تأثير السيستانش فينيل إيثانول جليكوسيد الحاجز المعوي والميكروبات المعوية في أمراض الكبد الكحولية لدى الفئران

خلاصة:

موضوعي:نموذج الفأرأمراض الكبد الكحوليةتم إنشاء (ALD) بواسطة تغذية سائلة كحولية ليبر-ديكارلي وتأثيراتهاسيستانش جليكوسيدات فينيليثانويدتمت مناقشة (CPhGs) على الحاجز المعوي وتكوين الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء لدى الفئران ALD.

الطريقة: تم تقسيم الفئران الأنثوية الـ 36 C57BL/6N بشكل عشوائي إلى مجموعة طبيعية، ومجموعة CPhGs عادية، ومجموعة نموذجية، ومجموعات CPhGs منخفضة ومتوسطة وعالية الجرعة (175 مجم · كجم -1، 350 مجم · كجم {{6) }} و 700 ملجم·كجم-1)، مع 6 فئران. إنشاء نموذج الفأر ALD باستخدام تغذية السائل الكحولي ليبر-ديكارلي. تم إعطاء مجموعة جرعة CPhGs والمجموعة الطبيعية CPhGs تزقيمية CPhGsby يوميًا بالجرعات المناسبة. اكتشف محلل كيميائي حيوي تلقائي مستويات ALT وAST وTG وTC في الدم. تم الكشف عن SerumTNF- و IL -1 و LPS و LBP و D-LA و DAO و LBP للكبد بواسطة ELISA. تم الكشف عن مستويات TG و TC في عينات الكبد المتجانسة عن طريق قياس الألوان. كانت أنسجة الكبد ملطخة بالزيت الأحمر O وتلطيخ HE. كانت الأنسجة المعوية ملطخة بتلطيخ HE andAB-PAS والكيمياء المناعية Muc2. تم جمع محتويات الأمعاء للمجموعة الطبيعية، والمجموعة الطبيعية لـ CPhGs، والمجموعة النموذجية، ومجموعة الجرعات العالية لـ CPhGs، وتم تسلسل ميكروبات الأمعاء.

النتيجة: تم إنشاء نموذج ALD بنجاح. وبالمقارنة مع المجموعة الطبيعية، زادت مستويات ALT وAST وTG في المصل ومستويات TG وTC في الكبد في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (P).<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

خاتمة: يمكن أن تقلل CPhGs من إصابة الحاجز المعوي الناجم عن ALD، التي قدتلعب دورًا وقائيًا من خلال تنظيم وفرة وبنية Akkermansia وAllobaculum، وتؤثر على توازن الطبقة المخاطية للحاجز المخاطي المعوي.

الكلمات الدالة:CPhGs; أمراض الكبد الكحولية; حاجز معوي جراثيم الأمعاء

مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 40% من الإكيناكوسيد و16% من الأكتيوسايد.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop

أصبح الكحول أحد عوامل الخطر المهمة لالأمراض المزمنة في جميع أنحاء العالم.ويظهر "التقرير العالمي عن الكحول والصحة 2018" الصادر عن منظمة الصحة العالمية أن ما يقرب من 3 ملايين شخص ماتوا بسبب الإفراط في تعاطي الكحول في جميع أنحاء العالم في عام 2016، وهو ما يمثل 5.3% من الإجمالي [1]. في بلادنا، تتزايد أمراض الكبد الناجمة عن الكحول سنة بعد سنة وهي ثاني أكبر سبب لتليف الكبد [2]، والذي أصبح مشكلة صحية عامة خطيرة. آليات ظهور وتطور مرض الكبد الكحولي (ALD) معقدة ومتعددة، وخاصة آلية تلف الكبد من مستقلب الإيثانول أسيتالديهيد وأنواع الأكسجين التفاعلية [3]. من بينها، كان دور "محور الأمعاء والكبد" في تطور ALD قد اجتذب اهتمامًا كبيرًا [4-5]. الكبد هو الموقع الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي التأكسدي للكحول. يمكن أن يؤدي شرب الخمر بكثرة على المدى الطويل إلى تلف الكبد بشكل مباشر، مما يؤدي إلى حدوث ALD [6]. تنكس الكبد الدهني هو رد فعل مبكر بعد شرب الكحول. يُقدر عدد الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء البشرية (GM) بـ 10 تريليون [7]. توازن بيئي دقيق يتكون من النباتات المعوية والفيروسات والفطريات والأيضات.

يرتبط التوازن، أي البيئة الدقيقة المعوية، ارتباطًا وثيقًا بتطور ALD من خلال "محور الأمعاء والكبد"، لكن الآليات ذات الصلة لا تزال غير واضحة [8-9]. يهيمن الحاجز المعوي والنباتات على "محور الأمعاء والكبد"، ويلعب خلل تنظيم الجينات الوراثية والإفراط في التعبير عن العوامل الالتهابية دورًا مهمًا في حدوث وتطور ALD [10-11].

لقد وجدت الدراسات أن خلل تنظيم GM الشديد والإفراط في التعبير عن العوامل الالتهابية يحدث أثناء حدوث وتطور ALD [12]. سيؤدي تناول الكحول المزمن على المدى الطويل أو تناول كميات كبيرة من الكحول على المدى القصير إلى تغيير نفاذية الأمعاء، مما يتسبب في دخول LPS المعوي إلى الدورة الدموية، مما يؤدي إلى استجابة التهابية وتفاقم تلف الكبد [12-13].

تم تسجيل السيستانش، باعتباره مادة طبية صينية مميزة في شينجيانغ، في المواد الطبية لوو بو في عهد أسرة وي وجين، و"خلاصة المواد الطبية" في أسرة سونغ، و"خلاصة المواد الطبية" في أسرة مينغ [14 ]. وجدت الأبحاث الدوائية الحديثة أن Cistanche phenylethanoid glycosides (CPhGs) يلعب دورًا مهمًا في مكافحة الالتهاب والتليف الكبدي [15-16]. ومع ذلك، يوجد حاليًا نقص في الأبحاث حول ما إذا كانت CPhGs يمكنها تنظيم وظيفة الحاجز المعوي أو النباتات المعوية في ALD وممارسة تأثير وقائي للكبد.

استخدمت هذه الدراسة تغذية سائل كحول ليبر-ديكارلي لتأسيس المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIAAA) [17] نموذج فأر قصير المدى لإصابة الكبد بسبب الكحول لاستكشاف تأثير CPhGs على البيئة الدقيقة المعوية لـ ALD. تأثير. تم إيلاء اهتمام خاص لتأثيرات CPhGs على وظيفة الحاجز المعوي وتوازن الكائنات الحية الدقيقة المعوية في الفئران النموذجية ALD. يساعد هذا في الكشف عن آلية حماية الكبد لـ CPhGs من منظور البيئة الدقيقة المعوية ويوفر مرجعًا تجريبيًا لتطوير الأدوية.

1. المواد

1.1 الحيوانات

تم شراء الفئران الأنثوية من فئة SPF C57BL / 6N، 17 ~ 20 جم، من شركة Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.، رقم الشهادة SCXK (Beijing) 2021-0006. تم تربية الحيوانات وإجراء التجارب في بيئة SPF بمركز التجارب الحيوانية بجامعة شينجيانغ الطبية (SYXK (جديد) 2022-0003). حازم

الالتزام بمتطلبات رعاية الحيوان والمتطلبات الأخلاقية للجنة أخلاقيات الحيوان التجريبية بجامعة شينجيانغ الطبية (IACUC-20220127-4).

1.2 الكواشف

الإيثانول المطلق، كحول الأيزوبروبيل (مصنع الكاشف الكيميائي Tianjin Damao، أرقام الدفعة 20230201 و20190103 على التوالي)؛ التغذية السائلة للتحكم في Lieber-Decarli، التغذية السائلة للكحول Lieber-Decarli (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd.، أرقام الدُفعات على التوالي لـ 710027 و710260)؛

مثبت بارافورمالدهيد، مثبت كارنوي ومثبت المجهر الإلكتروني (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd.، أرقام الدُفعات CR2208028، CR2305094 وCR2210001 على التوالي)؛ مجموعة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم LBP (ELISA)، مجموعة TNF- ELISA، IL-1

طقم ELISA، طقم D-LA ELISA، طقم DAO ELISA، طقم اختبار اللونية TG ومجموعة اختبار اللونية TC (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd.، أرقام الدُفعات هي CV072V649815، CV112VX05028، CV106T8F3303، GY00L4423397)،

GY010XN08244، GY03P04Z5104 وGY02DHB82603)؛ مجموعة LPS ELISA (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd.، رقم الدفعة U3126I069T)؛ مجموعة مقايسة ALT، ومجموعة مقايسة AST، ومجموعة مقايسة TG، ومجموعة مقايسة TC (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd.، أرقام الدُفعات هي 140122014 و140223002 و141722001 و141622017)؛ محلول تلطيخ HE، محلول تلطيخ مشبع بالزيت الأحمر O، محلول تلطيخ AB-PAS؛ الجسم المضاد الأولي Muc2، والجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd.، أرقام الدفعة هي G1005 وG1015 وG1049 وGB11344 وGB23301 على التوالي).

1.3 المخدرات

تم شراء مستخلص Cistanche منشركة شينجيانغ هوتان ديتشن للأدوية والبيولوجية المحدودة. (إشيناسيسيد أكبر من أو يساوي 40٪، فيرباسكوسيد أكبر من أو يساوي 16٪، جليكوسيد فينيلثانويد أكبر من أو يساوي 85٪، رقم الدفعة 20230103).

1.4 الأدوات

BS-240محلل كيميائي حيوي أوتوماتيكي للتعليم والتدريب المهني (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); المجهر الإلكتروني ناقل الحركة HT7800 (شركة هيتاشي للتصنيع المحدودة، اليابان).

2. الطريقة

2.1 إنشاء المجموعات والنماذج الحيوانية

تم تقسيم 36 فأرًا بشكل عشوائي إلى مجموعة طبيعية، ومجموعة تناول عادية، ومجموعة نموذجية، ومجموعات CPhGs منخفضة ومتوسطة وعالية الجرعات (175 مجم · كجم -1، 350 مجم · كجم -1 و700 مجم · كجم {{ 6}})، كل مجموعة مكونة من 6. تم إعطاء جميع الفئران أولاً تغذية سائلة للتحكم في Lieber-Decarli وتم تكييفها للتغذية لمدة 3 أيام. طبيعي

تم تغذية المجموعة الضابطة ومجموعة الجرعة العادية بتغذية سائلة للتحكم من ليبر-ديكارلي. تم تغذية المجموعة النموذجية ومجموعات الجرعات المنخفضة والمتوسطة والعالية CPhGs بتغذية سائلة من الكحول LieberDecarli. بدءًا من اليوم الرابع للتجربة، قامت المجموعة النموذجية ومجموعات الجرعات المنخفضة والمتوسطة والعالية من CPhGs بزيادة تركيز الكحول في تغذية الكحول تدريجيًا من 0% إلى 5%، وحافظت على تغذية الكحول بنسبة 5% حتى نهاية التجربة، والضغط 9 ساعات قبل جمع المواد. تم إعطاء 0.2 مل · 10 جم -1 إلى المعدة باستخدام 30% من الإيثانول.

يتم الآن تجهيز جميع الأعلاف واستخدامها، ويتم استبدال الأعلاف الطازجة كل يوم من الساعة 17:00 إلى الساعة 19:00. مراقبة أكل الفئران ونشاطها وحالتها العقلية كل يوم. عندما تظهر الفئران في المجموعة النموذجية في حالة سكر مثل الخمول وانخفاض النشاط وانخفاض تناول الطعام، فهذا يشير إلى نجاح النمذجة [17]. عندما بدأت مجموعات الجرعات المنخفضة والمتوسطة والعالية من CPhGs ومجموعة الإدارة العادية في تغذية الأعلاف الكحولية، تم تجفيف محلول CPhGs ذي التركيز المقابل كل يوم لمدة 14 يومًا، وتم تطهير المحلول الملحي الطبيعي للباقي.

2.2 الملاحظة العامة

تمت ملاحظة أكل الفئران ونشاطها وحالتها العقلية وإفرازها يوميًا. أثناء النمذجة وإدارة الدواء، تم تسجيل حالة الوفاة ووزن الفئران. معامل العضو=كتلة العضو/(كتلة الجسم/100)×100%.

2.3 اختيار حيوانات التجارب

بعد حرمانها من الطعام والماء لمدة 12 ساعة، تم تخدير الفئران وإزالة مقل العيون وجمع الدم قبل التضحية بها. تم إصلاح أنسجة الكبد من الفص الأكبر في محلول بارافورمالدهيد. تم فصل الأنسجة الصائمية بسرعة على الجليد وتثبيتها في مثبت المجهر الإلكتروني؛ تم فصل 3 سم من أنسجة الصائم والقولون (دون تنظيف المحتويات) وتثبيتها في مثبت كارنوي. تم إصلاح 3 سم أخرى من أنسجة الصائم والقولون (المحتويات المشطفة بمحلول ملحي فسيولوجي) في محلول بارافورمالدهيد. تم جمع محتويات جميع الأجزاء المعوية في قارورات معقمة خالية من الإنزيمات، وتم تجميدها بسرعة في النيتروجين السائل، ثم نقلها إلى ثلاجة بدرجة -80 للتخزين.

2.4 تقنية ELISA والكشف اللوني عن مؤشرات تجانس أنسجة المصل والكبد

تم استخدام أداة البيوكيميائية الأوتوماتيكية للكشف عن مستويات ALT، AST، TG وTC في الدم؛ تم استخدام طريقة ELISA للكشف عن مستويات TNF- و IL -1 و LPS و LBP و DAO و D-LA في الدم ومستويات LBP في الكبد. تعمل وفقا للتعليمات. لتجانس أنسجة الكبد، خذ 0.05~1.00 جم من أنسجة الكبد الطازجة، أضف كحول الأيزوبروبيل عند 2 ~ 8 درجة وفقًا لنسبة الوزن (جم): الحجم (مل) { {9}}:9، قم بالطحن حتى يصبح متجانسًا، ثم قم بالطرد المركزي عند 20000 جم·دقيقة-1 15 دقيقة، ثم خذ المادة الطافية وضعها على الجليد للاختبار، وقم بالعمل وفقًا للتعليمات. الكشف اللوني لمستويات TG و TC في عينات متجانسة من أنسجة الكبد.

2.5 HE وتلطيخ الزيت الأحمر O للكشف عن أمراض أنسجة الكبد

بالنسبة لتلطيخ الهيماتوكسيلين أيوزين (HE)، تمت إزالة أنسجة الكبد الثابتة، وتقسيم البارافين، وصبغ HE، وتجفيفه وتركيبه. تم إخراج أنسجة الكبد الثابتة وتجميدها وغسلها بكحول الأيزوبروبيل وملطخة بالزيت الأحمر O وإغلاقها ومراقبتها تحت المجهر الضوئي.

2.6 تلطيخ HE وAB-PSA للكشف عن الملاحظة المرضية للأنسجة المعوية

تمت إزالة الأنسجة الصائمية وتثبيتها في محلول بارافورمالدهيد لتلطيخ HE؛ تمت إزالة أنسجة القولون وتثبيتها في مثبت كارنوي لتلطيخ AB-PAS. خطوات الكيمياء المناعية: تجفيف أقسام البارافين، واسترجاع المستضد، وحجب البيروكسيديز الداخلي، وحجب المصل، وإضافة الجسم المضاد الأولي، وإضافة الجسم المضاد الثانوي، ومقاوم نواة الخلية بعد تطور اللون، والتجفيف والتركيب، والمراقبة تحت المجهر الضوئي. تمت إزالة الأنسجة الصائمية، وتقطيعها إلى قطع صغيرة بحجم 1 مم × 1 مم × 1 مم، وتم تثبيتها قبل الحيض، وبعد التثبيت، والمجففة، والمضمنة، والمبلمرة، والمقطعة بشكل رقيق جدًا. وقد لوحظت التغيرات الميكروفيلي للخلايا الظهارية الصائمية في كل مجموعة تحت المجهر الإلكتروني النافذ.

2.7 تسلسل وتحليل البكتيريا المعوية باستخدام طريقة 16S

المحتويات المعوية للمجموعة العادية، ومجموعة الجرعات العادية، ومجموعة النماذج، ومجموعة الجرعات العالية من CPhGs، استنادًا إلى المنطقة V3-V4 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') و806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT -3')، باستخدام تقنية التسلسل عالي الإنتاجية 16S rDNA لتسلسل المجتمع البكتيري. تم الانتهاء من تجربة التسلسل في هذه الدراسة بواسطة شركة Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. وتم تحميل بيانات تسلسل الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء في هذه الدراسة إلى المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية تحت رقم المشروع PRJNA1006676.

بناءً على نتائج تحليل متغيرات تسلسل الأمبليكون (ASVs)، يتم إجراء تنوع ألفا وتحليل تنوع بيتا وشرح تصنيف الأنواع وتحليل الفرق. من بينها، يتضمن مؤشر التنوع ألفا بشكل أساسي مؤشر شانون ومؤشر Chao1، ويستخدم الاختبار الإحصائي اختبار ويلكوكسون؛ PCoA

تم إجراء تحليل الإحداثيات الرئيسي (PCoA) باستخدام Anosim لتحليل الاختلافات بين المجموعات؛ تم استخدام LEfSe لتحليل LEfSe) للحصول على الأنواع ذات الاختلافات الكبيرة بين المجموعات. تم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام أدوات Bioincloud Platform الخاصة بـ Microtech Alliance (https://www.bioincloud.tech).

2.8 التحليل الإحصائي

يتم وصف جميع بيانات القياس بأنها igh̅± 𝑠. بالنسبة للبيانات التي تخضع للتوزيع الطبيعي وتلبي اختبار تجانس التباين، يتم استخدام تحليل التباين ذو العامل الواحد. وبخلاف ذلك، يتم استخدام الاختبار غير المعلمي. ويتم تحليل البيانات إحصائيا باستخدام SPSS 24.0. ص<0.05 means the difference is statistically significant.