تأثيرات جليوسيدات سيستانش على التعلم الإدراكي واللدونة التشابكية في الفئران النموذجية للحرمان من النوم

خلاصة

موضوعي:لاستكشاف ما إذا كانت جليكوسيدات السيستانش يمكنها تحسين الوظيفة التعليمية والمعرفية لفئران نموذج الحرمان من النوم من خلال تنظيم اللدونة التشابكية.

الطرق: تم تقسيم خمسين من فئران ويستار الذكور بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم فارغة (تحكم)، مجموعة تحكم منصة (كمبيوتر شخصي)، مجموعة نموذجية (نموذج)،جليكوسيدات مجموعة سيستانش (GCs)ومجموعة استازولام (Est). تم إعداد نموذج الحرمان من النوم لدى الفئران من خلال طريقة بيئة مائية معدلة متعددة المنصات. تم استخدام متاهة موريس المائية واختبار المجال المفتوح للكشف عن الوظيفة الإدراكية المكانية والتغيرات العاطفية لدى الجرذان. تم استخدام تلطيخ نيسل لمراقبة التغيرات في التشكل وكمية الخلايا العصبية فيمنطقة الحصين CAl من الفئران. تم استخدام لطخة غربية وR'T - PCR للكشف عن مستويات التعبير عن السينابتوفيسين (SY'N)، والمادة الكثيفة للغشاء بعد المشبكي 95 ( PSD -95)، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF). 

نتائج؛أظهرت نتائج متاهة موريس المائية أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم، فإنالتعلم والقدرة المعرفية للفئرانفي المجموعة النموذجية انخفض بشكل ملحوظ (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasتحسين علاج GCs ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the مستويات التعبير الجيني والبروتيني لـ BDNFو SYN و PSD -95في مجموعة Mlodel انخفضت بشكل ملحوظ (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

المكملات العشبية لصياغة السيستانشتحسين التعلم والوظيفة المعرفية

الكلمات الرئيسيةجليكوسيدات سيستانش; الحصين. الحرمان من النوم؛ التعلم والذاكرة. قلق؛ اللدونة متشابك

اضطراب النوم (SD)هو أاضطراب وظيفي من النوم غير الطبيعيناجمة عن سلسلة من العوامل المعقدة مثلأرق, الحلم، والاستيقاظ السهل. في السنوات الأخيرة،حدوث SDوقد تزايدت تدريجيا. وقد أفادت الدراسات ذات الصلة أن SD يمكن أن يسببأمراض القلب والأوعية الدموية,الخلل الأيضي,أمراض المناعة، والجهاز العصبي المركزيالأمراض التنكسية مثل مرض الزهايمر [1]. يمكن أن يسبب SD ضررًا مؤكسدًا للخلايا العصبية الحصينية، ويسبب خللًا إدراكيًا، ويؤدي إلى تغيرات مزاجية مثل القلق والاكتئاب [2]. تعتبر Cistanche deserticola مادة طبية ثمينة يمكن استخدامها كدواء وغذاء في الصين. له تأثيرات تقوية الكلى وتجديد تشي، وترطيب الأمعاء، وتعزيز حركات الأمعاء، وتقوية اليانغ. المستخلص الرئيسي لـ Cistanche deserticola، جليكوسيدات cistanche (GCs)، له تأثيرات مضادة للأكسدة، ومضادة لموت الخلايا المبرمج، وحماية الكبد، وتأثيرات وقائية عصبية [3]. وجد بحثنا السابق أن الخلايا الجذعية يمكنها تحسين الوظيفة التعليمية والمعرفية لفئران SAMP8 من خلال لعب دور مضاد للأكسدة ومضاد لموت الخلايا المبرمج [4].

أظهرت الدراسات ذات الصلة أن الخلل المعرفي الناجم عن SD يرتبط ارتباطًا وثيقًا باللدونة التشابكية [5]. ومع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير حول الآلية التي تنظم بها الخلايا الجذعية اللدونة التشابكية وتحسين ضعف التعلم والذاكرة والتدهور المعرفي لدى الفئران الناجم عن الحرمان من النوم. لذلك، تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف ما إذا كانت الخلايا الجذعية تؤثر على اللدونة التشابكية من خلال تنظيم التعبير عن العلامات المرتبطة بالتشابك العصبي، وبالتالي تحسين الوظيفة التعليمية والمعرفية للفئران ذات نماذج الحرمان من النوم، وتقديم أفكار وخطط علاجية جديدة للخلايا الجذعية العصبية لعلاج التعلم والإدراك. الضعف الناتج عن اضطرابات النوم.

1 المواد والأساليب

1.1 حيوانات التجارب

تم شراء فئران ويستار الذكور التي يتراوح عمرها من 6 إلى 8 أسابيع، ويتراوح وزنها من 280 إلى 300 جرام، من بكين سيبيفو، برخصة إنتاج حيواني [SCXK (Beijing) 2019-0010]. تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في مركز التجارب الحيوانية بكلية باوتو الطبية في ظل الظروف التالية: درجة الحرارة (24 ± 1) درجة، الرطوبة 50٪ إلى 55٪، 12 ساعة ضوء و 12 ساعة مظلمة، وعدم وجود قيود على الغذاء والماء. تمت الموافقة على هذه التجربة من قبل لجنة الأخلاقيات بالمدرسة [Baoyi Lunshen 2022 رقم (63)].

1. 2 الكواشف والأدوات الرئيسية

تم شراء إجمالي جليكوسيدات Cistanche deserticola من Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (رقم الدفعة: KSM20220609011)؛ تم شراء أقراص Estazolam من CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (رقم الدفعة: 044220343)؛ تم شراء المخزن المؤقت لتحميل البروتين (P1015) والمحلول المؤقت لتحلل RIPA (R0010) والمحلول الكيميائي (PE0010) وما إلى ذلك من Beijing Solebao؛ تم شراء مادة كثافة ما بعد المشبكي في 95 (PSD -95) جسم مضاد (AB192757) وجسم مضاد سينابتوفيسين (SYN) (ab32127) من شركة Abcam، USA؛ تم شراء عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) (48503-2) و-actin (52901) من شركة SAB بالولايات المتحدة الأمريكية؛ تم شراء الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرنب (SA 00001-20) من شركة Proteintech بالولايات المتحدة الأمريكية ؛ تم شراء الفئران الميلاتونين (MT) ومجموعة ELISA للبحث العلمي (MM -0657 R1) من شركة Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Paraffin Slicer (Leica، ألمانيا)؛ المجهر الضوئي (لايكا، ألمانيا)؛

متاهة موريس المائية، صندوق اختبار الحقل المفتوح (شنغهاي شينرون)؛ جهاز الرحلان الكهربائي العمودي (شركة بكين Liuyi)؛ شاكر إزالة اللون (شركة بكين Liuyi) ؛ نظام تحليل تصوير البروتين (تقنية شنغهاي تانون)؛ أداة PCR الكمية مضان (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 الطرق التجريبية

1.3.1 تجميع الحيوانات وإدارة الأدوية

تم تقسيم 5 0 ذكور فئران ويستار بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم فارغة (مجموعة التحكم)، مجموعة تحكم في النظام الأساسي (تحكم في شكل منصة، مجموعة PC)، مجموعة نموذجية (مجموعة نموذجية)، مجموع جليكوسيدات مجموعة Cistanche deserticola (مجموعة GCs ، 5 0 ملغم / كغم)، ومجموعة استازولين (مجموعة Est، 0.54 ملغم / كغم)، مع 10 فئران في كل مجموعة. أعطيت المجموعة الضابطة ومجموعة الكمبيوتر الشخصي 0.9٪ من المياه المالحة عن طريق التزقيم. تم تزقيم جميع المجموعات في الساعة 7 صباحًا كل يوم بعد بدء النمذجة، واستمر التزقيم لمدة 21 يومًا.

1.3. 2. إعداد نموذج حيواني للحرمان من النوم

تم إنشاء نموذج الحرمان من النوم باستخدام طريقة البيئة المائية المعدلة متعددة المنصات [6]. كانت المعدات التجريبية عبارة عن خزان مياه مستطيل الشكل من راتينج البولي إيثيلين مقاس 130 سم × 50 سم × 45 سم. تم وضع منصة صغيرة بقطر 5 سم وارتفاع 20 سم في خزان المياه. يبلغ قطر منصة مجموعة الكمبيوتر 10 سم وارتفاعها 20 سم. امتلأ خزان الماء بالماء إلى عمق حوالي 18 سم وحافظت على درجة حرارة الماء عند (20 ± 1) درجة. قبل أسبوع واحد من بدء التجربة، تم وضع الفئران في صندوق الحرمان من النوم كل يوم لمدة 60 دقيقة للتأقلم مع البيئة. بعد إنشاء النموذج، باستثناء المجموعة الضابطة، تم وضع فئران كل مجموعة على منصة صغيرة في الوقت المحدد من الساعة 8 صباحًا حتى 8 مساءً يوميًا للحرمان من النوم لمدة 21 يومًا متتاليًا.

تتمتع جميع الفئران بحرية الوصول إلى الطعام والماء وتتحرك بحرية على المنصة. كانت دورة الضوء والظلام 12 ساعة كل يوم.

1. 3. 3 تجربة متاهة موريس المائية

تم تقسيم متاهة موريس المائية إلى 4 مناطق مملوءة بالماء، وتم وضع المنصة في الربع الرابع. وكان سطح الماء حوالي 2 سم فوق المنصة. تمت إضافة الميلانين الصالح للأكل إلى الماء، وتم الحفاظ على درجة حرارة الماء عند (25 ± 1) درجة. (1) تجربة الملاحة لتحديد المواقع: تم اختيار مركز كل منطقة ووضع الفئران بلطف في الماء. سمح لهم بالاستكشاف بحرية. تم تسجيل الوقت الذي استغرقته الفئران للعثور على المنصة المستهدفة خلال 60 ثانية. تم توجيه الفئران التي لم تجد المنصة إلى المنصة وبقيت لمدة 20 ثانية. واستمر التدريب لمدة 5 أيام. (2) اختبار الاستكشاف المكاني: في اليوم السادس، تمت إزالة المنصة ووضع الفئران في الماء من منتصف الربع الثاني مقابل الحائط. تم تسجيل عدد المرات التي مرت فيها الفئران بالمنصة خلال 120 ثانية والوقت الذي مكثوا فيه في الربع الرابع.

1. 3. 4 تجربة ميدانية مفتوحة

تم استخدام صندوق تجريبي بأبعاد 100 سم × 100 سم × 50 سم، وتم تقسيم الجزء السفلي من الصندوق إلى 9 شبكات. تم وضع كل مجموعة من الفئران في غرفة التجارب المفتوحة مسبقًا للتكيف مع البيئة الداخلية لمدة 60 دقيقة. في بداية التجربة، تم وضع فئران الاختبار في زوايا ثابتة للمربع التجريبي المفتوح بدوره، وتم تسجيل عدد أوقات الوقوف ومسافة الحركة والوقت الثابت للفئران خلال 5 دقائق باستخدام برنامج التحليل السلوكي. كان مطلوبًا أن تكون البيئة هادئة أثناء التجربة، وتم مسح الجهاز التجريبي بالماء والكحول على التوالي بين تجربتين لمنع رائحة الجرذ الأول من التأثير على الحكم السلوكي للفأر التالي.

1. 3. 5 مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

الكشف عن مستويات MT في المصل لدى الفئران: تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق، وتم جمع 5 مل من الدم من الشريان الأورطي البطني. بعد الانتظار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تم طرد الدم للحصول على المصل. تمت إضافة 40 ميكرولتر من مخفف العينة إلى كل بئر، ثم تمت إضافة 10 ميكرولتر من العينة المراد اختبارها. بعد الختم بغشاء مانع للتسرب، تم تحضين الطبق عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. تم غسله 5 مرات، وتم إضافة 50 ميكرولتر من محلول وضع العلامات الإنزيمية، وتم إغلاق اللوحة بغشاء مانع للتسرب واحتضانها عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. يُغسل 5 مرات، ثم يُضاف محلول تطوير اللون ومحلول إنهاء التفاعل بالتناوب. تم قياس قيمة OD لكل بئر بواسطة ملصق إنزيم عند طول موجة قدره 450 نانومتر.

1. 3. 6 تلطيخ نيسل

تم اختيار ثلاثة فئران من كل مجموعة، وتمت إزالة أنسجة المخ عن طريق قطع الرأس وتثبيتها بمحلول بولي أوكسي إيثيلين 4٪. تم تجفيف الأنسجة وغمرها في محلول الشمع ودمجها وتقطيعها بالطرق التقليدية. تم الاحتفاظ بالشرائح بسماكة 5 ميكرون، وشطفها باستخدام PBS، وملطخة بـ 0.1٪ طولويدين أزرق لمدة 0.5 ساعة، متباينة مع 95٪ كحول، مجففة بنسبة 100٪ كحول، شفافة بالزيلين ومختوم بصمغ محايد. وقد لوحظت التغيرات في التشكل وعدد الخلايا العصبية في منطقة CA1 من قرن آمون الفئران تحت المجهر وتم جمع الصور.

1. 3. 7 تجربة لطخة غربية

تم اختيار أربعة فئران من كل مجموعة، وتم عزل الحصين عن طريق قطع الرأس. تم خلط أنسجة الحصين مع RIP A تحلل العازلة في بيئة حمام جليدي وتم طرد الأنسجة للحصول على طاف. تم الكشف عن تركيز البروتين بواسطة طريقة BCA. تمت إضافة 20 ميكروغرام من البروتين مع محلول تحميل البروتين من أجل الرحلان الكهربائي. بعد اكتمال التحليل الكهربائي للبروتين، تم نقل الغشاء عند تدفق ثابت 300 مللي أمبير، وتم حجبه بمسحوق حليب خالي الدسم بنسبة 5٪، وتم تحضين الجسم المضاد الأولي عند درجة حرارة 4 درجات خلال الليل، وتم تحضين الجسم المضاد الثانوي عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد استخدام محلول تطوير الألوان، تم تحليل نطاقات البروتين إحصائيًا باستخدام نظام تحليل التصوير بالتألق الكيميائي.

1. 3. 8 تجربة RT-PCR

تم اختيار ثلاثة فئران من كل مجموعة لتحضير أنسجة الحصين المتجانسة. تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي في سائل الأنسجة بطريقة Trizol وتم قياس التركيز. تم استخدام مجموعة تركيب Fastking [كدنا] للنسخ العكسي، وتم إجراء تفاعل تضخيم كمي مضان باستخدام مجموعة كمية مضان للكشف عن مستوى التعبير النسبي للبروتين المرتبط بالتشابك مرنا. تم تحليل النتائج باستخدام 2-ΔΔCt. وتظهر تسلسلات التمهيدي في الجدول 1.

الجدول 1: تسلسلات التمهيدي RT-PCR

1.4 الأساليب الإحصائية

تم التعبير عن نتائج البيانات المطابقة للتوزيع الطبيعي على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(x ± s)، وتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 9.5. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه للمقارنة بين عينات متعددة، وأشار P <0.05 إلى أن الفرق كان ذا دلالة إحصائية.