BHCP بتثبيط التيروزيناز بقيم IC5 0 التي تبلغ 1.1 0 ± 0.12 ميكرومتر و 8.18 ± 0.44 ميكرومتر ، بينما كان لحمض الكوجيك (التحكم الإيجابي) قيم IC50 تبلغ 18.68 ± 1.40 ميكرومتر و 33.89 ± 1.16 ميكرومتر ل monophenolase و diphenolase ، على التوالي. في دراستنا السابقة لمثبطات الجهد التخليقي للتيروزيناز ، وجدنا الآلية من خلال دراسات النمذجة الجزيئية التي من خلالها كان لمجموعتي 3- هيدروكسي و 4- ميثوكسي للبنزيلدين تمارين ارتباط كبيرة تجاه الموقع النشط للتيروزينيز [20]. من نتيجة هذه الدراسة ، تبين أن مجموعاتها الوظيفية (3- مجموعات هيدروكسي و 4- ميثوكسي) ارتبطت بزيادة كبيرة في نشاط التيروزيناز المثبط.

الجدول 1. النشاط المثبط للتيروزيناز والتحليل الحركي للإنزيم لـ BHCP.

علاوة على ذلك ، تم التحقيق في الآلية المسؤولة عن تثبيط التيروزيناز بواسطة BHCP بواسطة تحليل حركي الإنزيم في الدراسة الحالية (الجدول 1 والشكل 2). تم رسم مخططات Lineweaver-Burk باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من الدراسات الحركية ، وتم الحصول على ثابت التثبيط (Ki) من مؤامرات Dixon. أشارت مخططات Lineweaver-Burk المزدوجة المتبادلة إلى تثبيط من النوع التنافسي. كما هو موضح في الشكل 2 أ-ج ، عملت BHCP كمثبط تنافسي لكل من L-tyrosine و L-DOPA علاوة على ذلك ، فإن الاعتراضات على المحور x لمخططات Dixon شائعة تستخدم لتحديد أنواع ثوابت تثبيط الإنزيم (Ki) لمركب مثبط الإنزيم [21،22] ، حيث تشير قيمة المحور x إلى قيمة −Ki. كما هو مبين في الشكل 2 ب - د ، كانت قيم Ki لـ BHCP 1.7 ميكرومتر و 10.5 ميكرومتر كركائز لـ L-tyrosine و L-DOPA ، على التوالي. نظرًا لأن قيمة Ki تمثل التركيز المطلوب لتشكيل معقد مثبط الإنزيم ، فإن قيمة Ki الأقل تشير إلى تثبيط أكثر فعالية ضد التيروزيناز.

الشكل 2. مخططات Lineweaver-Burk (أ ، ج) وديكسون (ب ، د) لتثبيط إنزيم التيروزيناز بواسطة BHCP.

2.3 آثار BHCP على قابلية بقاء خلايا الورم الميلانيني B16F10 وخلايا الخلايا الليفية Hs27

قبل تحديد ما إذا كان BHCP قد مارس أي أنشطة مضادة لتكوين الميلانين ومضادة للتجاعيد ، قمنا بفحص السمية الخلوية لخلايا BHCP لخلايا B16F10 وخلايا Hs27 عن طريق العلاج بتركيزات مختلفة من BHCP لفترات زمنية مختلفة ، وتم قياس قابلية الخلية للحياة باستخدام مقايسة EZ-Cytox. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، ب ، ما يصل إلى 10 ميكرومتر من BHCP لمدة 48 ساعة لم يقلل من بقاء خلايا B16F10 أو خلايا Hs27. بعد ذلك ، تم إجراء مزيد من الدراسات في المختبر حول الأنشطة المضادة لتكوين الميلانين ومقاومة التجاعيد لـ BHCP مع 1 و 5 و 10 ميكرومتر.

2.4 تثبيط BHCP ضد محتوى الميلانين ونشاط التيروزيناز الخلوي في خلايا سرطان الجلد B16F10

لتحديد ما إذا كان BHCP يمارس إمكانات مثبطة على محتوى الميلانين لخلايا B16F10 المستحثة بـ MSH ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا بالتركيزات المختلفة المشار إليها (1 و 5 و 10 ميكرومتر) من BHCP أو حمض الكوجيك (5 ملي مولار) لمدة 24 ساعة ثم يتم تحفيزها مع-MSH لمدة 48 ساعة. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، انخفض محتوى الميلانين في الخلايا المعالجة بـ BHCP في وجود -MSH بطريقة تعتمد على التركيز ، حيث أظهر 113 في المائة عند 1 ميكرومتر ، و 106 في المائة عند 5 ميكرومتر ، و 102 في المائة عند 10 ميكرومتر ، مقارنة بـ عولجت المجموعة الضابطة بـ -MSH فقط (186 بالمائة). ومن المثير للاهتمام أن BHCP (1 ميكرومتر) يثبط محتوى الميلانين بقوة أكبر من حمض الكوجيك (5 ملي مولار). علاوة على ذلك ، تم إجراء اختبار نشاط التيروزيناز الخلوي لقياس التأثير المثبط لـ BHCP على خلايا B16F10. كما هو مبين في الشكل 4 ب ، انخفض BHCP بطريقة تعتمد على التركيز مع نشاط التيروزيناز بنسبة 120 في المائة عند 1 ميكرومتر ، و 116 في المائة عند 5 ميكرومتر ، و 105 في المائة عند 10 ميكرومتر ، مقارنة بمجموعة التحكم المعالجة بـ MSH فقط (181 كان التأثير المثبط لـ BHCP أقوى بكثير من تأثير حمض الكوجيك ؛ كان تثبيط BHCP عند 1 ميكرومتر أفضل من تثبيط حمض كوجيك عند 5 ملي مول (131 بالمائة). تشير هذه النتائج إلى أن BHCP له تأثير التبييض عن طريق تثبيط تخليق الميلانين الحيوي وتخليق التيروزيناز داخل الخلايا في الخلايا الصباغية B16F10.

الشكل 4. تثبيط محتويات الميلانين (أ) ونشاط التيروزيناز الخلوي (ب) من BHCP على خلايا الورم الميلانيني B16F10.

2.5 تأثيرات BHCP على التعبير عن MITF / Tyrosinase و MITF / Tyrosinase و MITFORYLED CREB في خلايا B16F10

يلعب MITF ، وهو عامل نسخ محدد ، دورًا محوريًا في التنشيط الفعال للجينات الميلانينية ، بما في ذلك التيروزيناز ، وتحفيز خطوة تحديد المعدل في التخليق الحيوي للميلانين: TRP -1 ، و TRP -2. يمكن للتعبير عن MITF يمكن زيادتها عن طريق فسفرة السرب [23]. يعتبر CREB مُحفزًا مهمًا لـ MITF [24،25] ، وتزيد فسفرة CREB في الخلايا الصباغية من تعبير MITF عن طريق الارتباط بـ CREB (بروتين ربط عنصر استجابة c-AMP) في الخلايا الصباغية [26]. لتوضيح المسارات الجزيئية المسؤولة عن التأثير المضاد للميلانين لـ BHCP على خلايا B16F10 ، قمنا بفحص مستويات البروتين للجزيئات الرئيسية ، بما في ذلك CREB و MITF ، التي تلعب أدوارًا مهمة في تكوين الميلانين عن طريق تحليل لطخة ويسترن. عولجت الخلايا بـ BHCP أو حمض الكوجيك ثم تم تحفيزها بواسطة -MSH لمدة 48 ساعة. اتبعت الفترة الزمنية للقياسات المنهجية الموصوفة في الدراسات السابقة [27]. كما هو مبين في الشكل 5 ، زادت مستويات التيروزيناز و MITF مع -MSH ، لكن BHCP خفض مستويات البروتين هذه. علاوة على ذلك ، تم قمع فسفرة CREB بشكل كبير بواسطة BHCP. من المعروف أن تنظيم الفسفرة بالروتين CREB الناجم عن MSH له أهمية محتملة في تنظيم التصبغ [28]. تشير هذه النتائج إلى أن التأثيرات المضادة للميلانين لـ BHCP ناتجة عن تقليل تنظيم MITF و tyrosinase في تقليل تنظيم CREB الفسفوري. تقترح الدراسة الحالية أن توضيح آلية تثبيط BHCP على التيروزيناز وتكوين الميلانين أمر بالغ الأهمية ويجب إجراء مزيد من التحقيق في المستقبل. على الرغم من أن خط خلايا سرطان الجلد B16F10 أكثر ملاءمة بشكل عام للتحقيق في آليات الإشارة في المختبر ، فإن خط خلية B16F10 هو من سرطان الجلد القارض ، لذلك ، سيكون من الضروري إجراء مزيد من الدراسات على الخلايا الصباغية البشرية لتأكيد النتائج.

2.6. تأثير BHCP على تنشيط NF-B p-p65 المستحث بالأشعة فوق البنفسجية في خلايا Hs27

درسنا بعد ذلك تأثير BHCP على التعبير المستحث بالأشعة فوق البنفسجية للوسطاء الالتهابيين باستخدام الخلايا الليفية Hs27. تم الإبلاغ سابقًا عن أن فسفرة p65 (Ser536) ضرورية لقدرتها على التعامل مع الجينات [29]. لذلك ، تم فحص مستويات البروتين p-p65 (Ser536) و p65 في جزء النواة بواسطة النشاف الغربي. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، ب ، في خلايا Hs27 ، زادت الأشعة فوق البنفسجية من مستويات البروتين لـ p-p65 (Ser536) في النواة ، في حين أن علاج BHCP قلل من مستويات البروتين في النواة p-p65 (Ser536). في المقابل ، تم تقليل المبلغ الإجمالي لـ p65 في السيتوبلازم بواسطة الأشعة فوق البنفسجية واستعادته بواسطة BHCP (الشكل 6 ج ، د). على الرغم من انخفاض مستويات التعبير البروتيني لـ p65 في السيتوبلازم وزيادة في النواة بعد تحريض الأشعة فوق البنفسجية ، إلا أن المعالجة المسبقة باستخدام BHCP عكس هذه الاتجاهات بطريقة تعتمد على الجرعة. وبالتالي ، تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط p-p65 بواسطة BHCP قد يساهم في التأثيرات الوقائية على تصبغ الجلد وتدمير الكولاجين ضد الأشعة فوق البنفسجية.

الشكل 6. آثار BHCP على مستويات التعبير عن p-p65 (Ser536) في خلايا الأرومة الليفية البشرية Hs27 المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية.

2.7. تأثير BHCP على التعبير عن MMPs في خلايا Hs27

تلعب MMPs دورًا حيويًا في شيخوخة الجلد. الإشعاع فوق البنفسجي يغير الأنسجة الضامة للجلد عن طريق تنظيم التعبير عن MMPs [30،31]. MMP -1 هو إنزيم يحلل الكولاجين ويسرع تكسير الكولاجين المركب من النوع الأول procollagen. MMP -9 هو إنزيم متحلل للجيلاتين يعمل على تكسير ألياف الكولاجين المقطوعة بواسطة MMP -1 ، مما يزيد من إنتاج التجاعيد وفقدان المرونة. لفحص التأثير المضاد للتجاعيد لـ BHCP ضد تحريض الأشعة فوق البنفسجية ، حددنا مستويات بروتين MMP -1 و MMP -9 بواسطة النشاف الغربي. علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية مستوى مرتفعًا بشكل ملحوظ من MMP -13 ، مما يؤدي إلى تدهور الكولاجين من النوع الأول والثاني بدلاً من MMP -1 [32]. لقد درسنا زيادة MMPs (MMP1 و MMP9 و MMP12 و MMP13) بعد معالجة خلايا Hs27 المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية مع BHCP عند 1 و 10 ميكرومتر. كما هو موضح في الشكل 7 ، زادت مستويات تعبير MMP -1 و MMP -9 و MMP -12 و MMP -13 بعد تحريض الأشعة فوق البنفسجية ؛ ومع ذلك ، قللت معالجة BHCP التعبير في الجرعة - بطريقة مستقلة. تشير نتائجنا إلى أن BHCP قد يساهم في منع تكوين التجاعيد عن طريق تقليل الإنتاج غير الطبيعي لـ MMPs الناجم عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشير هذه النتائج إلى أن BHCP يثبط تعبير MMP في الخلايا الليفية Hs27 لمنع تحلل الكولاجين ، وبالتالي إنتاج التجاعيد. لذلك ، يُظهر BHCP إمكانية استخدامه كدواء وقائي وعلاجي للأمراض المرتبطة بالجلد.

فوائد cistanche الجذعية

3. المواد والطرق

3.1. الكيماويات والأجهزة

تم شراء فطر التيروزيناز (EC 1.14.18.1) ، -MSH ، L-tyrosine ، 3 ، 4- dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وحمض الكوجيك من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم شراء وسيط النسر المعدل من Dolbecco (DMEM) ومصل الأبقار الجنيني والستربتومايسين والأمفوتيريسين من شركة Gibco Life Technologies Inc. (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). الأجسام المضادة ضد MITF و CREB و p-CREB و p-p65 (Ser536) و p65 و tyrosinase و MMP -1 و MMP -9 و MMP -12 و MMP -13 و TFIIB ، و -actin تم شراؤها من Santa Cruz Biotechnology (سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على أغشية Polyvinylidene difluoride (PVDF) من شركة Millipore Corporation (بيدفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأدوات البلاستيكية المعقمة لمزارع الأنسجة من SPL Labware (سيول ، كوريا). تم توفير مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية من قبل سلسلة Crosslinker 800 (UVP ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) 6 وحدة مصباح (8 واط / مصباح). تم إجراء كروماتوغرافيا رقيقة الطبقة وهلام السيليكا 60 (شبكة 230-400) على هلام السيليكا {{27} } لوحات مطلية مسبقًا من شركة Merck Millipore (دارمشتات ، ألمانيا). تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي باستخدام أدوات Varian Unity INOVA 400 (400 ميجاهرتز لـ 1H ، و 100 ميجاهرتز لـ 13 درجة مئوية) و Varian Unity AS 500 (500 MHz for 1H). تم الإبلاغ عن قيم التحول الكيميائي (δ) بالرجوع إلى قمم المذيبات المتبقية أو القمم المبللة (δH 2.50 و C 39.51 لـ DMSO). تم الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي منخفض الدقة باستخدام مطياف الكتلة Expression CMS (Advion ، إيثاكا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية).

3.2 مقايسة تثبيط الفطر التيروزينيز

تم تحديد النشاط المثبط لتيروزيناز الفطر باستخدام ركائز L-tyrosine و L-DOPA ، بناءً على الإجراء الموصوف بواسطة Jung et al. [23]. باختصار ، تمت إضافة 190 ميكرولتر من إنزيم التيروزيناز (1000 وحدة مخففة بمخزن التيروزيناز الفطر ، بما في ذلك محلول L-tyrosine و L-DOPA) ، في وجود أو عدم وجود مركبات (تركيز نهائي يتراوح من 1 إلى 20 ميكرومتر ، مذاب في 100 بالمائة DMSO) ، لكل بئر من صفيحة بئر 96- ، لتوفير الحجم النهائي 200 ميكرولتر. تم تحضين اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم قياس نشاط التيروزيناز عن طريق قياس الامتصاصية عند 492 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (TECAN ، سالزبورغ ، النمسا) وتم الحصول على نسبة التثبيط (النسبة المئوية) من المعادلة التالية:

تثبيط النسبة المئوية=(Ac - As) / Ac × 100 (1)

حيث Ac هو الامتصاص للتحكم وامتصاص العينة. تم حساب قيم IC50 من المنحنيات اللوغاريتمية الخطية ومعادلاتها. يتم عرض متوسط ​​النتائج لثلاثة قرارات. تم استخدام حمض كوجيك كعنصر تحكم إيجابي.

3.3 التحليل الحركي لتثبيط التيروزيناز

لتحديد الآليات الحركية ، تم استخدام طريقتين حركيتين (مؤامرات Lineweaver-Burk و Dixon) بشكل متكامل [21،22،33]. بالنسبة لمخططات Lineweaver-Burk المزدوجة المتبادلة (مخطط سرعة 1 / إنزيم (1 / V) مقابل تركيز ركيزة 1 / (1 / [S])) ، تم تحديد نوع التثبيط باستخدام تركيزات مختلفة من L-tyrosine (1 ، 2 ، و 4 مم) و L-DOPA (0. 5 ، 1 ، 2 مم) كركائز في وجود تركيزات مختلفة من BHCP. كانت تركيزات BHCP كما يلي: 0 ، 0. 5 ، 1. {{2 0}} ، 2. 0 ميكرومتر لـ L-tyrosine ؛ و 0 و 2.5 و 5 و 1 0 ميكرومتر لـ L-DOPA. مخطط ديكسون هو طريقة رسومية (مخطط 1 / سرعة إنزيم (1 / V) مقابل تركيز المثبط (I)) لتحديد نوع تثبيط الإنزيم وتم استخدامه لتحديد ثابت التفكك أو Ki لمركب مثبط الإنزيم. تم الحصول على مؤامرات ديكسون (مؤامرات متبادلة مفردة) للتثبيط في وجود ركيزة L-tyrosine عند 1 و 2 و 4 مم و {{4 0}} ، 0. 5 ، 1. { {47}} و 2. 0 ميكرومتر لـ BHCP ؛ و L-DOPAsubstrate في {{5 0}. 5 ، 1. 0 ، و 2.0 ملي مولار و 0 ، 2.5 ، 5.0 ، و 10.0 ميكرومتر لـ BHCP.

مصنع cistancheهو مثبط للتيروزيناز.

3.4. خطوط الخلايا وزراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا سرطان الجلد Murine B16F10 من بنك Cell Line الكوري. تم شراء خط الخلايا الليفية للجلد البشري Hs27 من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحفاظ على هذه الخلايا في DMEM مكملًا بنسبة 10 في المائة من المصل البقري الجنيني ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 مجم / مل من الستربتومايسين في حاضنة مرطبة بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. تمت معالجة الأرومات الليفية الجلدية على طبق 100 مم باستخدام BHCP وتعرضت لـ 50 مللي جول / سم 2UV في DMEM الخالي من المصل (مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، UVP). تمت زراعة خلايا Hs27 حتى 70-80 في المائة من التقاء في صفيحة قطرها 100 مم واستخدمت بين رقم الممر 5 و 15.

3.5 فحص جدوى الخلية

تم تقييم جدوى الخلايا باستخدام مقايسة مجموعة EZ-Cytox. باختصار ، تم زرع خلايا B16F1 0 والأرومات الليفية Hs27 في لوحة بئر 96- بكثافة 1 × 104 خلية / بئر وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تغذية الخلايا DMEM الطازجة الخالية من المصل والتي تحتوي على تركيزات مختلفة (0 ، 1 ، 2 ، 5 ، و 10 ميكرومتر) من BHCP ، وحضنت لمدة 24 و 48 ساعة. بعد ذلك ، تم تحميل 10 ميكرولتر من محلول EZ-Cytox في كل بئر وحضنت الخلايا لمدة 2-4 ساعات. اعتبر قياس امتصاص الخلايا في حالة عدم وجود أي علاج على أنه بقاء الخلية بنسبة 100 في المائة. تم إجراء كل معاملة على مراحل ، وتكررت كل تجربة ثلاث مرات.

3.6 تحديد مقايسة محتويات الميلانين

استند تأثير BHCP على تكوين الميلانين المستحث بـ MSH في خلايا B16F10 على طريقة مستخدمة سابقًا مع تعديلات طفيفة [34]. باختصار ، تم السماح لخلايا B16F10 (5 × 104 خلية / بئر) في 6- لوحات جيدة بالنمو لتصل إلى 70-80 بالمائة من التقاء. تم بعد ذلك معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من BHCP (1 ، 5 ، و 10 ميكرومتر) أو حمض كوجيك (5 ملي مولار) لمدة 24 ساعة ، ثم تم تحفيزها باستخدام -MSH (5 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. بعد العلاج ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS بارد ، وتم إذابتها في 90 ميكرولتر 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم محلول بما في ذلك DMSO (5 في المائة) عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وتم قياس الامتصاصية عند 405 نانومتر مع مقياس طيف الصفيحة الدقيقة (TECAN ، سالزبورغ ، النمسا). لقياس كمية الميلانين في التجربة ، تم حساب معدل التثبيط في مجموعات العلاج من امتصاص التركيزات المعروفة للميلانين الاصطناعي ، والتي تم تصحيحها إلى الكمية الإجمالية للبروتينات الموجودة في المادة الطافية لمحللات الخلية. تم قياس امتصاص الخلايا غير المعالجة في ثلاث نسخ.

3.7 فحص نشاط التيروزيناز الخلوي

تم إجراء فحص نشاط التيروزيناز الخلوي عن طريق قياس معدل أكسدة L-DOPA [35]. تم وضع خلايا B16F1 0 بكثافة 5 × 104 / خلية في 6- أطباق جيدة واحتضانها طوال الليل. تمت معالجة الخلايا بعد ذلك بتركيزات مختلفة من BHCP (1 ، 5 ، و 10 ميكرومتر) أو حمض كوجيك (5 ملي مولار) لمدة 24 ساعة ، ثم تم تحفيزها باستخدام -MSH (5 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تم غسل الخلايا باستخدام PBS وتحلل في محلول يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول فوسفات 50 ملي مولار (درجة الحموضة 6.5) ، و 0.1 ملي ميثيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، و 1 بالمائة Triton X -100. بعد ذلك ، تم وضع الخلايا في آلة التجميد العميق (80 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة الجليد من الخلايا ، تمت تنقية المستخلصات الخلوية بالطرد المركزي عند 12 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تمت إضافة ما مجموعه 80 ميكرولتر من المادة الطافية و 20 ميكرولتر من L-DOPA (2 مجم / مل) إلى 96- لوحة بئر ، وتم قياس الامتصاصية بطول موجة 492 نانومتر كل 10 دقائق خلال ساعة واحدة عند 37 ◦ C مع قارئ لوحة ELISA (TECAN ، سالزبورغ ، النمسا).

3.8 تحضير مستخلصات خلوية ونووية لخلايا Hs27

تم غسل خلايا Hs27 باستخدام PBS المثلج وحصادها. تم استخدام مخزن مؤقت يحتوي على 1 0 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 8. 0) ، 1.5 ملي مولار MgCl2 ، 1 ملي مولار DTT ، 0.1 بالمائة NP -40 ، ومثبطات الأنزيم البروتيني لاستخراج الكسور الخلوية بواسطة الطرد المركزي عند 12 ، 000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم استخلاص الكسور النووية من الكريات باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على 10 ملي مولار تريس ، 50 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، ومثبطات البروتياز ، المحتضنة على الجليد لمدة 30 دقيقة ، ثم طرده عند 13 ، 000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على الكسور النووية.

3.9 النشاف الغربي

تم غلي عينات Lysate لمدة 0 دقيقة في المخزن المؤقت لتحميل الهلام (125 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك ، و 4 في المائة من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و 1 0 في المائة 2- مركابتوإيثانول ، و 0.2 في المائة بروموفينول أزرق ؛ الرقم الهيدروجيني 6.8) بحجم 1: 1. تم فصل معادلات البروتين الكلية لكل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-polyacrylamide (PAGE) باستخدام مواد هلامية من مادة الأكريلاميد بناءً على الإجراء الموصوف بواسطة Laemmli [36] وتم نقلها إلى أغشية PVDF عند 80 فولت لمدة ساعتين باستخدام نظام النقل الرطب. تم وضع الأغشية على الفور في محلول مانع للحظر (5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم) في 10 ملي مولار من Tris ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1 في المائة توين -20. تم حظر البقع لمنع الارتباط غير المحدد عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وبعد ذلك تم تحضين الأغشية بجسم مضاد أولي محدد عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، تليها الحضانة بجسم مضاد ثانوي مترافق ببيروكسيداز الفجل عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. . تم اكتشاف وضع العلامات على الجسم المضاد عن طريق التلألؤ الكيميائي المحسن وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء تقدير كمية البروتين باستخدام Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS -400 SM (Core Bio ، Seoul ، Korea). تم استخدام واسمات البروتين المعتمد لتحديد الوزن الجزيئي.

3.10. تحليل احصائي

يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​± SEM تم تحليل البيانات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) للاختلافات بين العلاجات متبوعة باختبار Bonferroni اللاحق. تم اعتبار القيمة p <0. 05="" ذات="" دلالة="">

4 - نتائج

باختصار ، أظهرت نتائج الدراسة الحالية أن BHCP له تأثير تبييض الجلد من خلال تثبيط التيروزيناز ، وهو إنزيم رئيسي لتخليق الميلانين الحيوي في B16F10 melanocytes المستحثة بـ MSH. علاوة على ذلك ، قلل BHCP من التعبير عن مستويات بروتين MMP في الخلايا الليفية التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية ، والتي من المتوقع أن يكون لها تأثير مضاد للتجاعيد. مطلوب مزيد من البحث لتأكيد آثار التبييض والمضادة للتجاعيد لـ BHCP من خلال الدراسات على الحيوانات والدراسات السريرية. أخيرًا ، تم تحديد أن BHCP لها تأثيرات تبييض ومضادة للتجاعيد ، مما يشير إلى قدرتها على تطوير عوامل علاجية للأمراض المرتبطة بفرط التصبغ والتجاعيد.

ما هو الكفالة

لمزيد من المعلومات، يرجى الضغط هنا.