تعزيز الآثار المضادة للوعائية من دلفينيدين عند تغليفها داخل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية الجزء 1

يرجى الاتصالoscar.xiao@wecistanche.comلمزيد من المعلومات

تجريدي:(1) الخلفية: يظهر الأنثوسيانين دلفينيدين خصائص مضادة للأوعية الدموية في كل من المختبر ونماذج تولد الأوعية في الجسم الحي. ومع ذلك ، في الجسم الحي يتم امتصاص الدلفينيدين بشكل سيئ ، وبالتالي فإن توافره البيولوجي المتواضع واستقراره يقلل من آثاره المضادة للأوعية. يستفيد العمل الحالي من خصائص الحويصلة الصغيرة خارج الخلية (EV) لتعزيز كل من استقرار وفعالية الدلفينيدين. عندما يتم تغليفه في sEVs ، يمنع الدلفينيدين المراحل المختلفة من تكوين الأوعية الدموية على الخلايا البطانية الأبهرية البشرية (HAoECs). (2) الأساليب: تم إنتاج sEVs من الخلايا المتغصنة غير الناضجة وتحميلها مع دلفينيدين. تم تنفيذ طريقة تعتمد على UHPLC-HRMS لتقييم مستقلبات دلفينيدين داخل sEVs. تم تقييم فحص الانتشار وإنتاج أكسيد النيتريك (NO) وفحص Matrigel في HAoECs. (3) النتائج: تم العثور على دلفينيدين ، 3-O-β-روتينوسيد ، و Peonidin-3-galactoside في كل من delphinidin و delphinidin-loaded sEVs.sEV المحملة بدلفينيدين زادت من فعالية الدلفينيدين الحر 2-fold للانتشار البطاني ، 10 أضعاف لإنتاج NO البطاني ، و 100 ضعف للتكوين الشبيه بالشعيرات الدموية. وبالتالي ، فإن دلفينيدين المحمل ب sEV يمارس تأثيرات على الخطوات المختلفة لتكوين الأوعية. (4) الاستنتاجات: يمكن اعتبار sEVs نهجا واعدا لتقديم دلفينيدين لاستهداف الأمراض المرتبطة بتولد الأوعية الدموية ، بما في ذلك السرطان والأمراض المرتبطة بالأوعية الدموية الزائدة.

يرجى الضغط هنا لمعرفة المزيد

الكلمات الرئيسيهدلفينيدين.: الخلايا البطانية. تولد الأوعية. حويصلات صغيرة خارج الخلية. السرطان. أمراض القلب والأوعية الدموية

1. مقدمة

تم العثور على البوليفينول بشكل رئيسي في الأطعمة والمشروبات المشتقة من النباتات وتوفر طعم ولون الأطعمة النباتية. علاوة على ذلك ، أبلغت الدراسات الوبائية عن انخفاض أكبر في مخاطر القلب والأوعية الدموية والسرطان المرتبط بالوجبات الغذائية الغنية بالبوليفينول [1-3.

دلفينيدين (2-(3،4،5-ثلاثي هيدروكسي فينيل) كرومنيليوم-3،5،7-تريول) هو أنثوسيانين تم تحديده بكثرة في الخضروات والفواكه المصطبغة ، وخاصة التوت والعنب الأحمر. لقد أبلغنا سابقا أن دلفينيدين يمتلك نفس المظهر الدوائي مثل مستخلص إجمالي من مركبات البوليفينول للنبيذ الأحمر لتعزيز زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتنشيط كينازات التيروزين [3] ، مما يؤدي إلى إنتاج أكسيد النيتريك البطاني (NO) بعد تحفيز مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا (ERo) [4]. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا أن الدلفينيدين عبر ERo يعمل كجزيء مناعي ومضاد للالتهابات يمكن أن يغير انتشار الخلايا الليمفاوية التائية وتمايزها في المرضى الذين يعانون من عوامل الخطر القلبية الوعائية [5].

أخيرا ، أثبتنا أن دلفينيدين يعرض خصائص مضادة للأوعية الدموية ، سواء في المختبر أو في نماذج تكوين الأوعية في الجسم الحي ، ويقلل في نمو الورم الحي من سرطان الجلد [6-10]. في الواقع ، يمنع الدلفينيدين تكاثر الخلايا البطانية من خلال إشراك المسارات المعتمدة على السيكلين D1 و A [6,7]. أبلغنا أيضا عن وجود ارتباط محتمل بين تثبيط التكوين الحيوي للميتوكوندريا الناجم عن VEGF من خلال مسار Akt بواسطة الدلفينيدين وتأثيره المضاد للأوعية الدموية [8]. علاوة على ذلك ، يقلل دلفينيدين من نمو الورم في الخلايا السرطانية الميلانينية في الجسم الحي من خلال العمل بشكل خاص على تكاثر الخلايا البطانية. تتضمن الآلية وجود ارتباط بين تثبيط الانتشار الناجم عن VEGF عبر إشارات VEGFR2 ، MAPK ، PI3K ، وعلى مستوى النسخ على عوامل CREB / ATF1 ، وتثبيط phopsphodiesterase2 [9]. والأكثر إثارة للاهتمام ، أن الجرعات العالية من دلفينيدين قللت من الأوعية الدموية الجديدة في نموذج في الجسم الحي لتكوين الأوعية الدموية الناجم عن نقص التروية باستخدام نموذج الفئران من رباط الشريان الفخذي [10]. معا ، تظهر هذه البيانات أن دلفينيدين هو مركب واعد لمنع الأمراض المرتبطة باضطرابات القلب والأوعية الدموية وتكوين الأورام.

ومع ذلك ، فإن الدلفينيدين أقل فعالية للحث على هذه الآثار المفيدة مقارنة بإجمالي مستخلصات البوليفينول من النبيذ الأحمر ، خاصة في تحفيز توسع الأوعية بدون وساطة تعتمد على البطانة [11]. في الواقع ، الدلفينيدين حساس للضوء ومستقر فقط عند درجة الحموضة<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

تتمثل إحدى الاستراتيجيات للتغلب على مثل هذه المشاكل في استخدام الحويصلات خارج الخلية (EVs) كنظام لتوصيل الأدوية. وجدنا مؤخرا أن المركبات الكهربائية ، بما في ذلك المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة (sEVs) ، هي هياكل نانوية تنشأ من خصائص مختلفة للمقصورة تحت الخلوية ، متغلبة على قيود التركيبات النانوية الكلاسيكية. تقلل المركبات الكهربائية من عدم الاستقرار والمناعة ، وتحسن التوافر البيولوجي والانتقائية المستهدفة [13]. تؤكد بعض التقارير على الآثار الوقائية للمركبات الكهربائية التي تطلقها الخلايا المعالجة بالبوليفينول. في الواقع ، فإن sEVs المخصب ب miR-21 من الخلايا المعالجة بالكركمين قلل من نمو الخلايا السرطانية وتكوين الأوعية الدموية ، وصحح نفاذية البطانية ، وقلل من صلاحية الخلايا لخطوط الخلايا السرطانية المختلفة [14]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن sEVs المخصبة ب miR-16 من الخلايا المعالجة ب epigallocatechin gallate قمعت نمو الورم [15].

Cistanche يمكن أن يحسن المناعة

في هذه الدراسة ، استفدنا من خصائص sEV لتعزيز كل من استقرار وفعالية تثبيط تكوين الأوعية الدموية الناجم عن delphinidin.sEV باستخدام الخلايا البطانية الأبهرية البشرية (HAoECs). كما تم تحديد محتوى دلفينيدين من حيث المستقلبات داخل هذه المركبات الكهربائية.

2. المواد والأساليب

2.1.زراعة الخلايا

تم استزراع HAoECs (Promocell ، هايدلبرغ ، ألمانيا) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في وسط نمو الخلايا البطانية MV2 (Promocell) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (سيغما ألدريتش ، سانت كوينتين فالافييه ، فرنسا). تم تربسين الخلايا عند التقاء 70/80٪ وتم استخدامها بين الممرات 3 و 6 لجميع التجارب.

تم شراء خط الخلايا المتغصنة JAWS II من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (CRL-1194; ATCC; ماناساس، فرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية). نمت خلايا JAWS II عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ، في وسط استزراع كامل يتكون من وسط أساسي أدنى ألفا (Lonza; بازل ، سويسرا) تحتوي على الريبونوكليوسيدات وديوكسي ريبونوكليوسيدات وتستكمل مع مصل البقر الجنيني بنسبة 20٪ (FBS) (Gibco ، Life Technologies ؛ غراند آيلاند، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية)، 4 ملليمتر L-الجلوتامين (لونزا)، 1 ملم بيروفات الصوديوم (لونزا)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (البنسلين / -الستربتومايسين، سيغما-ألدريش) و 5ng/مل الفئران GM-CSF (ميلتيني بيوتيك; سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تربسين الخلايا عند التقاء 70/80٪ وتم استخدامها بين الممرات 8 و 16 لجميع التجارب.

2.2.sEVIsolation

تم زرع خلايا JAWS II بكثافة 5×10 درجات في قارورة زراعة الخلايا T175 في وسط نمو كامل ، وقد تضورت جوعا في FBS قبل أي عزلة. تم طرد وسط الخلية مركزيا عند 300×g و 2000×g لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا وحطام الخلايا ، على التوالي. تم طرد السوبرنات الناتج عن ذلك في 20000× غرام لمدة 30 دقيقة لاستبعاد المركبات الكهربائية الكبيرة. تم طرد الطرد المركزي الفائق عند 200000× جم (جهاز الطرد المركزي الفائق Optima MAX-XP ودوار MLA-50 ، بيكمان كولتر ، فيلبينت ، فرنسا) لمدة 2 ساعة لتكوير sEVs. بعد ذلك ، تم غسل sEVs في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (NaCl 137 mM ، KCl 2.7 mM ، Na2HPO410 mM ، KH2PO41.8 mM ، pH = 7.4) وإعادة طردها المركزي عند 200000 ×g لمدة ساعتين. أخيرا ، تم إعادة تعليق sEVpellets في 1 مل من PBS وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام اللاحق. تم تحديد كمية sEVs باستخدام طريقة Lowry ، مع ألبومين مصل البقر (Sigma-Aldrich) حيث تم استخدام standard.sEVs عند 10 ميكروغرام / مل.

2.3. تحميل دلفينيدين

تم تحضير دلفينيدين في الماء عند درجة الحموضة = 2 مع 0.1٪ DMSO من أجل الوصول إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل. تمت إضافة sEVs (2 ملغ) ، وتم تحريك المحلول ثم دوامة لمدة 10 دقائق. بعد 2 ساعة من الطرد المركزي الفائق عند 200000× جم ، أعيد تشكيل الكريات التي تم الحصول عليها في 1 مل من 0.1٪ DMSO أو PBS. تم قياس امتصاص دلفينيدين عند 530 نانومتر ، وتم إجراء منحنى قياسي بتركيزات مختلفة (0.1 إلى 10 ميكروغرام / مل) من الدلفينيدين الحر. كانت النسبة المئوية لفعالية تحميل sEVs 9٪ ، بغض النظر عن تركيز دلفينيدين المستخدم (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، تم تعديل كمية دلفينيدين للحصول على التركيز المطلوب (0.1 إلى 5 ميكروغرام / مل) ضمن 10 ميكروغرام / مل sEVs. لإزالة الدلفينيدين الحر ، تم غسل هذه الحويصلات مرتين.

2.4. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

تم تخفيف عينات sEV في NaCl0.9٪ المعقمة ، وتم تحليل توزيع الحجم باستخدام NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd. ، Malvern ، المملكة المتحدة). تم تسجيل مقاطع الفيديو. حدد برنامج NTA توزيع الحجم باستخدام معادلة ستوكس-إنشتاين.

2.5. المجهر الإلكتروني للإرسال

تم تثبيت sEVs لأول مرة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع 2.5٪ glutaraldehyde (توزيع LFG ، ليون ، فرنسا) في 0.1 M PBS. بعد ذلك ، تم غسل sEVs مرتين في PBS بواسطة 100000×g الطرد المركزي لمدة 70 دقيقة.sEVs تم ترسيبها على الشبكات النحاسية لمدة دقيقتين وملطخة سلبا ب 20 ميكرولتر من خلات اليورانيل 5٪ (مخففة في الإيثانول 50٪) لمدة 30 ثانية. ثم لوحظت الشبكات باستخدام مجهر Jeol JEM 1400 (Jeol ، Croissy sur Seine ، فرنسا) يعمل بسرعة 120 keV.

2.6. تحديد مستقلبات دلفينيدين داخل sEVs

كان إعداد العينة على النحو التالي ∶ 250 ميكرولتر من الميثانول (MeOH) تمت إضافته إلى 10μg sEVs المعاد تشكيلها في PBS ، وتعرضت العينات ل ultrasonication لمدة 20 دقيقة. تمت إضافة مائتي لتر من MeOH ، وتم طرد العينات مركزيا (10000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) وتبخرت في مكثف ثنائي miVac (Genevac Ltd. ، Ipswich ، المملكة المتحدة). تم إعادة تشكيل المستخلص الجاف بمياه 200 ميكرولتر LC-MS تحتوي على 1٪ من حمض الفورميك. تعرض الخليط للطرد المركزي الثاني (10000× جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) قبل كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بتحليل الطيف الكتلي عالي الدقة (UHPLC-HRMS) من أجل تحليل مستقلبات دلفينيدين مع قياسات كتلة دقيقة.

تم تحقيق الفصل الكروماتوغرافي باستخدام عمود Kinetex@ 1.7 ميكرومتر XB C18,150×2.1 مم مع عمود SecurityGard C18 المقابل (Phenomenex). تألفت المراحل المتنقلة من HO في القناة A والأسيتونيتريل في القناة B ، وكلاهما يحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك. كان تدرج الاستغناء (A∶B, o/ø) على النحو التالي∶ عقد الظروف الأولية 95:5 لمدة دقيقتين، يليه تدرج خطي من 95:5 إلى 0:100 على مدى فترة 6 دقائق، وعقد في 0:100 لمدة 3 دقائق، والعودة إلى الظروف الأولية 95:5 وعقد هذه الشروط لمدة 3.5 دقيقة. واستخدم معدل تدفق ثابت قدره 0.300 ملليلتر/دقيقة؛ كان حجم الحقن 10 ميكرولتر.

تم الحصول على المسح الكامل وأطياف كتلة SIM المستهدفة في وضع التأين الإيجابي ، باستخدام الدقة 70000 عرض كامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) مع هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) البالغ 3 × 10 درجات والحد الأقصى لوقت حقن الأيونات (IT) البالغ 200 مللي ثانية. تم الحصول على تجارب MS / MS المعتمدة على البيانات في وضع الاعتماد على البيانات في Top5.

تم رصد المستقلبات المبلغ عنها في الأدبيات [16-18]: دلفينيدين، ألد هايد، فلوروجلوسينول ألدهيد، حمض غاليك، كالكون، بيتونيدين-3-غالاكتوسيد، بيتونيدين-3-أرابينوسيد، بيتونيدين 3-أو-روتينوسيد، دلفينيدين-3-أرابينوسيد، دلفينيدين-3-غالاكتوسيد، دلفينيدين-3-غالاكتوسيد، دلفينيدين 3-O-(6-كومارويل غلوكوزيد)، دلفينيدين 3-O-β-روتينوسايد، سيانيدين-3-غالاكتوسيد، سيانيدين 3-O-β-روتينوسيد، بيونيدين-3-غالاكتوسيد ومالفيدين-3-غالاكتوسيد.

تم إجراء معايرة الأدوات اليومية عن طريق ضخ مجموعات المعايرة الإيجابية / السلبية Pierce LTO Velos ESI على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تم استخدام Xcalibur 2.2 soft-ware (Thermo Fisher Scientific ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) للحصول على البيانات ، وتم استخدام برنامج TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) لمعالجة البيانات.

2.7. فحص صلاحية الخلية

1 ×104 HAoECs تم زرعها على صفيحة من 96 بئرا واستزرعت لمدة 24 ساعة وعولجت بالدلفينيدين (1 إلى 10 ميكروغرام / مل). ثم ، تمت إضافة 5 ميكروغرام / مل من 3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl) -2H- tetrazolium (كاشف MTS ، Promega ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) في كل بئر وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. تم قياس الامتصاص على مقياس الطيف الضوئي CLARIOstar (BMG LABTECH، أورتنبرغ، ألمانيا) عند 490 نانومتر.

2.8. فحص الانتشار

تم إجراء اختبارات الانتشار باستخدام مجموعة مقايسة تكاثر خلايا CyQUANT (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. باختصار ، تم زرع 1.5 × 10 * خلايا في صفيحة من 96 بئرا. كانت الخلايا متعطشة للمصل لمدة 2 ساعة ثم عولجت بالدلفينيدين أو sEVs الأصلية أو sEVs المحملة بالدلفينيدين بتركيزات مختلفة. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS ، وتمت إضافة محلول ملزم بالصبغة. تم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم استخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية (CLARIOstar9 ، BMG LABTECH ، أورتنبرغ ، ألمانيا) مع مرشحات لإثارة 485 نانومتر وانبعاث 530 نانومتر لقياس التألق.

2.9.NO الإنتاج أساتي

تم زرع HAoECs على شريحة من 8 آبار (Ibidi ، Gräfelfing ، ألمانيا) بمعدل 3×104 خلية لكل بئر (أي 3×104 خلية / سم مربع) في 300 ميكرولتر من الوسط. عند الالتقاء At70-80٪ ، تم تحفيز الخلايا لمدة 24 ساعة باستخدام دلفينيدين أو sEVs الأصلية أو دلفينيدين محمل ب sEV. تم استخدام الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) كعنصر تحكم إيجابي (10 ميكرومتر ، سيغما ألدريش) لتحفيز إنتاج NO. بعد 24 ساعة ، تمت إزالة وسط كل بئر ، وتمت إضافة مسبار ثنائي أسيتات ثنائي أمينوفلوريسين (DAF-2 DA) (5 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة ، سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم ، تم غسل الآبار مع PBS. تم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد (4 ٪ ، 20 دقيقة). تمت قراءة التألق بواسطة المجهر البؤري (زايس ، جينا ، ألمانيا ، LSM700). تم الحصول على أربع صور ، وتم استخدام برنامج ImageJ للقياس الكمي.

2.10.فحص ماتريجيل

تم زرع HAoECs في آبار مغلفة ب Matrigel (هلام من مصفوفة خارج الخلية من ساركوما الفئران من Engelbreth-Holm-Swarm ، Sigma-Aldrich). باختصار ، تم وضع 10 ميكرولتر من Matrigel السائل في كل بئر من 15 بئرا من صفيحة تولد الأوعية الدموية Ibidi μ الانزلاق (lbidi) ثم تم تحضينها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتشكيل هلام. ثم تم زرع HAoECs وتحضينها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ، لمدة 45 دقيقة قبل العلاجات إما مع الدلفينيدين أو sEVs الأصلية أو الدلفينيدين المحمل ب sEV ، تليها حضانة من 12 إلى 14h عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO. لوحظ تشكيل "هياكل تشبه الشعيرات الدموية" باستخدام المجهر الضوئي (أوليمبوس CK40). تم إجراء القياس الكمي عن طريق قياس عدد الهياكل الشبيهة بالشعيرات الدموية باستخدام برنامج الصور.

2.11.التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± SEM. تم تحديد أهمية الاختلافات بين المجموعات من خلال تحليل التباين (ANOVA) ، يليه اختبار توكي متعدد المقارنات. p-قيم<0.05 were="" considered="">

3. النتائج

3.1.sEV توصيف وتحميل دلفينيدين

وبالاتفاق مع الأدبيات، لم يحدث الدلفينيدين المحمل داخل المركبات الكهربائية الصغيرة تغيرات في حجم الحويصلات، حيث بلغ 118.7± 2.9 و111.7± 1.8 نانومتر للمركبات الكهربائية الفارغة والمركبات الكهربائية المزودة بدلفينيدين، على التوالي، على النحو الذي يحدده تحليل تتبع الجسيمات النانوية (الشكل 1 ألف) ويؤكده تحليل المجهر الإلكتروني (الشكل 1 باء). بالإضافة إلى ذلك ، عبر كلا النوعين من sEVs ، الأصلي وتلك المحملة بالدلفينيدين ، عن علامات خارجية مثل ALIX و CD63 و TSG101 على مستويات مماثلة (الشكل 1C) ، في حين أنها لم تعبر عن ß-actin ، وهي علامة على المركبات الكهربائية الكبيرة.

الشكل 1. توصيف sEVs. (أ) توزيعات حجم sEVs الأصلية و sEVs المحملة بالدلفينيدين بناء على قياسات NTA. (ب) صورة المجهر الإلكتروني للإرسال التمثيلي ل sEVs و sEVs الأصلية المحملة بالدلفينيدين. شريط المقياس = 100 نانومتر. (ج) تحليل اللطخة الغربية الذي يظهر التعبير عن Alix و CD63 و TSG101 و ß-Actin في sEVs و sEVs المحملة بالدلفينيدين.

تم استخراج هذه المقالة من Nutrients 2021 ، 13 ، 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378