آثار ضغوط الإرواء على فقدان بودوسيت في كلية الفأر المعزولة المروية

edmund.chen@wecistanche.com

الملخص

الخلفية / الأهداف: يتم فقدان خلايا بودوسيت في معظم أمراض الكبيبات ، مما يؤدي إلى تصلب الكبيبات وتدريجيًامرض كلوي. يُفترض عمومًا أن خلايا الأرجل تتعرض لتدفق الترشيح وبالتالي لقوى قص كبيرة تدفع انفصالها عن الغشاء القاعدي الكبيبي (GBM). في هذا السياق ، تم اقتراح إضعاف عملية القدم كاستجابة تكيفية محتملة لزيادة التصاق الخلايا البودوسية بـ GBM. الطرق: لقد اختبرنا هذه الفرضيات باستخدام المقاصة الضوئية والتحليل المورفومتري عالي الدقة 3- للأبعاد في الفئران المروية المعزولةالكلى.لقد بحثنا في ديناميكيات انفصال الخلايا الجرثومية عند ضغوط نضح مختلفة (50 ، 300 وأكثر من 450 ملم زئبقي) في فئران شابة أو كبيرة في السن (20 مقابل 71 أسبوعًا من العمر) ، أو فئران محقونة بمصل مضاد لـ GBM للحث على القدم العالمية عملية محو. النتائج: أظهرت النتائج أن الخلايا البودوسية السليمة في الفئران الصغيرة مرتبطة بإحكام بـ GBM وحتى الضغوط فوق القصوى لا تسبب انفصالًا كبيرًا. مقارنة بالفئران الصغيرة ، في الفئران المسنة والفئران المصابة بالتهاب الكلية المضاد لـ GBM وانحسار عملية القدم ، حدث فقدان تدريجي للخلايا البودوسية بالفعل قبل التروية. أدت ضغوط التروية العالية إلى خسارة إضافية طفيفة نسبيًا للخلايا في الفئران المسنة. في الفئران المصابة بالتهاب الكلية المضاد لـ GBM ، حدثت خسارة إضافية كبيرة في خلية البودوسيت في هذه النقطة الزمنية المبكرة عند زيادة ضغوط التروية إلى 300 مم زئبق أو أعلى. الخلاصة: يقدم هذا العمل أول دليل تجريبي على أن الخلايا القرنية مقاومة بشكل غير عادي لضغوط التروية المتزايدة بشكل حاد في خارج الجسم الحي المعزولالكلىنموذج نضح. فقط في مرض الكبيبات ، يتم فصل أعداد كبيرة من الخلايا الجسدية المصابة بعد الزيادات الحادة في ضغط التروية.

الكلمات الدالة:ارتفاع ضغط الدم الكبيبي. فرط الترشيح الكبيبي الضغط الميكانيكى؛ تقدم. فشل كلوي مزمن

سيحسن القسطرة من أمراض الكلى / الكلى

مقدمة

يؤدي ارتفاع ضغط الدم الكبيبي وفرط الترشيح إلى تلف الكبيبات مما يؤدي إلى مرض الكبيبات التدريجي. من المعتقد على نطاق واسع أن زيادة ضغط التروية يعرض الخصلة لضغط ميكانيكي متزايد يتحدى التصاق الخلايا البودوسية بالغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، مما يساهم في انفصالها [1 ، 2]. خلايا بودوسيت هي خلايا متباينة للغاية ، ما بعد الانقسام ، ضرورية لحاجز الترشيح الكبيبي السليم. من المرجح أن يكون فقدان بودوسيت ناتجًا عن انفصال الخلايا القابلة للحياة من GBM بدلاً من موت الخلايا المبرمج أو النخر [3-6] حيث كان من الممكن استنبات خلايا podocytes تم استعادتها من بول المرضى [4]. قد ينتج عن انفصال الخلايا البودوسية القابلة للحياة من GBM آليات التعلق الضعيفة أو القوى الميكانيكية البديلة. قد يكون ضعف التعلق بـ GBM ناتجًا عن إصابة خلوية أو انخفاض التعبير عن جزيئات الالتصاق ويرتبط بشكل أساسي بأمراض الكبيبات الالتهابية. فيما يتعلق بالقوى الميكانيكية ذات الصلة بالخلية ، هناك نوعان من المحددات الرئيسية ، وهما ضغط الترشيح وتدفق الترشيح [7-9]. يولد ضغط الترشيح ضغطًا محيطيًا على الجدار ويعمل كقوة ممتدة على GBM. يتم تعويض التغيرات في الضغط الهيدروستاتيكي العابر بفاعلية بقدرة GBM على العمل كغشاء مرن ويتمدد أو يتقلص في مساحة السطح [8 ، 1 0]. من ناحية أخرى ، فإن تدفق الترشيح عبر GBM يمارس قوى عرضية على سطح خلايا الأرجل ، أي إجهاد القص. نحن نعلم من الدراسات في المختبر أن خلايا الأقدام معرضة بشدة لضغط القص المنفصل عن الركيزة عند تعرضها لضغوط القص التي تزيد عن 0.025 باسكال [11] وتبني نمطًا ظاهريًا وسيطًا قد يساعدها على مواجهة القوى المشتقة من التدفق [12]. لا يزال من غير الواضح ما إذا كان ارتفاع ضغط الدم الكبيبي يؤثر على الخلايا البودوسية من خلال زيادة ضغط الترشيح و / أو زيادة الترشيح. في هذه الدراسة ، نقدم أول تحليل لقدرة الخلايا البودوسية على مقاومة القوى الميكانيكية المتزايدة في نموذج خارج الجسم الحي. تم قياس فقدان Podocyte بدقة عالية باستخدام تطهير الأنسجة 3- وتحليل شكلي الأبعاد في الفئران الشابة والسليمة

المواد والأساليب

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقًا لإرشادات القانون الألماني لرعاية الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل Landesamt für Natur، Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02. 04.2015.A469). تم إيواء الفئران في منشأة محددة خالية من مسببات الأمراض مع حرية الوصول إلى الطعام والماء و 12- ساعة في النهار / الليل. تم إجراء التكاثر والتنميط الجيني وفقًا للإجراءات القياسية. تم وصف Pod-rtTA / LC1 / R26R / H2BeGFP على خلفية وراثية FVB / N من قبل [13]. لتنشيط التعبير الجيني عن Pod-rtTA-eGFP ، تلقت الفئران الدوكسيسيكلين عبر مياه الشرب الإعلانية بالشهرة لمدة 7 أيام (2 جم / لتر ، 5 في المائة سكروز ، محمية من الضوء) تليها فترة غسل لمدة أسبوع واحد وفقًا للتقارير السابقة. تم إحداث التهاب الكلية المضاد لـ GBM عن طريق حقنة واحدة داخل الصفاق مقدارها 5 ملجم / غم من مصل الدم السام للكلية على النحو الموصوف سابقًا [14].

سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ

نضح الكلى

المعزولونالكلىتم استخدام نموذج التروية كما هو موضح في مكان آخر [15]. باختصار ، تم تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من الزيلازين / الكيتامين (0 ، 1 مل / 10 جم من وزن الجسم IP) ، ثم تم ترطيب الكلى بمحلول كريبس-هنسيليت المعدل المعقد (الجدول 1) المكمّل بـ 5 نسبة الألبومين المصل البقري (BSA) عند 37 درجة لتقليد البيئة الفسيولوجية أثناء التجربة. الحد الأقصى لتوسيع الأوعيةالكلىتم تحفيز الأوعية الدموية عن طريق 1. حقن فيراباميل تحت الجلد (50 ميكرولتر) مباشرة بعد تحريض التخدير و 2. إضافة بابافيرين إلى محلول التروية. بعد التروية الأولية لمدة 5 دقائق عند 50 مم زئبق ، تم حقن ليكتين ذو علامة الفلورسنت (Communis I - RCA120 ؛ مختبرات المتجهات: RL -1082 ؛ 4 ماي في 986 ماي من محلول ملحي) لتسمية الخلايا البطانية.الكلىتم ترطيبها لمدة 5 دقائق إضافية باستخدام محلول Krebs-Henseleit المعدل بنسبة 5 بالمائة من مساحة سطح الجسم. بعد ذلك اليسارالكلىالتي كانت بمثابة تحكم مزدوج في كل تجربة تمت إزالتها بعد الربط الدقيق لليساركلويأوعية ، مقطعة إلى شرائح ، ومغمورة مباشرة في 3 في المائة من بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزون الفوسفات (PBS). الحقالكلى was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 مم زئبق ، تم تقدير ضغوط الترشيح لتكون أعلى بكثير من 400 مم زئبق) ، يتم تطبيقها يدويًا ، الحجم الإجمالي 50 مل من محلول التروية. الالكلىتم ترطيبها بضغط ثابت يبلغ 50 مم زئبق أو 300 مم زئبق باستخدام مضخة يتم التحكم فيها بالضغط (Universal Perfusion Systems UP -100 ، Hugo-Sachs Electronics ، ألمانيا). ثم الحقالكلىتمت إزالته ، وتقطيعه إلى شرائح بحجم 2 مم ، وغمره في 3 في المائة من بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS).

التصوير ثلاثي الأبعاد والتحليل الحسابي PFA مغمورالكلىتم تحضين الشرائح على شاكر ميكانيكي لمدة 5 أيام عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تم غسل العينات الثابتة في 1x PBS ووضعها في شاكر ميكانيكي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.الكلىتم وضع الشرائح بعد ذلك في إيثانول عالي الجودة بنسبة 100 في المائة (Merck ؛ 100983) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف (تغيير واحد على الأقل إلى الإيثانول الطازج) ، متبوعًا بالغمر المباشر في Ethyl Cinnamate (ECi) (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، مو ؛ 112372) وتركت طوال الليل في شاكر لطيف في درجة حرارة الغرفة تحت حماية الضوء. تم تحقيق شفافية الأنسجة في أقل من ساعة واحدة. بالنسبة إلى المجاهر المستقيمة ، استخدمنا غرفًا مبنية في المنزل يمكن التخلص منها كما هو موضح سابقًا [16]. تم إجراء معظم التجارب باستخدام 2- مجهر فوتوني (LaVision BioTec TriMScope ، "Medizinische Fakultät RWTH Aachen ، IZKF Aachen ، المرافق الأساسية). تم استخدام برنامج التصوير فيجي للتنقل عبر المحور Z لكل مجموعة من الأقسام البصرية التسلسلية وعزل الكبيبات الفردية عن طريق الاقتصاص ثلاثي الأبعاد [16] .40 من الكبيبات لكلالكلى(20 تحت القشرة و 20 juxtamedullary) للتحليل. وبالتالي ، تم تحليل 1200 من الكبيبات في هذه الدراسة للحصول على نتائج بدقة كافية. تم تحديد Podocytes كخلايا eGFP plus. تم إجراء القياس الكمي لحجم الشعيرات الدموية والحجم الكبيبي وكذلك عدد النوى (النقاط) والحجم باستخدام برنامج عرض وتحليل ثلاثي الأبعاد (Imaris v9.1 ؛ Bitplane AG ، زيورخ ، سويسرا) تم حساب مسافة الخلايا البودوسية من القطب الوعائي باستخدام Bitplane XTension "أقرب نقطة. المسافة". تم إجراء القياس الكمي الآلي للخلايا البودوسية كما هو موضح سابقًا [17]. تم إجراء تحليل الصورة باستخدام Imaris (Biplane AG Zurich ، سويسرا). تم تعريف كل كبيبة من خلال شريانها الوارد المسمى الليكتين. 20 تحت القشرة و 20 juxtamedullary (محددة ببعدها عن السطح القشري).

سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى

الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي

بالنسبة للفحص المجهري الضوئي ، تم تخزين الفورمالين الثابت بنسبة 4 في المائةالكلىشظايا مجففة ، مغروسة في البارافين وملطخة بحمض شيف الدوري (PAS). تم حساب النسبة المئوية للكبيبات غير الطبيعية / المصابة بناءً على تحديد 50 مقطعًا عرضيًا كبيبيًا تمثيليًا لكل فأر تم تحديده أثناء المشي المنتظم عبركلويالقشرة. تم إجراء بروتوكول التألق المناعي المعياري الخاص بنا [18] على 2 ميكرومتر من المقاطع المضمنة بالبارافين. تم استخدام الأجسام المضادة التالية: مضاد للدجاج متعدد الأضلاع لـ GFP (ab13970 ؛ Abcam) ، مضاد للسينابتودين وحيدة النسيلة للفأر (sc -515842 ؛ سانتا كروز Biotechnology) ، أرنب متعدد النسيلة مضاد للفأر p57 (sc -8298 ؛ سانتا -Cruz Biotechnology) ، أرنب polyclonal anti-WT1 (sc -192 ؛ Santa-Cruz Biotechnology) ، Cy2 donkey anti-chicken (703-225-155 ؛ Dianova ، هامبورغ ، ألمانيا) ، Alexa Fluor546 goat anti-mouse IgG1 (A -21123؛ Thermo Fischer)، حمار متعدد الأضلاع مضاد للأرانب AF555 (A31572؛ Life Technologies، Carlsbad، CA).

المجهر الإلكتروني

تم إصلاح قطع صغيرة من القشرة في محلول كارنوفسكي وتم تضمينها في Epon (سيرفا ، هايدلبرغ ، ألمانيا). تم فحص المقاطع شديدة الرقة باستخدام مجهر الإرسال الإلكتروني ZEISS Leo 9 0 6 عند 6 0 كيلو فولت بواسطة تكبير من 3597-6000 x. تم غسل العينات في 0.1 مولار من فوسفات Soerensen (Merck ، Darmstadt ، ألمانيا) ، مثبتة لاحقًا في 1٪ OsO 4 (Roth ، Karlsruhe ، ألمانيا) في محلول سكروز بنسبة 17٪ (Merck ، Darmstadt ، ألمانيا) وتم تجفيفها عن طريق تصاعد سلسلة الإيثانول ( 30 و 50 و 70 و 90 و 100 بالمائة) لمدة 10 دقائق لكل منهما. تكررت الخطوة الأخيرة 3 مرات. تم تحضين العينات المجففة في أكسيد البروبيلين (سيرفا ، هايدلبرغ ، ألمانيا) لمدة 30 دقيقة ، في خليط من راتنجات Epon (سيرفا ، هايدلبرغ ، ألمانيا) وأكسيد البروبيلين (1: 1) لمدة ساعة واحدة وأخيراً في Epon النقي لمدة ساعة واحدة. تم إجراء بلمرة Epon عند 90 درجة لمدة ساعتين. تم قطع المقاطع شديدة الرقة (70-100 نانومتر) بواسطة الجسيمات الدقيقة (Reichert Ultracut S ، Leica بسكين ماسي (Leica) والتقطت على شبكات Cu / Rh (HR23 Maxtaform ، Plano ، Wetzlar Germany). تم تحسين التباين بواسطة تلطيخ بنسبة 0.5 في المائة من خلات اليورانيل و 1 في المائة من سترات الرصاص (كلاهما EMS ، ميونيخ ، ألمانيا). تم فحص العينات بجهد تسريع قدره 60 كيلو فولت باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا).

تحليل احصائي

تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism v8. يتم التعبير عن جميع القيم كوسائل ± SD. للمقارنة بين مجموعتين ، تم استخدام اختبار t. تم إجراء مقارنة بين عدة مجموعات باستخدام تحليل التباين. تم استخدام تصحيح Tukey اللاحق لإجراء مقارنات متعددة. كانت جميع الاختبارات 2- متدرجة وتم تحديد الدلالة الإحصائية على أنها P <0.>

نتائج

طريقة شبه آلية لتحديد عدد الخلايا البودوسية لكل كبيبة تمت دراسة ثلاث مجموعات ، أي فئران صغيرة وكبيرة في السن وفئران مصابة بالتهاب كبيبات الكلى المضاد لـ GBM (♂: ♀ 1: 1). كان عمر الفئران الشابة السليمة 15-21 أسبوعًا ، بينما كان عمر (عمر) 74 أسبوعًا. تم إحداث إضعاف عملية القدم العالمية في 14-20 أسبوعًا من الفئران عبر حقنة واحدة من مصل مضاد GBM قبل 3 أيام من إعداد المعزول المعزولالكلىنموذج (الشكل 1 أ) ، كما هو موصوف سابقًا [19].

لتحديد تأثير ضغط التروية داخل الكلى على خلايا الأقدام ،الكلىتعرضوا لضغوط نضح مختلفة في المعزولةالكلىنموذج نضح. أولاً ، كلاهماالكلىيتم ترطيبها دائمًا عند 50 مم زئبق لمدة 5 دقائق. لاختبار ما إذا كان حل التروية الخاص بنا قد حافظ على سلامة الكبيبة في الحالة غير المثبتةالكلى، تم ترطيب 2 فأر عند ضغط ثابت قدره 100 مم زئبق لمدة 90 دقيقة. ظل التروية وتدفق البول (25 ميكرولتر / دقيقة / غرام من وزن الجسم) وكذلك تصفية الأنسولين (22 ميكرولتر / دقيقة) ثابتة طوال الوقت (الشكل التكميلي 1 - لجميع المواد التكميلية انظرwww.cellphysiolbiochem.com).في الفئران التجريبية ، بعد نضح الأولي عند 50 مم زئبق ، اليسارالكلى was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 مم زئبق تم تطبيق ضغط ترشيح فوق الحد الأقصى من حوالي 450-500 مم زئبق) على اليمين المتبقيالكلىلمدة 5 دقائق. (الشكل 1 ب). في المعزولة المرويةالكلى، تم التعرف على خلايا podocytes باستخدام العلامات النووية باستخدام eGFP-هيستون في الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن eGFP تحت مروج podocin (eGFP: الفئران Pod-rtTA). تم قياس أعداد بودوسيت باستخدام مزيج من هذا في وضع العلامات الأيضية في الجسم الحي وقياس التشكل ثلاثي الأبعاد (الشكل 1 ج).

فقدان Podocyte في الفئران السليمة وكبار السن

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 مم زئبقي على التوالي مقارنة بخط الأساس يشير إلى أن هذه الزيادة الطفيفة في فقدان خلية البودوسيت مع ارتفاع الضغط ليست نتيجة مصادفة. في أقسام PAS ، لوحظت تغيرات معتدلة في الكبيبات في الفئران المسنة عند خط الأساس (تمدد ميسانجي وتصلب عرضي ، الشكل 2F). أ

فقدان بودوسيت بعد الإصابة الحادة

تم تطبيق مصل مضاد لـ GBM على فئران شابة صحية للحث على إصابة كبيرة ومحددة للخلايا البودوسية. في نقطة زمنية مبكرة جدًا (أي 3 أيام) بعد تحريض التهاب كبيبات الكلى المضاد لـ GBM ، لوحظ إمح معمم لعملية القدم في جميع الكبيبات عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (الشكل 3 أ-د). في معزولة نقيةالكلىobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>تسبب 300 مم زئبقي في فقدان أكثر من 80 بالمائة من الخلايا البودوسية في أقلية من الكبيبات (الشكل 3E). وهذا يتماشى مع الطبيعة المحورية لنموذج مرض GBM. داخل الكبيبات المجاورة للنواة ، كان فقدان الخلايا القرنية أكثر وضوحًا مقارنةً بالكبيبات تحت القشرية (56.66 ± 16.9 و 47.35 ± 17.07 ، على التوالي) (الشكل 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 مم زئبق) ؛ لم تظهر البطانة تغييرات كبيرة. تحديد تلطيخ PAS تمدد أنبوبي. بعد ثلاثة أيام من حقن المصل المضاد لـ GBM ، لم تظهر آفات هلالية حتى الآن (الشكل 3G-I). أظهر الذكور درجة أعلى من فقدان خلايا podocyte مقارنة بالإناث (63.71 ± 2.11 مقابل 75.81 ± 3.83 خلية بودوسية لكل كبيبة) ، وهو ما يتوافق مع ملاحظة أن الفئران الذكور أكثر عرضة لمضاد GBM وتشكل المزيد من الهلال الخلوي في سياق المرض (الشكل 3J). ومع ذلك ، فإن الخسارة الإضافية للخلايا البودوسية بعد ضغوط التروية العالية كانت مماثلة في الذكور والإناث (الشكل 3J).

التين. 3. فقدان بودوسيت بعد الإصابة الحادة. (AB) المجهر الإلكتروني للإرسال من عنصر تحكمالكلى per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 مم زئبق). لمقارنات متعددة ANOVA. **** ص<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

تتبع الخلايا البودوسية المفقودة في الأنابيب

لوحظت eGFP plus podocytes بانتظام داخل تجويف الأنابيب القريبة حيث يبدو أنها تلتصق بحد الفرشاة لخلايا الأنابيب القريبة (الشكل 4 أ). لم يتم غسل هذه الخلايا البادئة في حالة فرط النشاطالكلىs ، بدلاً من ذلك ، التزموا بإحكام إلى حد ما بحدود الفرشاة لتحمل التدفق غير العادي للبول الأساسي عند ضغوط التروية العالية جدًا. لتأكيد هويتهم ، تم تلوين الخلايا البودوسية بعلامات خاصة بالخلية (أي ، p57 ، سينابتودين و WT -1) بالإضافة إلى eGFP النووي لعلامة تتبع النسب الجيني (الشكل 4 ب). كانت أعداد Podocyte أقل بشكل ملحوظ في تلك الكبيبات مع خلايا podocytes ملتصقة في النبيب القريب المرتبط ، ووجود خلايا podocytes في الأنابيب يرتبط عكسياً مع عدد خلايا podocytes لكل كبيبة (الشكل 4C).

الخسارة التفضيلية للخلايا البودوسية في الموقع المحيط بالجلد

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 مم زئبق ، لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في التوزيع المكاني للخلايا القرنية في الفئران الشابة والصحية. في الفئران المسنة ، زادت مسافات الخلايا البادئة من القطب الوعائي بشكل عام ، مما يعكس على الأرجح تضخم الكبيبات ، بينما أدى فرط التسريب إلى انفصال تفضيلي للخلايا البودوسية بالقرب من القطب الوعائي (تم تقليل الربع الأول من 11.5 إلى 4.9 في المائة في الفئران المسنة ، الشكل 4E). ). وبالمثل ، لوحظ انفصال تفضيلي للخلايا البودوسية بالقرب من القطب الوعائي في الخلايا البودوسية الممسوحة (المضادة لـ GBM ، تم تقليل الربع الأول من 25 إلى 5 بالمائة).

مناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بفحص التأثيرات الحادة لضغط الترشيح المرتفع وتدفق الترشيح على فقدان الخلايا البودوسية في الكلية الفأرية المعزولة ، باستخدام الطريقة الأكثر دقة حاليًا لتحديد أعداد خلايا البودوسيت. كان أول اكتشاف رئيسي لدراستنا هو أن خلايا القدم السليمة ليست عرضة لإجهاد القص الحاد في الجسم الحي ، كما هو مقترح سابقًا في دراسات زراعة الخلايا [11]. لدهشتنا ، حتى الضغوط فوق الفيزيولوجية الشديدة (أكثر من 450 مم زئبق) تسببت في انفصال كبير في خلية البودوسيت. بدلاً من ذلك ، كشف الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال أن الطبقات الثلاث لحاجز الترشيح ظلت محفوظة جيدًا نسبيًا. أظهرت الفئران الأكبر سنًا عددًا منخفضًا من خلايا البودوسيت (كما ورد سابقًا) وكان هذا مرتبطًا فقط بقابلية محدودة للغاية لزيادة ضغوط التروية العالية. كان الاكتشاف الرئيسي الثاني هو أن إصابة خلية البودوسيت السابقة جعلت خلايا الأرجل عرضة للانفصال عند ضغوط التروية العالية. أظهرت الفئران المضادة لـ GBM انجراف عمليات القدم العالمية بعد ثلاثة أيام من حقن المصل المضاد لـ GBM وأعداد كبيرة مفصولة عند ضغوط التروية العالية. في الفئران المسنة ، نفترض أن فسيولوجيا الخلايا البودوسية محفوظة جيدًا نسبيًا ، مما يجعلها أقل عرضة للانفصال. من خلال تطبيق نهج العد شبه الآلي ، تم تحليل كل الكبيبة بشكل منفصل (تم تحليل ما مجموعه 1200 من الكبيبات). لقد أكدنا أن الكبيبات المجاورة للنخاع لها حجم أكبر من الكبيبات تحت القشرية. ومن المثير للاهتمام ، أن أرقام الخلايا البودوسية كانت هي نفسها ، مما يدل على أن كثافة الخلايا الحجرية تقل في الكبيبات المجاورة للنواة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الكبيبات المجاورة للنواة أكثر عرضة لزيادة ضغوط الترشيح مقارنةً بالكبيبات تحت القشرية. يمكن أن تفسر هذه النتائج جزئيًا ، لماذا يمكن ملاحظة آفات FSGS بتردد أعلى في مثل هذه الكبيبات الأكبر حجمًا [22 ، 23].

التين. 4. الكشف عن الخلايا البودوسية في الوكلاء المجاورين. أنبوب صغير. (أ) صورة تمثيلية تظهر eGFP بالإضافة إلى بودوسيتس (أخضر) في الأنابيب. (ب) تلطيخ التألق المناعي للخلايا البودوسية المسمى بالاشتراك مع eGFP التحوير هيستون (أخضر) ، وعلامات podocyte الذاتية p57 (أحمر) ، بالوزن -1 (أحمر) ، وسينابتوبودين (أرجواني). (ج) ارتباط عدد خلايا القدم لكل كبيبة مع عدد الخلايا البودوسية المحددة في النبيبات (ن =81 الكبيبات من الفئران الضابطة ، و=41 الكبيبات من الفئران المسنة ، ون=81 الكبيبات من الفئران المضادة لـ GBM). لمقارنات متعددة ، تم استخدام ANOVA. **** ص<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

حدود هذه الدراسة هي فترة المراقبة القصيرة ، حيث لا يمكن التوصل إلى استنتاجات فيما يتعلق بالتكيف طويل المدى للخلايا البودوسية مع ضغوط الترشيح المتزايدة. تم اقتراح أن الاستجابة الأولى للخلايا القرنية المعرضة لضغط القص هي الخضوع لتغييرات هيكلية وقائية [8 ، 24]. تتضمن هذه التغييرات فقدان شقوق الترشيح (أي FPE) واستبدال الأغشية الشقّية عن طريق سد الوصلات أو الوصلات الضيقة. تم وصف انسداد التقاطعات مسبقًا في العديد من نماذج الأمراض الكبيبية [25-28]. ومع ذلك ، في دراستنا ، لاحظنا أن الخلايا البودوسية ذات FPE كانت أكثر عرضة لضغوط التروية العالية =. ومن ثم ، أظهرت نتائجنا أن هذه التغييرات التكيفية لم تكن كافية للحماية من الانفصال أو حتى العكس ، فهي تجعل الخلايا البودوسية أكثر عرضة للانفصال. بعد ذلك ، يمكن القول أن المعزول يتروىالكلىليس نظامًا فسيولوجيًا وأن الضغوط المطبقة كانت أعلى بكثير مما كانت عليه في ظروف الجسم الحي. على حد علمنا ، لا يوجد نموذج آخر يستخدم سليمة قابلة للحياةالكلىموجود من شأنه أن يسمح بالتحقيق في آثار ضغوط التروية المتزايدة مباشرة. من خلال تطبيق موسعات الأوعية قبل وأثناء التروية ، يكون التوسيع الأقصى للأوعية قبل الكبيبة مستحثًا للسماح بالتدفق غير المقيد (الترشيح المفرط) والانتقال الأقصى لضغوط التروية المتزايدة إلى الكبيبة. في هذه الدراسة تمت دراسة التأثيرات الحادة لضغوط التروية العالية. يمكن أن تكون الآثار طويلة المدى لفرط التروية المرضية أكثر ضررًا ، مما يؤدي إلى المزيد من فقدان الخلايا البادوسية. ومع ذلك ، تشير دراستنا إلى أن هذا الفقد المزمن للخلايا البودوسية لا يكون مدفوعًا بالقوة الهائلة لتدفق الترشيح في حد ذاته ، بل بسبب التغييرات التكيفية (السيئة) في الخلايا البادئة التي تقلل من التزامها بـ GBM. المرضى الذين يعانون من أمراض الكبيبات يستفيدون من العلاج الخافض للضغط من خلال منع التغيرات الهيكلية التكيفية (الضارة) في الخلايا البادوسية.

استنتاج

يوفر هذا العمل أول دليل في الجسم الحي على أن الخلايا الجسدية الصحية مرتبطة بقوة بشكل غير عادي بـ GBM في الكلى الفأرية السليمة ويمكنها مقاومة ضغوط التروية العالية جدًا. الشيخوخة أو حتى إصابة الخلايا البودوسية الحادة الأكثر وضوحًا مع الانصباب الشامل ، تجعل الخلايا القرنية عرضة للانفصال عند زيادة ضغوط التروية.