التعبير التفاضلي عن إنزيمات الأيض السفينجوليبيد في الجرذان المصابة بارتفاع ضغط الدم تلقائيًا: ركيزة محتملة للتعرض لأضرار الدماغ والكلى
Feb 24, 2022
الملخص: يتم التعرف بشكل متزايد على التعديلات في عملية التمثيل الغذائي للدهون السفينغولية ، وهي فئة من الجزيئات النشطة بيولوجيًا في أغشية الخلايا ذات التأثير المباشر على التوازن الوعائي ، كعامل محدد مهم في اضطرابات الأوعية الدموية المختلفة. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت السفينجوليبيدات متورطة في التسبب في ارتفاع ضغط الدم المرتبط بارتفاع ضغط الدم.تلف كلوي. في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم وجود تشوهات محتملة تتعلق بعملية التمثيل الغذائي للدهون السفينغولية في الدماغ والكلىمن سلالتين من سلالات الجرذان ذات الضغط العالي تلقائيًا ، وهما النموذجان المعرضان للسكتة الدماغية (SHRSP) والنموذج المقاوم للسكتة الدماغية (SHRSR) ، مقارنة بسلالة الفئران ذات الضغط الطبيعي Wistar Kyoto (WKY). أظهرت نتائجنا تغيرًا عالميًا في عملية التمثيل الغذائي للدهون السفينغولية في كل من الدماغ وكلوي أنسجة كل من سلالات ارتفاع ضغط الدم مقارنة بالفئران السوية. ومع ذلك ، تم اكتشاف عيوب قليلة حصريًا في SHRSP ، مثل انخفاض التعبير عن الإنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي / تقويض فوسفات السفينجوزين -1- وفي مسارات التخليق الحيوي de novo. على الرغم من أن المزيد من الدراسات ضرورية لفهم أهمية هذه النتائج تمامًا ، إلا أنها تشير إلى أن العيوب في جزيئات الدهون المحددة و / أو المسارات الأيضية المرتبطة بها قد تساهم على الأرجح في التسبب في تلف العضو المستهدف الناتج عن ارتفاع ضغط الدم وقد تعمل في النهاية كأهداف علاجية مستقبلية لتقليلها. العواقب الوعائية لارتفاع ضغط الدم.
الكلمات الدالة:سفينغوليبيدات. السكتة الدماغية؛ مخ؛ الكلى؛ SHR ؛ WKY
مقدمةيمثل ارتفاع ضغط الدم مشكلة صحية رئيسية تسبب تلفًا محددًا للأعضاء وعواقب إكلينيكية وخيمة ، مما يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات والعجز في المجتمعات الغربية [1-3]. لتقليل عبء مضاعفات ارتفاع ضغط الدم ، يلزم فهم أكثر شمولاً لآليات مسببات الأمراض الكامنة. قد يكون توافر النماذج الحيوانية التي قد تحاكي عن كثب علم الأمراض البشري ، وفي الوقت نفسه ، تبسيط التعقيد المتأصل في دراسة السكان البشريين ، مفيدًا للغاية في هذه المسابقة. حاليًا ، الجرذ المصاب بارتفاع ضغط الدم التلقائي المعرض للسكتة الدماغية (SHRSP) ، والذي يُظهر استعدادًا كبيرًا للإصابة بالدماغ وتلف كلوي، خاصة عند التغذية بنظام غذائي عالي الملح / منخفض البوتاسيوم ، يمثل نموذجًا مثاليًا. يتصرف ارتفاع ضغط الدم والعوامل الغذائية كعوامل خطر مهيئة لكل من الجرذان والبشر [4،5]. يُظهر SHRSP تواترًا أعلى للسكتة الدماغية عند إطعامه بنظام غذائي ياباني (JD) مقارنة بالتحكم المرتبط به بدقة ، وهو مقاومة السكتة الدماغية (SHRSR) ، على الرغم من مستويات ضغط الدم المماثلة [6]. من المذكرة،تلف كلوي دائما تسبق أحداث السكتة الدماغية [6]. على الرغم من أن الآليات الجزيئية الأساسية غير مفهومة تمامًا ، إلا أن الأدلة تشير إلى أن الخلل الوظيفي الوعائي الناتج والآفات الهيكلية اللاحقة تفضلتلف كلويوتطور السكتة الدماغية.
سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ
على مدى السنوات الماضية ، ظهرت بعض الجوانب الميكانيكية ومحددات الأوعية الدموية الدماغية وتلف كلويتم التعرف على حدوثها في نموذج SHRSP [7-12]. ومع ذلك ، لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافه. تمثل السفينجوليبيدات ، بما في ذلك سيراميدات (سير) ، وسفينجوزين ، وفوسفاته (S1P) شكل فوسفينجوزين -1- (S1P) ، المكونات الدهنية الرئيسية للأغشية البيولوجية وتعدل العديد من الوظائف المهمة لمجموعات الخلايا العصبية وغير العصبية [13]. ومع ذلك ، لا يقل أهمية عن الدور المحوري الذي يلعبونه في تكوين الأوعية الدموية ووظيفتها [13-15] ، وكذلك في تنظيم سلامة حاجز الدم في الدماغ (BBB) من خلال تعديل بروتينات الوصلة الضيقة [16]. في هذا الصدد ، تشير الدلائل إلى أن تخليق دي نوفو للشحميات السفينغولية أمر حاسم في الحفاظ على وظائف الخلايا البطانية [17 ، 18] ، مما يساهم على الأرجح في سلامة الأوعية الدموية واستتبابها. تم وصف خلل التمثيل الغذائي سفينجوليبيد لتكمن وراء أمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة [19،20]. ومع ذلك ، لم يتم تقديم أي دليل مباشر على الدور المسبب للدهون السفينجولية في التسبب في تلف العضو المستهدف الناتج عن ارتفاع ضغط الدم. على الرغم من عدم وجود تفاصيل ميكانيكية ، فقد ثبت أن مسار S1P ، وهو دهون نشطة بيولوجيًا ، يكون محميًا للأعصاب أثناء نقص التروية [21 ، 22] ، ويؤدي تحفيز مستقبلاته إلى تأثيرات مفيدة في نموذج حيواني للسكتة الدماغية [23]. وبالتالي ، فمن المتصور وجود تفاعل محكم بين السكتة الدماغية و sphingolipids. في هذه الدراسة ، قمنا بفحص المخ وكلويالتعبير عن العديد من الجزيئات المشاركة في مسارات سفينجوليبيد في كل من سلالات SHRSP و SHRSR ، فيما يتعلق بسلالة WKY المعيارية. تسلط النتائج التي توصلنا إليها ، لأول مرة ، الضوء على عملية التمثيل الغذائي الشاذة للدهون السفينغولية إما في الدماغ أو في الكلى في كلا النموذجين الحيوانيين المصابين بارتفاع ضغط الدم. الأهم من ذلك ، تم اكتشاف بعض العيوب حصريًا في سلالة SHSRP. تشير هذه الأدلة إلى أن التغييرات في جزيئات الدهون المحددة و / أو مساراتها المحددة قد تساهم في التسبب في ارتفاع ضغط الدم وتلف العضو المستهدف الناتج عن ارتفاع ضغط الدم.
نتائج
مستويات إنزيمات الأيض S1P مقلقة في SHRSPللكشف عما إذا كان يمكن اكتشاف أي اضطراب محتمل في استقلاب السفينغوليبيد في سلالات SHRSP و SHRSR ، قمنا أولاً بالتحقيق في التعبير عن الجزيئات المتورطة في مسارات التوليف والتدهور S1P (المخطط في الشكل 1). تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتقييم مستويات SPHK1 و 2 وكذلك SGPL1 في الدماغ وكلويالأنسجة من كل من الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا مقارنة بسلالة WKY. كما ورد في الشكل 2 ، تميزت فئران SHRSP بانخفاض كبير في SPHK2 وكذلك SGPL1 في الدماغ مقارنة بكل من WKY و SHRSR. لا فرق فيكلويتم الكشف عن التعبير عن جميع الإنزيمات بين سلالات الفئران الثلاثة.
مستويات مستقبلات S1P شاذة في الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًاتشير الدلائل إلى أن تعديل مستقبلات S1P قد يكون مفيدًا في النماذج الإقفارية [23]. هنا ، من أجل تحديد ما إذا كان أي تغيير في تعبيرهم يمكن أن يرتبط في النهاية بالأنماط الظاهرية للمرض ، قمنا بتقييم مستويات البروتين لأكثر المستقبلات وفرة ، S1PR 1-3 [24] ، في سلالات الفئران الثلاثة. كشف تحليل التجلط المناعي عن تباين في التعبير عن جميع المستقبلات الثلاثة بطريقة تعتمد على الأنسجة. ومن المثير للاهتمام ، أن S1PR1 كان هو المستقبل الوحيد الذي زاد تعبيره في كل من الدماغ والكليتين من SHRSR (الشكل 3 أ ، 3 ب). على العكس من ذلك ، لم يُظهر تحليل أنسجة SHRSP أي اختلاف في التعبير عن جميع المستقبلات ، باستثناء S1PR3 الذي زادت مستوياته في الدماغ ، على غرار تلك المكتشفة في SHRSR (الشكل 3E)
التعبير عن تركيبات السيراميد معيب في أنسجة متعددة من نماذج SHRSP و SHRSRتشير الدلائل السابقة إلى أن مستويات السيراميد تزداد في نماذج ما قبل السريرية للسكتة وكذلك لدى المرضى من البشر [25-27]. هنا ، من أجل تقييم ما إذا كان استقلاب السيراميد قد يتأثر في الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة مستويات السيراميد ، قمنا بفحص التعبير عن تركيبات السيراميد ، والتي يُقال إنها الأكثر وفرة في الدماغ (CerS1 و CerS2) وفيالكلى(CerS2 و CerS4) [28]. كما ورد في الشكل 4 ، كشف تحليل qPCR عن اختلال عام في التعبير عن التركيبات ، مع بعض الاختلافات بين سلالتي ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا. أظهر SHRSP مستويات متزايدة من CerS1 mRNA في الدماغ بالمقارنة مع WKY أو SHRSR (الشكل 4 أ) وانخفاض مستويات CerS6 في الدماغ.الكلى، على غرار ما لوحظ في SHRSR (الشكل 4 د). على العكس من ذلك ، تميزت SHRSR بتعبير منخفض عن CerS2 مرنا في كل من المخ والكليتين (الشكل 4 ب ، 4 ج).
يتم تقليل التعبير عن SPTLC1 في أنسجة SHRSPأشارت الدراسات الحديثة إلى احتمال تورط دي نوفو في التخليق الحيوي للشحميات السفينغولية في ارتفاع ضغط الدم وأمراض الأوعية الدموية [29،30]. للتحقيق في أي ارتباط محتمل بين مسارات de novo sphingolipid والسكتة الدماغية ، قمنا بتقييم ملامح تعبير البروتين لـ SPTLC1 و 2 ، وهما وحدتان فرعيتان من SPT ، والإنزيمات المحددة للمعدل في التخليق الحيوي لـ sphingolipids [13] ، في كل من الدماغ والدماغ.كلويمناديل. كما ورد في الشكل 5 أ ، ب ، تميزت فئران SHRSP بانخفاض كبير في SPTLC1 في كل من الدماغ والكلى.ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تقليل SPTCL2 أيضًا في دماغ SHRSP مقارنةً بـ SHRSR (الشكل 5C).
يتم تقليل التعبير عن 3- Keto-Dihydrosphingosine Reductase في كل من الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًاتم التأكيد بشكل أكبر على التغيير في التخليق الحيوي للشحميات السفينغولية من خلال تحليل إنزيمات {{0} اختزال كيتو ثنائي هيدرو سفينغوزين (KDSR) وسيراميد ديساتوراز (DES) ، والتي تشارك عادة في تخليق دي نوفو للدهون السفينغولية [13]. أظهر تحليل qPCR انخفاضًا كبيرًا في مستويات تعبير mRNA لـ KDSR فيالكلىمن كل من SHRSP و SHRSR (الشكل 6 ب). لم يلاحظ أي تغييرات أخرى.
الشكل 2. التعبير عن إنزيمات استقلاب S1P معيب في أنسجة المخ من SHRSP. تمثيلية للخلايا المناعية المحصودة وتحليل قياس الكثافة لـ SPHK1 (sphingosine kinase 1) (A ، B) ، SPHK2 (sphingosine kinase 2) (C ، D) و SGPL1 (S1P-Lyase) (E ، F) في أنسجة المخ والكلى من WKY ، SHRSP و SHRSR. في كل عملية تخثر مناعي ، تم تشغيل جميع العينات على نفس الهلام. يتم فصل العينات غير المتجاورة بخط أسود. يتم تمثيل البيانات على أنها ± SD ، n {{1 0} / 7 لكل مجموعة من الفئران. * ف <0. 0="" 5="" ؛="" **="" ف=""><0.01 ؛="" ***="" p=""><0.001 (اتجاه="" واحد="" anova="" ،="" اختبار="" tukey="" اللاحق).="" تم="" الإبلاغ="" عن="" التاريخ="" الأولي="" لتوليد="" الشكل="" في="" جدول="" المواد="" التكميلية="">
مناقشة
على الرغم من الجهود البحثية الهائلة من قبل العلماء الأساسيين والسريريين ، فإن مضاعفات ارتفاع ضغط الدم مثل السكتة الدماغية وكلويلا تزال الأمراض تمثل الأسباب الرئيسية الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم [1-3]. وبالتالي ، هناك حاجة إلى معرفة المسارات المسببة للأمراض البديلة والأهداف الدوائية الجديدة للحفاظ على صحة الأوعية الدموية الدماغية والكلى. قد يمهد استكشاف عملية التمثيل الغذائي للدهون السفينغولية ، وهي فئة من الجزيئات النشطة بيولوجيًا في أغشية الخلايا والتي تلعب دورًا رئيسيًا في توازن الأوعية الدموية ، الطريق نحو أفق جديد من الفهم. على الرغم من أن الدلائل الناشئة تشير إلى أن التغيرات في استقلاب الشحوم السفينغولية ، مثل S1P والسيراميد ، قد يكون لها دور في اضطرابات الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم [31] ، إلا أن ما إذا كانت متورطة في التسبب في تلف أعضاء ارتفاع ضغط الدم لا يزال غير واضح. في هذه الدراسة ، حاولنا الحصول على بعض الأفكار حول عملية التمثيل الغذائي للدهون السفينغولية في سلالات الفئران SHRSP و SHRSR ، وهما نموذجان قبل السريريان مصحوبان بفرط ضغط الدم تلقائيًا مع قابلية مختلفة للإصابة بـكلويوتطور تلف الأوعية الدموية الدماغية. على وجه الخصوص ، أجرينا الدراسة على 8- فئران عمرها أسبوع ، في عمر أصيبوا فيه بارتفاع ضغط الدم ولكنهم لا يزالون خاليين من تلف الأعضاء المستهدف. من خلال هذا النهج ، كنا نهدف إلى تحديد أي توقيع "بيولوجي سفينجولوجي" يحتمل أن يكون متورطًا في النتائج المختلفة لمرض ارتفاع ضغط الدم في نموذجي الفئران. سلالة الفئران المعتادة بمثابة عنصر التحكم المناسب. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها لأول مرة أن كلا النموذجين من الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم يتميزان باضطراب عالمي في التمثيل الغذائي للدهون السفينغوليبيدية ، ولكن القليل من التغييرات كانت محددة إما لسلالة SHRSP أو SHRSR. على وجه الخصوص ، تم تقليل التعبير عن كل من SPHK2 و SGPL1 بشكل ملحوظ فقط في دماغ SHRSP. قد يكون للحد من مستويات SPHK2 تأثيرات ضارة للغاية في الدماغ ، حيث يتواجد بكثرة بشكل خاص في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة ويمارس دورًا وقائيًا ضد نقص التأكسج الناجم عن التكييف المسبق [32]. من ناحية أخرى ، قد يكون تقليل SGPL1 سامًا لوظائف الخلايا العصبية [33].
في ضوء ذلك ، من الممكن تصور أن عدم توازن إنزيمات استقلاب S1P ، مع التوافر البيولوجي المعيب لـ S1P ، قد يؤدي إلى زيادة تلف الأوعية الدموية. جاءت المشاركة المحتملة لـ S1P في تنظيم الآليات الجزيئية المرتبطة بالسكتة الدماغية من الدليل على أن مستويات S1PR1 ، والتي تم تحديدها مؤخرًا على أنها جين مرشح موضعي لحساسية الملح في SHRSP [22] ، زادت في أنسجة SHRSR . تشير هذه النتائج إلى دور مزدوج محتمل لـ S1P في تحديد تلف الأوعية الدموية وحدث السكتة الدماغية المترتب على ذلك. في الواقع ، يمكن أن يؤدي تقليل التوافر البيولوجي لـ S1P و / أو التنظيم المعيب للمسارات المرتبطة به إلى زيادة التعرض للسكتة الدماغية في SHRSP. بالمقابل ، زيادة التعبير عن S1PR1 ، الذي تم الإبلاغ عن أن تنشيطه مفيد في النماذج التجريبية لنقص التروية الدماغي [34-36] ، يمكن أن يمثل في النهاية عاملًا وقائيًا في SHRSR. كشفت النتائج التي توصلنا إليها عن اختلاف آخر مثير للاهتمام بين سلالتي الفئران المصابة بارتفاع ضغط الدم تلقائيًا. قد يشير التعبير المتزايد لـ CerS1 ، الذي تم اكتشافه فقط في SHRSP ، إلى التوافر البيولوجي المرتفع للسيراميد الدماغي والذي قد يكشف عن سمية ومن المحتمل أن ترتبط بزيادة القابلية للإصابة بالسكتة الدماغية. تم تأكيد ذلك من خلال العديد من الدراسات التي تشير إلى الارتباط بين زيادة محتوى السيراميد ومرض نقص تروية الأوعية الدموية الصغيرة والكثافة المفرطة للمادة البيضاء [37 ، 38].
سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ
ملاحظة مهمة أخرى مستمدة من دراستنا هي الانخفاض الكبير في كل من SPTLC1 و 2 في SHRSP مقارنة بـ SHRSR ، حيث لم يتم اكتشاف أي اختلافات. على الرغم من أن كلا سلالتي ارتفاع ضغط الدم تشتركان في بعض العيوب في التعبير عن الجينات الأخرى المشاركة في تخليق دي نوفو سفينجوليبيد ، فإن تقليل SPTLCs يشير بوضوح إلى دور رئيسي لهذا المسار الأيضي في التسبب في مرض الأوعية الدموية الدماغية. في هذا السياق ، تشير الدلائل الحديثة إلى أن تخليق الشحميات السفينغولية البطانية ينظم ضغط الدم والتوازن البطاني [30] ، مما يسلط الضوء على الدور الحاسم للدهون السفينغولية المصنعة من دي نوفو في أمراض الأوعية الدموية. قد تشير البيانات الحالية إلى أن تخليق de novo للشحميات السفينغولية يمكن أن يكون مضطربًا في SHRSP. دراستنا هي الأولى التي تتناول جوانب محددة من استقلاب سفينجوليبيد فيما يتعلق بالسكتة الدماغية. على الرغم من أننا لم نجري أي تحليل كمي للشحميات السفينغولية في أنسجة الفئران ، فقد اقترحت خمساتنا تغييرًا محتملاً في التوافر البيولوجي لشحميات سفينجولية مختلفة مثل S1P وسيراميد في SHRSP. نظرًا لأن S1P يحفز تكاثر الخلايا ومسارات البقاء على قيد الحياة بينما يمارس السيراميد عادةً تأثيرات مضادة للتكاثر والاستماتة [39] ، فإن عدم التوازن بينهما قد يؤثر على توازن الدماغ في SHRSP ويحتمل أن يساهم في التسبب في السكتة الدماغية. بالنظر إلى الطبيعة الترابطية لدراستنا ، من الضروري إجراء مزيد من التحقيقات لفهم الدور المحوري المحتمل لتعديلات سفينجوليبيد في التسبب في تلف أعضاء ارتفاع ضغط الدم من أجل تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فاعلية "مبنية على سفينجوليبيد". بالنظر إلى أن العديد من الأدوية ، التي تنتمي أهدافها الجزيئية إلى مسارات سفينجوليبيد ، متاحة بالفعل لعلاج أمراض أخرى [40] ، فإننا نعتقد أن النتائج التي توصلنا إليها قد تقدم الدعم لاستكشاف إمكاناتها العلاجية في الدماغ المصحوب بارتفاع ضغط الدم وكلوياضطرابات الأوعية الدموية.
المواد والأساليب
نماذج حيوانيةتم إجراء جميع التجارب باستخدام ذكور يبلغ من العمر شهرين معرضين للسكتة الدماغية بشكل عفوي لارتفاع ضغط الدم (SHRSP) ، وسلالات جرذ ذات ضغط عالي تلقائي مقاومة للسكتة الدماغية (SHRSR) ، ومقارنتها بسلالة الفئران ذات الضغط الطبيعي المتطابقة مع العمر والجنس ، WistarKyoto (WKY) . تعد SHRSP و SHRSR أكثر النماذج الحيوانية استخدامًا في الدراسات قبل السريرية لارتفاع ضغط الدم والسكتة الدماغية المرتبطة بها [5،6]. تم الاحتفاظ بها في منشأة حيوانية تابعة لـ IRCCS Neuromed ، وتم الحفاظ عليها في درجة حرارة ثابتة للغرفة و 12 ساعة من دورات النهار / الليل ، وتم إطعامها بطعام الفئران العادي ومياه الشرب. تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس مراجعة رعاية الحيوانات العصبية IRCCS و "Istituto Superiore di Sanità" (رقم تصريح ISS: 1086/2020) وتم إجراؤها وفقًا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU للتجارب على الحيوانات .
المناعيةتم التضحية بالجرذان عن طريق قطع الرأس والأنسجة (الدماغ والكلى) تم تجميدها بشكل مفاجئ في سائل N2 وسحقها في ملاط بمدقة. تم تجانس الأنسجة المسحوقة في محلول تحلل يحتوي على 20 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 7،4 ، و 1 بالمائة نونيديت P -40 ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 20 ملي مولار NaF ، و 2 ملي مولار Na3VO4 و 1: 1000 خليط مثبط الأنزيم البروتيني (سيغما-الدريتش) ويتم صوتها بنبضات 2 * 10 ثانية. من أجل التكتل المناعي ، تم تحصين 20 ميكروغرام من محلول البروتين الكلي بالأجسام المضادة التالية: مضادات SPHK1 (1: 1000) (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد SPHK2 (1: 1000) (Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ) ، مضاد SGPL1 (1: 1000) (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضاد S1PR1 (1: 1000) (العلوم المناعية) ، مضاد S1PR2 (1: 1000) (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية) ، مضاد لـ S1PR3 (1: 1000) (العلوم المناعية) ، مضاد SPTLC1 (1: 1000) (Abcam) ومضاد SPTLC2 (1: 1000) (Abcam). لتطبيع البروتين ، تم استخدام مضادات الأكتين (1: 2000) (العلوم المناعية ، روما ، إيطاليا). تم اكتشاف نطاقات البروتين بواسطة ECL Prime (GE Healthcare) وتم قياسها باستخدام برنامج Quantity One (مختبرات Bio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
استخراج الحمض النووي الريبي و qPCR.
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة Rneasy (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تصنيع 1000 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي Super Script III (Invitrogen) وتم تضخيم cDNA الناتج باستخدام Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم إجراء التحليل الكمي qPCR باستخدام بادئات محددة: Kdsr FW: 50- TAAAGCAGGCACAGGAGAAG -30؛ Kdsr RV: 50- GCCTGAGAGGACACAAACA -30 ؛ Des FW: 50- AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA -30 ؛ Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG -30 ؛ CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT -30 ؛ CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA -30 ؛ CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA -30 ؛ CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG -30 ، CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA -30 ، CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG -30 ، Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC -30 ، Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT -30.
سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ
