كيف يزيد Cistanche echinacoside من الأندروجين من خلال الخلايا البطانية؟

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

الملخص.

Echinacoside (ECH) مركب طبيعي له تأثير موسع للأوعية يعتمد على البطانة. أكسيد النيتريك (NO) هو مهم للأوعية الدموية يتم إطلاقه من الخلايا البطانية. من أجل فحص الآلية الجزيئية لإنتاج NO الناجم عن ECH في الخلايا البطانية ، بحثت الدراسة الحالية في تورط مستقبلات الأندروجين (AR) وفوسفاتيديلينوسيتول 3- كيناز (PI3K) / مسار بروتين كيناز ب (Akt) في فسفرة سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) في الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). باستخدام مسبار الفلورسنت DAF ‑ FM ، تم العثور على زيادة كبيرة في إنتاج NO ، وتم فسفرة eNOS في Ser1177 بطريقة تعتمد على التركيز تحت 0. 01-10 µM ECH في HUVECs. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل إنتاج NO و eNOS فسفرة الناجم عن ECH عند المعالجة المسبقة بمضاد AR nilutamide ، أو عند نقله باستخدام AR صغيرة متداخلة RNAs. علاوة على ذلك ، تم إلغاء الفسفرة المستحثة بـ ECH لـ Akt في Ser473 بواسطة 5 ميكرومتر من wortmannin (مثبط PI3K). أشارت هذه البيانات إلى أن ECH لم يحفز أي إنتاج عبر التنشيط المعتمد على AR لـ eNOS في HUVECs وأن مسار PI3K / Akt قد يكون متورطًا في فسفرة eNOS الناجم عن ECH.

Cistanche deserticola له العديد من التأثيرات ، انقر هنا لمعرفة المزيد

مقدمة

سيستانش هوفمان. Et Link هو عشب طفيلي معمر من جنس عائلة Orobanchaceae. هيرباسيستانش، جذعCistanche DeserticolaYC MA وCistanche tubulosa(شينك). Cistanche هو عشب منشط تم استخدامه في العلاجنقص الكلى والعجز الجنسي، الإفرازات الدهنية المهووسة ، وإمساك الشيخوخة (1) ، والتي قد تكون بسبب تأثيرها التنظيمي الشبيه بالأندروجين أو الهرمون الجنسي (2). Echinacoside (ECH ؛ C35H46O20 ؛ الوزن الجزيئي ، 786.73 ؛ الشكل 1) ، هو أحد جليكوسيدات الفينيثانويد (PhGs) المعزولة من سيقان Herbaسيستانشويعرض خصائص بيولوجية متعددة ، بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومضادة للشيخوخة ، ومضادة للالتهابات ، ووقاية الكبد ، وتأثيرات الحماية العصبية (3). أثبتت الدراسات الصيدلانية الحديثة أن مختلف مكونات Herbaسيستانش، بما في ذلك ECH ،أكتيوسيدو kankanose و Lankan side F و والسيستانوسيدF ، عرض نشاط vasorelaxant (4).

البطانة هي منظم مهم للأوعية الدموية ، وأكسيد النيتريك (NO) هو عامل استرخاء مهم يفرزهالخلايا البطانية.من خلال الانتشار في خلايا العضلات الملساء ، ينشط NO إنزيم guanylate cyclase ، ويزيد من مستويات أحادي الفوسفات الدوري (cGMP) ، ثم ينشط كينازات البروتين المعتمدة على cGMP (PKGs) لتعزيز استرخاء العضلات الملساء (5). لقد تم إثبات أن ECH عند 350-400 ميكرومتر يعمل بشكل مباشر على العضلات الملساء الوعائية ويمنع الانتشار الناجم عن نقص الأكسجة في خلايا العضلات الملساء للشريان الرئوي لدى الفئران (6) ، في حين أن 30-300 µM ECH تسبب في تباطؤ الأوعية الحاد في البطانة- حلقات سليمة بطريقة تعتمد على التركيز ، وإنتاج cGMP محسن في الجسم الكهفي للعضلات الملساء للحلقات الأبهرية المتعاقد عليها بفينيليفرين (7). من خلال فتح قنوات NO-cGMP-PKG-BKCa في خلايا العضلات الملساء ، قام 100 أو 300 ميكرومتر من ECH بقمع الانقباض الناجم عن النورادرينالين في الشرايين الرئوية للفئران ، خاصة في الحلقات المغطاة بالبطانة (8).الخلايا البطانيةهي المنظمين الرئيسيين لوظيفة القلب والأوعية الدموية ، وفي العديد من الحالات ، وجد أن الاسترخاء المعتمد على البطانة كان بسبب مادة قابلة للنقل ، مثل NO ، المنبعثة من البطانة (9). ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية المنبع لإنتاج NO الناجم عن ECH في الأوعية الدمويةالخلايا البطانيةيتطلب مزيد من التحقيق. في البطانة الوعائية ، يتم التوسط في توليد NO بشكل أساسي بواسطة NO synthase البطاني (eNOS). أظهرت عدة مجموعات أن مسار فوسفاتيديلينوسيتول 3- كيناز (PI3K) ينشط بروتين سيرين ثريونين كيناز B (Akt) ، والذي يتسبب في فسفرة eNOS مباشرة في سيرين 1177 (Ser1177) (10). مستقبل الاندروجين (AR) هو عضو في فصيلة المستقبلات النووية s3 ، والتي تعدل بشكل قانوني التعبير الجيني. يشارك توطين AR إلى الكهوف في غشاء الخلية في التنظيم غير الجيني لوظيفة الخلايا البطانية أو التعبير الجيني عن طريق تشغيل سلسلة c-Src / PI3K / Akt ، والتي تؤدي في النهاية إلى فسفرة eNOS وإنتاج NO (11). في الشريان الأورطي البشريالخلايا البطانية، تم الإبلاغ عن هرمون التستوستيرون لتنشيط إشارات PI3K / Akt والحث بسرعة على عدم الإنتاج بسبب التفاعل المباشر لـ AR والوحدة الفرعية p85 من PI3K على نظام القلب والأوعية الدموية (12). تم الإبلاغ عن أن ECH يؤدي إلى تفاقم الأعراض المرتبطة بنقص الهرمون ويمارس آثاره الشبيهة بالأندروجين بسبب الارتباط التنافسي مع AR بدلاً من التستوستيرون (2). لذلك ، افترضت الدراسة الحالية أن مسار PI3K / Akt قد يكون متورطًا في إنتاج NO من خلال فسفرة eNOS المعتمدة على AR الناجم عن ECH. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم التأثيرات التالية لـ ECH: 1) تحريض إنتاج NO وفسفرة eNOS ؛ 2) مشاركة AR في فسفرة eNOS ، و 3) تنشيط مسار PI3K / Akt في الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) ، وهو نموذج تجريبي معروف لدراسة تنظيم وظائف الخلايا البطانية وتكوين الأوعية (13).

المواد والأساليب

المواد الكيميائية والكواشف. تم الحصول على ECH (نقاء ، 92.5 بالمائة) من المعايير المرجعية للأدوية الوطنية في المعهد الوطني لمراقبة الغذاء والدواء. تم شراء الأجسام المضادة ضد p-Akt (Ser473 ، cat. no. ab8805) ، Akt (cat. no. ab81283) ، p-eNOS (Ser1177 ؛ cat. no. ab184154) ، و eNOS (cat. no. ab76198) من Abcam . تم الحصول على مثبطات nilutamide و ICI 182780 من Sigma-Aldrich ؛ ميرك KGaA. تم شراء L-NAME من Adamas-Beta، Ltd. وتم شراء Wortmannin من Pribolab.

زراعة الخلايا والعلاج من تعاطي المخدرات.

تم الحصول على HUVECs من ScienCell Research Laboratories Inc. وتم تربيتها فيخلية البطانيةمتوسط ​​(ECM ، ScienCell Research Laboratories) مع 5 بالمائة (v / v) مصل بقري جنيني (FBS ؛ Gibco ، Thermo Fisher Scientific ، Inc.) ومكمل نمو الخلايا البطانية بنسبة 1 بالمائة (ECGS) عند 37 درجة مئوية (5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة) (14). عند الوصول إلى التقاء ، تم هضم الخلايا مع التربسين وطليها في ECM بنسبة 1 بالمائة FBS و 1 بالمائة ECGS. بالنسبة لجميع التجارب ، تم طلاء HUVEC بتركيز 1 × 1 0 4 / مل ونمت حتى الوصول إلى نقطة التقاء. قبل العلاج بـ ECH أو المنبهات الأخرى ، تم تحضين الخلايا في ECM خالية من الفينول الأحمر بدون FBS و ECGs لمدة 6 ساعات للحث على توقف النمو. في التجارب المثبطة ، تم تحضين HUVECs مسبقًا بمضادات أو مثبطات مختلفة ، بما في ذلك 1 0 ميكرومتر من nilutamide ، 10 ميكرومتر ICI 182780 ، 0.5 ملي L-NAME أو 5 ميكرومتر من wortmannin ، لمدة 30 دقيقة ، مع أو بدون ECH ، عند 37 درجة مئوية. في جميع المجموعات ، بما في ذلك المجموعة الضابطة ، تم استخدام DMSO كمذيب بتركيزات متساوية قدرها 0.001 بالمائة.

قياس إنتاج NO داخل الخلايا.

تمت مراقبة التغييرات النسبية في تركيز NO العصاري الخلوي في HUVECs باستخدام مسبار NO الفلوري DAF FM (شركة كايمان الكيميائية) ، كما ورد سابقًا (12). باختصار ، تم تحميل الخلايا بـ 5 ميكرومتر DAF FM ثنائي أسيتات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في لوحة ميكروترية سوداء وشطفها عدة مرات باستخدام PBS (درجة الحموضة 7.4). تم تحديد التألق عند أطوال موجية للانبعاث والإثارة تبلغ 495 و 515 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية (Biotek Synergy H4 ؛ BioTek Instruments ، Inc.) ومجهر مقلوب مضغوط (Nikon eclipse Ts2R ؛ شركة Nikon).

تحليل لطخة غربية.

كما ورد سابقًا (15) ، تم غسل الطبقات الأحادية المتكدسة من الخلايا مرتين في PBS المثلج وتم فصلها باستخدام محلول RIPA (P 0 013D ؛ معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية). تم قياس تركيز البروتين في المادة الطافية باستخدام طريقة فحص حمض البيسينشونينيك (16). بعد ذلك ، تم تحميل 30 ميكروغرام من البروتين في كل حارة ، وفصلها باستخدام 10 في المائة من المواد الهلامية من البولي أكريلاميد ، ونقلها إلى أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين. تم حظر الأغشية باستخدام حليب مقشود بنسبة 5 في المائة لمدة ساعة عند 25 درجة مئوية. بعد الحضانة بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد Akt (1: 1 ، 000 التخفيف) ، p-Akt (التخفيف 1: 500) ، eNOS (1: 2 ، 000 التخفيف) ، أو p-eNOS (1 : 1 ، 000 التخفيف) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، تم غسل الأغشية بـ TBST (يحتوي على 0.1 بالمائة توين -20) 4 مرات لمدة 15 دقيقة تقريبًا لكل غسلة عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مترافقة ببيروكسيداز الفجل (1: 5 ، 000 تخفيف ؛ جسم مضاد للفأر ، القط. رقم A0216 ، أو جسم مضاد للأرانب ، القط رقم A0208 ، معهد بيوتايم. من التكنولوجيا الحيوية) لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية ، وتم الكشف عنها باستخدام مجموعة اللمعان الكيميائي المحسن (القط رقم 32209 ، Thermo Fisher Scientific ، Inc.). تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج تحليل Image J gel ، الإصدار 1.8. 0_112 (المعاهد الوطنية للصحة).

تدخل صغير (سي) إعداد الحمض النووي الريبي وتعداء.

تم تصنيع الحمض النووي الريبي الطويل مزدوج الشريطة بواسطة مرنا المستهدف لمستقبلات AR ومستقبلات الاستروجين (ER) مع التسلسلات الموضحة في الجدول الأول. وسط استزراع في أطباق 60 مم مغطاة بالكولاجين. تم إجراء تعداء 5 نانومتر AR-siRNA أو 10 نانومتر ER -siRNA مع كاشف Lipofectamine 3000 (Invitrogen ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) بشكل منفصل ، وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم تقييم كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق التحليل الكمي للنسخ العكسي PCR (RT-qPCR) ، كما ورد سابقًا (17). كانت ظروف التدوير الحراري كما يلي: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية ؛ 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ومنحنى ذوبان عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ؛ تم إجراء ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة لكل عينة. أجريت التجارب اللاحقة بعد 48 ساعة من تعداء العدوى. تم تصميم أزواج Primer باستخدام برنامج Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) بالتسلسلات التالية: AR forward ، 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA -3 'والعكس ، 5'-GACTTGTAGAGAGAGACAGGGTAGA -3' ؛ ER forward ، 5 '‑ CCAGTACCAATGACAAGGGAAG -3' وعكس ، 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA -3 '؛ و GAPDH للأمام ، 5'‑ CAGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA -3 'والعكس ، 5'-GGGTGGAATCATTGGAACATGT -3

تحليل احصائي.

يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري. تم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار Kruskal-Wallis أو ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق لمقارنات متعددة. ص<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتائج

لا يؤدي ECH إلى إنتاج وفسفرة eNOS.

كما هو مبين في الشكل 2 أ و ب ، أدت 1 ميكرومتر من ECH إلى زيادة كبيرة في إنتاج NO داخل الخلايا في HUVECs مقارنة بخلايا التحكم السلبية ، بينما تم تخفيف التأثير التحفيزي لـ ECH إلى مستوى التحكم عن طريق المعالجة المسبقة بـ L-NAME. للحصول على التركيز الأمثل ، تم اختبار فسفرة eNOS في 6 0 دقيقة بعد العلاج بـ ECH بتركيزات 0 ، 0. 0 1 ، 0. 1 و 1 و 10 ميكرومتر. كشفت النتائج أن ECH بتركيزات من 0.01 - 10 ميكرومتر قد تحفز بشكل كبير فسفرة eNOS عند Ser 1177 بطريقة تعتمد على التركيز ، مع ملاحظة أقصى قدر من فسفرة eNOS عند تحريض 10 ميكرومتر ECH (الشكل 2C و D). علاوة على ذلك ، تم فحص فسفرة eNOS في Ser1177 عن طريق تحليل اللطخة الغربية عند 0 و 5 و 15 و 30 و 60 و 120 دقيقة بعد الحضانة باستخدام 1 ميكرومتر من ECH. لوحظ أن فسفرة eNOS تم تشغيلها بسرعة بواسطة ECH عند 5 دقائق ، واستمرت في الزيادة حتى 30 دقيقة من الحضانة (الشكل 2E و F). بعد ذلك ، على الرغم من معالجة ECH ، ظل الحجم النسبي لفسفرة eNOS مستقرًا من 30 دقيقة فصاعدًا ؛ لذلك ، لم تؤثر ECH على التعبير الكلي لـ eNOS (الشكل 2C و E).

AR يتوسط ECH المستحث بـ NO و eNOS phosphorylation.

أظهر اختبار RT-qPCR أن التأثيرات المتداخلة لـ AR-siRNA -1 و ER -siRNA -2 كانت الأكثر نجاحًا في تثبيط التعبير عن AR و ER في HUVECs في هذه الدراسة (الشكل 3). ). بعد ذلك ، تم تطبيق مضاد لتحليل تثبيط الوظيفة AR و siRNA لتحليل فقدان الوظيفة AR لتقييم مشاركة AR في تنشيط eNOS الناجم عن ECH وإنتاج NO. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، أدت 1 ميكرومتر من ECH إلى زيادة كبيرة في إنتاج NO في HUVECs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ينشط ECH مسار PI3K / Akt.

في هذه الدراسة ، تم اختبار فسفرة Akt في Ser473 بعد 6 دقائق من حضانة ECH بتركيزات 0 ، 0. 0 1 ، 0. 1 و 1 و 10 ميكرومتر. أشارت النتائج إلى أن ECH (0. 01-10 ميكرومتر) قد تحفز بشكل كبير فسفرة Akt. بلغت مستويات التعبير النسبي لـ p-Akt ذروتها عند 1 و 10 ميكرومتر من علاج ECH (الشكل 5 أ و ب). علاوة على ذلك ، تم فحص فسفرة Akt عن طريق تحليل اللطخة الغربية عند 0 و 5 و 15 و 30 و 60 و 120 دقيقة بعد إضافة 1 ميكرومتر من ECH إلى ثقافات HUVEC. كما هو مبين في الشكل 5C و D ، زادت ECH بسرعة فسفرة Akt بعد 5 دقائق من الحضانة ، ولوحظ الحد الأقصى لمستوى البروتين لـ p-Akt عند 60 دقيقة. على النقيض من ذلك ، لم تؤثر ECH على إجمالي تعبير Akt (الشكل 5A و C). علاوة على ذلك ، لاستقصاء التأثير المحتمل لمسار PI3K على فسفرة eNOS ، تمت معالجة HUVECs مسبقًا باستخدام مثبط PI3K wortmannin قبل تطبيق ECH. تم العثور على Wortmannin للحد من إنتاج NO الناجم عن ECH إلى مستويات خط الأساس (الشكل 5E). ولوحظت ظاهرة مماثلة باستخدام مجهر مضان عند فحص مضان DAF ‑ FM الناجم عن ECH (الشكل 5F). علاوة على ذلك ، قد يكون لدى ورتمانين القدرة على إلغاء فسفرة eNOS السريعة في HUVECs (الشكل 5G و H). تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن ECH قد تنشط فسفرة eNOS ولا تنتج عبر مسار PI3K / Akt.

مناقشة

ECH هو مركب طبيعي معزول عن Herbaسيستانش، بخصائص دوائية مختلفة. لقد تم إثبات أن ECH تمارس تأثير استرخاء الأوعية الدموية المعتمد على البطانة من خلال فتح قنوات NO-cGMP-PKG-BKC في خلايا العضلات الملساء للأوعية الدموية (7،8). تقدم النتائج الحالية دليلًا على أن ECH تمارس التنشيط المعتمد على AR لـ eNOS للحث على إنتاج NO بمشاركة مسار إشارات PI3K / Akt في الأوعية الدموية.الخلايا البطانية.

بصفتها الطبقة الأعمق من جدار الوعاء الدموي ، يمكن للبطانة أن تستشعر وتستجيب بسرعة للتغيرات في تدفق الدم ، مما يؤدي بدوره إلى انتقال الإشارة إلى خلايا العضلات الملساء الأساسية من أجل تنظيم توتر الأوعية الدموية (18). تم الإبلاغ على نطاق واسع عن وجود العديد من المركبات المشتقة من بطانة الأوعية الدموية ، مع أكثر المواد النموذجية

كونه NO ، يتكون من الشكل الإسوي البطاني لـ eNOS ، مما يؤدي إلى الفسفرة (19). في ظل الظروف العادية ، تظل eNOS غير نشطة عند ارتباطها بالكافولين ، ويتم تنشيطها بالتتابع التالي للأحداث فيالخلايا البطانية: i) eNOS ينفصل عن caveolin -1 ويرتبط بـ Ca2 plus / CaM ؛ ب) بروتين الصدمة الحرارية (HSP) 90 يعزز eNOS.

علاوة على ذلك ، أظهر عدد متزايد من الدراسات أنه يتم التعبير عن الواقع المعزز بـالخلايا البطانيةفي عدد من الأنسجة البشرية ، مما يشير إلى دور محتمل للأندروجينات ونظائرها ، التي تعمل من خلال عمليات تتوسطها AR ، في تعديل توازن الخلايا البطانية البشرية (21). في مسار PI3K / Akt غير الكلاسيكي ، قد ينشط AR PI3K من خلال التفاعل المباشر مع الوحدة الفرعية التنظيمية PI3K p85 (22). أظهرت الدراسة الحالية أن مضاد AR أو AR siRNA قلل من إنتاج NO و eNOS الفسفرة الناجم عن ECH في HUVECs. تم الإبلاغ سابقًا عن أن هرمون الاستروجين يحث على فسفرة eNOS ويحفز إنتاج NO عبر تنشيط ER الكلاسيكي في الخلايا البطانية (23) ، ويعزز إعطاء ECH بشكل كبير التعبير عن ER في الرحم (24). ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، كان تأثير AR أكثر بروزًا مقارنة بتأثير ER على تنشيط eNOS الناجم عن ECH وإنتاج NO. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن ECH تسبب في إنتاج NO حاد في غضون دقائق عبر تنشيط eNOS المتضمن AR في HUVECs ، وهو ما يتوافق مع الطبيعة غير الجينية للاستجابة في الخلايا البطانية. يرتبط AR ببروتينات السقالات ، بما في ذلك HSP90 و HSP70 و kinase Src ، في السيتوبلازم ، ويمكن نقله إلى الغشاء من مجمع AR في غضون 5 دقائق من علاج التستوستيرون (23). بناءً على استراتيجية "الصيد المستهدف" ، تم تحديد HSP90 كهدف مقترن بـ PhGs ، مما يشير إلى أن ECH قد تسهل تفكك AR من بروتينات السقالات (25). اقترحت دراسة أخرى أنه في منطقة ما تحت المهاد ، قد تتحد ECH مع جيب AR في الأحماض الأمينية Met -894 و Val -713 وتمنع نقل AR السيتوبلازمي إلى النواة (26). ومع ذلك ، فإن الآلية الأساسية التي تتوسط من خلالها ECH الانتقال السيتوبلازمي AR إلى الغشاء تتطلب مزيدًا من التحقيق. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح الآلية التي يحقق من خلالها ECH تنشيط eNOS المعتمد على AR وكيف يمكن أن يرتبط بالارتباط بـ HSP90 في الخلايا البطانية الوعائية.

يعد مسار PI3K / Akt أحد أهم سلاسل الإشارات ، ويتم تنشيطه عن طريق إنتاج فوسفاتيديلينوسيتول -3 ، 4 ، 5- ثلاثي فوسفات لربط المجال المتماثل N-terminal pleckstrin في Ser / Thr kinase Akt. هذا يسهل تجنيد Akt في غشاء البلازما (27). قد يلعب مسار PI3K / Akt دورًا مهمًا في التحكم في الاسترخاء المعتمد على NO الناجم عن ECH. كشفت الدراسة الحالية أن إنتاج NO الناجم عن ECH قد انخفض بشكل كبير عندما تم تحضين الخلايا باستخدام مثبط PI3K wortmannin. أظهر تقرير سابق أن 15 مجم / كجم من ECH نشط مسار إشارات PI3K / Akt في خلايا نخاع العظم المكبوتة 5 فلورويوراسيل (28). في هذه الدراسة ، قللت مثبطات PI3K بشكل كبير من فسفرة eNOS المستحثة بـ ECH في Ser1177. علاوة على ذلك ، تم تنظيم نشاط Akt في الغالب من خلال المسارات التنظيمية الأولية ، ولا سيما الفسفرة المعتمدة على PI3K في Ser473 (20). في هذه الدراسة ، تسبب ECH في فسفرة Akt عند Ser473 بطريقة تعتمد على الجرعة ؛ وبالمثل ، أظهرت دراسة سابقة أن 5 أو 10 أو 20 ميكرومتر من ECH تمارس تأثيرًا وقائيًا للقلب ضد علاج نقص الأكسجين / إعادة التروية بطريقة تعتمد على الجرعة عن طريق تنظيم p-Akt و SLC8A3 (29). لا يزال تنظيم النسخ لجين Akt غير معروف إلى حد كبير (30) ؛ لذلك ، ركزت الدراسة الحالية على التأثيرات التنظيمية لما بعد النسخ لـ ECH على Akt. مع الأخذ في الاعتبار النتائج المذكورة أعلاه ، تم الاستدلال على أن تطبيق ECH على HUVECs قد يؤدي إلى تنشيط مسار PI3K / Akt ، والذي يؤدي إلى فسفرة eNOS وبالتالي يزيد من عدم الإنتاج.

في الختام ، يعتبر ECH منتجًا طبيعيًا يتم عزله بشكل أساسي عنهيربا سيستانش. الآلية المحتملة الكامنة وراء إنتاج NO الناجم عن ECH فيالخلايا البطانيةيمكن أن تشمل ما يلي (الشكل 6): 1) تعمل ECH كرابطة وظيفية للـ AR التي تتمركز في الكهوف في غشاء الخلية ؛ ب) يرتبط PI3K بالمجال المسعور لـ Akt في Ser473 ويسهل تجنيد Akt في غشاء الخلية ؛ 3) يؤدي توظيف سلاسل PI3K / Akt إلى فسفرة eNOS المعتمدة على AR ، و 4) توليد NO بوساطة eNOS فيالخلايا البطانية. قد تساهم الملاحظة التي تفيد بأن ECH لا تؤدي إلى أي إنتاج من خلال الفسفرة المعتمدة على AR لـ eNOS بمشاركة مسار PI3K / Akt في زيادة فهم تأثيرات ECH. علاوة على ذلك ، فإن استهداف ECH لمسارات NO المشتقة من البطانة قد يكون بسبب تأثيرات غير جينية. لذلك ، قد تساعد الدراسة الحالية في توضيح الآليات التي من خلالها تمارس ECH آثارها الدوائية للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية.

مؤلف:

LI GU و DANHONG LIAN و YIMEI ZHENG و WEI ZHOU و JINLEI GU و XIN LIU

مركز أبحاث هندسة الغذاء والصحة التابع لوزارة التعليم الحكومي ، كلية علوم الحياة ،

جامعة صن يات صن ، قوانغتشو ، قوانغدونغ 510275 ، جمهورية الصين الشعبية

تم الاستلام 1 مايو 2019 ؛ تم القبول في 10 ديسمبر 2019

مراجع

1. لجنة دستور الأدوية الصينية:سيستانش هيربا. في: دستور الأدوية لجمهورية الصين الشعبية 1. الذقن. ميد. علوم. الصحافة ، بكين ، ص 135 ، 2015.

2. Jiang Z و Wang J و Li X و Zhang X:إشيناكوسايدوCistanche tubulosa(Schenk) R. wight يحسن بيسفينول A الناجم عن تلف الخصية والحيوانات المنوية في الجرذان من خلال إنزيمات الستيرويد المنشأ التي تنظم محور الغدد التناسلية. J Ethnopharmacol 193: 321-328 ، 2016.

3. Liu J و Yang L و Dong Y و Zhang B و Ma X:إشيناكوسايد، منتج طبيعي لا يقدر بثمن في علاج الاضطرابات العصبية وغيرها. الجزيئات 23: piiE1213، 2018.

4. Yoshikawa M و Matsuda H و Morikawa T و Xie H و Nakamura S و Muraoka O: أمينوغليكوزيدات فينيليثانويد و oligosugars acylated مع نشاط vasorelaxant منCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475 ، 2006.

5. Arnold WP و Mittal CK و Katsuki S و Murad F: ينشط أكسيد النيتريك محلقة الغوانيلات ويزيد مستويات أحادي الفوسفات الحلقي في مستحضرات الأنسجة المختلفة. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207 ، 1977.

6. Gai XY و Tang F و Ma J و Zeng KW و Wang SL و Wang YP و Wren TN و Lu dX و Zhou Y و Ge RL: تأثير مضاد للتكاثر لـإشنكوسايدعلى الفئران الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء تحت نقص الأكسجة. J Pharmacol Sci 126: 155-163 ، 2014.

7. He WJ و Fang TH و Ma X و Zhang K و Ma ZZ و Tu PF:إشيناكوسايديثير الاسترخاء المعتمد على البطانة في حلقات الشريان الأورطي للفئران عبر مسار NO-cGMP. بلانتا ميد 75: 1400-1404 ، 2009.

8. Gai XY و Wei YH و Zhang W و Wren TN و Wang YP و Li ZQ و Liu S و Ma L و Lu dX و Zhou Y و Ge RL:إشيناكوسايديحث على توسع الأوعية في الشريان الرئوي للجرذان عن طريق فتح قنوات NO-cGMP-PKG-BKca وتقليل ca داخل الخلايا^{2 زائد}المستويات. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596 ، 2015.

9. Maruhashi T و Kihara Y و Higashi Y: تقييم توسع الأوعية المعتمد على البطانة: من المنهجية إلى المنظورات السريرية. J Hypertens 36: 1460-1467 ، 2018.

10. Ahmad KA و Ze H و Chen J و Khan FU و Chen X و Xu J و ding Q: التأثيرات الوقائية لمشتق عنصر اصطناعي جديد على الوريد السري البشريالخلايا البطانيةضد الإصابات الناجمة عن الإجهاد التأكسدي: إشراك مضادات الأكسدة ومسارات إشارات PI3k / Akt / eNOS / NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741 ، 2018.

11. Yu J ، و Akishita M ، و Eto M ، و Koizumi H ، و Hashimoto R ، و Ogawa S ، و Tanaka K ، و Ouchi Y ، و Okabe T: تنشيط غير جينومي يعتمد على مستقبلات الأندروجين بوساطة مستقبلات الأندروجين ، مما يؤدي إلى تخليق أكسيد النيتريك البطاني . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543 ، 2012.

12. Yu J و Akishita M و Eto M و Ogawa S و Son B و Kato S و Ouchi Y و Okabe T: التنشيط المعتمد على مستقبلات الأندروجين لمركب أكسيد النيتريك البطاني في الأوعية الدمويةالخلايا البطانية: دور phosphatidylinositol 3- مسار kinase / Akt. طب الغدد الصماء 151: 1822-1828 ، 2010.

13. Pittarella P و Squarzanti dF و Molinari c و Invernizzi M و Uberti F و Reno F: انتشار وهجرة لا يعتمدان على فيتامين د في HUVEc. J ستيرويد Biochem 149: 35-42 ، 2015.

14. He Y و Luan Z و Fu X و Xu X: الإفراط في التعبير عن البروتين 2 يثبط موت الخلايا المبرمج الناتج عن الجلوكوز في الوريد السري البشريالخلايا البطانية. Int J Mol Med 37: 631-638 ، 2016.

15. Xiao-Hong d ، و chang-Qin X ، و Jian-Hua H ، و Wen-Jiang Z ، و Bing S: Icariin يؤخر بسبب الهوموسيستينالخلايا البطانيةالشيخوخة التي تنطوي على تنشيط مسار إشارات PI3K / AKT-eNOS. فارم بيول 51: 433-440 ، 2013.

16. Smith PK و Krohn RI و Hermanson GT و Mallia AK و Gartner FH و Provenzano Md و Fujimoto EK و Goeke NM و Olson BJ و Klenk dc: قياس البروتين باستخدام حمض bicinchoninic. الشرج Biochem 150: 76-85 ، 1985.

17. Gu L و Zhong X و Lian d و Zheng Y و Wang H و Liu X: التخليق الحيوي Triterpenoid والاستجابة النسخية الناتجة عن أكسيد النيتريك في غانوديرما لوسيدوم المخمر المغمور.عملية Biochem 60: 19-26 ، 2017.

18. Ellingsworth dc، Sandow SL، Shukla N، Liu Y، Jeremy JY and Gutterman dd: فرط الاستقطاب المشتق من البطانة وتوسع الأوعية التاجية: الأدوار المتنوعة والمتكاملة لأحماض الإيبوكسي إيكوزاترينويك وبيروكسيد الهيدروجين وتقاطعات الفجوات. دوران الأوعية الدقيقة 23: 15-32 ، 2016.

19. Freed JK and Gutterman dd: الاتصال هو المفتاح: آليات التأشير بين الخلايا في توسع الأوعية. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272 ، 2017.

20. Quillon A ، من B ومناقشة R: استشعار البيئة الدقيقة البطانية المؤدية إلى توسع الأوعية بوساطة أكسيد النيتريك: مراجعة للإشارات العصبية والميكانيكية الحيوية. أكسيد النيتريك 45: 20-26 ، 2015.

21. Torres-Estay V و Carreno V و Francisco IF و Sotomayor P و Godoy AS و Smith GJ: مستقبل الأندروجين في الإنسانالخلايا البطانية. J Endocrinol 224: 131-137 ، 2015.

22. Deng Q و Zhang Z و Wu Y و Yu WY و Zhang J و Jiang ZM و Zhang Y و Liang H و Gui YT: يتم التوسط في العمل غير الجيني للأندروجين عن طريق الفسفرة السريعة وتنظيم تهريب مستقبلات الأندروجين. Cell Physiol Biochem 43: 223-236 ، 2017.

23. de Oliveira TS و de Oliveira LM و de Oliveira LP و costa RMd و Tostes Rc و Georg Rc و costa EA و Lobato NS و Filgueira FP و Ghedini Pc: تنشيط مسار PI3K / Akt بوساطة حسابات مستقبلات هرمون الاستروجين- المستحث في تنشيط الأوعية الدموية لإشارات cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48 ، 2018.

24. Li F و Yang X و Yang Y و Guo c و Zhang c و Yang Z و Li P: نشاط مكافحة هشاشة العظام فيإشنكوسايدفي الفئران المبيض. طب النبات 20: 549-557 ، 2013.

25. Zeng KW و Liao LX و Wan YJ و Jiang Y و Tu PF: تحديد الأهداف الدوائية وتحليل فعالية جليكوسيدات فينيلثانويد منسيستانشHerba على أساس استراتيجية "الصيد المستهدف". chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178 ، 2018.

26. Jiang Z و Zhou B و Li X و Kirby GM و Zhang X:إشيناكوسايديزيد من كمية الحيوانات المنوية في الفئران عن طريق استهداف مستقبل الاندروجين تحت المهاد. Sci Rep 8: 3839-3850 ، 2018.

27. coffer PJ، Jin J، and Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): وسيط متعدد الوظائف لتنشيط فوسفاتيديلينوسيتول 3- كيناز. Biochem J 335 ، 1-13 ، 1998.

28. Wang S و Zheng G و Tian S و Zhang Y و Shen L و Pak Y و Shen Y و Qian J:إشيناكوسايديحسن الوظيفة المكونة للدم في 5- الفئران التي يسببها الكبت النقوي الناجم عن FU. Life Sci 123: 86-92 ، 2015.

29. Chen M و Wang X و Hu B و Zhou J و Wang X و Wei W و Zhou H: التأثيرات الوقائية لـإشيناكوسايدضد إصابة نقص الأكسجين / ضخه في خلايا H9c2 عن طريق تنظيم p-AKT و SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59 ، 2018.

30. Abeyrathna P and Su Y: الدور الحاسم لـ Akt في وظيفة القلب والأوعية الدموية. Vascul Pharmacol 74: 38-48 ، 2015.