ELOVL2 يعزز تطور السرطان عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج في سرطان الخلايا الكلوية

edmund.chen@wecistanche.com

الملخص. كلويسرطان الخلايا (RCC) هو ورم خبيث بولي تناسلي عدواني ارتبط بسوء التشخيص ، خاصة في المرضى الذين يعانون من ورم خبيث ، وأنواعه الفرعية الرئيسية هي RCC الخلوي (ccRCC) ، و PCC الحليمي (pRCC) ، و chromophob RCC (chRCC). يعتبر وجود قطرات الدهون داخل الخلايا (LDs) سمة مميزة لـ ccRCC. وقد تم الاعتراف على نطاق واسع بأهمية تغيير التمثيل الغذائي للدهون في ccRCC. يحفز استطالة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة (ELOVL) استطالة الأحماض الدهنية (FAs) ، وتعديل تركيبة الدهون ، وهي ضرورية لوظائف الجسم الطبيعية. ومع ذلك ، فإن تورط الاستطالات في RCC لا يزال غير واضح. في هذه الدراسة ، تم فحص التعبير عن ELOVL2 في ccRCC. على وجه الخصوص ، لوحظت مستويات عالية من سبعة ELOVLisozymes في الأورام الأولية. تجدر الإشارة إلى أن مستويات التعبير ELOVL2 المرتفعة لوحظت في ccRCC ، وكذلك في pRCC و chRCC. علاوة على ذلك ، ارتبط المستوى الأعلى من ELOVL2 بشكل كبير بزيادة حدوث سوء تشخيص للمرضى الذين يعانون من ccRCC و pRCC. أدت الضربة القاضية التوسط لـ CRISPR / Cas 9- لـ ELOVL2 إلى قمع استطالة FAs المتعددة غير المشبعة طويلة السلسلة وزيادة إنتاج LD فيكلويخلايا سرطان. علاوة على ذلك ، أدى استئصال ELOVL2 إلى قمع تكاثر الخلايا عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج في المختبر وتخفيف نمو الورم في الجسم الحي. بشكل عام ، تقدم الدراسة الحالية نظرة ثاقبة جديدة لآليات انتشار الورم التي تنطوي على التمثيل الغذائي للدهون وتقترح أن ELOVL2 قد يكون هدفًا جديدًا جذابًا لعلاج سرطان الخلايا الكلوية.

الكلمات الدالة:سرطان الخلايا الكلوية ، قطيرات الدهون ، التكاثر الخلوي ، الكلى ، الكلى

مقدمة

سرطان الخلايا الكلوية (RCC) هو ورم خبيث شائع وقاتل ، وهو يمثل حوالي 2 في المائة من جميع حالات السرطان والوفيات ذات الصلة في جميع أنحاء العالم (1) ، وأنواعه الفرعية الرئيسية هي الخلايا الصافية RCC (ccRCC) ، و PCC الحليمي (pRCC) ، و chromophob. RCC (RCC). من بين جميع الأنواع الفرعية لـ RCC ، يعد ccRCC هو المظهر النسيجي الأكثر شيوعًا ، ويتميز مرضه بالتفعيل التأسيسي للعوامل المحفزة بنقص الأكسجة (HIFs) بسبب فقدان الوظيفة في جين von Hippel-Lindau (VHL) الكابت للورم (1). تم تطوير العديد من العلاجات المستهدفة ضد عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) أو الهدف من الثدييات لإشارات الراباميسين (mTOR) ومثبطات نقاط التفتيش المناعية للأمراض المنتشرة. ومع ذلك ، فإن تطور المرض أمر لا مفر منه في غالبية المرضى (1،2).

سيحسن الكستانش الكلى / الكلى

السمة المميزة لـ ccRCC هي وفرة قطرات الدهون داخل الخلايا (LDs) ، والتي تتكون من قلب دهني محايد يحتوي على الدهون الثلاثية (TGs) واسترات الكوليسترول (CEs) المحاطة بطبقة فسفوليبيد أحادية الطبقة (3). النطاقات هي عضيات ديناميكية مسؤولة عن امتصاص الدهون والتخزين وتستخدم للحفاظ على التوازن ، وتسهيل إنتاج الطاقة والحماية من أنواع مختلفة من الإجهاد أو للحفاظ على التكوين الحيوي للأغشية أثناء نمو الخلايا السرطانية السريع في عدة أنواع من السرطان (4). في الواقع ، أظهرت الدراسات السابقة أن LDs تساهم في ccRCC تقدم (5،6).

تم الإبلاغ عن الأحماض الدهنية (FAs) التي تشكل المكون الرئيسي للدهون لتكون بمثابة ركائز لتخزين الطاقة ، وتخليق الغشاء ، وإنتاج جزيئات الإشارة. الاستطالة وعدم التشبع هما خطوتان مركزيتان لتخليق Novo لسلسلة FAs طويلة السلسلة (LC-FAs) ، وطول ودرجة عدم التشبع هما المحددان لوظيفة FA والمصير الأيضي (7). تمت دراسة Stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) ، وهو عضو في عائلة أسيل ديساتوراز الدهنية ، على نطاق واسع في ccRCC (6.8.9) ، وقد تم إثبات أن زيادة تعبير SCD1 يدعم قابلية البقاء ، بينما مثبط جزيء صغير SCD1 (A939572) لقد ثبت أنه يمنع الانتشار الخلوي في ccRCC (8.9). علاوة على ذلك. أظهر Yang et al (10) أن بروتين ربط عنصر الستيرول التنظيمي 1 (SREBP1) عزز إزالة التشبع الدهني من خلال FA acid desat-urase 1 (FADSI) قبل تنشيط إشارات NF-xB لتعزيز الانتشار الخلوي في ccRCC. ومع ذلك ، فإن أي أدوار محتملة للإطالة في RCC تظل غير واضحة.

تم الإبلاغ عن أنه ، في الثدييات ، يتم تحفيز تفاعلات تكثيف FA الأولية والتحكم في المعدل بواسطة عائلة من إنزيمات الاستطالة يشار إليها باسم استطالة FAs طويلة السلسلة جدًا (ELOVL). حتى الآن ، تم تحديد سبعة أعضاء من ELOVL ، والتي يمكن تقسيمها عمومًا إلى تلك الخاصة بـ FAs المشبعة والأحادية غير المشبعة (ELOVL1 و ELOVL3 و ELOVL6 و ELOVL7) أو FAs غير المشبعة (PUFAs ؛ ELOVL2 و ELOVL4 و ELOVL5). كشف Lucarelli et al (9) عن تراكم كبير لـ PUFAs وزيادة التعبير عن ELOVL2 و ELOVL5 في ccRCC. من الجدير بالذكر أنه تم إثبات أن حمض الدوكوساهيكسانويك الجهازي (DHA) يتم إنتاجه داخليًا ويتحكم في تكوين الدهون في de novo ، بينما ينظم أيضًا تخزين الدهون في عامل النسخ المرتبط بعنصر الستيرول التنظيمي 1 (SREBPF1) - بطريقة مستقلة ، بسبب اجتثاث ELOVL2 في الفئران (11). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن التعبير الزائد لـ ELOVL2 يعزز تراكم LD مع امتصاص FA محسّن في كل من خلايا خط الخلايا preadipocyte 3T 3- LI و F442A (12). الدراسات السابقة في المختبر ، مع DHA ، تدار خارجيًا للخلايا السرطانية. أظهر أن DHA يمارس تأثيرات مضادة للأورام ، ومضادة للالتهابات ، ومؤيدة للاستماتة على الخلايا السرطانية (13-15). ومع ذلك ، فإن أي دور محتمل لـ ELOVL2 في تقدم ccRCC من خلال تعديل التمثيل الغذائي للدهون لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير.

في هذه الدراسة ، تم استكشاف أدوار ELOVL2inccRCCprogres-sion من خلال إجراء التنميط النسخي لـ ccRCC الأساسي والطبيعي.الكلىعينات ، تكشف أن ELOVL2 يتم التعبير عنه بشكل مفرط في ccRCC ويتم تمثيله بشكل مفرط بين إنزيمات ELOVL. من الجدير بالذكر أن ELOVL2 تم التعبير عنه أيضًا بشكل مفرط في ccRCC ، وكذلك في pRCC و RCC ، وهذا مرتبط بشكل كبير بالتشخيص السيئ للمرضى الذين يعانون من CCR CCR pRCC. علاوة على ذلك ، تم إثبات أن تثبيط ELOVL2 يؤثر على التمثيل الغذائي للدهون ويثبط التكاثر الخلوي من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج ، على الأقل جزئيًا من خلال تعطيل التوازن في الشبكة الإندوبلازمية (ER) فيسرطان الكلىالخلايا. اقترحت نتائج الدراسة الحالية أن ELOVL2 قد يكون هدفًا علاجيًا جديدًا محتملاً لعلاج سرطان الخلايا الكلوية.

سيحسن الكستانش الفشل الكلوي / الفشل الكلوي

المواد والأساليب

خطوط الخلايا والثقافات. تم شراء خطوط الخلايا 293T (RCB2202) و OS RC ‑ 2 (RCB0735) من RIKEN BioResource Center بينما تم شراء خطوط الخلايا 786 ‑ O و ACHN من ATCC ؛ كانت خلايا SK ‑ RC ‑ 52 هدية كريمة من دكتور جي جي أولد (مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان). خط خلية RPTEC ، وهو مشتق من الخلايا الظهارية للإنسانكلويالأنبوب القريب ، تم شراؤه من Lonza Group، Ltd. (CC ‑ 2553). تمت زراعة خلايا ACHN و 786 ‑ O و SK RC ‑ 52 و OS RC ‑ 2 في وسط RPMI ‑ 1640 مكملًا بنسبة 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5 بالمائة. تمت زراعة الخلايا 293T في وسط Dulbecco المعدل النسر مع 10 في المائة من مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون مرطب بنسبة 5 في المائة. تم استنبات خلايا RPTEC فيكلويوسط النمو الظهاري (REGM ™) Bulletkit ™ (CC ‑ 3190 ؛ Lonza Bioscience) عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون مرطب بنسبة 5 بالمائة.

المرضى وعينات ccRCC. أنسجة RCC والمجاورة طبيعيةالكلىتم الحصول على أنسجة من 46 مريضًا خضعوا لعمليات استئصال الكلية الجذري أو الجزئي من مستشفى جامعة تسوكوبا ، بين عامي 2006 و 2015 وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة تسوكوبا (الموافقة رقم H28-104). قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل الخضوع لعملية جراحية. تم تحديد مراحل الورم وفقًا لمراحل TNM التابعة للاتحاد الدولي لمكافحة السرطان (16). تم تصنيف الدرجات الباثولوجية وفقًا لنظام تصنيف الفوهرمان ذي المستويات الأربعة (17). يتم تلخيص جميع خصائص المريض في استخراج الجدول SI RNA وتوليف (كدنا). تم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي من الأنسجة المجمدة وكلويالخلايا السرطانية باستخدام TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific ، Inc.). بعد تنقية الحمض النووي الريبي ، تم بعد ذلك نسخ الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي (كدنا) عالية السعة (القط رقم 4368814 ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

النسخ العكسي ‑ تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (RT ‑ qPCR). تم قياس مستويات التعبير الجيني باستخدام 7500 Fast Real-Time PCR Machine مع Fast SYBR ‑ Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific ، Inc.). كانت ظروف التدوير على النحو التالي: تعليق مبدئي عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، متبوعًا بمنحنى انصهار يتراوح من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية إلى 60 درجة مئوية. C لمدة 1 دقيقة. تم استخدام Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) كعنصر تحكم داخلي. يتم سرد جميع تسلسلات التمهيدي في الجدول SII. من أجل تقييم الجينات المرتبطة بالاستماتة ، مستويات التعبير النسبي للجينات المؤيدة للاستماتة ، Bcl ‑ 2 بروتين X المرتبط (BAX) ، Bcl ‑ 2 مضاد / قاتل متماثل (BAK) ، phorbol ‑ 12 ميريستات ‑ 13‑ تم تحليل البروتين 1 الناجم عن الأسيتات (PMAIP1 / NOXA) والمعدِّل المنتظم p53 لموت الخلايا المبرمج (BBC3 / PUMA) والجين المضاد للاستماتة BCL2 وجين بروتين تمايز خلايا سرطان الدم النخاعي المستحث (MCL1). تم قياس مستويات التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2 ‑ ΔΔCq (18).

تحليل لطخة غربية. تم إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقًا (19). تم فصل الخلايا في محلول تحلل (20 ملي مولار Tris ‑ HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 في المائة من SDS ومثبط البروتياز) وصوتت على الجليد. تم الطرد المركزي للمحللين عند 1 ، 000 xg لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتم جمع المواد الطافية كعينات. تم إجراء تقدير كمية البروتين للعينات باستخدام اختبار Quick Start Bradford Protein (القط رقم 5000202JA ؛ مختبرات Bio ‑ Rad ، Inc.). تم إخضاع العينات لـ 10 بالمائة SDS-PAGE وتم نقل المنتجات المنفصلة لاحقًا إلى أغشية PVDF.

سيحسّن القسطرة من التهاب الكلى / الالتهاب الكلوي

تم حظر الأغشية باستخدام عامل منع ECL Prime (القط رقم RPN418V ؛ Cytiva) لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. ثم تم تحضين الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة التالية: مضاد سيرين / ثريونين بروتين كيناز / إندوريبونوكلياز إينوزيتول يتطلب إنزيم 1 (مضاد ‑ IRE1 ؛ 1: 200 ؛ # 3294 ، تقنية تشوير الخلية ، Inc.) ، مضاد ‑ الفسفرة IRE1 (مضاد ‑ p ‑ IRE1 ؛ 1: 200 ؛ NB100‑2323 ، Novus Biologicals ، LCC) ، مضاد ‑ C / EBP بروتين متماثل (مضاد ‑ CHOP ؛ 1: 200 ؛ MA1‑250 ، Thermo Fisher Scientific ، Inc .). تم استخدام الغلوبولين المناعي المضاد للأرنب أو المضاد للفأر G HRP ‑ المرتبط بالحمار الكامل Ab (القط رقم NA934V ، NA931VS ؛ GE Healthcare ؛ Cytiva) في 1:10 ، 000 كأجسام مضادة ثانوية. تم تصور البقع الغربية باستخدام ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) باستخدام مصور Fujifilm LAS ‑ 4 000 و LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). تم استخدام ‑actin كعنصر تحكم داخلي (1: 10000 ، القط رقم. A5316 ؛ Sigma ‑ Aldrich).

تحليل المعلوماتية الحيوية للتعبير الجيني. تم تنزيل البيانات السريرية وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) للأورام الأولية التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من RCC في قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) من بوابة بيانات Genomic Data Commons (GDC) (20). تم فحص ما مجموعه 1،005 (880 مريضة و 125 عينة شاهدة) ، بما في ذلك 530 عينة مريضة و 71 عينة تحكم من أجلالكلى الكلويمجموعة سرطان الخلايا الصافية (KIRC ؛ ccRCC) ، 286 عينة مريضة و 31 عينة صحية لعنق الرحمالكلى الكلويمجموعة سرطان الخلايا الحليمية (KIRP ؛ pRCC) ، و 64 عينة مريضة و 23 عينة صحية لمجموعة الكروموفوب في الكلى (KICH ؛ chRCC). تم تحليل التعبير الجيني ELOVL2 في عينات سرطان الجهاز البولي التناسلي باستخدام قاعدة بيانات التعبير الجيني للأنسجة العادية والورم (GENT2). تم تنزيل بيانات التعبير الجيني من المستودع العام للتعبير الجيني الشامل (GEO) لمنصة U133 Plus 2 (GPL570) (//gent2.appex.kr/gent2/) (21).

البلازميدات والتنقل الفيروسي. تم استنساخ الحمض النووي الريبي الصغير (shRNAs) لـ ELOVL2 المميز في الدراسات السابقة (22،23) في ناقلات الفيروسة البطيئة pLKO.1 (البلازميد # 8453 ؛ Addgene ، Inc.). يتم سرد تسلسل قليل النوكليوتيد المستخدم في بناء ناقل shRNA في الجدول SIII. تم إنشاء فيروسات Lentivirus في خلايا 293T من خلال المشاركة في نقل أربعة بلازميدات في trans ، بما في ذلك ناقل الفيروسة البطيئة (pLKO ‑ shControl أو pLKO ‑ shELOVL2) ، pMDLg / pRRE (بلازميد # 12251 ؛ Addgene ، Inc.) ، pRSV ‑ Rev (بلازميد # 12253 ؛ Addgene ، Inc.) و pMD2.G (plasmid # 12259 ؛ Addgene ، Inc.) باستخدام كاشف تعداء Lipofectamine 2 0 00® (Thermo Fisher Scientific ، Inc.). في 48 ساعة بعد تعداء العدوى ، تم جمع المواد الطافية المحتوية على الفيروس وتصفيتها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للعدوى. بالنسبة للتحولات الفيروسية ، تم تحضين فيروسات pLKO ‑ shControl أو pLKO ‑ shELOVL2 مع الخلايا 786 O و ACHN و SK RC ‑ 52 طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلايا المرطبة. تم اختيار الخلايا في وجود بوروميسين في 24 ساعة بعد الإصابة. لتحقيق الاستقرار في النسائل الفرعية ، تم زراعة الخلايا في وسط مع بوروميسين لمدة شهر واحد عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة واستخدمت البرك الباقية لتحليلات التعبير والتكاثر.

بالنسبة لتجارب الإفراط في التعبير ، تم نقل خلايا OSRC ‑ 2 باستخدام ناقل فارغ pCMV6 (بلازميد # PS100001 ؛ Origene Technologies ، Inc.) أو pCMV6 ‑ ELOVL2 (بلازميد # RC209232 ؛ Origene Technologies ، Inc.) عند 37 درجة مئوية في ثقافة خلية مرطبة الحاضنة ، باستخدام كاشف تعداء Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific ، Inc.) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام الخلايا للمقايسات المشار إليها في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تصميم CRISPR / Cas9 والاستنساخ. كان البلازميد pX330 ‑ U6 ‑ Chi‑ meric _ BB ‑ CBh ‑ hSpCas9 (pX330) هدية من Feng Zhang (Addgene، Inc .؛ plasmid # 42230) (24). تم استهداف تسلسل دليل CRISPR الفردي (sg) لـ ELOVL2 على وجه التحديد إلى exon 2 (sgELOVL2 # 1) و exon 3 (sgELOVL2 # 2 و # 3) من ELOVL2 باستخدام أداة تصميم CRISPR (GE Healthcare Dharmacon، Inc.‑discovery.com/gene‑editing/crispr‑cas9/crispr‑design‑tool/) ، قبل الاستنساخ في pX330. تم تصميم تسلسل دليل CRISPR للتحكم في دليل أحادي (sgControl) مسبقًا (25). يتم سرد تسلسل قليل النوكليوتيد من الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs) في الجدول SIII

تم زرع خلايا ACHN بعد ذلك في 6 أطباق جيدة (1.4 × 1 0 5 خلايا / بئر) وتم نقلها بعد ساعتين مع 2 ميكروغرام من pX330 sgRNAs المعبر عنها و 0.2 ميكروغرام pCI - ناقل جديد (Promega Corporation ؛ القط رقم E1841) عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة ، باستخدام FuGENE HD (شركة Promega ، القط رقم E2312). في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تم تطبيق 400 ميكروغرام / مل G418 لمدة 7 إلى 10 أيام وتم السماح للخلايا بالتعافي لمدة 2 أو 3 أيام. عندما كانت الخلايا تقترب من الالتقاء ، تم إعادة زرعها بشكل متناقص في أطباق 10 سم. بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع ، تم عزل الطوائف التي يمكن تمييزها باستخدام أقراص الاستنساخ (MilliporeSigma ، القط رقم Z374431-100EA). تم توسيع الحيوانات المستنسخة الفردية وتقييمها لحالة خروج المغلوب من خلال تسلسل سانجر للمنطقة المستهدفة.

سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى

فحوصات الانتشار الخلوي تم تقييم الانتشار الخلوي باستخدام مقايسة MTT مع مجموعة عد الخلايا ‑ 8 (CCK ‑ 8 ؛ Dojindo Molecular Technologies ، Inc.) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تم زرع الخلايا في 96 طبق جيدًا وتمت إضافة 1 0 ميكرولتر من WST - 8 بعد 72 ساعة. تم قياس OD460 بعد حضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. xenografting تحت الجلد. تم شراء الفئران الإناث BALB / c عارية (nu / nu) (n =12 ؛ 6-8 أسابيع) من Charles River Laboratories، Inc .. تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، تحت 12 درجة مئوية دورة فاتحة / مظلمة ، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء. بالنسبة لفحوصات الكسب غير المشروع تحت الجلد ، تم حقن 1x107 خلية معلقة في 100 ميكرولتر من PBS تحت الجلد في الجناح الأيمن باستخدام إبرة 24G وتم قياس أحجام الورم مرة واحدة في الأسبوع. تم حساب حجم الورم بالصيغة: مم 3=الطول × العرض × الارتفاع × 0.52 (26). بعد 90 يومًا ، تم التضحية بجميع الحيوانات ، وتم استئصال أورام طعم xenograft. تم تخدير الحيوانات بنسبة 2 في المائة من الأيزوفلورين قبل أن يتم قتلها رحيمًا عن طريق خلع عنق الرحم

تم قطع عينات فورمالين ‑ الثابتة والبارافين المدمجة (FFPE) لأورام طعم أجنبي إلى أقسام بسماكة 4 ميكرومتر ، قبل إزالة الكافيين وإعادة التميؤ. لاسترجاع المستضد ، تمت معالجة المقاطع بواسطة الميكروويف لمدة 21 دقيقة في محلول حامض الستريك. بعد إجراء استرجاع المستضد ، تم حظر نشاط البيروكسيداز الداخلي بنسبة 3 في المائة H O لمدة 25 دقيقة وتم تحضين الشرائح باستخدام الجسم المضاد Ki ‑ 67 (1: 200 ؛ داكو ؛ Agilent Technologies ، Inc .؛ M7240) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم تصور التفاعل الكيميائي المناعي باستخدام الجسم المضاد الثانوي Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences ، Inc ، القط رقم 424151) باستخدام ديامينوبنزيدين باعتباره الكروموجين. تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة التجارب على الحيوانات في جامعة تسوكوبا وتم إجراء جميع التجارب وفقًا لإرشادات لوائح جامعة تسوكوبا للتجارب على الحيوانات (الموافقة رقم 20-370). فحوصات موت الخلايا المبرمج. تم تقييم موت الخلايا المبرمج باستخدام نظام المقايسة Caspase ‑ Glo® 3/7 (شركة Promega ؛ القط رقم G8090) ، مجموعة تلطيخ Annexin ‑ V ‑ FLUOS (تشخيصات Roche ؛ القط. رقم 11858777001) ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا JC ‑ 1 طقم الفحص (شركة كايمان للكيماويات ، القط رقم 10009172) ، طبقاً لتعليمات الشركة الصانعة.

تلطيخ LDs. تم زرع الخلايا على أغطية زجاجية في أطباق بحجم 6 0 مم وتم تربيتها باستخدام حمض الأوليك (2 0 0 ميكرومتر) - وسط يحتوي على 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة بنسبة 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تم استنشاق الوسط بعد ذلك ، وغسلت الخلايا مرتين باستخدام PBS قبل التثبيت باستخدام 4 في المائة من الفورمالديهايد (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها بـ 0. 5 ميكرومتر ليبي - جرين (Dojindo Molecular Technologies، Inc.) لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وتم تثبيت الأغطية على شرائح زجاجية باستخدام VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium مع DAPI (Vector Laboratories ، Inc. ، cat. no. H 1200). تم الحصول على صور للخلايا الملطخة باستخدام مجهر مضان BZ ‑ X710 (شركة Keyence Corporation). تم تحضين الخلايا الحية بـ 0.5 ميكرومتر من Lipi Green في محلول الملح المتوازن من Hanks لمدة 30 دقيقة قبل غسلها مرتين في HBSS ، وتم تعليقها في 1 ملي مولار EDTA / PBS (درجة الحموضة 8.0) مع 0.5 بالمائة من مساحة سطح الجسم ، وتمريرها من خلال مصفاة خلية . تم تحليل الخلايا على مقياس تدفق جاليوس (Beckman ‑ Coulter ، Inc.) وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo v10 (FlowJo LLC).

تلطيخ تعقب ER. تم زرع خلايا ACHN (ACHN / sgControl و ACHN / sgELOVL2‑1 و ACHN / sgELOVL2‑2) على أغطية زجاجية في 6 أطباق {{2 0} - مم وتم تربيتها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في حاضنة 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. تم تصنيف الوسط بعد ذلك ، وتم غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS قبل التثبيت بنسبة 4 في المائة من الفورمالديهايد (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS واحتضانها بـ 500 نانومتر ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific، Inc. ؛ القط رقم E34250) لمدة ساعتين في الظلام عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتم تركيب الأغطية على شرائح زجاجية. تم الحصول على صور للخلايا الملطخة باستخدام مجهر مضان BZ ‑ X710 (شركة Keyence Corporation). تم تحضين الخلايا الحية باستخدام 500 نانومتر ER Tracker في HBSS لمدة 30 دقيقة قبل غسلها مرتين في HBSS ، وتعليقها في 1 ملي مولار EDTA / PBS (درجة الحموضة 8.0) مع 0.5 بالمائة من مساحة سطح الجسم ، وتمريرها من خلال مصفاة خلية. تم تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي Gallios وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo v10.

اللوني للغاز ‑ مطياف الكتلة (GC-MS). تم إجراء استخراج الدهون الكلية من كريات الخلايا كما هو موضح سابقًا (27). تم إجراء التحلل المائي واشتقاق المستخلصات إلى استرات الميثيل FA (FAMEs). بالنسبة للمعايير الداخلية لـ FAs المترافق ، C2 0: 4 (ω ‑ 6) ، C20: 5 (ω ‑ 3) ، C22: 5 (ω ‑ 6) ، C22: 5 (ω ‑ 3) و C22 : 6 (ω ‑ 3) تم شراء FAMEs من MilliporeSigma أو شركة Cayman Chemical Company. تم إجراء تحليل GC-MS باستخدام GCMS - TQ8040 (شركة Shimadzu) مع عمود GC-Capillary GC (MilliporeSigma ؛ القط رقم 24136). تمت زيادة تدرج درجة الحرارة مبدئيًا من 70 إلى 150 درجة مئوية بمعدل 20 درجة مئوية لكل دقيقة ومن 150 إلى 280 درجة مئوية بمعدل 8 درجات مئوية لكل دقيقة قبل أن ينخفض ​​من 280 إلى 200 درجة مئوية بمعدل 15 ˚C لكل دقيقة. تم إجراء حقن العينة في وضع عدم الانقسام مع حقن 1.0 ميكرولتر من العينة. لتحليل MS ، تم ضبط مصدر الأيونات ودرجة الحرارة البينية على 200 درجة مئوية و 270 درجة مئوية ، على التوالي. تم الحصول على البيانات في وضع المسح الكامل (30-600 م / ض) تحت 70 فولت من جهد التأين. تم تحديد FAMEs وفقًا لوقت الاستبقاء وطيف التأين الإلكتروني ‑ MS (EI-MS) المطابق لمعايير FAME المرجعية. تم حساب المقدار النسبي من FAMEs من خلال مقارنة متوسط ​​منطقة الذروة لكل كتلة عينة. تم قياس كل عينة بشكل مستقل ثلاث مرات.

تحليل احصائي. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SD. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج JMP 1 0 (SAS Institute، Inc.) أو GraphPad Prism8 (GraphPad Software، Inc.) أو حزمة R (الإصدار 4.0.2 ؛ RStudio ، Inc.). تم تقييم أهمية الفروق بين المجموعتين باستخدام اختبار الطالب غير المقيد أو اختبار مان ويتني. تم تقييم أهمية الاختلافات بين المجموعات الثلاث أو أكثر باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات لاحقة باستخدام اختبار Dunnett أو اختبار Kruskal ‑ Wallis متبوعًا باختبار Dunn اللاحق مع تصحيح Bonferroni. تم إنشاء منحنيات البقاء باستخدام طريقة Kaplan-Meier وتم تقييم الفرق بين المنحنيات باستخدام اختبار ترتيب السجل. تم تقسيم المرضى إلى مجموعتين ، مجموعة منخفضة التعبير أو مجموعة عالية التعبير ، باستخدام قطع قيم التعبير الوسيط. ص<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتائج

يتم التعبير عن ELOVL2 بشكل مفرط في RCC. تم فحص وفرة سبعة من إنزيمات ELOVL في الأنسجة الطبيعية والورم المناظرة لأول مرة في المجموعة الحالية ، وكشف أن مستويات التعبير ELOVL1 و ELOVL2 و ELOVL5 و ELOVL7 كانت مرتفعة في أنسجة ccRCC (الشكل 1 أ). للتحقق من صحة هذه النتائج ، تم فحص التعبير الجيني ELOVL في الأنسجة الطبيعية والورم المقابلة باستخدام قاعدة بيانات TCGA (مجموعة KIRC). تم التأكيد على أن تعبير ELOVL2 mRNA كان مرتفعًا بدرجة كبيرة وبشكل ملحوظ في أنسجة ccRCC (الشكل 1 ب ؛ P.<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">

تم رفع مستويات التعبير بشكل ملحوظ في خطوط الخلايا ACHN و 786 ‑ O و SK RC ‑ 52 ، على الرغم من أن مستويات تعبير mRNA في خط خلية OS RC كانت أقل مقارنةً بتلك الموجودة في خط خلية RPTEC (الشكل 1D) . بعد ذلك ، تم فحص التغيير المرتبط بالسرطان للتعبير الجيني ELOVL2 في أنواع مختلفة من السرطان باستخدام قاعدة بيانات GENT2 (الشكل 1E). بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية ، وجد أن تعبير ELOVL2 أعلى بشكل ملحوظ فيالكلىوسرطان البروستاتا والرئة والقولون ، في حين أن تعبير ELOVL2 كان مشابهًا في سرطان المثانة أو الثدي. تشير هذه النتائج إلى أن أدوار إنزيمات ELOVL تختلف باختلاف نوع السرطان وأن الإفراط في التعبير عن ELOVL2 قد يكون مرتبطًا بالسرطان أو تطور المرض في الخلايا الكلوية السرطانية ، خاصةً ccRCC.

يرتبط تعبير ELOVL2 الزائد بتطور RCC. تم فحص الارتباط بين التعبير الجيني لـ ELOVL2 ومراحل ورم خبيث (TNM) في مجموعة KIRC ، من أجل توضيح الأهمية السريرية لـ ELOVL2 في ccRCC. كان تعبير ELOVL2 أعلى في المرض المتقدم محليًا والنقائل ، على الرغم من أن تعبيره لم يكن مرتبطًا بحالة ورم خبيث في العقدة الليمفاوية (الشكل 2 أ - ج). بشكل جماعي ، تم زيادة تعبير ELOVL2 وفقًا للمرحلة السريرية (الشكل 2D). بعد ذلك ، تم تقييم العلاقة بين التعبير عن ELOVL2 وتشخيص المرضى الذين يعانون من RCC ، من أجل توضيح التأثير السريري لـ ccRCC. وفقًا لتحليل Kaplan-Meier ، تم الكشف عن أن التعبير العالي لـ ELOVL2 كان مرتبطًا بشكل كبير بسوء التشخيص في المجموعة الحالية (P =0. 0015 ، الشكل 2E). للتحقق من صحة هذه النتائج ، تم فحص العلاقة بين التعبير عن ELOVL2 وتشخيص المرضى الذين يعانون من ccRCC بشكل أكبر في مجموعة KIRC وتم إثبات أنه ، بالمثل ، كان التعبير العالي لـ ELOVL2 مرتبطًا بشكل كبير بسوء التشخيص (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">

يعزز ELOVL2 تكاثر الخلايا السرطانية الكلوية. لتقييم وظيفة ELOVL2 في تكاثر خلايا RCC ، تم إجراء ضربة قاضية لـ shRNA لـ ELOVL2 في خلايا 786 ‑ O و ACHN و SK RC ‑ 52. تم تقييم تأثيرات كل shRNA باستخدام RT ‑ qPCR وتم تأكيد انخفاض كبير في تعبير ELOVL2 (الشكل 3 أ). ثم تم إجراء فحوصات MTT لفحص آثار ضربة قاضية ELOVL2 على الانتشار الخلوي. لوحظ أن ضربة قاضية لـ ELOVL2 حالت دون تكاثر جميع الخلايا مقارنة بالخلايا المنقولة بواسطة shRNA الضابطة (الشكل 3 ب).

على النقيض من ذلك ، تم إحداث زيادة في التعبير ELOVL2 في خلايا OS-RC ‑ 2 ، وهي عبارة عن خط خلية به تعبير قاعدي أقل لـ ELOVL2. تم تقييم فعالية ترنسفكأيشن باستخدام RT ‑ qPCR وتم تأكيد زيادة التعبير بشكل ملحوظ عن ELOVL2 (الشكل 3 ج). كشفت فحوصات MTT أن تكاثر خلايا ELOVL2-overexpressing قد تم تعزيزه بشكل كبير ، بالمقارنة مع مجموعة التحكم (الشكل 3D) ، مما يشير إلى أن ELOVL2 قد يكون محفزًا لتكاثر الخلايا.كلويخلايا سرطان.

يوقف اجتثاث ELOVL2 نمو الورم في الجسم الحي ، وتخليق PUFAs ، وإنتاج LDs فيكلويخلايا سرطان. لتوضيح أدوار ELOVL2 في تقدم RCC ، تم إنشاء خط خلية ELOVL2 بالضربة القاضية ACHN ، باستخدام نظام CRISPR / Cas9 (sgELOVL2‑1 و sgELOVL2‑2) (الشكل S1). في المختبر ، انخفض التكاثر الخلوي بشكل كبير عن طريق استئصال ELVOVL2 في خلايا ACHN (الشكل S1). الأهم من ذلك ، أن استئصال ELOVL2 بوساطة CRISPR / Cas9 قد كبح نمو الورم عندما تم زرع الخلايا تحت الجلد في الفئران (الشكل 4 أ). كانت الأحجام القصوى لأورام طعم xenograft تحت الجلد في ACHN / control و ACHN / sgELOVL2‑2 في يوم التضحية 241 و 109 مم 3 ، على التوالي. وتجدر الإشارة إلى أن جميع أورام طعم أجنبي في مجموعة ACHN / sgELOVL2‑1 تراجعت تلقائيًا في 14 يومًا بعد الزرع ولم يتم اكتشافها في وقت الاستئصال. تم فحص مؤشر Ki ‑ 67 أيضًا في أورام طعم xenograft المنقولة بالتحكم أو sgELOVL2 ولوحظ أن خلايا ACHN / sgELOVL2‑2 أظهرت مؤشر Ki أقل بكثير من خلايا التحكم / ACHN (الشكل 4B و C) . دعمت هذه النتائج أيضًا احتمال أن يزيد ELOVL2 نمو الورم في الجسم الحي. نظرًا لأن ELOVL2 يقع على كروموسوم 6p24.2 ويرمز إلى بروتين عبر الغشاء الشبكي الإندوبلازمي الذي يتحكم في استطالة C20-C24 PUFAs (7) ، تم بعد ذلك تقييم مستويات FA الإجمالية في خلايا ACHN / sgControl و ACHN / sgELOVL2 باستخدام تحليل GC ‑ MS (الشكل S2). تم توضيح تغيير مستويات LC-PUFA في الشكل 4D. ELOVL2 هو إنزيم أساسي في الإنتاج الداخلي لحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA ، C22: 6 ن ‑ 3) (28،29) وكما هو متوقع ، انخفضت مستويات DHA بشكل كبير عن طريق استئصال ELOVL2 فيكلويخلايا سرطان. وعلاوة على ذلك، فإن

كما انخفضت بشكل كبير كميات من أنواع LC ‑ PUFAs الأخرى ، بما في ذلك حمض الأراكيدونيك (AA ، C20: 4 ن ‑ 6) ، وحمض إيكوسابنتاينويك (EPA) وحمض الدوكوسابنتانويك (DPA). من ناحية أخرى ، لم يتم تغيير إنتاج DPA باستمرار في خلايا ACHN / sgELOVL2. كانت كمية DPA في خلايا ACHN منخفضة جدًا ولم يتم اكتشافها في عدة عينات (الشكل S2). منذ أن أظهرت الدراسات السابقة أن ELOVL2 يعزز تراكم LDs من خلال إنتاج DHA (11 ، 12) ، تم تقييم تخزين LDs باستخدام تلطيخ الدهون المحايد. تجدر الإشارة إلى أن وفرة LDs في خلايا ACHN / sgELOVL2 انخفضت بشكل كبير مقارنة بخلايا ACHN / sgControl (الشكل 4E ‑ 4G) ، مما يشير إلى أن تغيير التمثيل الغذائي للدهون بواسطة ELOVL2 المفرط قد يؤثر على تكاثر خلايا RCC.

يؤدي استئصال ELOVL2 إلى موت الخلايا المبرمجكلويخلايا سرطان. كشفت الدراسات السابقة أن إنتاج LDs داخل الخلايا يعزز موت الخلايا المبرمج في ظل البيئات الميكروية للورم المجهدة (4). لذلك ، في هذه الدراسة ، تم تقييم موت الخلايا المبرمج في خلايا ACHN / sgControl أو ACHN / sgELOVL2 وتم اكتشاف نشاط مرتفع بشكل ملحوظ لـ caspase 3/7 في خلايا ACHN / sgELOVL2 (الشكل 5A). وبالمثل ، تم تحديد عدد أكبر من خلايا ACHN / sgELOVL2 موت الخلايا المبرمج مقارنة بخلايا ACHN / sgControl ، كما يتضح من تلطيخ Annexin V / PI (الشكل 5 ب). اعتمادًا على الإجهاد الخلوي ، يؤدي موت الخلايا المبرمج الجوهري (30) إلى فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا ؛ وبالتالي ، قيمت الدراسة الحالية كذلك الإمكانات الكهربائية لغشاء الميتوكوندريا لخلايا ACHN / sgControl أو ACHN / sgELOVL2 باستخدام الفلورسنت JC 1. انخفضت نسبة التجميع / المونومر بشكل كبير في خلايا ACHN / sgELOVL2 (الشكل 5C) ، مما يشير إلى تعزيز استقطاب الغشاء عبر الميتوكوندريا وتفعيل مسار موت الخلايا المبرمج الجوهري عن طريق اجتثاث ELOVL2. بتعبير أدق ، زادت مستويات التعبير عن الجينات المؤيدة للاستماتة (BAX و BAK و PUMA و NOXA) بشكل كبير ، بينما انخفضت مستويات التعبير الجيني المضاد للاستماتة (BCL2 و MCL1) بشكل كبير بسبب اجتثاث ELOVL2 (الشكل 5 د). أشارت هذه النتائج إلى أن ELOVL2 يساهم في بقاء الخلايا من خلال تثبيط موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الكلى

يمكن أن يؤدي تدهور سعة تخزين الدهون في شكل LD إلى انهيار استتباب ER ، مما يؤدي إلى استجابة البروتين غير المكشوفة (UPR) وموت الخلايا المبرمج الخلوي (4،5). لذلك ، من أجل دعم فرضية مشاركة تعبير ELOVL2 في توازن ER ، تم إجراء تلطيخ تعقب ER في خلايا ACHN / sgControl أو ACHN / sgELOVL2. أشار تصوير ER اللاحق (الشكل 5E) والتقدير الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 5F و G) إلى توسع ER في خلايا ACHN / sgELOVL2 ، بسبب إجهاد ER. بالإضافة إلى ذلك ، شجع اجتثاث ELOVL2 على فسفرة IRE1 ، وهو منشط لمستشعرات UPR (الشكل 5H) ، في حين أن التعبير عنتم تنظيم CHOP ، الذي يلعب دورًا رئيسيًا في موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد ER ، عن طريق اجتثاث ELOVL2 (الشكل 5H). بشكل جماعي ، أظهرت هذه النتائج أن التمثيل الغذائي للدهون ELOVL2 بوساطة ‑ يثبط موت الخلايا المبرمج في الخلاياكلويالخلايا السرطانية واقترحوا أن تعطيل استتباب ER قد يكون آلية محتملة للتحريض.

مناقشة

أظهرت الدراسة الحالية أن ELVOL2 قد يغير استقلاب الدهون ويعزز نمو الورم عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الكلى. علاوة على ذلك ، لوحظ أن تعبير ELOVL2 في أنسجة RCC كان مرتفعًا وأن ذلك

ارتبط التعبير الأعلى لـ ELOVL2 بشكل كبير بسوء تشخيص المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكلوية. هناك دراسات محدودة متاحة حول دور ELOVL2 في تطور السرطان (22،31،32) ونتائجها مثيرة للجدل. أظهر Simple et al (22) أن ELOVL2 عزز تخليق LC-PUFA ، ودعم إشارات EGFR الفعالة وانتشار الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي. على النقيض من ذلك ، أفاد Kang et al (31) أن استئصال ELOVL2 قد يعزز هجرة الخلايا وتكوين مستعمرة لخلايا سرطان الثدي وكشف أن انخفاض تعبير ELOVL2 كان مرتبطًا بتوقعات أسوأ لمرضى سرطان الثدي. علاوة على ذلك ، أفاد Ding et al (32) أن ELOVL2 يثبط تكاثر خلايا الورم الأرومي العصبي ويرتبط بمعدلات بقاء مواتية. وفقًا للنتائج المتضاربة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة ، تم إثبات وظيفة متعددة الأدوار لـ ELOVL2 في تطور السرطان ، والتي تختلف بشكل واضح حسب نوع السرطان.

يؤثر التمثيل الغذائي المتغير للدهون بشكل كبير على تطور السرطان ، وهو تأثير لوحظ في نتائج الدراسة الحالية ، يتماشى مع البحث الذي يصور دور ELOVL2 كمتحكم أساسي في عملية استطالة LC ‑ PUFAs وإنزيم حاسم في التخليق الحيوي لـ DHA ( 7). في هذه الدراسة ، تم إثبات أن LC-PUFAs الذاتية ،

بما في ذلك AA و DHA ، انخفض بسبب استئصال ELOVL2 في خلايا سرطان الكلى. فيما يتعلق بهذا ، فقد تم الإبلاغ سابقًا أن تثبيط مسار AA بواسطة مثبطات lipoxygenase (LOX) يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج ويقلل من قابلية بقاءكلويالخلايا السرطانية في المختبر (33،34). على الرغم من أن نتائج ELOVL2 المفرطة في الدراسة الحالية تتماشى مع هذه النتائج الآلية ، فقد تم الإبلاغ سابقًا ، ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن إدارة DHA قد تمنع انتشار وغزو خلايا سرطان الكلى في المختبر (35 ، 36). ومع ذلك ، من المعروف أن LC-PUFAs لها تأثيرات مميزة ومتناقضة على تطور السرطان. لذلك ، قد يرتبط تغيير التوازن الدقيق بين مجموعة متنوعة من LC-PUFAs ، بسبب تثبيط ELOVL2 ، بالأنماط الظاهرية المختلفة التي لوحظت في أنواع السرطان المختلفة. أظهرت الدراسات السابقة أن LDs تزداد من خلال الإنتاج الداخلي لـ DHA بواسطة ELOVL2 في الفئران (11 ، 12). وبالمثل ، تم الكشف عن أن استئصال ELOVL2 قد يثبط إنتاج DHA و LDs في خلايا سرطان الكلى ، مما يشير إلى أن الإفراط في التعبير عن ELOVL2 قد يعزز إنتاج LD من خلال إنتاج DHA الداخلي في RCC. غالبًا ما توجد الخلايا السرطانية في ظروف بيئية أكثر قسوة (كبيرة وصغيرة) ، بما في ذلك نقص الأكسجة والحرمان من المغذيات ، ومع ذلك ، لا تزال تنمو بسرعة في ظل هذه الضغوط الشديدة. تم توضيح وظائف LDs في ظل ظروف الإجهاد الخلوي ، مثل الحفاظ على الطاقة واستتباب الأكسدة والاختزال ، وتنظيم الالتهام الذاتي ، والحفاظ على توازن ER ، والحماية من السمية الدهنية (4).

كشف Ackerman وآخرون (6) أن LDs تمنع تراكم الدهون السامة والمشبعة أثناء نقص الأكسجة عن طريق التخزين المؤقت للتشبع الخلوي للدهون من خلال تبادل FAs غير المشبعة المقيمة TG في ccRCC. قد تسبب السمية الدهنية الخلوية الناتجة عن التحفيز الشحمي المشبع (SFA) ، بما في ذلك بالميتات (C16: 0) ، موت الخلايا المبرمج ، مما يؤدي إلى موت الخلايا السرطانية (37،38). في الآونة الأخيرة ، تم تصنيف ELOVL2 على أنه إنزيم مؤيد للبقاء على قيد الحياة ، مما يساعد في الوقاية من موت الخلايا المبرمج الناتج عن التسمم الجلدي (39). وتجدر الإشارة إلى أن تقسيم الدهون المعدل على محور ELOVL2 / DHA ينتج عنه استخدام غير سام لبالميتات SFA من خلال تفضيل نقله إلى الميتوكوندريا من أجل أكسدة FA (الفاو) من خلال آلية تعتمد على CPT1. بالإضافة إلى ذلك ، أوضح بالابان وآخرون أن خلايا سرطان البروستات C4‑2B وخلايا سرطان الثدي MCF-7 محمية من موت الخلايا المبرمج الناجم عن البالميتات بواسطة منظمة الميتوكوندريا (37 ، 38). أثناء السمية الدهنية المستحثة بالميتات ، تم الإبلاغ عن انخفاض المستويات الخلوية للبروتينات المضادة للاستماتة ، بما في ذلك BCL 2 أو MCL 1 (40 ، 41) بينما تم الإبلاغ عن مستويات البروتينات المؤيدة للاستماتة ، بما في ذلك PUMA أو NOXA. تزداد (42،43). تم الكشف في هذه الدراسة أن استئصال ELOVL2 قد يعززكلويموت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية من خلال تغيير الجينات المؤيدة والمضادة لموت الخلايا المبرمج بطريقة مماثلة. تشير هذه النتائج إلى أن ELOVL2 قد يحمي الخلايا من موت الخلايا المبرمج الناتج عن السمية الدهنية لتعزيز نمو الورم في RCC.

بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات أن استئصال ELOVL2 في RCC قد يعزز إجهاد ER وتنظيم CHOP ، مما يؤدي إلى تقليل تنظيم BCL 2 و MCL 1 ، أثناء تنظيم BAK و BAX ، عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا (44). في الواقع ، أظهرت نتائج الدراسة الحالية أن الجينات المؤيدة والمضادة لموت الخلايا المبرمج قد تغيرت بالمثل عن طريق اجتثاث ELOVL2. تماشياً مع النتائج الواردة في الدراسة التي أجراها Qui وآخرون (5) ، الذين أفادوا أن LDs المعتمد على HIF2 / PLIN2 يعزز المقاومة ضد إجهاد ER وبقاء الخلية في ccRCC ، فإن هذه النتائج الجماعية تدعم إجهاد ER الذي يعزز موت الخلايا المبرمج الخلوي بواسطة ELOVL2 الاجتثاث فيكلويالخلايا السرطانية ، وتقليل LDs وإزالة الحاجز الخلوي ضد الدهون السامة.

في الختام ، أظهرت الدراسة الحالية لأول مرة ، على حد علمنا ، أن ELOVL2 يعزز نمو الورم عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج عن طريق استطالة PUFAs ، على الأقل جزئيًا عن طريق الحفاظ على توازن ER فيكلويخلايا سرطان. مجتمعة ، تم اقتراح أن LDs المستحثة بـ ELOVL2 قد تساهم في تطور السرطان بسبب التأثيرات الوقائية المتعددة ضد الإجهاد الخلوي في RCC. علاوة على ذلك ، تم اقتراح أن ELOVL2 قد يكون هدفًا علاجيًا محتملاً جذابًا لمرضى RCC.