تأثير الجري الثاني على نمو ورم خبيث للورم المزروع في الفئران الحاملة لسرطان الثدي وآليته

موضوعي:

لدراسة تأثير Runing II (مستحضر عشبي صيني لسرطان الثدي) على نمو ورم خبيث للأورام المزروعة لسرطان الثدي MA -891- التي تحمل الفئران TA2 وآليتها. الطريقة: نموذج سرطان الثدي MA -891 ورم خلوي مزروع في الفئران TA2 مع ورم خبيث رئوي تم تطويره لمراقبة تأثير Runing II على نمو ورم خبيث للورم المزروع. تم اعتماد الطريقة الكيميائية الهيستوكيميائية المناعية وتحليل الصور للكشف عن مستويات عامل نمو البطانة الوعائية (VEGF) ومستقبلات عامل نمو البطانة الوعائية (VEGFR) وعدد الأوعية الدقيقة (MVC) ومنطقة الأوعية الدقيقة (MVA).

النتائج: في مجموعة الجري 2 ، كان معدل تثبيط وزن الورم ومعدل تثبيط ورم خبيث في الرئة 37.3 في المائة و 65.4 في المائة على التوالي ، ومن الواضح أنه تم تثبيط نمو الورم ورم خبيث في الرئة. وانخفضت مستويات VEGF و VEGFR و MVC و MVA بشكل ملحوظ مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة التحكم الحاملة للورم (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

بالإضافة إلى ذلك ، في نفس وقت البحث ، وجدنا أن إشنسا في Cistanche لها تأثير مضاد للورم. لتطبيق إشنكوسايد في الأدوية المضادة للأورام ، يضيف الاختراع الحالي أولاً MTH1 ، بيروفوسفاتيز غير عضوي ، و dGTP إلى محلول التفاعل (1 0 0 ملي pH8.0 Tris-acetic acid ، 40mM NaCl ، 10mM أسيتات المغنيسيوم ، 0.005 بالمائة Tween20 و 1 mDTT) في الطريقة ، تم تحضين الإنزيم والركيزة عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ثم تمت إضافة 25 مايكرولتر من محلول الملكيت الأخضر لإنهاء التفاعل. تم الكشف عن الامتصاصية عند 630 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية BIO-RAD iMark. أظهرت النتائج أن إشنكوسايد له تأثير مثبط معنوي على نشاط إنزيم MTH1. ثانيًا ، تم اكتشاف تأثير إشنكوسايد على الخلايا السرطانية على المستوى الخلوي بواسطة مقايسة MTT ، وأظهرت النتائج أن إكيناكوسيد يمكن أن يثبط بشكل كبير نمو خلايا سرطان القولون SW480 وخلايا ساركومة عظمية بشرية U2OS ، وقد أدى الاختراع الحالي إلى تثبيط نمو إشيناكوسيد. يؤدي MTH1 ، وهو إنزيم محدد يحافظ على بقاء الخلايا السرطانية ، إلى دمج النيوكليوتيدات المؤكسدة في الحمض النووي ، مما يتسبب في حدوث انكسارات فتاكة مزدوجة في الخلايا السرطانية ، وبالتالي إنتاج تأثيرات مضادة للورم. سيضع التطبيق الطبي الجديد الأساس لتطوير عقاقير جديدة مضادة للأورام في المستقبل.

انقر فوق منتج تأثيرات cistanche

الكلمات الدالة:

ورم الثدي تولد الأوعية. عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ؛ الجري الثاني (مستحضر عشبي صيني لسرطان الثدي)

سرطان الثدي هو ورم خبيث يهدد بشدة صحة المرأة ويحتل انتشار المرض المرتبة الأولى بين الأورام الخبيثة للإناث ويميل إلى الزيادة عاما بعد عام. على الرغم من أن طرقه العلاجية قد حققت بعض التقدم ، إلا أن معدل البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل لمريض سرطان الثدي لم يرتفع بسبب النمو الغازي والورم الخبيث للأورام. تشكل الأوعية الدموية للأورام شرطًا أساسيًا لنمو الأورام وغزوها وانتشارها.

لذلك ، فإن تثبيط تكوين الأوعية الدموية للأورام هو وسيلة فعالة لمنع إنتاج الأورام وتطورها وإطالة عمر المريض. تمت دراسة تنظيم الطريق وأوعية الحمل ، وحل الكتلة ، وإزالة السموم في تثبيط الورم ومضادات النقائل من تكوين الأوعية وعواملها التنظيمية في الورم المزروع لسرطان الثدي MA -891 لفئران TA2 مع ورم خبيث في الرئة.

مواد

تم شراء ستين فأر TA2 من الإناث مع عامل الحماية من الشمس SPF ، تزن (20 ± 2) جم ، عمرها 6-8 أسبوعًا ، من قسم حيوانات المختبرات بجامعة تيانجين للعلوم الطبية. تم توفير سلالة خلية سرطان الثدي MA -891 للفأر من قبل البروفيسور لو ليكين ، المختبر الباثولوجي ، معهد الأورام ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية.

يتكون Runing II من Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici) و Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) و Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae) و Gou Qi Zi (Fructus Lycii) و E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis) و Yi Yi Ren ( Semen Coicis) ، Yin Yang Huo (Herba Epimedii) ، Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) ، إلخ ، مع نسبة جرعة 1.67: 1.67: 1.33: 1.33: 1.33: 1.33: 1.33: 1 ، والتي أعدت ديكوتيون بواسطة قسم الصيدلانيات ، مستشفى Longhua ، وفقًا لتقنية تقليدية ، ويتم الاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية للاستخدام ؛ تم إنتاج Cyclophosphamide (CTX ، 200mg / ampule ، رقم الفرع: 981104) و tamoxifen (TAM) بواسطة Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd. ؛ تم إنتاج محلول ملحي عادي بواسطة شركة Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) ، جسم مضاد متعدد النسيلة (التخفيفات العاملة 1: 25-1: 50) ، مستقبل عامل النمو البطاني الوعائي (VEGFR ، التخفيفات العاملة 1: 30-1: 50) ، والأجسام المضادة متعددة النسيلة FVIIIAg (تخفيف العمل 1:50 ) تم شراؤها من شركة Santa Cruz Biotechnology Inc ؛ تم شراء الجسم المضاد الثاني لـ EnVision ، والأجسام المضادة VEGF للأرانب المضادة للجرذان ، والجسم المضاد FVIII Ag المضاد للأرانب من الماعز والأجسام المضادة VEGFR المضادة للأرانب والماعز من شركة Dako ، الدنمارك ؛ 3 ، 3- تم شراء Diaminobenzidine (DAB) من Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

طُرق

تطوير النموذج الحيواني

تم تطوير النموذج الحيواني مع الاستدلال على طرق Luo و Gao ، وآخرون. تم اختيار خلايا MA لسرطان الثدي المستزرع في المختبر -891 من الفئران في مرحلة البقاء اللوغاريتمي وتم تنظيم تركيز الخلايا على أنه 1 × 1 0 7 / مل. في ظل الظروف المعقمة ، تم تلقيح خلايا سرطان الثدييات في الجزء تحت الجلد من الفئران TA2 من الإبط الأيمن (0.2 مل / فأر ، أي 2X106 خلية / فأر).

تجميع الحيوانات وطرق إدارتها

بعد يومين من التلقيح ، قسمت الفئران عشوائيا إلى 4 مجموعات ، 15 فأرا في كل مجموعة. 1) مجموعة التحكم في تحمل الورم: 0 تم إعطاء 4 مل من محلول ملحي عادي داخل المعدة ، مرة كل يوم ، خمس مرات كل أسبوع. 2) مجموعة Runing II: تم تخفيف Runing II بمحلول ملحي عادي و 0. 4 مل من هذا التخفيف المقابل لـ 48 جم · كجم {{1 0} · د -1 والذي كان حسب الجدول المرفق "جدول التحويل بين مناطق سطح جسم الإنسان والحيوان" في "منهجية دراسات علم الأدوية للأدوية الصينية" 4 تم إعطاؤه داخل المعدة ، مرة واحدة يوميًا ، خمس مرات كل أسبوع. 3) مجموعة التحكم في CTX: حول الجرعة التي استخدمها Jiang Bo ، تم تخفيف 5 CTX بمحلول ملحي عادي ، و 0 .4 مل مقابل 50 مجم · كجم -1 · د -1 كان تعطى داخل المعدة ، مرة كل يومين ، ثلاث مرات كل أسبوع. 4) مجموعة التحكم TAM: تم تخفيف TAM بمحلول ملحي عادي و 0.4 مل بما يعادل 2.7 مجم · كجم -1 · د -1 تم إعطاؤه داخل المعدة ، مرة واحدة يوميًا ، خمس مرات كل أسبوع. أعطيت الأدوية لمدة 3 أسابيع في المجموعات الأربع.

أخذ العينات

في اليوم الثاني والعشرين بعد الإعطاء ، تم التضحية بالفئران عن طريق خلع فقرات عنق الرحم ووزنها. ثم تم أخذ كتلة الورم والرئة ووزنها على التوالي. وزن الجسم الحقيقي للماوس=وزن الجسم - وزن الورم. تم حساب العقد الرمادية على سطح الرئة ، أي بؤر الانبثاث ، بالعين المجردة. تم وضع كتلة الورم في محلول فورمالديهايد محايد بنسبة 10 في المائة للتثبيت ، متبوعًا بتضمين البارافين ، وتقسيم شديد الرقة ، وإجهاد من خطوتين للتصور الكيميائي المناعي ، وتحديد VEGF ، و VEGFR ، وعدد الأوعية الدقيقة (MVC) ، ومنطقة الأوعية الدقيقة (MVA).

معدل تثبيط وزن الورم

معدل تثبيط الورم=(متوسط ​​وزن الورم للمجموعة الضابطة بعد العلاج - متوسط ​​وزن الورم لمجموعة الأدوية بعد العلاج) / متوسط ​​وزن الورم لمجموعة التحكم بعد العلاج × 100 بالمائة.

معدل تثبيط ورم خبيث في الرئة

معدل تثبيط ورم خبيث في الرئة=(متوسط ​​عدد عقدة ورم خبيث في الرئة للمجموعة الضابطة - متوسط ​​عدد عقدة ورم خبيث في الرئة لمجموعة الأدوية) / متوسط ​​عدد عقدة ورم خبيث في الرئة لمجموعة التحكم × 100 في المائة.

تخيل تلطيخ من خطوتين

تم أخذ مقطع البارافين البالغ 4 ميكرومتر ، متبوعًا بالديبارافين الروتيني بالزيلين ، والجفاف المتدرج ، والغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق × 3 مرات ؛ تم غمر القسم في 0. 0 1 مول / لتر ، عازل سيترات pH6.0 ، وضع في فرن ميكروويف من 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإصلاح مستضد وتم تبريده بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة بعد أخذ من فرن المايكرويف؛ تقطير الجسم المضاد الأول (الجسم المضاد المذكور أعلاه والتخفيف من الجسم المضاد المقابل على التوالي) ، 37 درجة مئوية ، 90 دقيقة ، الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني ، 5 دقائق × 3 مرات ؛ تقطر الجسم المضاد الثاني Envasion ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة ، والغسيل مع PBS ، 5 ​​دقائق × 3 مرات ؛ يقطر محلول تطوير ألوان DAB المُعد حديثًا ، ويتحكم في اللون المتطور لمدة 3-10 دقائق تحت المجهر ، ويقاوم البقع لمدة 45 ثانية بالكامبيتشي ، والشطف بماء الصنبور ، والتجفيف باستخدام منفاخ ، وتركيب العلكة المحايدة. اعتبرت الخلية التي تحتوي على سيتوبلازم حبيبات بنية صفراء أو بنية سوداء إيجابية. تم استخدام القسم الإيجابي المعروف لسرطان الثدي كعنصر تحكم إيجابي ، وتم استخدام الجزء الذي تم فيه استبدال محلول PBS المؤقت بالجسم المضاد الأول كعنصر تحكم سلبي.

تحليل الصور

تم استخدام كاميرا فيديو ACE (حل الطاقة 930 خطًا) ومحلل الصور LEICAQ500W ونظام تحليل الصور الآلي الكامل LEICA. تحت المجهر × 200 ، تم اختيار حقلي رؤية في كل قسم بشكل عشوائي لتحديد VEGF أو 3 مجالات رؤية لتحديد VEGFR و MVA ، وتم حساب النسبة المئوية للمنطقة الإيجابية لمنطقة مجال الرؤية بالكامل في جميع المجموعات . لتحديد MVC ، تم اختيار 5 مناطق بها أغنى الأوعية الدموية في كل قسم تحت المجهر × 100 ، ثم تم حساب الأوعية الدقيقة في كل مجال رؤية لـ 5 مناطق غير متداخلة تحت × 400 ، وتم استخدام المتوسط كمتوسط ​​عداد للأوعية الدقيقة (MVC) للورم.

الطريقة الإحصائية

تم استخدام برنامج SPSS8. 0 وتم استخدام اختبار مربع كاي للمقارنة بين المعدلات ، وتم استخدام اختبار t أو ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة الوسائل.

نتائج

تأثيرات مثبطة للورم ومضادة للورم الخبيث من الجري الثاني على الورم المزروع لسرطان الثدي MA -891- الذي يحمل الفئران TA2 مع ورم خبيث في الرئة

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 في المائة ، مع اختلاف كبير (كلاهما P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

تأثيرات الجري II على تعبيرات VEGF و VEGFR في الورم المزروع لـ MA -891- الذي يحمل الفئران TA2

كما هو مبين في الجدول 2 ، كانت تعبيرات VEGF و VEGFR في كل من مجموعة Running II ومجموعة التحكم CTX أقل بكثير من تلك الموجودة في مجموعة التحكم الحاملة للورم (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0. 05) ، كان تعبير VEGF أقل بكثير من التعبير الموجود في مجموعة التحكم TAM (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0. 05) ، وكان تعبير VEGFR أقل من التعبير الموجود في مجموعة التحكم الحاملة للورم (P<0.05).

تأثير الجري II على MVA و MVC للورم المزروع في MA -891- تحمل الفئران TA2

كما هو مبين في الجدول 3 ، كانت مستويات MVA و MVC في السرطان المزروع في مجموعات الأدوية أقل بكثير من تلك الموجودة في مجموعة التحكم الحاملة للورم (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

مناقشة

يرى الطب الصيني التقليدي أن نشأة الورم وتطوره ناتجان عن التأثيرات الشاملة لعوامل مجهول السبب والتعاطف ولكن مع الضغط على الأول. في دراسة إكلينيكية سابقة ، أكد البروفيسور لو وتانغ أن النقص الحيوي في تشي الداخلية والتنافر في الطريق وأوعية الحمل هما السببان الرئيسيان لتكوين الورم ، والغزو الداخلي ، وتحريك وانتشار مسببات السرطان هي الشروط الرئيسية نمو ورم خبيث لسرطان الثدي .6 لذلك ، في العلاج ، ينادون بتغذية qi الحيوية وإزالة الكتل. الجري 2 هو تركيبة عشبية صينية يتم تلخيصها من خلال الممارسة السريرية لسنوات عديدة وفقًا لمبدأ العلاج المتمثل في تقوية مقاومة الجسم أولاً والقضاء على العوامل المسببة للأمراض ثانيًا. في الصيغة ، Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici) ، Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae) ، Gou Qi Zi (Fructus Lycii) ، Yin Yang Huo (Herba Epimedii) هي مكونات ذات سيادة ، مع تأثيرات مكملة لـ qi وتغذية الين ، وتنظيم أوعية الطريق والحمل ، والتي تتوافق مع الخصائص الشائعة لسرطان الثدي مثل كل من نقص تشي ويين وعدم تناسق الطرق وأوعية الحمل. سريريًا ، تحقق هذه الصيغة تأثيرًا واضحًا لإطالة وقت البقاء على قيد الحياة ، وزيادة جودة الحياة ، واستقرار تركيز الورم ، ومنع ورم خبيث للسرطان.

حددت الدراسة الحالية نموذجًا لسرطان الثدي MA -891 ورم خلوي مزروع في الفئران TA2 المصابة بورم خبيث في الرئة ولاحظت تأثير الجري II على نمو الورم الصلب ونقائل الرئة ، ووجدت أن هناك اختلافات كبيرة في الورم معدل التثبيط ومعدل تثبيط ورم خبيث في الرئة بين مجموعة الجري II والمجموعة الحاملة للورم ، وبين مجموعة الجري الثاني ومجموعة التحكم في CTX ، مما يدل على أن الجري الثاني له وظائف واضحة في تثبيط نمو الورم ومقاومة الانبثاث. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمتلك عقار تاموكسيفين (TAM) الوظيفة الواضحة المتمثلة في تثبيط نمو الورم ومضاد النقائل في الفئران النموذجية ، حيث يكون مشابهًا لنتيجة أن سرطان الثدي MA -891 هو سلالة من خلايا ER والتقرير عن الإجراء المباشر من انخفاض تركيز TAM في الخارج 7

الورم هو مرض نموذجي يعتمد على الأوعية الدموية ، ويعتمد نموه وتسلل ورم خبيث على تكوين الأوعية الدموية. في الوقت نفسه ، توفر الأوعية الدموية الجديدة مرة أخرى قناة ورم خبيث للخلايا السرطانية ، مما يخلق ظروفًا مواتية للنمو ، والورم الخبيث ، وانتشار الورم. 8 ، 9 VEGF هو عامل مؤيد لتكوين الأوعية الدموية مع تأثير أقوى وفريد ​​ومحدد على الخلايا البطانية الوعائية ، ويمكن للعديد من الخلايا السرطانية أن تفرز VEGF ، مما يزيد من نفاذية الأوعية الدموية ويعمل بشكل مباشر على الخلايا البطانية الوعائية من خلال الارتباط بمستقبل VEGF ، تحفيز انقسامه وانتشاره ، مما يؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية للورم والتأثير على عدد الأوعية الدقيقة ، لتعزيز نمو ورم خبيث للورم. الكلى ، المبيض ، إلخ ، لديها تعبير أعلى من VEGF. لذلك ، يرى بعض العلماء أنه يمكن استخدام VEGF كعلامات لاستقلاب الورم والورم الخبيث 12 وجزءًا أكثر هدفًا مثاليًا لمنع تكوين الأوعية الدموية في الأورام ، والتدخل في العوامل التنظيمية للأوعية الدموية للأورام ورابط عملها ، وتنظيم التعبير عن عوامل تكوين الأوعية ، و قد يؤدي تثبيط تكوين الأوعية الدموية إلى التحكم في نمو ورم خبيث للورم.

تشير النتائج في هذه الدراسة إلى أن Runing II يمكن أن يقلل من تنظيم تعبيرات VEGF و VEGFR لإمكانية منع توصيل إشارة الهجرة الناتجة عن VEGF وتكاثر الخلايا البطانية ، وكذلك منع تكوين الأوعية الدموية في الأورام ، وبالتالي ممارسة تأثيرات مضادة للأورام ومضادة للنقائل .

أظهرت الدراسات السابقة أنه في مسار نمو الأورام الخبيثة ، يؤدي النمو السريع للأنسجة حتمًا إلى نقص الأكسجة الخطير للأنسجة المحلية ، ويمكن أن يحفز نقص الأكسجين تخليق VEGF mRNA ويبطئ تحلل VEGF mRNA للحث على تكوين a عدد كبير من الأوعية الشعرية المحلية الجديدة. ، والتي قد تكون مرتبطة بمستوى أعلى من عامل تحفيز نقص الأكسجين في الخلايا السرطانية ، بما يتوافق مع تقرير Talks KL ، وآخرون. يحتوي الجري الثاني على Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis) و E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis) ، Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis) ، Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) ، وما إلى ذلك ، والتي تعمل على تنشيط الدورة الدموية ، وإزالة البلغم وإزالة العكارة. أنها تمنع تخليق وإفراز VEGF ربما من خلال تحسين دوران الأوعية الدقيقة المحلية للورم ، وزيادة إمدادات الأكسجين إلى الخلايا السرطانية ، وبالتالي تثبيط نمو الورم لأداء مكافحة الورم الخبيث.

مراجع

1. فولكمان ج. تولد الأوعية الدموية وسرطان الثدي. J كلين أونكول 1994 ؛ 12: 441-443.

2. أبحاث فولكمان ج.تكون الأوعية الدموية: من المختبر إلى العيادة. منتدى (جينوفا) 1999 ؛ 9: 59-62.

3. Potgens AJ. يؤثر التعبير عن عامل نفاذية الأوعية الدموية على تكوين الأوعية الورمية في خطوط الورم الميلاني البشري xenografted إلى الفئران العارية. آم جيه باتول 1995 ؛ 5: 775-782.

4.Sauter ER ، Nesbit M ، Watson JC ، وآخرون. عامل النمو البطاني الوعائي هو سوق لغزو الورم والنقائل في سرطانات الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. كلين كانسر ريس 1999 ؛ 5: 775-782.

5.Warren RS ، Yuan H ، Matli MR ، وآخرون. التنظيم بواسطة عامل النمو البطاني الوعائي بنقص الأكسجة. J بيول كيم 1996 ؛ 271: 2746-2753.

6. Levy AP، Levy NS، Goldberg MA. تنظيم ما بعد النسخ لعامل النمو البطاني الوعائي بنقص الأكسجة. J بيول كيم 1996 ؛ 271: 2746-2753.

7- محادثات كوالالمبور ، تورلي إتش ، جاتر كيه سي ، وآخرون. التعبير عن العوامل المحفزة بنقص الأكسجة HIF -1 ألفا و HIF -2 ألفا في الأنسجة البشرية الطبيعية والسرطانات والضامة المرتبطة بالورم. آم جيه باتول 2000 ؛ 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com