يتسبب اقتران Dendrimer-tesaglitazar في حدوث تحول في النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة ويعزز البلعمة الأميلويد† الجزء 1

يعد تحويل الخلايا الدبقية الصغيرة من حالة "مؤيدة للالتهابات" تؤدي إلى تفاقم المرض إلى النمط الظاهري "المضاد للالتهابات" المحمي للأعصاب استراتيجية واعدة لمعالجة أمراض التنكس العصبي المتعددة.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي نوع من الخلايا الموجودة في الجهاز العصبي المركزي وهي المسؤولة بشكل أساسي عن الحفاظ على صحة الخلايا العصبية ووظيفتها. يمكنهم إفراز مجموعة متنوعة من عوامل النمو وعوامل التغذية العصبية ويمكنهم الحفاظ على النشاط الأيضي الطبيعي للخلايا العصبية عن طريق إزالة النفايات حول الخلايا العصبية. أظهرت الدراسات التي أجريت في السنوات الأخيرة أن الخلايا الدبقية الصغيرة ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالذاكرة. دعونا نلقي نظرة على ذلك معا.

أولاً، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز الخلايا العصبية وتعزيز تنشيط الخلايا العصبية، وبالتالي تعزيز الذاكرة. من خلال إطلاق سلسلة من الناقلات العصبية، مثل الغلوتامات والألانين، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تعزيز نقل الإشارات بين الخلايا العصبية ويمكن أن تعزز رنين إشارة الخلايا العصبية الدبقية بين الأغشية قبل المشبكي، مما يزيد من تعزيز استثارة الخلايا العصبية وتكوين الذاكرة.

ثانيًا، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة أيضًا إزالة النفايات حول الخلايا العصبية، والحفاظ على النشاط الأيضي الطبيعي للخلايا العصبية، وتقليل معدل وفيات الخلايا العصبية، وبالتالي تعزيز تحسين الذاكرة. عندما تتراكم الكثير من النفايات حول الخلايا العصبية، فإنها ستؤثر على النشاط الأيضي الطبيعي للخلايا العصبية، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وضعف وظيفتها، وبالتالي تقليل أداء الذاكرة. يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة الحفاظ على البيئة الأيضية الطبيعية للخلايا العصبية وتقليل معدل موت الخلايا العصبية عن طريق ابتلاع النفايات المحيطة وتحللها، وبالتالي تحسين الذاكرة.

باختصار، ترتبط الخلايا الدبقية الصغيرة ارتباطًا وثيقًا بالذاكرة. ومن خلال تعزيز إثارة الخلايا العصبية وإزالة النفايات المحيطة، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تحسين الذاكرة بشكل أكبر والحفاظ على صحة أدمغتنا ونشاطها. يجب أن نهتم بحماية صحة الخلايا الدبقية الصغيرة لتحقيق ذاكرة أفضل. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche هي مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية Cistanche من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك حمض التانيك، والسكريات، وجليكوسيدات الفلافونويد، وما إلى ذلك. ويمكن لهذه المكونات تعزيز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق تعرف على 10 طرق لتحسين الذاكرة

تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة المسببة للالتهابات في تطور المرض عن طريق إطلاق مواد سمية عصبية وتسريع تراكم البروتين المسببة للأمراض. لقد ثبت أن منبهات PPAR وPPAR تعمل على تحويل الخلايا الدبقية الصغيرة من النمط المسبب للالتهابات ('M1-like') إلى النمط الظاهري المنشط بشكل بديل ('M2-like'). وقد تم استكشاف مثل هذه الاستراتيجيات في التجارب السريرية للأمراض العصبية، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ولكن من المحتمل أنها فشلت بسبب ضعف اختراق حاجز الدم في الدماغ (BBB).

لقد ثبت أن ديندريمرات البولي أميدو أمين المنتهية بالهيدروكسيل (بدون ربط أي بروابط مستهدفة) تعبر BBB المعيب في موقع الالتهاب العصبي وتتراكم في الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة.

ولذلك، فإن اقتران dendrimer لـ PPAR / ناهض مزدوج قد يمكّن من تبديل النمط الظاهري المستهدف للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة. نقدم هنا توليف وتوصيف المترافق الجديد dendrimer-PPAR / الناهض المزدوج (D-tesaglitazar).

في المختبر، يؤدي D-tesaglitazar إلى تحول النمط الظاهري "M1 إلى M2"، ويقلل إفراز أنواع الأكسجين التفاعلية، ويزيد من التعبير عن جينات البلعمة والتحلل الأنزيمي للبروتينات المسببة للأمراض (على سبيل المثال - الأميلويد، - السينوكلين)، ويزيد من البلعمة الأميلويد.

تدعم هذه النتائج مواصلة تطوير D-tesaglitazar نحو الترجمة للأمراض التنكسية العصبية المتعددة، وخاصة مرض الزهايمر ومرض باركنسون.

مقدمة

في الولايات المتحدة وحدها، يوجد حاليًا أكثر من 5.3 مليون شخص مصاب بمرض الزهايمر (AD) ومليون شخص مصاب بمرض باركنسون (PD). نظرًا لأن زيادة العمر هو أكبر عامل خطر للعديد من الأمراض التنكسية العصبية، فإن معدل انتشار هذه الأمراض وتكلفة علاجها سوف تستمر في الزيادة مع استمرار نمو السكان في السن.

علاوة على ذلك، فإن عدم النجاح مؤخرًا في تطوير أدوية جديدة لعلاج هذه الأمراض قد سلط الضوء على الحاجة إلى تطوير علاجات مبتكرة.2،3 وتسلط هذه الإخفاقات السريرية الضوء على الصعوبات في تطوير دواء، بما في ذلك إيصال تركيز عالٍ بما فيه الكفاية من الدواء إلى الدماغ لتحقيق الفعالية دون الحاجة إلى علاج. التسبب في آثار جانبية ضارة.

تشترك الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر وداء باركنسون في ثلاثة مكونات مرضية عصبية رئيسية: الالتهاب العصبي، وتراكم البروتين الممرض، وموت الخلايا العصبية. في الأشخاص الأصحاء، تقوم الخلية المناعية الفطرية في الدماغ (الدبقية الدبقية) ببلعمة البروتينات غير المطوية باستمرار (على سبيل المثال - الأميلويد، - السينوكلين). ) التي تسبب موت الخلايا العصبية أثناء إنتاجها، مما يمنع التجمعات المميزة من التشكل.

ومع ذلك، في الأشخاص الذين يصابون في نهاية المطاف بأمراض التنكس العصبي، لم تعد الخلايا الدبقية الصغيرة تزيل هذه البروتينات بشكل فعال وتتحول إلى النمط الظاهري المسبب للالتهابات والذي يؤدي إلى تفاقم المرض (يُعرف عادةً باسم M1).

في حين أن تصنيف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة المؤيد للالتهابات/المضاد للالتهابات (M1/M2) هو في الغالب تبسيط مفرط لطيف استقطاب البلاعم، إلا أنه لا يزال يستخدم كتسمية واسعة لوصف النمط الظاهري السائد للخلايا الدبقية الصغيرة في التهاب الأعصاب والاستجابة للعلاج.

M1-تطلق الخلايا الدبقية الصغيرة مثل الخلايا الدبقية الصغيرة أنواع الأكسجين التفاعلية والوسائط الالتهابية الأخرى التي تؤدي إلى موت الخلايا العصبية وتفاقم أمراض المرض عن طريق زيادة إنتاج البروتينات المسببة للأمراض (مثل الأميلويد والسينوكلين).

علاوة على ذلك، يتم التعبير عن عوامل الخطر الجينية الرئيسية لتطور مرض الزهايمر (TREM2 وAPOE) بمستويات عالية في الخلايا الدبقية الصغيرة، وقد ثبت أن مسار TREM2/APOE يسبب تحولًا في النمط الظاهري غير الدبقي في مرض الزهايمر، والتصلب الجانبي الضموري (ALS)، والتصلب المتعدد. النماذج الحيوانية.8

توضح هذه النتائج أيضًا دور الخلايا الدبقية الصغيرة في أمراض التنكس العصبي البشري المتعددة. إن اتباع نهج لمعالجة النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة من شأنه أن يمكّن الباحثين من فهم دورها في الأمراض التنكسية العصبية، بالإضافة إلى كونها علاجًا فعالاً.

تم اقتراح تحويل الخلايا الدبقية الصغيرة من النمط M1 إلى النمط الظاهري المضاد للالتهابات والواقي للأعصاب (M2) كإستراتيجية علاجية لعلاج أمراض التنكس العصبي المتعددة. وقد ثبت أن اثنين من منبهات PPAR المعتمدة حاليًا من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، وهما أدوية السكري من النوع الثاني روزيجليتازون وبيوجليتازون، يحفزان تحول النمط الظاهري من M1 إلى M2 في الخلايا البلعمية والدبقية الصغيرة في المختبر وفي الجسم الحي.

لقد تم عرض 9،10 منبهات PPAR لتقليل الإفراز الناجم عن LPS لأنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق تقليل نشاط NF-byB عن طريق تحفيز NF-κBdegradation والتصدير من النواة، بالإضافة إلى القمع المعتمد على الليجند.11

علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات الوبائية أن مرضى السكري الذين يتناولون روزيجليتازون أو بيوجليتازون هم أقل عرضة للإصابة بمرض الزهايمر ومرض باركنسون. وفي وقت لاحق، تم فحص روزيجليتازون وبيوجليتازون من خلال المرحلة الثالثة من التجارب السريرية لمرض الزهايمر، لكنها فشلت.

أحد التفسيرات المحتملة لفشل التجارب السريرية المذكورة أعلاه هو سوء نقل هذه الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB)، مما يحد من عدد الأدوية التي تصل إلى أدمغة المرضى المسجلين في هذه التجارب السريرية.

في الواقع، تشير التقديرات إلى أن BBB يمنع حوالي 98% من جميع الأدوية الجزيئية الصغيرة من الوصول إلى الدماغ، ولا يصل إلا جزء صغير من الدواء الذي يدخل الدماغ إلى الخلايا الدبقية الصغيرة.

بالإضافة إلى ذلك، فإن PPAR هو مستقبل نووي آخر في عائلة PPAR.16 وهو يُظهر دورًا في توازن الدهون وتنظيم الالتهاب، وقد ثبت أيضًا أن منبهات PPAR تظهر تأثيرات مضادة للالتهابات في الخلايا الدبقية الصغيرة.

قدمت الدراسات السريرية باستخدام التصوير العصبي، وتحليل الأنسجة بعد الوفاة، والمؤشرات الحيوية CSF أدلة على أن BBB ضعيف في AD وPD، بالإضافة إلى أمراض التنكس العصبي الأخرى.

لقد ثبت أن 17 جيلًا من بولي أميدو أمين منتهية بالهيدروكسيل (G4- PAMAM-OH) تتخطى بشكل جوهري BBB الضعيف وتتراكم في الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة دون الحاجة إلى استهداف الروابط، بعد الإدارة الجهازية في نماذج متعددة مختلفة من أمراض الالتهاب العصبي. ، بما في ذلك القوارض والأرانب والكلاب والرئيسيات غير البشرية. 18-28 بشكل ملحوظ، يمكن إدارة G4- PAMAM-OH بشكل منهجي وعبور BBB في نماذج المرض مع اضطراب BBB خفيف مثل متلازمة ريت.29

بالإضافة إلى ذلك، يتناسب مدى امتصاص G4-PAMAM-OH في الدماغ بشكل مباشر مع شدة المرض في نموذج أرنب مصاب بالشلل الدماغي.30 تتمتع التشعبات المنتهية بالهيدروكسيل بميزة تسليمها بطريقة غير جراحية مقارنةً بالتوصيل الموضعي شديد التوغل من خلال كانت الجمجمة مطلوبة في الدراسات السابقة مع الجسيمات النانوية الأخرى مثل poly-εcaprolactone وPEG، وdendrimers PAMAM سالبة الشحنة، والنقاط الكمومية، والتركيبات النانوية المكونة من البولي إيثيلين أمين (PEI) وكبريتات ديكستران.

بالإضافة إلى ذلك، فإن ديندريمرات الهيدروكسيل PAMAM هذه في وضع مثالي للترجمة نظرًا لقابليتها للتوسع وتحملها جيدًا في ملف تعريف السلامة في الجسم الحي.36–38 نظرًا لبيانات الفعالية الإيجابية قبل السريرية، a (G4-PAMAM-OH)-N- يتم حاليًا تقييم مقترن الأسيتيل سيستين في التجارب السريرية المبكرة لعلاج الحثل الكظري الدماغي لدى الأطفال (NCT03500627) والالتهاب المرتبط بمرض فيروس كورونا الحاد 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

قمنا بدراسة مترافق دواء dendrimer من tesaglitazar(Tesa) المرتبط بجيل -4 PAMAMdendrimer المنتهي بالهيدروكسيل. Tesaglitazar هو منبه قوي لـ PPAR/مزدوج يجمع بين التأثيرات المفيدة لمنبهات PPAR وPPAR. يحتوي على مجموعة وظيفية من حمض الكربوكسيل للارتباط التساهمي مع التغصنات وللإطلاق اللاحق.

تم تطوير القيثارات الإضافية واختبارها سريريًا، ولكن تم اختيار تيسا نظرًا لنسبة نشاط PPAR الأكبر إلى PPAR، والبنية الكيميائية البسيطة نسبيًا، وملف تعريف السلامة.

لقد وصل تيسا سابقًا إلى المرحلة الثالثة من التجارب السريرية لمرض السكري من النوع 2 في الولايات المتحدة الأمريكية ولكنه فشل بسبب السمية المعتمدة على الجرعة، والتي يمكن الوقاية منها عن طريق تقليل الجرعة اللازمة من الإعطاء عن طريق توصيل التغصنات الخاضعة للرقابة.39،40،44 نظرًا لأن تيسا هو دواء PPAR / الناهض المزدوج، يمكن أن يكون توصيله المستهدف إلى الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في موقع الالتهاب العصبي مفيدًا للغاية.

هنا، نعرض تخليق وتوصيف مترافق dendrimer-tesaglitazar (D-Tesa) وإظهار قدرة هذا المركب على إحداث تحول في النمط الظاهري "M1 إلى M2" في الخلايا الدبقية الصغيرة وتعزيز البلعمة للأميلويد المسمى بالفلورسنت.

المواد والأساليب

مواد

1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-إيثيل كاربوديميد ميثيوديد (EDC)، 4 (ثنائي ميثيل أمينو) بيريدين (DMAP)، CuSO4 · 5H2O، أسكوربات الصوديوم، حمض الهيكسينويك وألبومين المصل البقري (BSA) تم شراؤها من Sigma Aldrich US واستخدامها كما تم استلامها (St Louis، MO).

تم الحصول على Tesaglitazar من شركة AstaTech Inc. (بريستول، بنسلفانيا). تم استلام dendrimer PAMAM من إيثيلينديامين (الجيل 4 مع 64 مجموعة هيدروكسيل نهائية) من شركة Dendritech Inc. (Midland، MI) كحل في الميثانول.

تم تخزين التغصن في الميثانول عند درجة حرارة 4 وتم تبخير الميثانول قبل الاستخدام. تم شراء غشاء غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي (MWCO) بمقدار 1 كيلو دالتون من شركة Spectrum Laboratories Inc. (نيو برونزويك، نيوجيرسي).

تم استخدام جميع المذيبات الأخرى كما وردت في أشكالها اللامائية. جميع التفاعلات، باستثناء تفاعلات النقر فوق النحاس (I)، والألكين - الأزيد المحفز (CuAAC)، تم إجراؤها تحت ظروف لا مائية في وسط عضوي باستخدام أواني زجاجية مجففة بالفرن تحت نيتروجين خامل. أَجواء.

بالنسبة لثقافة الخلايا: تم الحصول على متوسط ​​النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco، ومصل الأبقار الجنيني (FBS)، والبنسلين - الستربتوميسين (P / S)، 0.05% التربسين-EDTA، وكاشف MTT من Invitrogen (Carlsbad، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم الحصول على كاشف Griess منPromega (Madison، WI) وتم الحصول على TNF-ELISA من R&D Systems (Minneapolis، MN). تم شراء الميثانول من الدرجة التحليلية من شركة Sigma-Aldrich. تم الحصول على التريبان الأزرق من كورنينج (ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية).

إجراءات التوليف لاقتران D-Tesa
تم تصنيع رباعي إيثيلين جلايكول أحادي أزيد (2) باستخدام البروتوكول المنشور مسبقًا.45

تخليق وتنقية تيسا-TEG-أزيد (3).
تم إذابة تيسا (950 مجم، 2.32 مليمول) في 10 مل ثنائي ميثيل فورماميد (DMF). إلى هذا المحلول المقلب، تمت إضافة رباعي ميثيلين جلايكول أحادي أزيد (2،662.1 مجم، 3.02 مللي مول) في DMF (1 مل) قطرة قطرة. تمت بعد ذلك إضافة DMAP (255.4 مجم، 2.09 مليمول) وEDC (577.5 مجم، 3.02 مليمول) إلى خليط التفاعل، وتم تقليب التفاعل تحت تطهير النيتروجين عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.

تمت مراقبة التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وكروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). تم تخفيف خليط التفاعل باستخدام 100 مل ثنائي كلورو ميثان (DCM) وتم نقل خليط التفاعل الخام إلى قمع فصل، وتم بعد ذلك غسل الطبقة العضوية ثلاث مرات بمحلول بيكربونات الصوديوم المشبع، يليه محلول كلوريد أمونيوم مشبع وأخيرًا بمحلول ملحي.

تم بعد ذلك تجفيف الطبقة العضوية باستخدام كبريتات الصوديوم اللامائية. تمت بعد ذلك إزالة المذيب الموجود في الطبقة العضوية باستخدام مبخر دوار، وتمت إعادة إذابة المحلول في 3 مل DCM وتم امتصاصه على هلام السيليكا ليتم تنقيته باستخدام نظام كروماتوجرافيا CombiFlash® باستخدام طريقة التدرج مع أسيتات إيثيل/هكسان كمذيبات لإنتاج 3as واضح. - زيت أصفر.

تتم التصفية النهائية للمنتج النقي المطلوب بنسبة 30–40% أسيتات إيثيل تقريبًا. (العائد: 70٪.) 1H NMR (500 ميجاهرتز، CDCl3) δ 7.27 (d، J=8.6 هرتز، 2H)، 7.15(d، J=1.9 هرتز، 2H)، 7.08 (د، J=8.6 هرتز، 2H)، 6.73 (د، J=8.6 هرتز، 2H)، 4.25-4.14 (م، 2H)، 4.07 (ر، J {{ 33}}.8 هرتز، 2H)، 3.94 (يوم، J =7.8، 5.2 هرتز، 1H)، 3.67–3.47 (م، 14H)، 3.30 (يوم، J=8.7 ، 3.8 هرتز، 2H)، 3.06 (ق، 3H)، 3.02 (t، J=6.7 هرتز، 2H)، 2.91-2.84 (م، 2H)، 1.08 (t، J=7 .0 هرتز، 3H).ESI-MS: نظري C28H39N3O10S: 609.24، تم الحصول عليه (M + 1):610.13.

توليف وتنقية D-YNE (5).

تمت إضافة (480 مجم، 4.22 مللي مول) إلى محلول مقلب من G4- PAMAM-OH (2.5 جم، 0.176 مللي مول) في 20 مل DMF لا مائي. تمت إضافة DMAP (430 مجم، 3.52 مليمول) وEDC (1 جم، 5.28 مليمول) إلى هذا الخليط.

تم تقليب خليط التفاعل تحت تنقية النيتروجين لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. عند اكتمال التفاعل، تم نقل خليط التفاعل إلى أنبوب غسيل كلوي سعة 1000 MWCO وتم إجراء غسيل كلى DMF لمدة 24 ساعة، وتم تغيير DMF كل ست ساعات تقريبًا.

ثم تم إجراء غسيل الكلى بالماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 24 ساعة، مع تغيير الماء كل ست ساعات تقريبًا. أخيرًا، تم تجفيف محتويات أنبوب غسيل الكلى الناتج لمدة 48 ساعة، مما أدى إلى الحصول على مسحوق أبيض رقيق. (العائد: 61٪.) 1H NMR (500 ميجا هرتز، DMSO) δ 8.10–7.67 (م، dendrimerinternal أميد H)، 4.72 (ق، سطح dendrimer OH)، 4.01 (t، استر –CH2)، 3.32 (m، dendrimer –CH2)، 3.06 (m، dendrimerand linker –CH2)، 2.85–2.58 (m، dendrimer –CH2)، 2.56–1.89(m، dendrimer ورابط –CH2)، 1.78–1.61 (م، رابط –CH2).توليف وتنقية D-Tesa (6).

تمت إضافة Tesa-TEG-azide (3,177.8 مجم، 0.3{{10}}3 مليمول) إلى خليط مقلب من D-YNE(5, 35{{2{{27}) }}} مجم، 0.023 ملي مول) في 5 مل من خليط 1: 1 من رباعي هيدروفيوران (THF) والماء مع 0.5 مل من DMF في قنينة آمنة لمفاعل الميكروويف سعة 20 مل. بالنسبة لتفاعل النقر CuAAC، تمت إضافة خماسي هيدرات كبريتات النحاس (11.6 مجم، 0.0467 مليمول) و(+)-صوديوم-لاسكوربات (9.3 مجم، 0.0467 مليمول) إلى خليط التفاعل.

تم إغلاق القارورة، ثم تم وضع وعاء التفاعل في مفاعل الميكروويف Biotage® Initiator وتم التفاعل تحت إشعاع ميكروويف 20 وات مع التحريك لمدة 8 ساعات عند 50 درجة. تم نقل خليط التفاعل إلى أنبوب غسيل الكلى سعة 1000 ميجاوات، وتم إجراء غسيل الكلى DMF لمدة 24 ساعة، مع استبدال DMF بمذيب جديد كل 4 ساعات تقريبًا.

بعد ذلك، تم نقل محتويات أنبوب غسيل الكلى إلى أنبوب أفالكون، وتم إضافة كمية مكافئة من ماء DI. بالإضافة إلى ذلك، تمت إضافة 200 ميكرولتر من محلول ملح ثنائي الصوديوم لحمض الإيثيلين أمين رباعي أسيتيك إلى محتويات أنبوب الصقر.

تم بعد ذلك وضع هذا الخليط في أنبوب غسيل كلى جديد بسعة 1000 MWCO، وتم إجراء غسيل الكلى لمدة 12 ساعة في 1000 مل من الماء DI مع إضافة محلول EDTA متبوعًا بغسيل الكلى المائي لمدة 12 ساعة.

تم بعد ذلك تجفيف الخليط بالتجميد لمدة 48 ساعة لينتج عنه مسحوق أبيض رقيق. (العائد: 64٪.) 1H NMR (5 0 0 ميجاهرتز، DMSO) δ 8.2–7.6 (m، dendrimer Internalamide H)، 7.36 (d، Tesa ArH)، 7.21 (d، Tesa ArH)، 7.03 ( d، TesaArH)، 6.76 (d، Tesa ArH)، 4.37 (s، Tesa H)، 4.18-4.04 (m، linkerH)، 3.96 (dd، Tesa و linker H)، 3.70 (m، Tesa و linker H) ،3.58–3.14 (م، التشجير –CH2)، 3.14–2.86 (م، التشجير –CH2)، 2.87–2.49 (م، التشجير والرابط –CH2)، 2.25 (م، التشجير –CH2) ، 1.82-1.67 (م، رابط –CH2)، 0.97 (ر، تيسا –CH3).

تقنيات التوصيف

الرنين المغناطيسي النووي (NMR). تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي على مطياف Bruker 500 MHz في درجة حرارة الغرفة. تم الإبلاغ عن التحولات الكيميائية البروتونية (δ) بوحدة جزء في المليون.

تم استخدام 1H NMR لتحديد عدد جزيئات تيسا المرتبطة بكل جزيء من D-Tesa بواسطة طريقة تكامل البروتون، من خلال مقارنة قمم بروتونات الأميد الداخلية للتغصن عند δ 7.6–8.2 جزء في المليون مع بروتونات تيسا العطرية عند δ 7.36–6.76 جزء في المليون وبروتونات الميثيل من تيسا في المنطقة الأليفاتية. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC).

تم استخدام HPLC (شركة Waters Corporation، Milford، Massachusetts) المجهزة بمضخة ثنائية a1525، وجهاز إزالة الغازات AF في الخط، وجهاز أخذ العينات التلقائي 717 plus، وكاشف صفيف الثنائي الضوئي 2998، وكاشف التألق المتعدد 2475 المتداخل مع برنامج Waters Empower.

تم استخدام عمود الطور العكسي Symmetry C18 (توسوه، اليابان) بحجم جسيم يبلغ 5 ميكرومتر وطول 25 سم وقطر داخلي 4.6 مم. تمت مراقبة المركبات عند 210 نانومتر و 254 نانومتر باستخدام كاشفات المساعد الشخصي الرقمي.

كان المذيب A عبارة عن ماء بدرجة HPLC يحتوي على 0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)، وكان المذيب B عبارة عن أسيتونتريل (ACN) مع 5% ماء و0.1% TFA. بدأت الطريقة المستخدمة عند 1{ {7}}0 : 0 (ACN: ماء)، انخفض إلى 10: 90 (ماء: ACN) في 5 دقائق، وبقي عند تلك القطبية لمدة 15 دقيقة، وعاد إلى 100 : 0 (ACN: ماء) في 5 دقائق. تم الحفاظ على معدل التدفق عند 1 مل دقيقة −1. التحليل الطيفي الشامل.

تم إجراء ESI-MS على مطياف الكتلة BrukermicroTOF-II باستخدام الأسيتونيتريل / الماء (9: 1) كنظام مذيب. تم استخدام الأيونات الجزيئية في صورة قمم بروتونية[M + nH]n+ أو متقاربة [M + nX]n+ (X=Na أو K أو NH4) لتأكيد الصيغة التجريبية.

تشتت الضوء الديناميكي وإمكانات ζ. تم استخدام Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd، Worchester، UK) المجهز بالليزر He-Ne بقدرة 5 0 ميجاوات (633 نانومتر) لتحديد حجم الجسيمات وتوزيع إمكانات ζ. تم إذابة D-Tesa في ماء DI إلى تركيز 0.2 مجم ml لـ DLS وفي 10 مم كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.1 مجم ml −1 لإمكانات ζ.

تم إجراء القياسات عند 25 درجة، باستخدام زاوية تشتت قدرها 173 درجة كما هو موضح سابقًا.27،46 دراسة إطلاق الدواء. تم إذابة D-Tesa بتركيز 1 مجم مل في أي من محلول الفوسفات المنظم (الرقم الهيدروجيني 7.4) لظروف البلازما أو محلول سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5) لتقليد الظروف الليزوزومية.

تمت إضافة الإستريزات من كبد الخنازير (من سيجما ألدريتش) إلى محلول سترات الصوديوم في بداية دراسة الإطلاق وتم تجديدها كل 3 أيام تقريبًا أثناء الدراسة.

تحتوي كل قارورة على 15 مل عينة وتم رجها بشكل مستمر عند درجة حرارة 37 درجة طوال مدة التجربة. في نقاط زمنية مختلفة، تم جمع 200 ميكرولتر من العينات المكررة من كل درجة حموضة وتم إخماد نشاط الاستريز لاحقًا بإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول. كانت عينات النقطة الزمنية لساعة الصفر بمثابة عنصر التحكم.

تم تخزين العينات عند درجة حرارة 80 درجة لتجنب أي تحلل مائي. تم تحليل العينات بشكل إضافي بواسطة HPLC وتم حساب المنطقة الواقعة أسفل المنحنى (عند 210 نانومتر) لذروة الدواء المجانية. تم ربط المنطقة الموجودة أسفل المنحنى بكمية الدواء المنطلق باستخدام منحنى المعايرة حيث تم تشغيل تركيزات معروفة من تيسا الحرة على HPLC عند 210 نانومتر.

For more information:1950477648nn@gmail.com