اكتشاف وتحديد المكونات النشطة المحتملة المضادة للميلانين من Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1 و Juan Wang1 و Shuo Li1 و Yue Wu1 و Zhirui Wang1 و Shaojun Chen1 و Hongjiang Chen1،2 *

الملخص

خلفية:Bletilla striata هو الدواء الرئيسي للعديد من الصيغ الكلاسيكية لتبييض البشرة في الطب الصيني التقليدي (TCM) ويستخدم على نطاق واسع في صناعة مستحضرات التجميل مؤخرًا. ومع ذلك ، فإن مكوناته النشطة لا تزال غير واضحة ولا يتم استخدام جذوره الليفية بشكل فعال. الهدف من هذه الدراسة هو اكتشاف وتحديد المكونات النشطة المضادة للميلانين المحتملة من خلال نموذج الزرد والالتحام الجزيئي.

طُرق:المضادات الأكسدةتم تقييم الأنشطة بواسطة 2 ، 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) ، نشاط الكسح الجذري ، 2،2′-azino-bis - (3- ethylbenthiazoline -6- sulphonic acid) (ABTS ) نشاط الكسح الجذري وتقليل الحديديكمضادات الأكسدةمقايسة الطاقة (FRAP). تم تقييم النشاط المضاد للميلانين بواسطةالتيروزينازمثبطنشاطمثبطات الميلانين في المختبر في الزرد. تم إجراء الملامح الكيميائية بواسطة كروماتوجرافيا سائلة فائقة الأداء جنبًا إلى جنب مع مطياف الكتلة الترادفي الرباعي لوقت الرحلة (UPLC-Q-TOF-MS / MS). وفي الوقت نفسه ، تم تحديد المكونات النشطة المحتملة المضادة للميلانين مؤقتًا عن طريق الالتحام الجزيئي.

نتائج:يمتلك مستخلص الإيثانول بنسبة 95 في المائة من جذور ب. و 58.92 ملغم / لتر على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، قلل EFB و 95 بالمائة من مستخلص الإيثانول من درنات B. تم تحديد 39 تركيبة كيميائية ، بما في ذلك 24 stilbenoids مبدئيًا من EFB و ETB. أشار الالتحام الجزيئي إلى أن هناك 83 مركبًا (بما في ذلك 60 ستيلبينويد) و 85 (بما في ذلك 70 ستيلبينويد) أظهرت ارتباطات ارتباط أقوى تجاه التيروزيناز وإنزيم الأدينيلات.

استنتاج:تدعم النتائج الحالية الأساس المنطقي لاستخدام EFB و ETB كمواد طبيعية لتبييض البشرة في الصناعات الدوائية ومستحضرات التجميل.

الكلمات الرئيسية: Bletilla striata ، مضاد للأكسدة ، نشاط مضاد للميلانين ، UPLC-Q-TOF-MS / MS ، سمك الزرد ، الالتحام الجزيئي

انقر لمعرفة الآثار الجانبية والفوائد لمضادات الأكسدة

خلفية

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. F. هو نبات عشبي معمر منتشر على نطاق واسع في آسيا ، مثل الصين وكوريا واليابان [1]. تم استخدام درنة B. striata ، المعروفة أيضًا باسم Baiji ، والتي تم تسجيلها لأول مرة في Shennong's Classic of Materia Medica ، على نطاق واسع كدواء صيني تقليدي (TCM) لآلاف السنين في الصين. تنص دساتير الأدوية الصينية على أنها تمتلك قابلية قابضة على الإرقاء والتسكين ، لذلك فقد تم استخدامها على نطاق واسع في علاج القيء ونفث الدم والنزيف الرضحي والقرحة والتورم وتشقق الجلد [2 ، 3]. أظهرت الدراسات الدوائية أن بكتيريا B. striata تمتلك طيفًا واسعًا من الأنشطة البيولوجية ، مثل التئام الجروح [4 ، 5] ، مضاد القرحة [6 ، 7] ، مرقئ [8] ،مضاد-اشتعال[9], مضادات الأكسدة[10] ، مضاد للبكتيريا [11] ، مضاد للأنفلونزا الفيروسية [12] ، مضاد للبكتيريا [13]. في الوقت نفسه ، تحتوي B. striata على فئات مختلفة من التركيبات الكيميائية ، بما في ذلكالسكريات[14] ، ثنائي البنزيل ، الفينانثرين ، أنثراكينون ،مركبات الفلافونويد، و 2- isobutylmalates [3 ، 15] ، إلخ.

B. striata هو الدواء الرئيسي للعديد من الصيغ الكلاسيكية لتبييض البشرة في الطب الصيني التقليدي [16] ويستخدم على نطاق واسع في صناعة مستحضرات التجميل مؤخرًا [17]. ومع ذلك ، فإن مكوناته النشطة لا تزال غير واضحة وحتى بعض نتائج الأبحاث كانت معاكسة. على سبيل المثال ، نتائج البحث التي قدمها Chenet al. أشار إلى أن 95 بالمائة من مستخلص الإيثانول من B. striata يمتلك نشاطًا مثبطًا للتيروزيناز أعلى من تلك الموجودة في مستخلصه المائي مع معدل تثبيط 68.36 بالمائة في المختبر [18] ، بينما نتيجة Huang et al. أظهر أن النشاط التثبيطي لمستخلص ماء B. striata على التيروزيناز كان أقوى من 95٪ من خلاصة الإيثانول ومعدل تثبيط 62٪ في المختبر [19]. أظهرت نتائج البحث بواسطة Luetal. [20] و Linghuetal. [21] أن كلا من الماء و 95٪ من مستخلص الإيثانول من B. striata ، خاصة تجزئة الكلوروفورم ، يمكن أن يثبط نمو خلية B16 ويحفز موت الخلايا المبرمج بطريقة تعتمد على التركيز.

نظرًا لأن الاختبارات في المختبر لتثبيط التيروزيناز وخطوط خلايا الورم الميلانيني ، لم تتضمن الظروف الفسيولوجية المعقدة في الجسم الحي ، والامتصاص والتمثيل الغذائي والتوزيع والإفراز لعينة الاختبار ، فقد أظهرت العديد من هذه العينات نشاطًا مثبطًا كبيرًا ضد خطوط الخلايا التيروزيناز والورم الميلانيني في المختبر ، مع ذلك ، أظهر فعالية ضعيفة أو حتى غير فعالة في الجسم الحي [22،23]. أظهر الجلابريدين نشاطًا مثبطًا لانزيم التيروزيناز مع IC 50 0. 43 ميكرولتر / لتر ، والذي كان أقوى 176 مرة من حمض الكوجيك. ومع ذلك ، لم يكن له تأثير على تصبغ الزرد في الجسم الحي [24].

وفي الوقت نفسه ، كانت جذور B. striata الليفية (FB) عبارة عن منتجات ثانوية تم إنتاجها أثناء معالجة B. أشارت الأبحاث الحديثة إلى أن FB يحتوي على مركبات مماثلة مع مرض السل ومحتوى أعلى من الفينول [25]. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الأنشطة المضادة للبكتيريا [26] ومضادات الأكسدة والتيروزيناز في مستخلص FB أقوى من تلك الموجودة في مستخلص السل [25]. ومع ذلك ، لم يتم استخدام موارد FB بشكل فعال وتم التخلي عنها في الأراضي الزراعية ، مما أدى إلى إهدار الموارد المالية والتلوث البيئي [27].

الزرد (Danio rerio) ، وهو سمكة استوائية صغيرة للمياه العذبة ، هو نموذج حيواني ناشئ في علم العقاقير

وأبحاث السموم في الجسم الحي ، مع العديد من المزايا بما في ذلك التكلفة المنخفضة ، ودورة الحياة القصيرة ، والشفافية العالية ، وسهولة الصيانة ، والخصوبة العالية ، وعينات الاختبارات المطلوبة أقل [28 ، 29]. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي سمك الزرد على صبغات الميلانين على السطح ، مما يسمح بملاحظة بسيطة لعملية التصبغ ، وقد استخدم على نطاق واسع في دراسة مكافحة تكون الميلانين [28 ، 30].

في هذه الدراسة ، قمنا بمقارنة الأنشطة المضادة للأكسدة والتيروزيناز المثبطة لركوب polysaccha الخام و 95 بالمائة من مستخلص الإيثانول من السل و FB في المختبر وأنشطة مضادات الميلانين في نموذج الزرد. في غضون ذلك ، تم تحديد المكونات النشطة المحتملة المضادة للميلانين مؤقتًا عن طريق الالتحام الجزيئي. اكتشفنا أن 95 في المائة من مستخلص الإيثانول من السل (ETB) و FB (EFB) يمتلكان أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للتيروزيناز بشكل كبير ، ويمكن أن يقلل من تخليق الميلانين في أجنة الزرد بطريقة تعتمد على الجرعة. وبالتالي ، يمكن استخدام ETB و EFB كعوامل تبييض طبيعية للجلد في الصناعات الدوائية ومستحضرات التجميل.

طُرق

المواد الكيميائية والكواشف

تم شراء Tyrosinase و 3- (3 ، 4- dihydroxyphenyl) -L-alanine (L-DOPA) و arbutin من شركة كاشف علاء الدين (شنغهاي ، الصين) .2 ، 2- ثنائي فينيل {{8 }} picrylhydrazyl (DPPH)، 2،2′-azino-bis - (3- ethylbenthiazoline -6- حمض السلفونيك) (ABTS) ، 6- هيدروكسي -2 ، 5،7 و 8- tetramethylchroman -2- carboxylic acid (Trolox) و 2،4 و 6- tris (2- pyridyl) -s-triazine (TPTZ) تم شراؤها من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأسيتونيتريل والميثانول (درجة HPLC) من Tedia (فيرفيلد ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير الماء منزوع الأيونات بواسطة نظام المياه Milli-Q (18.2 MΩ ، Millipore ، الولايات المتحدة الأمريكية).

إجراءات جمع واستخراج النباتات

تم جمع B. striata من شركة Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co.، Ltd. (Quzhou ، Zhejiang ، الصين). تم إيداع عينات القسائم في معرب بكلية تشجيانغ الصيدلانية (إدخال رقم 190615). تم تقسيم النبات كله إلى جذور ليفية وجذور درنات. بعد ذلك ، تم تقطيعها إلى قطع صغيرة وتجفيفها عن طريق التجفيف بالتجميد بالتفريغ ، على التوالي.

تم استخلاص العينات المجففة والمسحوق (TB و FB) باستخدام 95 بالمائة من الإيثانول لمدة ثلاث مرات (1.5 ساعة لكل مرة). تم ترشيح المستخلص باستخدام ورق ترشيح What man (رقم 1). تم تركيز ناتج الترشيح حتى الجفاف في مبخر دوار (Hei-VAP ، Heidolph ، ألمانيا) عند 50 درجة وتم تجفيفه لاحقًا بواسطة مجفف التجميد. كان استخراج الإيثانول من محاصيل السل (ETB) و FB (EFB) 5.21 و 6.53 في المائة على التوالي. تم استخدام Thedregs لاستخراج عديد السكاريد الخام عن طريق التشتت في 80 درجة من الماء لمدة 4 ساعات والترسيب باستخدام الإيثانول [31]. كانت عوائد السكاريد من السل (PTB) و FB (PFB) 14.75 في المائة و 6.45 في المائة على التوالي.

استخراج cistanche

تحليل كيميائي

تم إجراء التحليل الكيميائي على كروماتوجرافيا سائلة فائقة الأداء جنبًا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي الترادفي الرباعي (UPLC-Q-TOF-MS / MS). تم إجراء الفصل الكروماتوغرافي على درجة حرارة Waters Acquity UPLC (Waters Corp. ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة) مع عمود WatersBEH Shield RP C18 (1 0 0 × 2.1 مم ، 1.7 ميكرومتر) عند 3 { {43}} درجة. يتكون الطور المتحرك من 0.1 في المائة من حمض الفورميك في الماء (أ) وأسيتونيتريل (ب) ، مع تدرج خطي: ​​0-3 دقائق ، 5-16 في المائة ب ؛ 3-8 دقائق ، 16-30 في المائة ب ؛ 8-10 دقائق ، 30-35 في المائة ب ؛ 10-15 دقيقة ، 35-55 في المائة ب ؛ 15-18 دقيقة ، 55-80 في المائة ب ، 18-19 دقيقة ، 80-5 في المائة ب ؛ 19-20 دقيقة ، 5 بالمائة ب. كان معدل التدفق 0.3 مل / دقيقة ، وكان حجم الحقن 2 ميكرولتر.

تم إجراء تجارب TOF-MS / MS باستخدام مقياس الطيف الكتلي AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX ، Foster City ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) المجهز بتأين بالرش الكهربائي (ESI). تم إجراء الكشف عن MS بطريقة التأين السلبي. تم تعيين المعلمات على النحو التالي: درجة حرارة المصدر والذوبان كانت 100 درجة و 450 درجة على التوالي ؛ كان معدل تدفق غاز الذوبان 900 لتر / ساعة ؛ كان الجهد الشعري 2 كيلو فولت. كان جهد المخروط 40 فولت ؛ كانت طاقة الاصطدام 22 فولت. وكان المسح الضوئي الكامل من 100 إلى 2000 دا.

مقايسات مضادات الأكسدة نشاط الكسح الجذري DPPH

تم تحديد نشاط الكسح الجذري لـ DPPH وفقًا لـ Ali et al. مع تعديلات طفيفة [32]. باختصار ، تم خلط 5 0 عينة من محلول اختبار ميكرولتر مع 15 0 μLDPPH من محلول الإيثانول (0.2 ملي مولار) في 96- أطباق جيدة وتم الاحتفاظ بها في الظلام لمدة 30 دقيقة . تم تقييم امتصاص المزيج عند 517 نانومتر (A1) بواسطة مقياس طيف الصفيحة الدقيقة (Thermo Fisher Scientific ، أمريكا). تم تعيين المحلول الفارغ بدون عينة الاختبار الممزوجة بمحلول DPPHethanol كمجموعة موجبة (A0). تم تعيين الحل الفارغ بدون DPPH الممزوج بعينات الاختبار كمجموعة فارغة (A2). تم تنفيذ جميع التجارب في ثلاث نسخ. تم حساب كسح جذور DPPH باستخدام الصيغة التالية:

معدل الكسح الجذري لـ DPPH (النسبة المئوية) {{0} [A 0- (A 1- A2)] / A0 × 100 بالمائة.

نشاط الكسح الجذري ABTS

تم قياس قدرة الكسح الجذري ABTS باستخدام الطريقة التي وصفها علي وآخرون. [32]. باختصار ، تم خلط محلول مائي 7mMABST مع 2.45 ملي مولار من بيرسلفات البوتاسيوم بنسبة 1: 1 (حجم / حجم) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 16 ساعة للحصول على محلول ABST بالإضافة إلى المخزون. تم تخفيف محلول المخزون بمحلول ملحي منظم الفوسفات (PBS) لضبط امتصاص (0. 72 ± 0. 2) عند 734 نانومتر. تم خلط 20 ميكرولتر من عينات الاختبار بتركيزات مختلفة تمامًا باستخدام محلول ABTS + 180 ميكرولتر. تم الاحتفاظ بالمخاليط التفاعلية في الظلام لمدة 5 دقائق وبعد ذلك تم قياس الامتصاص (B1) عند 734 نانومتر. تم ضبط امتصاص المخاليط بدون عينة الاختبار و ABST plus على B و B على التوالي. تم تنفيذ جميع التجارب في ثلاث نسخ. تم حساب معدل الكسح الجذري ABTS وفقًا للصيغة التالية:

معدل الكسح الجذري لـ ABTS (النسبة المئوية) {{0} [B 0- (B 1- B2)] / B0 × 100 بالمائة.

مقايسة قدرة مضادات الأكسدة الحديديك (FRAP)

تم تحديد نشاط تقليل الحديد الحديديك وفقًا للإجراءات بواسطة Kosakowska et al. [33]. تم خلط 3 0 0mM acetate buffer 10mM TPTZ (2،4، 6- tris (2- pyridyl) -s-triazine) و 20 mM FeCl3 عند a (v / v / v) نسبة 10: 1: 1 أعدت كاشف العمل. تم خلط 100 ميكرولتر من كل عينات اختبار مع كاشف عمل TPTZ 100 ميكرولتر ، وحضنت عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة وتم تحديد الامتصاص عند 593 نانومتر. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام سلسلة من الحلول القياسية FeSO4 في نطاقات التركيز من 0-1000 ميكروغرام / مل لتحضير منحنى المعايرة. تم حساب قدرة الاختزال الحديدي في تكوين مركب Fe2 plus -TPTZ الأزرق المكثف. تم التعبير عن النتائج على أنها Fe2 بالإضافة إلى قدرة مضادات الأكسدة (مليمول FeSO4 / جم من الاستخراج).

النشاط المثبط للتيروزيناز

تم تحديد الأنشطة المثبطة للتيروزيناز بالطريقة الطيفية باستخدام L-DOPA كركيزة [34]. باختصار ، تم خلط 50 ميكرولتر من محاليل العينات بتركيزات مختلفة مع 50 ميكرولتر من التيروزيناز (200 وحدة / مل ، محلول فوسفات 6.8 مذاب) في 96- بئر أطباق وحضنت لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة. بدأ التفاعل بعد ذلك بطرح L-DOPA (50 ميكرولتر). بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة ، تم تحديد الامتصاصية عند 490 نانومتر (Aa) باستخدام مقياس الطيف الضوئي متعدد الصفيحة السماوية (ThermoFisher Scientific ، أمريكا). وبالمثل ، تم اكتشاف امتصاص آبار العينة بدون التيروزيناز (Ab) وبئر التحكم مع إنزيم ولكن بدون عينة (Ab) في نفس الوقت. تم حساب النشاط المثبط للتيروزيناز بالمعادلة على النحو التالي:

معدل مثبطات التيروزيناز (بالمائة)=[1− (Aa - Ab) / Ac] × 100 بالمائة.

تم حساب IC50 باستخدام معادلة GraphPad Prism على النحو التالي:

ص=دقيقة زائد (حد أقصى - دقيقة) / 1 زائد 10 (x − logIC50) × منحدر التل

يمثل X تركيز المثبط ؛ تمثل Y بيانات التثبيط (النسبة المئوية) جنبًا إلى جنب مع القيم الدنيا (الدنيا) والقصوى (القصوى) ؛ منحدر التل هو عامل الانحدار.

يمنع Cistanche نشاط التيروزيناز.

مثبطات الميلانين في الزرد

أسماك الزرد البرية من النوع AB (مقدمة من شركة Hunter Bio-technology، Inc. ، Hangzhou ، مقاطعة Zhejiang) تم تسكينها في مياه الأسماك (0. 2٪ ملح المحيط الفوري في المياه منزوعة الأيونات ، ودرجة الحموضة 6.9-7.2 ، والتوصيل 48 { {18}} - 510 مللي ثانية / سم ، والصلابة 53.7-71.6 ملليجرام / لتر كربونات الكالسيوم 3) في فترة ضوئية خفيفة / داكنة 14/10 ساعات عند درجة حرارة ثابتة 28 ± 0.5 درجة ، ويتم إطعام الأرتيميا الحية مرتين يوميًا. تم الحصول على zebrafishembryos من التبويض الطبيعي وتم جمعها في غضون 30 دقيقة. تم اعتماد اختبار الزرد من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية الحيوان المختبرية (AAALAC). تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل IACUC (لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية) في شركة Hunter Biotechnology ، Inc. وكان رقم موافقة IACUC هو 001458.

تمت معالجة الأجنة في مرحلة 6 ساعات بعد الإخصاب (hpf) لكل مستخلص بستة تركيزات (1 0 ، 30 ، 62.5 ، 125 ، 250 و 500 ملجم / لتر) لمدة 72 ساعة لتقييم أقصى تركيز غير مميت (MNLC ). نتيجة لذلك ، كانت MNLCs لجميع المستخلصات أكثر من 62.50 ملجم / لتر 10 أجنة تم وضعها في 6- جيدًا وتم تعريض عينات مجهولة بتركيزات 10 و 30 مجم / لتر من 6 حصان إلى 54 حصانًا (تعرض لمدة 48 ساعة) ). تم استخدام DMSO (0.05 بالمائة ، حجم / حجم) واربوتين (10 و 30 مجم / لتر) كعنصر تحكم طبيعي وإيجابي ، على التوالي.

تم جمع الأجنة المتزامنة ومراقبتها تحت مجهر مجسم (SZX7 ، أوليمبوس ، اليابان) مزود بكاميرا رقمية (VertA1 ، الصين). تم حساب تراكم الميلانين ، المرتبط مباشرة بمناطق تصبغ الزرد ، باستخدام برنامج معالجة الصور GNUImage (GIMP الإصدار 2.10.2) وتم التعبير عنه كنسبة مئوية فيما يتعلق بالتحكم السلبي (تراكم الميلانين بنسبة 100 في المائة) [28 ، 30].

دراسة الالتحام الجزيئي

158 مركبًا معزولًا من ب. و 10 مركبات أخرى ، كانت تستخدم بروابط. تم رسم الهياكل ثلاثية الأبعاد بواسطة ChemBio3D وتم تحسينها باستخدام أدوات MM2 و Autodock. تم استرداد التركيب البلوري ثلاثي الأبعاد للتيروزيناز (PDBID: 5M8N) و adenylate cyclase (PDB ID: 5IV3) من بنك بيانات البروتين RCSB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). تمت إزالة جميع جزيئات الماء والذرات غير المتجانسة من الهياكل البلورية باستخدام Chimera و MGL Tools. أخيرًا ، Autodock

تم استخدام Vina لربط بروتين المستقبل بروابط الجزيئات الصغيرة. تم تعيين معلمات موقع الالتحام المؤيد للمستقبل على شكل −36.700 ، 7.034 ، 19.104 ، و - 17.467 ، - 22.807 ، 2.786 ، على التوالي ، وفقًا لـ ligand mimosine الأصلي و LRE1 [35]. من أجل تحقيق دقة حسابية أعلى ، تم إنشاء 20 معلمة شمولية لكل مستقبل ، وتم اختيار التشابه مع أعلى درجة من التقارب في التشكل النهائي لرسو السفن وتصور في Pymol2.3. وفي الوقت نفسه ، تم أخذ ligands mimosine الأصلي و LRE1 كعنصر تحكم إيجابي [36].

في Silico ADMET التنبؤ

امتلكت أفضل 3 نتائج من B. striata تقارب ارتباط أفضل مع التيروزيناز و adenylate cyclase ، خاضعين لتحليل ADMET. تم استخدام QikProp في Schrodingersuite لحساب الخصائص الفيزيائية والخصائص المتعلقة بالأدوية ، بما في ذلك الوزن الجزيئي (MW) ، ومعامل تقسيم الأوكتانول / الماء المتوقع (QPlogPo / w) ، والذوبان المائي المتوقع (QPlogS) ، وخلية Caco الظاهرة المتوقعة -2 نفاذية حاجز الدم المعوي (QPPCaco) ، معامل تقسيم الدماغ / الدم المتوقع (QPlogBB) ، نفاذية الجلد المتوقعة (QPlogKp) ، توقع IC50 لانسداد قنوات HERGK plus (QPlog HERG) وتوقع امتصاص الفم البشري. تم تقييم الخصائص بناءً على قاعدة ليبين سكي المكونة من خمسة وأدبيات [37 ، 38].

محاكاة الديناميات الجزيئية

من أجل فحص الاستقرار والتقلبات الديناميكية لمركب بروتين يجند تحت بيئة بيولوجية محاكية ، والتحقق من نتائج الالتحام ، تم اختيار مركبات بليسترين D (75) على أنها ligand لدراسة محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) ، بناءً على نتيجة الالتحام الجزيئي. تم إجراء محاكاة MD مع مركب blestrin D مع حلقي التيروزيناز والأدينيلات لمدة 100 نانوثانية ، باستخدام وضع الماء TIP3P. تم حساب قيم الانحراف التربيعي لمتوسط ​​الجذر (RMSD) لذرات العمود الفقري للبروتين بالنسبة إلى الهيكل الأولي لفحص ثبات البروتين على مدار فترة المحاكاة [39].

نتائج

التركيب الكيميائي

تم عرض كروماتوجرام ذروة القاعدة النموذجية لكروماتوجرام ETB و EFB في الشكل 1. تم استخدام برنامج PeakView لتحديد المكونات. تم تعيين الصيغة الجزيئية بدقة ضمن خطأ جماعي قدره 10 جزء في المليون. تم استخدام الوزن الجزيئي الدقيق والشظايا لتحديد المكونات وفقًا للأرقام وقاعدة بيانات التركيب الكيميائي الحر ، مثل ChemSpider و Massbank. نتيجة لذلك ، تم تحديد 39 تركيبة كيميائية ، بما في ذلك 24 stilbenoids (bibenzyls ، phenanthrenes ومشتقاتهما) ، 6 جليكوسيدات ، 4 أحماض فينولية ، 3 كينونات ، 1 ستيرويد ، ومركب واحد آخر مبدئيًا من EFB و ETB. في نفس الوقت ، تم إجراء القياس شبه الكمي النسبي لها عن طريق قياس مناطق الذروة لكل مركب في وضع MS باستخدام كروماتوجرام الأيونات المستخرجة [40]. التركيز) في الجدول 1.

القدرة المضادة للأكسدة

من المعروف أن الأشعة فوق البنفسجية أ (UVA) - الإشعاع يمكنها تحفيز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والتوسط في تكوين الميلانين المفرط في خلايا الجلد. كان البوليفينول الطبيعي مثبطات لتوليد ROS ويمكن أن يكون مسؤولاً عن النشاط المضاد لتولد الميلانين في المستخلصات النباتية. ، 42]. وهكذا ، في الدراسة الحالية ، تم تقييم القدرة المضادة للأكسدة من خلال DPPH ، ونشاط الكسح الجذري ABTS و FRAPassay. أظهرت النتائج (الجدول 2 والشكل 2) أن EFB (IC 50=5. 94mg / L) تمتلك أقوى نشاط لكسح جذري DPPH في المختبر مقارنة بـ PTB (IC 50=548. 24 مجم / لتر) و PFB (IC 50=285. 81 مجم / لتر) و ETB (IC 50=65. 25 مجم / لتر). ولوحظ اتجاه مماثل في مقايسة ABTS و FRAP. تحتوي المستخلصات الإيثانولية البالغة 95 في المائة من السل و PB على نشاط مضاد للأكسدة أقوى في المختبر من عديد السكاريد الخام. بالإضافة إلى ذلك ، يُظهر EFB نشاطًا مضادًا للأكسدة من ETB ، والذي كان متسقًا مع نتائج البحث السابقة [25].

النشاط المثبط للتيروزيناز

كان Tyrosinase هو الإنزيم الرئيسي الذي يحد من المعدل في مسار تخليق الميلانين الحيوي ، وكان يستخدم على نطاق واسع لتحديد إمكانات المنتجات الطبيعية ذات التأثير المضاد لتكوين الميلانين [43]. أظهرت النتائج (الشكل 3) أن ETB وEPB لهما نشاط مثبط أقوى للتيروزيناز من PTBand PPB في المختبر ، والذي كان متسقًا مع نتائج البحث السابقة [25]. أظهر EFB نشاطًا أقوى لتثبيط التيروزيناز بطريقة تعتمد على الجرعة (بين 20 و 200 مجم / لتر) باستخدام IC 50=58. 92 مجم / لتر من ETB (IC 50=75. 44 مجم / لتر) والمركب الإيجابي أربوتين (IC {{ {11}}. 02 مجم / لتر).

مثبطات الميلانين في الزرد

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{0}. 05) ، مشيرًا إلى أن المادة 0.05٪ DMSO لم تؤثر على إنتاج الميلانين في أجنة الزرد. ومع ذلك ، بعد التعرض للعينات المختبرة والأربوتين لمدة 48 ساعة ، أظهر أجنة الزرد درجات متفاوتة من ترسب الميلانين (الأشكال 3 ب ، 4) ، باستثناء مجموعة PFB 10 مجم / لتر. من الملاحظ أن محتويات الميلانين النسبية في ETB 10 مجم / لتر (78.38 بالمائة) و ​​30 مجم / لتر (64.72 بالمائة) كانت أقل بكثير من تلك الموجودة في مجموعات PTB 10 مجم / لتر (93.06 بالمائة) و ​​30 مجم / لتر (82.02 بالمائة) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

الالتحام الجزيئي

Tyrosinase هو إنزيم يحد من المعدل في التخليق الحيوي للميلانين: hydroxylation من tyrosine to 3 ، 4- dihydroxy-phenylalanine (DOPA) ، وأكسدة DOPA todopaquinone. لذلك ، تم اعتبار التيروزيناز هدفًا حاسمًا لتطوير مثبطات تكون الميلانين [44]. بالإضافة إلى ذلك ، يعد adenylatecyclase الإنزيم الرئيسي لتكوين الميلانين الناجم عن cAMP. أدى ارتباط الميلانوتروبين ألفا بولي ببتيد (-MSH) بمستقبلات MC1R إلى تنشيط إنزيم الأدينيلات ، وزيادة مستوى cAMP ، والتعبير المنظم لجين التيروزيناز ، وبالتالي زيادة تخليق الميلانين [45]. لذلك ، أجرينا دراسة الالتحام الجزيئي لـ 158 مركبًا معزولة من B. striata سابقًا [2] ، مع التيروزيناز وإنزيم الأدينيلات. تم تلخيص طاقات الربط للروابط المدروسة مع التيروزيناز والأدينيلات سيكلاز في الجدول S1. كان هناك 83 مركبًا (بما في ذلك 6 0 stilbenoids) و 85 مركبًا (بما في ذلك 70 stilbenoids) تُظهر ارتباطًا أقوى إلى جانب tyrosinase و adenylate cyclase ، مقارنة مع تلك المركبات الأصلية ligands mimosine (- 6.4 كيلو كالوري / مول) و LRE1 (- 8.5 كيلو كالوري / مول). 1 ، 8- مكرر (p-hydroxybenzyl) -4- methoxyphenanthrene -2 ، 7- ديول (56) ، بليسترين D (75) ، و 2 ، 7- ثنائي هيدروكسي -1 ، 6- مكرر (p-hydroxybenzyl) -4- meth-oxy -9 ، 10- dihydrophenanthrene (93) كانت أعلى ثلاثة أرقام تجاه التيروزيناز ، مع طاقة ملزمة −10.2 ، 10.0 ، 9.7 كيلو كالوري / مول ، كل على حدة. بينما blestrin D (75) ، blestrin B (73) ، و 3،3′-dihydroxy -5- methoxy -2 ، 5 ′ ، 6- tris (p-hydroxybenzyl) bibenzyl (42) كانت الروابط الثلاثة العلوية تجاه إنزيم الأدينيلات ، مع طاقة ملزمة - 12.1 ، - 11.9 ، و - 11.6 كيلو كالوري / مول ، على التوالي. تم تلخيص تقاربات الارتباط النظرية وتفاعلات اللجين مع الأحماض الأمينية في الجدول 3.

تجدر الإشارة إلى أن blestrin D (75) ، مركب ثنائي الفينانثرين ، دخل في جيب الربط من التيروزيناز وأدينيلات محلقة (الشكل 5) ، وأظهر ارتباطات ارتباط كبيرة تجاه كل من إنزيم التيروزيناز والأدينيلات. تساهم تفاعلات Van der Walls في القيمة الإجمالية لتفاعل الطاقة ، وفي الوقت نفسه تنتج مجموعة الهيدروكسيل روابط هيدروجينية مع بقايا الأحماض الأمينية Glu 451 ، و Arg114 من التيروزيناز ، و Val 167 of adenylate cyclase ، كل على حدة (الجدول 3 والشكل S1). أظهر المركب 93 أيضًا ارتباطات ارتباط كبيرة نحو التيروزيناز من خلال تكوين 6 أحواض هيدروجينية مع بقايا الأحماض الأمينية Glu232 و Glu451 و Ser106 و Cys113 و Lys223 و Gln236.

في Silico ADMET التنبؤ

تم تلخيص القيم المتوقعة للعديد من المعلمات المهمة جنبًا إلى جنب مع النطاق المقبول لها في الجدول 4. بصرف النظر عن QPlogS البالغ 3،3 ′ ، 5- تريميثوكسي بيبينزيل ، بليسترين ب ، بليسترين د ، و QPlogBBof 3،3 ′ ، {{6} } trimethoxybibenzyl ، وجميع خصائص ADMET المحسوبة الأخرى لأفضل ثلاث نتائج كانت ضمن النطاقات المتوقعة ، وفي الوقت نفسه ، كانت QPlog HERG لجميع النتائج الثلاثة الأولى أقل من −5 ، مما يشير إلى أنها كانت قابلة للتعاطي للاستخدام البشري. QPlog Kp من جميع النتائج الثلاثة الأولى لكل من التيروزيناز والأدينيلات سيكلاز ، باستثناء 3،3 ′ ، 5- تريميثوكسي بيبنزيل ، كانت في النطاق المفضل ، مما يشير إلى أن هذه المركبات يمكن أن تخترق الجلد بسهولة.

المحاكاة الديناميكية الجزيئية

أظهرت مؤامرة RMSD أن قيم RMSD لمركب بروتين-يجند لم تتقلب بشكل كبير خلال فترة المحاكاة بأكملها. تم تحديد قيم RMSD (الشكل 6 أ) لـ blestrin D مع مركب tyrosinase و ade-nylate cyclase تتراوح من 1.5 إلى 2.8 ، ومن 2. 0 إلى 3.6 ، على التوالي. تعكس قيمة RMSF مرونة كل محاكاة متبقية. كشفت البقايا ذات قيم RMSF الأعلى أنها كانت أكثر مرونة (الشكل 6 ب). تم العثور على قيم RMSF لبقايا الأحماض الأمينية في مناطق الحلقة لتقلبات عالية. بينما ، احتفظت قيم المواقع النشطة بقيمة RMSF صغيرة (أقل من 1. 0 Å) ، مثل Arg114 و Val167 و Tyr226 و Leu229 و Arg230in tyrosinase و Val167 و Leu102 و Phe45 و Lys95 وLeu166 في adenylate cyclase ، مشيرا إلى أن جيوب الربط ظلت مستقرة. التفاعلات الجزيئية لـ blestrin D مع التيروزيناز و adenylate cyclase مذكورة في الشكل 7.

تم حساب الطاقات الحرة الملزمة من خلال طريقة مساحة السطح المعممة للميكانيكا الجزيئية (MM-GBSA) [39]. كانت الطاقة الحرة الملزمة المتوقعة لـ blestrin D مع tyrosinase و adenylatecyclase − 96.94kcal / mol و 139.69kcal / mol ، على التوالي ، مما يعني أن تفاعلات الربط كانت تلقائية (الجدول 5). علاوة على ذلك ، كانت المساهمات التي تفضل الارتباط بالرابط هي تفاعل الذوبان غير القطبي ، والتفاعل الكهروستاتيكي.

وتجدر الإشارة إلى أن أنواع ومحتويات المكونات الكيميائية في EFB كانت أكثر من تلك الموجودة في inETB. كانت مناطق الذروة لجميع المركبات المحددة في EFB تقريبًا ضعف تلك الموجودة في ETB. كانت Mili-tarine هي أكثر المركبات وفرة في كل من EFBand ETB ، والتي تمتلك أنشطة كبيرة مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات والحماية العصبية ، وتم اختيارها كواسمات كيميائية لمراقبة جودة B. striata في طبعة 2020 دستور الأدوية الصيني. كانت منطقة الذروة النسبية للجيش العسكري inEFB (38.39 × 106) أعلى قليلاً من تلك الموجودة في ETB (30.48 × 106). يعتبر Gastrodin مركبًا معروفًا في العديد من الأدوية العشبية الصينية ، مثل Gastrodia elata ، والذي يُظهر تأثيرات مثبطة لانزيم التيروزيناز وتأثيرات مسح كالاشعاع [30]. كانت منطقة الذروة النسبية للجاسترودين في EFB (1.43 × 106) أقل قليلاً من تلك الموجودة في inETB (2.17 × 106).

كان للمستخلصات الإيثانولية البالغة 95 في المائة من السل و PB نشاط أقوى في الأكسدة في المختبر من بوليساك شارايد الخام. بالإضافة إلى ذلك ، يُظهر EFB نشاطًا مضادًا للأكسدة أقوى من ETB ، والذي كان متسقًا مع نتائج البحث السابقة [25]. يمكن أن تُعزى هذه الظاهرة إلى أن EFB تحتوي على مستوى أعلى من مركبات مضادات الأكسدة ، مثل الميليتارين والستيلبينويدس (البوليفينول الطبيعي). على سبيل المثال ، منطقة الذروة النسبية 4،8،4 ، 8′-tetramethoxy- [1،1′-biphenanthrene] -2 ، 7،2 ′ ، 7′-tetrol ، ثنائي الفينانثرين مع أربع مجموعات هيدروكسيل الفينول ، كان 9.15 × 1 0 6 في FB ، بينما كان 0.01 × 106 بوصة تيرابايت.

في هذه الدراسة ، أظهر PPB و PTB نشاطًا طفيفًا لتثبيط التيروزيناز بطريقة تعتمد على الجرعة ، ومع ذلك ، فقد أظهر أنه لم يتم اكتشاف أي نشاط في المستخلص المائي لـ PB (يحتوي على PPB) [25]. قد تكون هذه الظاهرة ناتجة عن تحضير العينة المختلف. تم استخدام المستخلص المائي لـ PB لتقييم النشاط التثبيطي للـ PB في تجربة Jiang [25] ، بينما في هذه الدراسة ، كان المستخلص المائي عبارة عن ترسيب مع الإيثانول للحصول على عديد السكاريد الخام.

في الآونة الأخيرة ، يستخدم نموذج الزرد على نطاق واسع في تقييم التأثير المضاد لتكوين الميلانين في الجسم الحي [47 ، 48]. تم تعيين Arbu-tin ، وهو مركب هيدروكينون غلوكوزيد موجود في النباتات غير المتغيرة ، والذي تم استخدامه تجاريًا في صناعة مستحضرات التجميل ، كعنصر تحكم إيجابي. كانت الأنشطة المضادة لتكوين الميلانين لكل من ETB و EFB أقوى من أنشطة arbutin ، مما يشير إلى أن ETB و EFB يمكن أن يتم تطبيقهما كعوامل تفتيح البشرة في صناعة مستحضرات التجميل.

تبلغ مساحة الذروة النسبية لـ blestrin D في EFB (1.91 × 1 0 6) تقريبًا أربعة أضعاف تلك الموجودة في ETB (0. 46 × 1 0). مساحة الذروة النسبية للمركب 56 (8.73 × 1 0 6) و 93 (0.64 × 106) في EFB هي أيضًا أعلى بكثير من تلك الموجودة في ETB (أقل من 0.01 × 106 و 0.10 × 106). قد يكون هذا أحد الأسباب التي تجعل EFB تُظهر تأثيرات أقوى مضادة للميلانين من ETB. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن الروابط الثلاثة الأولى تجاه التيروزيناز والأدينيلات سيكلز تنتمي جميعها إلى الستيلبينويدات (البينزيل ، الفينانثرين ومشتقاته). التي جذبت اهتمامًا كبيرًا في السنوات الماضية بسبب نشاطها الحيوي الملحوظ مثل النشاط المضاد للالتهابات ومضادات الميكروبات ومضادات الأكسدة [49]. ريسفيراترول هو الستيلبينويد الأكثر شيوعًا. أشار البحث السابق إلى أن الريسفيراترول ومشتقاته يمكن أن تثبط بشكل كبير النشاط التحفيزي والتعبير الجيني والتعديلات اللاحقة للترجمة للتيروزيناز. وبالتالي ، فقد أظهروا فائدة محتملة كعوامل لتفتيح البشرة ومضادة للشيخوخة في مستحضرات التجميل [41 ، 50].

أظهر Cistanche أنه يحتمل أن يكون مفيدًا مثل تفتيح البشرة وعوامل مضادة للشيخوخة في مستحضرات التجميل.

لمزيد من المعلومات ، الرجاء الضغط على الصورة.

الاستنتاجات

في هذه الدراسة ، تم فحص النشاط المضاد للأكسدة ومضاد الميلانوجين لعديد السكاريد الخام من B. . أظهرت النتائج أن EFB تمتلك أقوى DPPH و ABTS وفعالية الكسح الجذري ونشاط تقليل الحديد الحديديك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يقلل ETB و EFB بشكل كبير من نشاط إنزيم التيروزيناز في تخليق المختبر والميلانين لأجنة الزرد بطريقة تعتمد على الجرعة. أشار الالتحام الجزيئي إلى وجود عدد كبير من المركبات ، ينتمي معظمها إلى الستيلبينويدس ، مما يظهر ارتباطات ارتباط أقوى تجاه التيروزيناز وأدينيلات سيكلاز ، مقارنة بألفة الارتباط للرابط الأصلي. تدعم النتائج الحالية الأساس المنطقي لاستخدام ETB و EFB كعوامل طبيعية لتبييض البشرة في الصناعات الدوائية ومستحضرات التجميل.