تجميع De Novo Transcriptome واكتشاف الجينات لساق Cistanche Deserticola اللحمية-Ⅱ

التصنيف الوظيفي لجميع النصوص المعبر عنها بناءً على قواعد بيانات الجينات وقواعد بيانات KEGG

تم الحصول على التعليق التوضيحي لـ Gene Ontology (GO) من ملف ارتباط الهويات والتعليقات التوضيحية لـ UniProt. في المجموع، تم تخصيص 20907 نسخة، وهو ما يمثل 32.69٪ من إجمالي التسلسلات المعبر عنها، إلى 1745 مصطلحًا وظيفيًا. من إجمالي مصطلحات GO الوظيفية، شكلت تخصيصات العملية البيولوجية الأغلبية (1116، 63.95٪) يليها المكون الخلوي (329، 18.85٪) والوظيفة الجزيئية (300، 17.20٪). غطت الوظائف المخصصة للنصوص المعبر عنها نطاقًا واسعًا من فئات GO، وتم إدراج أفضل 10 مصطلحات GO مع النصوص الأكثر شرحًا في الجدول 3. نحن نقدم جميع توزيع النصوص المعبر عنها في ثلاث فئات لعلم الجينات (الوظيفة الجزيئية، والمكون الخلوي، و العملية البيولوجية) في الملف التكميلي (S3 Dataset). تم تمثيل مصطلحات GO المتعلقة بوظائف الربط ونشاط الترانسفيراز في الغالب في فئة الوظيفة الجزيئية. فيما يتعلق بوظائف الربط، يمثل الارتباط الكاتيوني (4394 نسخة) الأكثر وفرة، يليه الارتباط النيوكليوتيد/النيوكليوزيد (3404 نسخة في المتوسط) وربط البروتين (2422 نسخة). بينما في مجموعة نشاط ترانسفيراز، فإن معظمهم هم أولئك الذين لديهم مجموعات ناقلة تحتوي على الفوسفور (2256 نسخة، 65.77٪). من بين فئة المكونات الخلوية، كانت النصوص موجودة داخل الخلايا بشكل أكبر (10,581 نسخة في المتوسط)، بينما من بين فئة العمليات البيولوجية، كانت النصوص أكثر مشاركة في عملية التمثيل الغذائي للبوليمر الحيوي (6,683 نسخة في المتوسط)، يليها تنظيم العملية الخلوية (4,841 نسخة). ) والتعبير الجيني (4678 نسخة) والنقل (3512 نسخة).

سيستانش توبولوسا الطبيعي للوقاية من مرض الزهايمر PHGS75% ECH 30% ACT 12%

لاستخراج الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للجنين وPhG، تم البحث في 21358 تسلسلًا بروتينيًا محتملًا غير زائد عن الحاجة مقابل تسلسلات جينية لـ 13 كائنًا نباتيًا في قاعدة بيانات KEGG، وتم تخصيصها لـ 275 مسارًا لـ KEGG مع 5 زيارات على الأقل. يتم سرد المسارات العشرة الأولى ذات التسلسلات الأكثر محاذاة في الجدول 4. وقد شاركت معظم المسارات في عمليات التمثيل الغذائي الأولية، مثل استقلاب الأحماض الأمينية أو البروتين (ko01230، ko04141، وko04120)، استقلاب الكربوهيدرات (ko01200 وko00500)، والنيوكليوتيدات أو استقلاب النيوكليوزيد (ko03018، ko00230، وko00240). علاوة على ذلك، هناك 27 مسارًا ثانويًا مرتبطًا بعملية التمثيل الغذائي (الشكل 2)، مثل التخليق الحيوي للعمود الفقري للتربينويد، والتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد، والتخليق الحيوي للكاروتينويد، والتخليق الحيوي لقلويد الإيزوكينولين، والتروبان، والبيبريدين والبيريدين الحيوي. توفر هذه النتائج مؤشرًا إضافيًا على أن عمليات التمثيل الغذائي النشطة كانت جارية في الجسمج. ديزيرتيكولاالأنسجة الجذعية. تم إدراج جميع النصوص المعبر عنها المرتبطة بمسارات KEGG في الملف التكميلي (S4 Dataset). على الرغم من وجود بعض المسارات المتغيرة بشكل ملحوظ بين C. deserticola والنباتات الأخرى، مثل الأرز (مجموعة بيانات S5)، فإن هدفنا الرئيسي في هذه الدراسة هو الكشف عن ملف النسخ الكامل لجذع C. deserticola وتصوير المسارات ذات الصلة للتخليق الحيوي لـ PhGs والتي يمكن أن تكون مفيدة لتوجيه الزراعة.

الجينات المرشحة التي تشفر الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي لللجنين

اللجنين هو ثاني أكثر البوليمرات الأرضية الطبيعية وفرة في المملكة النباتية، حيث يشكل ما يصل إلى ثلث المادة الموجودة في جدران الخلايا النباتية. باعتباره عنصرًا مهمًا في جدران الخلايا، يساعد اللجنين في نقل المياه، ويوفر الدعم الميكانيكي والسلامة الهيكلية، ويدافع ضد مسببات الأمراض والحيوانات العاشبة. تعتبر أدوار اللجنين هذه ذات قيمة كبيرة في دعم النمو الانتصابي تحت الأرض لـ C. deserticola في الصحراء. في هذه الدراسة، قدمنا ​​الصورة الكاملة لمسارات تخليق اللجنين الحيوي في C. deserticola (الشكل 3)، حيث يتم تصنيع مونومرات اللجنين حيويًا من الفينيل ألانين من خلال سلسلة من التفاعلات الأنزيمية، بما في ذلك عملية الهيدروكسيل، والميثيل، والاختزال، والبلمرة التأكسدية. تم الكشف عن الإنزيمات المرتبطة بالتخليق الحيوي للجنين في ثلاثة أشكال تم تصنيعها بشكل رئيسي في الأنسجة الوعائية (p-hydroxyl-phenyl (H)، وguaiacyl (G) وsyringyl (S) lignin) و5- hydroxyl-guaiacyl lignin الذي تم تحديده فقط في COMT (حمض الكافيين 3- O- ميثيل ترانسفيراز، EC 2.1.1.68) التي تعاني من نقص (مثل النباتات المهجورة).

فينيل ألانين أمونيا لياز (PAL، EC 4.3.1.24) هو الإنزيم الرئيسي الأول في مسار التخليق الحيوي للجنين (الشكل 3) والذي يحول فينيل ألانين إلى حمض سيناميك عن طريق تمييع غير مؤكسد. تم تسلسل ما مجموعه 6297 قراءة PAL وتم تجميع 7 نسخ PAL في C. deserticola (الجدول 5). من خلال مقارنة أوجه التشابه في التسلسل، وجدنا أن 4 منها (comp28550_c1_seq1/2/3/5) لديها تشابه أكثر من 95% مع تسلسل mRNA المعروف لـ C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|)، بينما كان لدى comp28550_c1_seq4 وcomp25940_c0_seq1 أوجه تشابه بنسبة 77% و82% على التوالي. كشف تنبؤ ORF أن 5 نصوص تحتوي على إمكانات تشفير البروتينات ويتم حملها باستخدام مجال لياز الأحماض الأمينية العطرية (PF00221.14). من بينها، فقط نسخة comp28550_c1_seq4 يمكنها تشفير تسلسل بروتين كامل مكون من 718 بقايا من الأحماض الأمينية. تم الإبلاغ عن أن PAL تم ترميزه بواسطة عائلة صغيرة متعددة الجينات في معظم الأنواع النباتية، مثل 4 في Arabidopsis thaliana، و5 في Populus trichocarpa، و3 في Scutellaria baicalensis، و7 Cucumis sativus، وما إلى ذلك. يشير تحليلنا التطوري إلى وجود 4 أنواع جينات ترميز PAL في C.

deserticola وقمنا بتسميتها CdPAL1 وCdPAL2 وCdPAL3 وCdPAL4 على التوالي (الشكل S2). 4- إنزيم الكوماريت-CoA (4CL، EC 6.2.1.12) وترانس سينامات 4-أحادي الأكسجين (CYP73A، EC 1.14.13.11) هما إنزيمان مسؤولان عن تحويل حمض السيناميك إلى ديكومارول-CoA في اتجاهين عكسيين. طلبات. هم أيضًا في العمود الفقري، وقيم تعبيرهم FPKM هي 39.57 و51.93، على التوالي.

تم تصنيع الأنواع الأربعة من اللجنين بيولوجيًا بواسطة مسارات مختلفة تم التحكم فيها بواسطة ثلاثة إنزيمات رئيسية، إنزيم Cinnamoyl-CoA reductase (CCR، EC 1.2.1.44)، وshikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT، EC 2.3.1.133)، والفيريوليت {{1{ {56}}}}هيدروكسيلاز (F5H, EC 1.14.-.-). تم الإبلاغ عن CCR كنقطة تحكم في مسار اللجنين [50، 51] الذي حفز X-CoA (X بما في ذلك الديكومارول، والكافيويل، والفيرولويل، 5- هيدروكسيل-فيرولويل، وسينابويل) إلى Y- ألدهيد (Y بما في ذلك p -cougar، caffeoyl، coniferyl، 5-hydroxyl-coniferyl، and snap)، بينما حفز HCT p-coumaroyl-CoA إلى p-coumaroyl shikimic acid / p-coumaroyl quinic acid. يقوم الإنزيمان، تمامًا مثل المفتاح، بتنظيم عملية التخليق الحيوي لـ P-hydroxyl-phenyl lignins أو الأنواع الثلاثة الأخرى من اللجنين. كان F5H عبارة عن مفتاح فرعي آخر ينظم syringyl lignin و5-hydroxyl-guaiacyl lignin. إنزيمات مهمة أخرى بما في ذلك حمض الكافيك 3-O-ميثيل ترانسفيراز (COMT، EC 2.1.1.68)، وكافيويل-CoA O-ميثيل ترانسفيراز (CCoAOMT، EC 2.1.1.104)، ونازعة هيدروجين السيناميل-الكحول (CAD، EC 1.1.1.195). ) تم الكشف عنها أيضًا. يتم سرد معلومات التعبير التفصيلية في الجدول 6. وستوفر جينات الإنزيم المحددة في هذه الدراسة مورداً قيماً للدراسات الجينومية الوظيفية في هذا النبات الطبي المهم. تم اختيار 10 جينات مرتبطة بمسار التخليق الحيوي للجنين في الجدول 6 للتحقق من RT-qPCR لتأكيد نتائج RNAseq (الشكل 4)، وتشير ارتباطاتها العالية (معامل ارتباط بيرسون: 0.90343) إلى دقة عالية وإمكانية تكرار نتائج تحليل النسخ لدينا. تسرد مجموعة بيانات S1 التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذا التحليل.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

الجينات المرشحة التي تشفر الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للـ PhGs

من المعروف أن جليكوسيدات الفينيليثانويد (PhGs) هي المكونات النشطة الأساسية في C. deserticola مع أنشطة تحسين القدرة الجنسية، ومسح الجذور الحرة، ومكافحة الشيخوخة. ثلاثة مكونات كيميائية لـ PhGs هي الحمض العضوي، والسكاريد، وفينيل إيثانول أجليكون (الشكل 3). الأحماض العضوية بما في ذلك حمض الكافيين وحمض الفيروليك وحمض الكوماليك هي منتجات مسار التخليق الحيوي للفينيل بروبانويد. مكونات السكاريد بما في ذلك الجلوكوز والرامنوز هي نتاج مسارات استقلاب الكربوهيدرات، مثل استقلاب النشا والسكروز، والسكر الأميني واستقلاب سكر النوكليوتيدات، واستقلاب الفركتوز والمانوز، وما إلى ذلك. ومع ذلك، فإن مسار التخليق الحيوي لجزء الفينيل إيثانول ليس واضحًا بعد. هنا، اقترحنا مسارين محتملين للتخليق الحيوي للفينيل إيثانول بناءً على بيانات التسلسل الخاصة بنا. أحدهما هو مسار حمض الكافيك أو حمض الفيروليك، المعروف أيضًا باسم مسار حمض السيناميك والذي يشبه المسار الأساسي للتخليق الحيوي لللجنين. يعتمد آخر على مسار استقلاب الفينيل ألانين (الشكل 3)، حيث يتم تحويل الفينيل ألانين إلى فينيل إيثانول من خلال "مسار إنرليش" المعروف الذي تم العثور عليه لأول مرة في الخميرة منذ قرن من الزمان وتم التحقق من صحته في زهور البطونية والطماطم والورد. تم اكتشاف أربعة جينات إنزيمية تشفر ناقلة أمين الأسبارتات/تيروزين، ناقلة أمين فوسفات الهيستيدين، وأكسيداز الأمين الأولي المسؤولة عن تحويل فينيل ألانين إلى فينيل إيثانول، معبرًا عنها في جذع C. deserticola. يمكن أكسدة منتج فينيل إيثانول بشكل إضافي بواسطة إنزيم أحادي الأكسجين أو ميثيله بواسطة ميثيل ترانسفيراز إلى مشتقاته (فينيل إيثانول أجليكون) التي تشارك في التخليق الحيوي لـ PhG. باختصار، تم اقتراح مسارين مفترضين للتخليق الحيوي لفينيل إيثانول أجليكونج. ديزيرتيكولاولكن لا تزال بحاجة إلى مزيد من الدراسة في مزيد.

المناقشات

في السنوات الأخيرة، تطور علم جينوم النبات بسرعة مع تطبيق تكنولوجيا التسلسل من الجيل التالي، في حين ركزت القليل من الأبحاث على جينوم النباتات الطبية الصحراوية. من الضروري بشكل عاجل إجراء أبحاث جينومية أو ترانسكريبتومية لفهم مدى تكيفها مع بيئات الجفاف والملوحة ومسار التخليق الحيوي للمكونات النشطة بيولوجيًا الرئيسية. اكتشاف دي نوفو ترانسكريبتوم لبعض النباتات الطبية،

مثل Panax ginseng، وGinkgo biloba، وGlycyrrhiza uralensis تم استغلالها لأول مرة باستخدام منصة Roche 454 لطول قراءتها الطويل. نظرًا لقدرة التجميع الفعالة مع القراءات القصيرة، وخاصة القراءات المزدوجة المميزة، فقد تم أيضًا استخدام تسلسل وتجميع النسخ المستند إلى Illumina على نطاق واسع للكائنات الحية النموذجية وغير النموذجية. في هذه الدراسة، قمنا بتوليد حوالي 8G من 101 نقطة أساس من القراءات المزدوجة وأنتجنا تسلسلات unigene أطول بمتوسط ​​طول 725 نقطة أساس. يمكن أن توفر بيانات النسخ الخاصة بالجذع على نطاق واسع بيانات مرجعية مفيدة ويمكن استخدامها لاستخراج عملية التمثيل الغذائي الثانوي للمكونات النشطة بيولوجيًا لـ C. deserticola. هناك 81.62% من إجمالي القراءات الأولية مرت بمرشحات جودة صارمة (بما في ذلك تشذيب المحول وتجاهل القراءات منخفضة الجودة) قبل التجميع، مما يشير إلى الجودة العالية لبيانات التسلسل لدينا، و82.08% من القراءات عالية الجودة كانت مفيدة للتجميع. قد تأتي القراءات الأخرى التي فشل استخدامها للتجميع من أخطاء التسلسل ومعلمات التجميع وما إلى ذلك. ظلت تلك القراءات عالية الجودة غير المستخدمة مفيدة في تحسين التجميع الجديد جنبًا إلى جنب مع القراءات الأطول من منصة أخرى (مثل Roche 454) في المستقبل.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

أظهر عدد كبير من النصوص المجمعة (30,098) أوجه تشابه عالية التسلسل مع الجينات المعروفة في قواعد البيانات العامة، مما يشير إلى أن بياناتنا المزدوجة المستندة إلى Illumina غطت جزءًا كبيرًا من نسخ C. deserticola. قد تكون النصوص التي لا تحتوي على نتائج BLAST ناجمة عن مناطق غير مترجمة تبلغ 3 أو 5 بوصات، أو RNA غير مشفر، أو تسلسلات جينية جديدة لـ C. deserticola. تم شرح النصوص المعبر عنها لمجموعة واسعة من فئات GO ومسارات KEGG (الجدولان 3 و4)، حيث تم تخصيص العديد من النصوص للمسارات الثانوية المتعلقة بعملية التمثيل الغذائي. كما نعلم، يمكن للفينيل بروبانويد أن يعمل كمركب مضاد للميكروبات محفز ومفيد جدًا لنمط الحياة تحت الأرض [1]، ويعمل أيضًا كجزيء إشارة في تفاعلات الميكروبات النباتية إلى جانب فائدته الطبية [68، 69]. يستخدم تيربينويد في التخليق الحيوي للمكونات النشطة بيولوجيًا (مثل 6- ديوكسي كاتالبول) [70]. لقد وجدنا أن الجينات المشاركة في مسار التخليق الحيوي للعمود الفقري للفينيل بروبانويد والتيربينويد كانت وفيرة للغاية في C. deserticola. والأهم من ذلك، أن اكتشاف مسارات جيدة التمثيل لتخليق اللجنين الحيوي (الشكل 3) أشار إلى عملية التمثيل الغذائي النشطة للجنين في جذع C. deserticola. تم الكشف عن جميع جينات الإنزيمات المعروفة المشاركة في التخليق الحيوي لللجنين (الشكل 3)، وكان لأربعة إنزيمات رئيسية بما في ذلك PAL وCCR وHCT وF5H وفرة تعبير أقل (FPKM 26.47، 3.89، 3.4، و3.83، على التوالي) مقارنة مع جينات الإنزيم الأخرى (الجدول 6). ما إذا كان تغيير التعبير عن تلك الجينات الثلاثة يمكن أن يؤثر على إنتاج اللجنين في C. deserticola أم لا، يستحق المزيد من الدراسة. PAL هو إنزيم رئيسي في التخليق الحيوي للجنين ويشارك أيضًا في التخليق الحيوي للفينيل بروبانويد والريسفيراترول والفلافونويد والكومارين [71-74]. اكتشفنا أربعة جينات PAL متميزة في جينوم C. deserticola (الشكل S2) والذي تزامن مع تشفير PAL بواسطة عائلة صغيرة متعددة الجينات [39، 43، 45–49] وأثبتنا أيضًا أنه قد يلعب أدوارًا مهمة في تدفق الكربون الأيضي .

PhG هو العنصر النشط الأساسي في C. deserticola. الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للفينيل إيثانول مهمة لجودة C. deserticola. استنتجنا مسارين مختلفين للتخليق الحيوي لإيثانول فينيل و17 جينًا إنزيمًا مشاركًا في التخليق الحيوي لـ PhG في جذع C. deserticola. تم أيضًا استنتاج العمليات المحتملة لما بعد حمض الكافيين/الفيروليك (الشكل 3) لأول مرة بناءً على الصيغة الهيكلية للوسائط والخصائص الحفزية للإنزيمات المقابلة، حيث يتم أكسدة حمض الكافيين/الفيروليك أولاً إلى مشتق فينيل بيروفات؛ ثم تم حرمان مجموعة الكربوكسيل بواسطة نزع الكربوكسيل. وأخيرا، تم تحويل مجموعة الألدهيد مرة أخرى إلى مجموعة كحول بواسطة ديهيدروجينيز. هذا هو التطبيق الأول لتقنية التسلسل المزدوج النهاية من Illumina للتحقيق في النسخة الكاملة لـ C. deserticola ولتجميع قراءات RNA-seq بدون جينوم مرجعي. ستوفر هذه الدراسة موارد مفيدة وتسلسلات جينية لأبحاث الجينوم الوظيفي والبروتينات على C. deserticola في المستقبل.

الاستنتاجات

في هذه الدراسة، قمنا بتوصيف نسخة جذع C. deserticola استنادًا إلى بيانات تسلسل عالية الإنتاجية، وحددنا الجينات المشاركة في مسارات التخليق الحيوي لللجنين، واستنتجنا أيضًا مسار التخليق الحيوي المحتمل لـ PhGs لأول مرة، مما سيسرع بالتأكيد فهم للعمليات الفسيولوجية الغامضة والقيمة الطبية الكبيرة على المستوى الجزيئي. حتى الآن، هذه هي المحاولة الأولى لتجميع النسخة الكاملة من جذع C. deserticola واكتشاف مسار التخليق الحيوي للمكونات الطبية باستخدام مجموعات بيانات التسلسل المستندة إلى Illumina. قد تعزز دراستنا تطوير الأدوية الطبيعية واختيار الأصناف ذات السمات الطبية.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%