تأثيرات معالجة حمض الفوسفونيك 2- aminoindan -2- على تراكم الساليدروسيد وأربعة جليكوسيدات فينيليثانويد في ثقافة الخلية المعلقة لـ Cistanche Deserticola

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

جاو شنغ هو وآخرون

الملخص

تم تطبيق 2- Aminoindan -2- حمض الفوسفونيك (AIP) ، مثبط فينيل ألانين أمونيا-لياز (PAL) التنافسي المحدد على مزرعة خلية معلقة لـCistanche Deserticola. تأثير علاج AIP على نمو الخلايا ونشاط PAL ومحتويات وعوائد المركب الفينولي الكلي والساليدروزيد وأربعةجليكوسيدات فينيلثانويد(PheGs) التحقيق. أظهرت النتائج أن علاجات {0}. 5 و 2.0 lM AIP لها تأثيرات مماثلة على القياسات التي تم فحصها في هذه الدراسة. نتج عن علاج AIP انخفاض كبير في نشاط PAL ومحتوى مركبات الفينول الكلية و(جليكوسيدات فينيلثانويد)محتوى PheGs. أظهر تحليل الانحدار الخطي أن نشاط PAL له معامل ارتباط عالي مع محتوى المركب الفينولي الكلي والأربعة(جليكوسيدات فينيلثانويد)محتويات PheGs. كان لإجمالي مساحة وقت نشاط PAL تحت المنحنى (AUC) معامل ارتباط عاليًا مع إجمالي إنتاج المركب الفينولي وأنها تحتوي على خمسة مركبات مختبرة في عينات الخلايا غير المعالجة. إجمالي ناتج المركب الفينولي وعوائد ثلاثة مركبات مختبرة ، إشنكوسايد ، أكتيوسيد ، وتوبولوسيد أ ، ولكن ليس ساليدروسايد وسيستانوزيد أ. يمكن أن يكون الاختلاف ناتجًا عن اختلاف أصول التخليق الحيوي لكل من المركبات المختبرة. توضح هذه النتائج الدور المهم لـ PAL في التخليق الحيوي(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs في ثقافة الخلية المعلقةCistanche Deserticola.

الكلمات الدالة

Cistanche Deserticolaثقافة الخلية المعلقةجليكوسيدات فينيلثانويد، 2- Aminoindan -2- حمض الفوسفونيك (AIP) ، نشاط PAL ، التخليق الحيوي ، Salidroside

انقر لاستخراج فوائد Cistanche ومنتجات Cistanche

مقدمة

Cistanche DeserticolaYC Ma ، عشب صيني تقليدي ، استخدم منذ قرون في الصين لتأثيراته المغذية. إنه غرض دائم وعشب طفيلي ينتمي إلى جنس Cistanche في عائلة Orobanchaceae. ينمو النبات في المناطق الصحراوية بغرب الصين وهو طفيلي على جذور Haloxylosammodendrun.

عزل المكونات الكيميائية ودراسات التفسير الإنشائي لـCistanche Deserticolaبدأت في الثمانينيات (كوباياشي وآخرون 1984 أ ، ب ، 1985 ، 1986 ؛ كاراساوا وآخرون 1986 ؛ شيونغ وآخرون 1996). مظاهرةجليكوسيدات فينيلثانويد(PheGs) كمركبات فعالة في حماية الخلايا العصبية من التلف (Sheng et al. 2002 ؛ Puet al. 2003 ؛ Geng et al. 2004 ؛ Tian and Pu.2005) الناجم عن المواد الكيميائية والشيخوخة ، مما أدى إلى زيادة الطلب في السوق على الأطعمة الصحية المتاحة تجاريًا والمخدرات. بسبب الحصاد ، وفساد الموائل ، والتطفل المعقد ، والموارد الطبيعيةCistanche Deserticolaعلى حافة الانقراض ، وفي عام 2003 ، تم إدراجها في اتفاقية التجارة الدولية في الأنواع المهددة بالانقراض من الحيوانات والنباتات البرية (CITES).

لحل المشاكل المتعلقة بالموارد المحدودة ، تم إجراء زراعة الخلايا والأنسجة لهذا النبات الطبي في الصين. بحثت هذه الدراسات في تأثيرات العوامل المختلفة بما في ذلك الإجهاد التناضحي (Liu and Cheng 2008) ، التغذية الأولية (Ouyang et al. 2005 ؛ Liu et al. 2007) ، الضوء ذو الطول الموجي المتغير (Ouyang et al. 2003a) ، مثبطات الفطريات (Lu and Mei 2003؛ Cheng et al. 2005، 2006)، andabiotic elicitors (Ouyang et al. 2003b) على نمو الخلايا وتراكم(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs. قدمت هذه الدراسات معلومات قيمة للثقافة واسعة النطاقCistanche Deserticolaكيف يتم تصنيع هذه المركبات حيويا في Cistanchecells لا تزال غير واضحة ولم يتم الإبلاغ عن القليل من المعلومات الجينية.

لقد ثبت في تجارب تغذية السلائف المسمى بالنظائر (Ellis 1983 ؛ Saimaru و Orihara 2010) أن مجموعة الكافويل من أكتيوسيد مشتقة من L-phenylalanine ، بينما تم اشتقاق 3 ، 4- ثنائي هيدروكسيل فينيل إيثانول من L-tyrosine. مسار تخليق حيوي افتراضي لـ(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs فيCistanche Deserticola(الشكل التكميلي 1) بناءً على المعرفة الحالية بمسارات التخليق الحيوي ذات الصلة. حفز إنزيم PAL الخطوة الأولى من فينيل ألانين إلى مجموعة الكافويل. ثبت بشكل غير مباشر أن PAL هو إنزيم مهم في التخليق الحيوي لـ(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs من خلال أبحاث العلاج elicitor فيCistanche Deserticola(Lu and Mei 2003؛ Cheng et al. 2005، 2006؛ Ouyang et al. 2003b) ، حيث مجموع(جليكوسيدات فينيلثانويد)تم تحسين تراكم PheGs جنبًا إلى جنب مع زيادة نشاط PAL. لن يؤدي علاج الموجه إلى تحسين مستوى التعبير لـ PAL فحسب ، بل سيؤدي أيضًا إلى تحسين مستويات الإنزيمات الأخرى المشاركة في مسار التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية. بسبب الصعوبات في إنشاء نظام التحولCistanche Deserticola، الدليل المباشر على تعبير PAL الزائد على(جليكوسيدات فينيلثانويد)لم يتم الإبلاغ عن تراكم PheG. في مصانع أخرى منتجة(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs ، مثل نباتات جنس Echinacea ، تم إجراء التجربة أيضًا. هنا نُبلغ عن تأثيرات مثبط PAL المحدد {0}} aminoindan -2- معالجة حمض الفوسفونيك على نمو الخلايا ، وإجمالي المركبات الفينولية ، والنشاط ، وتراكم(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs في الخلية المعلقة ثقافةCistanche Deserticola، في محاولة لتقييم الدور الوظيفي لـ PAL في التخليق الحيوي لـ PheGs. Tostudy مسار التخليق الحيوي(جليكوسيدات فينيلثانويد)على المستوى الجزيئي ، قمنا باستنساخ وتمييز جين CdPAL1 من دشبذCistanche Deserticola(Hu et al. 2010). نحن نحاول إنشاء نظام التحول من نباتات القنفذ بوساطة Agrobacterium rhizogenes وإدخال الجين في جذر شعر القنفذية لدراسة التأثيرات المباشرة للتعبير المفرط لهذا الجين على تراكم PheGs. إلى جانب ذلك ، قمنا أيضًا باستنساخ العديد من الجينات المشاركة في مسار التخليق الحيوي لـ PheGs منCistanche Deserticolaالكالس باستخدام فحص مكتبة cDNA و RACE PCR ، مثل Tyrosinase و Cinnamyl alcoholdehydrogenase و Tyrosine decarboxylase و Cinnamate -3- hydroxylase و Coumarate -4- hydroxylase؛ UDP-glucosyltransferase و Hydroxylcinnamyl transferase. سنقوم بإجراء مزيد من التجارب بما في ذلك التوصيف الجزيئي وتحليل التعبير وخطوط التعبير الزائد لجذر Echinaceahairy لتوضيح مسار التخليق الحيوي لـ PheGson على المستوى الجزيئي.

المواد والأساليب

ثقافة الخلايا المعلقة من C. Deserticola

ثقافة الخلية المعلقةCistanche Deserticolaتمت المحافظة عليه في B5 (Gamborg et al. 1968) الوسائط السائلة المكملة بـ 3 0 جم سكروز- لتر -1 ، 0. 5 مجم 6- BA-l -1 ، و 2.0 mgNAA l -1 عند 25 ± 1 درجة مع الاهتزاز (180 دورة في الدقيقة). كانت فترة الضوء 16 (L) / 8 (D) وتم استنبات ثقافة الخلية المعلقة كل 28 يومًا. أثناء الثقافة الفرعية ، تمت ترشيح مزرعة الخلايا المعلقة أولاً في مقعد نظيف باستخدام قطعة قماش ميرا مملوءة بالتلفاز ، ثم تم وزن حبيبات الخلية الطازجة وتلقيحها في وسائط جديدة بتركيز 2 غم -50 مل -1.

تحقيق النمو

تم قياس نمو الخلية أساسًا بالوزن الطازج للخلايا (FW) والوزن الجاف (DW). تم أخذ عينات من مزارع الخلايا في اليوم الثاني والرابع والثامن والثاني عشر والسابع عشر والثاني والعشرين والثامن والعشرين وتم تصفيتها بالترشيح الفراغي باستخدام قماش ميرا حتى لا يسقط المزيد من السائل من القمع. تم وزن بيليه الخلية وتسجيلها على أنها مهاجم. تم تخزين نصف الخلايا الطازجة التي تم جمعها عند درجة حرارة -78 درجة مئوية لفحص النشاط وتم تجفيف النصف الآخر عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة حتى لوحظ وجود وزن ثابت. تم تبريد الخلايا المجففة في مادة لاصقة إلى درجة حرارة الغرفة ثم وزنها. تم ضرب هذا الوزن في اثنين وتم تسجيله على أنه DW. تم طحن عينات الخلايا المجففة في مسحوق ناعم (80 شبكة حتى 100 بالمائة) ، ووضعها في أنابيب بنية اللون ، ومحكم الإغلاق ، وتخزينها عند درجة -20 للتجارب المستقبلية.

استخراج وتحديد محتوى مركبات الفينول

تم استخلاص ثلاثين ملليغرامًا من مسحوق الخلايا المجففة من كل عينة باستخدام 400 لتر من 80 بالمائة من الميثانول عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بسرعة اهتزاز تبلغ 200 دورة في الدقيقة متبوعة بالطرد المركزي. تم نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد واستخراج الحطام مرتين أخريين باستخدام نفس الإجراء. تم دمج المادة الطافية وترشيحها واستخدامها لتحديد إجمالي محتوى المركب الفينولي وتحليل HPLC (Hu 2007).

تم تحليل محتويات إجمالي المركبات الفينولية باستخدام طريقة Folin-Ciocalteu المعدلة (Singletonet al. 1999). تم تخفيف كاشف Folin-Ciocalteu باستخدام حجم واحد من الماء المقطر. تم تخفيف المستخلص الذي تم الحصول عليه عدة مرات واستخدم 10 لترات من المستخلص في كل اختبار محتوى. تمت إضافة عشرة ميكرولتر من كل مستخلص مخفف إلى 200 ليرة لبنانية محضرة حديثًا 2 في المائة من محلول كربونات الصوديوم. تم خلط الخليط بقوة وتبعه طرد مركزي قصير. تم تحضين الخليط عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم يخلط لاحقًا مع 10 لتر من كاشف Folin المخفف. يخلط الخليط النهائي بقوة ويحضن عند RT لمدة 30 دقيقة. تم قياس OD750 في مقياس الطيف الضوئي UV / Vis وتم تسجيله لحساب إجمالي المركبات الفينولية. تم استخدام محلول حمض الكلوروجينيك المتسلسل كمركب قياسي ومنحنى قياسي بين كمية حمض الكلوروجينيك و OD750 تم تحضيره لحساب المحتوى التمثيلي لمركبات الفينول الكلية مثل حمض الكلوروجينيك. باستخدام محتوى مركب الفينول الكلي وبيانات النمو للعينات ، قمنا بحساب ناتج إجمالي المركب الفينولي في كل عينة وعبّرنا عن عدد مليغرام من إجمالي المركب الفينول الذي يتم إنتاجه في فضلات واحدة (ملجم لتر -1).

علاج AIP

تم تحضير محلول مخزون AIP باستخدام الماء المقطر لتركيز نهائي قدره 4 ملي مولار. تمت إضافة حجم مناسب من محلول المخزون إلى 5 0 مل من الوسط للحصول على تركيزات نهائية من 0 .5 و 2.0 لتر. تم تعقيم الوسائط وتلقيحها بخلايا تم جمعها حديثًا. تم تلقيح القوارير الثلاثية بخلايا تم جمعها من نفس الزجاجة واستخدمت في جميع المجموعات لتقليل الخطأ المنهجي.

تحليل HPLC

تمت تصفية المستخلصات التي تم الحصول عليها في "الاستخلاص وتحديد محتوى إجمالي المركبات الفينولية" من خلال مرشح {{0}. 5 lm قبل تحليل HPLC. تم إجراء تحليل HPLC باستخدام مضخة Hitachi HPLC (L -2130 مضخة ، L -2420 كاشف UV / Vis و -2200 جهاز أخذ عينات تلقائي) مع عمود C18 (150 9 4. 6 مم ، 5 lm ، المياه) ، المرحلة المتنقلة (شطف التدرج MeOH / H2O) ، وطول موجة الكشف من 330 و 220 نانومتر للكشف عن(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs و salidroside ، على التوالي. تم حقن عشرة ميكرولترات من كل مخففات مركب معيارية ومستخلص عينة في العمود. تم إجراء عمليات تحديد محتوى إشيناكوسايد ، أكتيوسيد ، سيستانوسيد أ ، توبولوسيد أ ، وساليدروسيد باستخدام المنحنى القياسي لكل مركب مرجعي. قام كل من مراقبة المنتجات الصيدلانية والبيولوجية (بكين ، الصين) والدكتور نوبوهيسا إزاكي من شركة يوميشو سيزو بتوفير مركبات مرجعية أخرى. نقاوة جميع المركبات القياسية أعلى من 95 في المائة. يتم سرد المعلومات الهيكلية للمركبات الخمسة المختبرة في الجدول 1.

مقايسة نشاط PAL

تم استخلاص البروتين الخام من العينات المخزنة عند درجة {0}. تم ​​طحن عينة 0.1 جم إلى مسحوق ناعم مع نيتروجين سائل وأضيف 600 لتر من محلول استخلاص البروتين إلى الأنبوب المحتوي على مسحوق الخلية متبوعًا بتدفق قوي من أجل 5 دقائق في 4الدرجة العلمية. تم طرد الخليط عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة لمدة 10 دقائق. تم تعريف المادة الطافية على أنها مستخلص بروتين خام. تمت إضافة عشرة ميكرولتر من مستخلص البروتين الخام إلى عازلة Tris-HCl (pH 8.5) تحتوي على 10 لترات من 5 ملي مولار من الفينيل ألانين على الجليد. تم احتضان الخليط عند 55الدرجة العلميةلمدة 20 دقيقة ويتم إخمادها بإضافة 50 لتر من 2 مولار حمض الهيدروكلوريك. تم تسجيل تغييرات OD270 لحساب إنتاج حمض سيناميك على أساس المنحنى القياسي لحمض ترانس سيناميك. تم حساب إجمالي مساحة وقت النشاط PALactivity تحت المنحنى (AUC) بناءً على بيانات نمو الخلية وبيانات اختبار نشاط PAL.

تحليل احصائي

تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج Microsoft excelsoftware بما في ذلك تحليل الخطأ المعياري والانحدار الخطي

النتائج والمناقشة

تأثير العلاج AIP على نمو الخلاياCistanche Deserticolaثقافة خلية التعليق

كما هو مبين في الشكل 1 ، فإن معالجة AIP في كلا التراكيز لم يكن لها تأثيرات تثبيط على نمو الخلايا كما هو مبين في FW و DW.

آثار علاج AIP على نشاط PAL

كما هو مبين في الشكل 2 ، لم يؤد علاج AIP بتركيزاته إلى انخفاض في نشاط PAL في اليوم الثاني ، ولكن نشاط PAL انخفض بشكل ملحوظ في الأيام من 4 إلى 28. في تلك الأيام ، كان نشاط PAL لـ 0. 5 lMAIP من الخلايا المعالجة 80.3 ، 73.2 ، 82.7 ، 68.5 ، 62.3 ، و 42.4 بالمائة من الخلايا غير المعالجة ، وتحت 2 lM AIP.

آثار علاج AIP على تراكم المركبات الفينولية الكلية

أظهر الشكل 3 أ أن معالجة AIP في كلا التركيزين أثرت بشكل ملحوظ على التخليق الحيوي للمركبات الفينولية الكلية. على غرار نشاط PAL ، لم ينخفض ​​إجمالي محتوى مركب الفينول في اليوم الثاني ولكنه بدأ في الانخفاض في اليوم الرابع. كانت التأثيرات المثبطة لـ AIP عند 0 .5 و 2 lM على إجمالي محتويات المركب الفينولي متشابهة جدًا. تراوح معدل تثبيط المحتوى من 91.1 إلى 5 0. 1 بالمائة ومن 89.9 إلى 41.5 بالمائة من الخلايا غير المعالجة في 0. 5 و 2 لتر من الخلايا المعالجة بـ AIP ، على التوالي. بناءً على تحديد محتوى إجمالي المركبات الفينولية وبيانات نمو الخلايا ، تم حساب حصيلة المركبات الفينولية الكلية كما هو موضح في الشكل 3 ب. التغيرات الكبيرة في إنتاج المركب الفينولي في مراحل النمو المختلفة كانت واضحة في 0 5 و 2.0 lM AIP مقارنة بالخلايا غير المعالجة. كما هو مبين في التين. 2 و 3 ، كان لتثبيط نشاط PAL والانخفاض في إجمالي المركبات الفينولية والعوائد اتجاهات مماثلة.

تم إجراء تحليل الانحدار الخطي بين نشاط PAL والمركبات الفينولية الكلية واقترحت النتائج أنه في الخلايا المعالجة بـ AIP ، كان نشاط PAL مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا بمحتوى المركب الفينولي الكلي (الشكل 4 أ). ناتج إجمالي المركبات الفينولية في العينة في كل خطوة زمنية هو نتيجة التراكم ؛ لذلك ، تم إجراء تحليل الانحدار الخطي بين إجمالي AUC ووقت نشاط PAL وإجمالي العائد لمركب الفينول. يوضح الشكل 2 أن نشاط PAL كان مختلفًا في كل نقطة زمنية ؛ وبالتالي ، من أجل حساب إجمالي وقت نشاط PAL AUC ، نفترض هنا أن النشاط PAL بين نقطتين زمنيتين قد تغير خطيًا. كما هو موضح في الشكل 4 ب ، فإن AUC يرتبط جيدًا بإنتاج مركب الفينول الكلي ومعاملات الارتباط المعروضة (R2) لـ 0. 9788 ، {{1 0}. 8157 ، و 0 .6981 للخلايا غير المعالجة ، 0. 5 lM AIP و 2.0 lM AIP ، على التوالي. بناءً على هذه النتائج ، خلصنا إلى أن تثبيط النشاط PALactivity الناجم عن علاج AIP أدى إلى انخفاض إجمالي التخليق الحيوي للمركبات الفينولية وتراكمهاCistanche Deserticolaثقافة خلية التعليق.

آثار العلاج AIP على تراكم الساليدروسيد وأربعة(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs

لدراسة التأثيرات التفصيلية لـ AIP على التخليق الحيوي وتراكم(جليكوسيدات فينيلثانويد)تم تطبيق PheGs ، مقتطفات من عينات مختلفة على HPLC ويظهر الرسم البياني التمثيلي لكل عينة في الشكل 5. يتم سرد الصيغة القياسية للمركبات المختبرة وأوقات الاحتفاظ بها في الجدول 2. كما أوضح الشكل 5 أ ، ساليدروسايد والأربعة الأخرى تم فصل خطوط الأساس وفقًا لحالتنا التحليلية. يمكننا أن نرى من الشكل 5 ب-د ، أن محتوى الساليد لم يتغير بشكل ملحوظ ، وفي الشكل 5f ، g ، أن مساحة القمم المكتشفة عند 33 0 نانومتر انخفضت بشكل ملحوظ ومستمر في 0.5 و 2 lM AIP cellextracts مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 5 هـ).

تم توضيح تغيرات المحتوى والمحصول لكل مركب تم اختباره في الشكل 6 والجدول 3. ووفقًا لنتائجنا ، فإن إشنكوسايد وسيستانوسيد أ هما المركبان الرئيسيان ومحتوياتهما أعلى بنحو عشرة أضعاف من المركبات الثلاثة الأخرى. ومع ذلك ، كانت هناك اختلافات كبيرة في محتوى كل مركب في الاستجابة لعلاج AIP. في حالة إشنكوسايد ، بدأ المحتوى في الخلايا غير المعالجة في الزيادة بشكل مستمر من اليوم الثامن إلى اليوم الثامن والعشرين (الشكل 5 أ) ، والذي تم تركه مختلفًا عن نمط cistanoside A ، والذي وصل إلى أعلى محتوى في اليوم الثامن وانخفض بشكل طفيف باستمرار حتى اليوم الثامن. اليوم الثامن والعشرون. في الخلايا المعالجة بـ AIP ، انخفض محتوى المركبين بشكل ملحوظ في نفس النمط. محتوى أكتيوسيد وتوبولوسيد أقل بكثير من إشنكوسايد ، في حين أن الاتجاه المتغير كان مشابهًا لإشنكوسايد. هناك أيضًا انخفاض كبير في محصول كل مركب تم اختباره لـ 0. 5 و 2 lM من الخلايا المعالجة بـ AIP مقارنة بالخلايا غير المعالجة. وفقًا للشكل 6 والجدول 3 ، انخفض عائد إشنكوسايد وسيستانوسيد وأكتيوسيد وتوبولوزيد أ وساليدروسيد إلى ما يقرب من 10 و 10 و 34 و 36 و 25 في المائة من الخلايا غير المعالجة ، على التوالي ، في اليوم الثامن والعشرين في الخلايا المعالجة بـ AIP في كليهما. تركيزات.

تحليل الانحدار الخطي بين نشاط و PAL(جليكوسيدات فينيلثانويد)تراكم PheGs

لتحديد كيفية ارتباط نشاط PAL ومحتوى كل مركب تم اختباره في كل مجموعة ، تم إجراء تحليل الانحدار الخطي (الشكل 7). احتوى محتوى ساليدروسيد في جميع المجموعات على أقل معامل ارتباط (R2) ، بدءًا من 0. 1651 في الخلية غير المعالجة إلى 0. 4753 في 2. 0 الخلايا المعالجة بـ AIP. . باستثناء ساليدروسايد ، كان للمركبات الأخرى التي تم اختبارها معاملات ارتباط عالية جدًا وتم سرد R2 في الشكل 7. أظهرت نتائج Ourresults أن نشاط PAL يرتبط ارتباطًا وثيقًا بمحتوى إشنكوسايد وأكتيوسيد وسيستانوسيد أ وتوبولوسيد أ في جميع المجموعات.

أجرينا أيضًا تحليل الانحدار الخطي بين المساحة الكلية لوقت نشاط PAL وكل حقل مركب تم اختباره في العينات التي تم جمعها (الشكل 8). أشار تحليل الانحدار إلى ارتباط ناتج كل مركب مع الجامعة الأمريكية بالقاهرة بشكل مختلف. في الخلايا غير المعالجة ، تحتوي جميع المركبات الخمسة على معاملات ارتباط عالية مع إجمالي نشاط PAL-time AUC. ومع ذلك ، في الخلايا المعالجة بـ AIP ، احتفظ فقط إشنكوسايد ، أكتيوسيد ، وتوبولوسيد A بمعاملات الارتباط العالية والمركبين الآخرين ، السيستانوزيد A والساليدروزيد كان لهما علاقة ارتباط منخفضة جدًا مع إجمالي نشاط PAL - وقت AUC. اقترحت هذه النتائج أن نشاط PAL له تأثيرات مختلفة جدًا على تراكم هذه المركبات. وفقًا للجدول 1 ، تحتوي مركبات إشنكوسايد ، أكتيوسيد ، وتوبولوسيد أ على مجموعة كافويل ومجموعة 3 ، 4- ثنائي هيدروكسيل فينيل إيثانول ؛ يحتوي cistanoside A على مجموعة feruloyl ومجموعة ميثوكسي 3- ، 4- hydroxyl phenyl ethanol group ؛ يحتوي andsalidroside على مجموعة hydroxyl phenyl ethanol. السبب في أن هذه المركبات لها معاملات ارتباط مختلفة مع إجمالي وقت نشاط PAL في الخلايا المعالجة بـ AIP قد يكون مرتبطًا بأصولها الاصطناعية المختلفة.

كما هو مبين في الشكل 5 ، بعد علاج AIP ، انخفضت معظم القمم بشكل مستمر وبشكل ملحوظ وتم تحديد خمسة في هذه الدراسة. من بين هذه المركبات المختبرة ، فقط ساليدروسايد ليس لديه مجموعة كافويل. قبل هذه الدراسة ، كان يُعتقد أن محتوى الوسطاء المهمين قبل تكامل مجموعة الكافيين ، مثل أساليدروسيد ، سيزداد بسبب تثبيط نشاط PAL ، لكننا لم نجد زيادة كبيرة في القمم في الخلايا المعالجة بـ AIP. قد تحدث هذه النتيجة بسبب(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs هي مستقلبات ثانوية في C. deseriticola وإنتاج هذه(جليكوسيدات فينيلثانويد)يتم تنظيم PheGs من خلال الإجهاد البيئي للخلايا. في تجاربنا ، لا يتم التعامل مع الخلايا المعالجة بـ AIP بـ elicitor أو ضغوط أخرى ، لذا فإن إنتاج PheGs ووسطائها يتم تخليقه حيويًا بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بـ AIP. وقد أفادت أيضًا أن (Chapple et al. 1986) يمكن تثبيط نشاط التيروزين الكربوكسيلاز النباتي (TYRDC) بشدة بواسطة La-aminooxy-b-phenylpropionate ، وهو مثبط تنافسي آخر خاص بـ PAL. TYRDC هو إنزيم رئيسي في إنتاج salidroside من التيروزين. ومع ذلك ، وفقًا لنتائجنا ، لم يتأثر محتوى salidroside بشكل كبير بعلاج AIP ، مما يشير إلى أن نشاط TYRDC لم يتأثر بشدة. مطلوب اختبار نشاط معين باستخدام بروتين منقى أو بروتين مركب TYRDC لتحديد تأثيرات AIP على نشاطه.

الاستنتاجات

أظهرت نتائجنا أن علاج AIP في {0}. 5 و 2.0 lM ليس له آثار ملحوظة على نمو الخلايا ولكنه أدى إلى تثبيط كبير لنشاط PAL والتخليق الحيوي وتراكم المركب الفينولي الكلي واختباره(جليكوسيدات فينيلثانويد)ثقافة خلية تعليق PheGsinCistanche Deserticola. أشار تحليل الانحدار الخطي إلى أن نشاط PAL له معاملات ارتباط عالية مع إجمالي محتوى المركب الفينولي و(جليكوسيدات فينيلثانويد)محتوى PheGs ، باستثناء salidroside في جميع مجموعات الخلايا. كان لعائد إجمالي المركبات الفينولية والمركبات المختبرة معاملات ارتباط عالية مع إجمالي نشاط PAL - وقت AUC في الخلايا غير المعالجة. فيما يتعلق بالخلايا المعالجة بـ AIP ، احتفظ إشنكوسايد ، أكتيوسيد ، وتوبولوسيد أ فقط بمعامِلات ارتباط عالية مع AUC وقت النشاط الكلي PAL. قد تكون أصول التخليق الحيوي المختلفة مسؤولة عن هذا الاختلاف. في الختام ، تشير نتائجنا إلى أن إنزيم PAL لعب دورًا مهمًا في التحكم في التخليق الحيوي وتراكم(جليكوسيدات فينيلثانويد)PheGs في ثقافة الخلية المعلقةCistanche Deserticola.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث جامعة Dong-A. نود أن نشكر البروفيسور جيري زون الذي يعمل في معهد الكيمياء العضوية والكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة Wrocław للتكنولوجيا في بولندا لتزويدنا بـ AIP. نود أيضًا أن نعرب عن تقديرنا للدكتور Nobuhisa Ezaki في شركة Yomeishu Seizo في اليابان لإعطائنا مركبات قياسية cistanoside A و acteoside و tubuloside A لتجاربنا.

من: "تأثيرات معالجة 2- aminoindan -2- بحمض الفوسفونيك على تراكم ساليدروسايد وأربعة جليكوسيدات فينيليثانويد في ثقافة الخلية المعلقة لـ Cistanche deserticola" بواسطةجاو شنغ هو وآخرون

---ممثل الخلية النباتية (2011) 30: 665-674 DOI 10.1007 / s 00299-010-0997-3

مراجع

تشابل CCS ، Walker MA ، Ellis BE (1986) يمكن تثبيط ديكاربوكسيلاز التيروزين النباتي بشدة بواسطة La-aminooxy-b-phenylpropionate. بلانتا 167: 101-105

Cheng XY، Guo B، Zhou HY et al (2005) الاستنباط المتكرر يعززجليكوسيدات فينيلثانويدالتراكم في مزارع الخلايا المعلقةCistanche Deserticola. J Biochem Eng 24: 203-207
Cheng XY و Zhou HY و Cui X وآخرون (2006) تحسينجليكوسيدات فينيلثانويدالتخليق الحيوي فيCistanche Deserticolaمزارع الخلايا المعلقة بواسطة الشيتوزان إليسيتور. J Biotechnol 121 (2): 253-260
Ellis BE (1983) إنتاج هيدروكسي فينيل إيثانول جليكوسيدات في مزارع معلقة من Syringa vulgaris. كيمياء النبات 22 (9): 1941-1943
Gamborg OL ، Miller RA ، Ojima K (1968) المتطلبات الغذائية لمزارع تعليق خلايا جذر فول الصويا. دقة خلية الخبرة 50: 151-158
Geng XC ، Song LW ، Pu XP وآخرون (2004) تأثيرات الحماية العصبيةجليكوسيدات فينيلثانويدمنسيستانشالسالسا ضد 1- ميثيل -4- فينيل -1 ، 2،3 ، 6- رباعي هيدرو-بيريدين (MPTP) - السمية الدوبامينية المستحثة في الفئران C57. بيول فارم بول 27 (6): 797-801
Hu GS (2007) دراسات حول ثقافة الخلايا المعلقة والبيولوجيا الجزيئية لـCistanche Deserticola. أطروحة درجة الماجستير ، جامعة شنيانغ الصيدلانية Hu GS ، Jia JM ، Hur YJ ، وآخرون (2010) التوصيف الجزيئي لأمونيا-لياز فينيل ألانين منCistanche Deserticola.مندوب مول السيرة الذاتية doi: 10.1007 / s 11033-010-0489-0
Karasawa H ، Kobayashi H ، Takizawa N et al (1986) دراسات حول مكونات Cistanchis Herba. ثامنا. ياكوجاكو زاشي 106 (8): 721-724
كوباياشي إتش ، كاراساوا إتش ، مياسي تي وآخرون (1984 أ) دراسات حول مكونات سيستانشيس هيربا. رابعا. كيم فارم بول 32 (10): 3880-3885
Kobayashi H ، Karasawa H ، Miyase T et al (1984b) دراسات حول مكونات Cistanchis Herba. ثالثا. كيم فارم بول 32 (8): 3009-3014
Kobayashi H ، Karasawa H ، Miyase T et al (1985) دراسات حول مكونات Cistanchis Herba. فيشيم فارم بول 33 (4): 1452–1457
Kobayashi H ، Karasawa H ، Takizawa N et al (1986) دراسات حول مكونات Cistanchis Herba. سابعا. ياكوجاكو زاشي 106 (7): 562-566
Liu CZ، Cheng XY (2008) تعزيزجليكوسيدات فينيلثانويدالتخليق الحيوي في مزارع الخلاياCistanche Deserticolaعن طريق الإجهاد التناضحي. ممثل الخلية النباتية 27: 357-362
Liu JY، Guo ZG، Zeng ZL (2007) تراكم محسن لـجليكوسيد الفينيثانويدs عن طريق التغذية الأولية إلى الثقافة المعلقة من Cistanche salsa. Biochem Eng J 33: 88-93
Lu CT ، Mei XG (2003) تحسينجليكوسيدات فينيلثانويدعن طريق مستحضر فطري في زراعة الخلايا المعلقةCistanche Deserticola.Biotechnol Lett 25: 1437-1439
Ouyang J و Wang XD و Zhao B et al (2003a) تؤثر شدة الضوء والجودة الطيفية على نمو الكالس فيCistanche Deserticolaوالتخليق الحيويجليكوسيدات فينيلثانويد. علم النبات 165: 657-661
Ouyang J ، Wang XD ، Zhao B ، et al (2003b) تأثيرات العناصر الأرضية النادرة على نموCistanche Deserticolaالخلايا وإنتاججليكوسيدات فينيلثانويد. J Biotechnol 102: 129-134
Ouyang J ، Wang XD ، Zhao B ، وآخرون (2005) إنتاج محسن لـجليكوسيدات فينيلثانويدعن طريق تغذية السلائف إلى ثقافة الخليةCistanche Deserticola. عملية Biochem 40: 3480-3484
Pu XP ، Song ZH ، Li YY et al (2003) Acteoside من Cistanche salsa يثبط موت الخلايا المبرمج بمقدار 1 ، 2- methyl phenylpyridinium ion في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية. بلانتا ميد 69: 652 - 666
Saimaru H ، Orihara Y (2010) التخليق الحيوي للأكتيوسايد في الخلايا المستزرعة في Olea europaea. ج نات ميد 64: 139-145
Sheng GQ ، Pu XP ، Lei L ، وآخرون (2002) Tubuloside B من Cistanche salsa ينقذ الخلايا العصبية PC12 من موت الخلايا المبرمج الناتج عن ميثيل فينيل بيريدينيوم والإجهاد التأكسدي. بلانتا ميد 68: 966-970
Singleton VL ، Orthofer R ، Lamuela-Ravento´s RM (1999) تحليل إجمالي الفينولات وركائز الأكسدة الأخرى ومضادات الأكسدة عن طريق كاشف Folin-Ciocalteu. طريقة الإنزيم 299: 152 - 178
تيان XF ، بو XP (2005)جليكوسيد فينيلثانويدs من Cistanches salsa تمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن 1- methyl -4- phenylpyridinium ion في الخلايا العصبية. J إثنوفارماكول 97: 59-63
Xiong Q ، Kadota S ، Tani T ، et al (1996) التأثيرات المضادة للأكسدة من phenylethanoids منCistanche Deserticola. بيول فارم بول 19 (12): 1580-1585