جهة الاتصال: jerry.he@wecistanche.com

فينيتا دي أبراج 1 ، نانسي إس بانديتا 2

1 قسم العلوم البيولوجية ، 2 قسم الكيمياء ، مدرسة Sunandan Divatia للعلوم ، SVKM's NMIMS ، Vile-Parle (W) ، مومباي ، ماهاراشترا ، الهند

Cistanche له تأثير مضاد للشيخوخة

نبذة مختصرة

الخلفية: قشر الحمضيات الشبكية بلانكو يستخدم تقليديا كمنشط ، معدي ، قابض ، وطارد للريح. كما أنه مفيد في العناية بالبشرة. الهدف: دراسةمكافحة الشيخوخةإمكانات المستخلصات الكحولية لقشر C. reticulata Blanco باستخدام مقايسات مضادات الأكسدة ومضادات الإنزيم في المختبر.

المواد والطرق: تم الحصول على المستخلصات النباتية عن طريق Soxhlation (CR HAE‑ المستخلص الكحولي الساخن من الحمضيات الشبكية) وطريقة النقع (CR CAE‑ المستخلص الكحولي البارد للحمضيات الشبكية). تم إجراء التحليل النوعي والكمي الكيميائي النباتي. علاوة على ذلك ، في المختبرمضادات الأكسدةتم إجراء تحاليل قياس الطيف الكتلي (GC-MS) ومضادات الإنزيم وكروماتوجرافيا الغاز. النتائج: تم العثور على إجمالي محتويات الفينول والفلافونويد لـ CR HAE أعلى من CR CAE. كانت قيمة EC5 0 لـ CR HAE و CR CAE لمقايسات 1،1 ‑ Diphenyl ‑ 2 picrylhydrazyl ، وأنيون Superoxide ، و 2 ، 2'‑ azino ‑ bis (3 ‑ ethylbenzothiazoline ‑ 6 حمض السلفونيك) 25 { {55}}. 33 ± 40.16 ميكروغرام / مل و 254.73 ± 15.78 ميكروغرام / مل و 221.27 ± 11.25 ميكروغرام / مل و 354.20 ± 23.79 ميكروغرام / مل و 59.16 ± 2.17 ميكروغرام / مل و 59.12 ± 6.21 ميكروغرام / مل على التوالي. تم العثور على قيم قدرة الامتصاص الجذري للأكسجين لـ CR HAE و CR CAE لتكون 1243 و 1063 ميكرولتر 6 هيدروكسي ‑ 2،5،7،8 رباعي ميثيل كرومان ‑ 2 مكافئ حمض الكربوكسيل / غرام من المادة ، على التوالي. تم تقييم الأنشطة المضادة للكولاجيناز والمضادة للإيلاستاز لكل من CR HAE و CR CAE. كانت قيم EC50 لـ CR HAE و CR CAE لمضادات Collagenase ومضاد elastase 329.33 ± 6.38 ميكروغرام / مل و 466.93 ± 8.04 ميكروغرام / مل و 3.22 ± 0.24 مجم / مل و 5.09 ± 0.30 مجم / مل على التوالي. أظهر CR HAE نشاطًا أقوى لمقاومة الكولاجين ومضاد للإيلاستاز من CR CAE. تم إجراء تحليل GC-MS لـ CR HAE لأن CR HAE أظهر أعلىمضادات الأكسدةوإمكانات مقاومة الإنزيم من CR CAE. الخلاصة: يمكن استخدام قشر C. reticulata فيمكافحة تجعدتركيبات العناية بالبشرة.

الكلمات المفتاحية: 1،1 ‑ Diphenyl ‑ 2 picrylhydrazyl، 2، 2'azino ‑ bis (3 ethylbenzothiazoline ‑ 6 ‑ sulfonic acid)، anti ‑ wrinkle، elastase، chromatography، gas spectrometry، Oxygenation

ملخص

• تم تقييم إمكانات قشر الموالح الشبكي بلانكو المضادة للشيخوخة من خلال

• في المختبرمضادات الأكسدةومقايسات مضادات الإنزيم

• تم إجراء نوعين من الاستخلاص واخضاع المستخلصات للتحليل الكمي والنوعي. أظهر المستخلص الذي تم الحصول عليه بواسطة Soxhlation (CR HAE) محتوى إجمالي الفينول والفلافونويد أعلى من المستخلص الذي تم الحصول عليه عن طريق النقع (CR CAE).

• أظهر CR HAE نشاط قوي لإزالة الجذور الحرة DPPH و Superoxide بينما وجد أن نشاط الكسح ABTS لكلا المستخلصين متشابه. تم العثور على سعة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC) لـ CR HAE أكثر ؛ مما يشير إلى إمكانات مضادات الأكسدة القوية

• تم تقييم أنشطة تثبيط إنزيم الكولاجيناز والإيلاستاز في المختبر لكل من المستخلصات وأظهر CR HAE إمكانات قوية لمكافحة الكولاجيناز ومضاد الإيلاستاز مما يشير إلى قدرته على مقاومة الشيخوخة

• كشف تحليل GC‑ MS لـ CR HAE عن وجود مركبات مختلفة

بما في ذلك أساسا بولي ميثوكسي فلافون. أظهر CR HAE نشاطًا واعدًا مضادًا للأكسدة ومضادًا للأنزيمات ويمكن استخدامه كمحتملمكافحة تجعدوكيل فيمكافحة الشيخوخةتركيبات العناية بالبشرة.

الاختصار المستخدم: ECM: مصفوفة خارج الخلية ، الأشعة فوق البنفسجية: فوق بنفسجي ، ROS: أنواع الأكسجين التفاعلية ، MMP: مصفوفة البروتين المعدني ، Chc: Clostridium histolyticum collagenase ، DPPH: 2 ، 2 ، ثنائي فينيل 1 ، بيكريلهيدرازيل ، GC ‑ MS‑: غاز كروماتوجرافي التحليل الطيفي ، RT: درجة حرارة الغرفة ، ميكروغرام GAE / mg: ميكروغرام مكافئ حمض الجاليك / مليغرام ، W / V: الوزن حسب الحجم ، ميكروغرام QE /

mg: ميكروجرام مكافئ كيرسيتين / مليغرام ، CR HAE: مستخلص كحولي ساخن من الحمضيات الشبكية بلانكو ، CR CAE: مستخلص كحولي بارد من الحمضيات الشبكية بلانكو ، EC50: تركيز نصف الحد الأقصى الفعال ، PMS NADH: فينازين ميثوسلفات نيكوتيناميد ، نوكليوتيد النيكوتين ، DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، APS: أمونيوم برسولفات ، AAPH: 2،2 azobis (2 ‑ ميدينو ‑ بروبان) ثنائي هيدروكلوريد ، TROLOX: (±) 6 هيدروكسي ‑ 2،5،7،8‑ رباعي ميثيل كرومان ‑ 2 كربوكسيل حمض ، ORAC: سعة امتصاص الأكسجين الجذري ، FALGPA: N‑ [3‑ (2 ‑ Furyl) acryloyl)] - Leu Gly ‑ Pro ‑ Ala، SANA: Succinyl ‑ Ala‑ Ala Ala p ‑ nitroanilide، Rf: Retardation العامل ، MSD: جهاز الكشف الانتقائي الشامل

المقدمة

إن أهم دور للجلد للإنسان هو خلق حاجز بين البيئة الداخلية والخارجية للجسم. داخليا ، يحمي الجلد ويحمي الظاهرة الفيزيوكيميائية الكاملة الضرورية للحياة ، خارجيا هو حاجز ضد القوى الميكانيكية. الجلد هو أكبر عضو في الجسم. [1] إنه عضو حساس للغاية ويمكن أن يتضرر بسهولة بسبب العدوى والأمراض.

هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3. 0 الترخيص ، والذي يسمح للآخرين بإعادة مزج العمل وتعديله والبناء عليه بشكل غير تجاري ، طالما يُنسب إلى المؤلف ويتم ترخيص الإبداعات الجديدة بموجب الشروط المتطابقة.

يمكن أن تنشأ مشاكل الجلد بسبب عوامل مختلفة مثل التلوث البيئي ، والتعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية ، وعمر الفرد ، والكائنات الدقيقة الضارة ، وعادات الأكل ، والإجهاد ، والمواد الكيميائية. يعتبر علاج الجلد والعناية به أمرًا ضروريًا ليس فقط للحصول على بشرة صحية ، ولكن أيضًا من أجل الرفاهية العامة للشخص.

تعتبر الشيخوخة المبكرة للجلد واحدة من أكبر مشاكل الجلد في عالم اليوم. تم تقسيم عملية شيخوخة الجلد إلى فئتين: الشيخوخة الداخلية والخارجية. شيخوخة الجلد الجوهرية أو الشيخوخة الطبيعية ناتجة عن التغيرات في مرونة الجلد بمرور الوقت. شيخوخة الجلد الخارجية هي في الغالب نتيجة التعرض للإشعاع الشمسي (شيخوخة الصورة). تشكل الجذور الحرة بسبب الإجهاد التأكسدي ، وتلعب دورًا رئيسيًا في عملية الشيخوخة الداخلية والخارجية. يتكون الجلد من ثلاث طبقات رئيسية ؛ البشرة والأدمة وتحت الجلد. المكونات الرئيسية للأدمة هي ألياف الكولاجين والإيلاستين. انخفاض في الكولاجين والإيلاستين يؤدي إلىتجعدتشكيل. [4] السبب الرئيسي لبدأ الجلد في الترهل والتشكلالتجاعيدهو انهيار الإيلاستين والكولاجين. إن إنزيمات الكولاجين والإيلاستاز هي المسؤولة عن انهيار المكونات المختلفة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، أي الكولاجين والإيلاستين. الإيلاستين هو بروتين يساعد البشرة على البقاء ليونة وثابتة. عندما يتم شد بشرتك ، فإن الإيلاستين هو الذي يعيدها إلى وضعها الطبيعي. الكولاجين هو بروتين ليفي. يعتبر الكولاجين مميزًا بين البروتينات بسبب قوته الكبيرة التي توفر تماسكًا للجلد.التجاعيدينتج عن مزيج من الشيخوخة الداخلية والخارجية وكذلك بسبب زيادة مستوى إنزيمات الكولاجيناز والإيلاستاز.

تستخدم مستحضرات التجميل بشكل منتظم وعالمي بأشكال مختلفة لتعزيز الجمال. تعالج مستحضرات التجميل للعناية بالبشرة الطبقة السطحية من الجلد من خلال توفير حماية أفضل ضد البيئة من البشرة التي تُترك دون علاج. [6] هناك طلب متزايد على مستحضرات التجميل للعناية ببشرة الوجه. وفقًا لمراقبة البيانات ، بلغ الإنفاق العالمي على منتجات العناية بالبشرة في عام 2012 82 مليار دولار ، حيث اشتمل ثلثا الإنفاق على العناية ببشرة الوجه. يتوقع تقرير صادر عن الأبحاث والأسواق أن تتجاوز عائدات صناعة منتجات العناية بالبشرة العالمية 100 مليار دولار في عام 2018. ومن المتوقع أن يستمر قطاع العناية بالوجه في السيطرة على السوق. الطلب المتزايد علىمكافحة الشيخوخةالمنتجات والقلق المتزايد بشأن استخدام منتجات العناية بالبشرة الطبيعية والعضوية هي العوامل الرئيسية التي تدفع صناعة العناية بالبشرة. [7] مستحضرات التجميل وحدها لا تكفي للعناية بالبشرة وأجزاء الجسم. يتطلب الجمع بين المكونات النشطة للتحقق من تلف الجلد وشيخوخة الجلد. هذه المواد العشبية النشطة التي تحتوي على مكونات نشطة ضرورية للغاية للحفاظ على صحة الجلد. مستحضرات التجميل ذات المنشطات العشبية تظهر الآن كحل مناسب للمشكلة الحالية. في الدراسة الحالية ، الجلدمكافحة الشيخوخةتم تقييم إمكانات المستخلصات الكحولية لقشر الحمضيات الشبكي بلانكو بمضادات الأكسدة في المختبر ، ومضادات الكولاجيناز ، ومضادات الإيلاستاز. يُعرف C. reticulata Blanco (Rutaceae) باسم Narangi أو Santra (Orange). الثمرة ملين ، مثير للشهوة الجنسية ، قابض ، منشط ، ويخفف القيء. قشر الفاكهة يستخدم تقليديا كمنشط ، معدي ، قابض ، طارد للريح ، ومضاد للكوربوتيك. يعتبر قشر الحمضيات منتجًا ثانويًا لصناعة الحمضيات ، ولكن تم الإبلاغ عن احتوائه على العديد من المكونات النشطة بتركيز أعلى بكثير من اللب. قشر الفاكهة مفيد أيضًا في العناية بالبشرة.

المواد والأساليب

المواد الكيميائية والكواشف

حمض الأسكوربيك ، كيرسيتين ، كلوريد الحديديك ، كربونات الصوديوم (Na2CO3) ، نتريت الصوديوم (NaNO2) ، هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) ، كلوريد الألومنيوم (AlCl3) ، 1،1 ، ديفينيل ، 2 ، بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، إيلاستاز البنكرياس الخنازير .3.4.21.36) ، Succinyl ، Ala ، Ala ، Ala ، p ، nitroanilide (SANA) ، Clostridium histolyticum collagenase (CHC) (EC.3.4.23.3) ، N‑ (3‑ [2 ‑ Furyl] acryIoyl) ‑Leu‑ تم شراء Gly ‑ Pro ‑ Ala (FALGPA) ، ملح الصوديوم فلوريسئين ، 2،2 azobis (2 ‑ methyl propionamidine) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH) ، وحمض الغاليك من شركة Sigma Chemical Co. (سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية.) 2 ، 2 أزينو ‑ مكرر (3 إيثيل بنزوثيازولين ‑ 6 حمض سلفونيك) ثنائي الأمونيوم

ملح (ABTS) ، (±) 6 ‑ هيدروكسي ‑ 2،5،7،8 رباعي ميثيل كرومان ‑ 2 ‑ حمض الكربوكسيل (ترولوكس) المكتسبة من فلوكا ، الولايات المتحدة الأمريكية. تم الحصول على رباعي النيترو الأزرق (NBT) ، وميثوسلفات الفينازين (PMS) ، ونيوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد - ملح ثنائي الصوديوم (NADH) من SRRL Pvt. المحدودة ، مومباي ، الهند. تم شراء الأمونيوم لكل كبريتات (APS) من Rankem ، الهند.

جمع المواد النباتية

تم الحصول على ثمار C. reticulata Blanco، Rutaceae في يناير 2013 من مومباي (الهند). تم تأكيد التحديد التصنيفي للمواد النباتية من قبل الدكتور CS Latto ، جامعة مومباي. تم المصادقة في معهد أبحاث Agharkar ، بونا.

استخراج المواد النباتية

تم غسل الثمار جيدًا تحت الماء. تم فصل القشور عن الثمار وتجفيفها تحت الظل. بعد ذلك ، تم تعريض المادة المجففة إلى شكل مسحوق وتخزينها في حاوية محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. تم استخلاص حوالي 50 جم من المسحوق المجفف بـ 300 مل ميثانول. تم الحصول على المستخلصات النباتية عن طريق Soxhlation (CR HAE‑ Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata) وطريقة النقع (CR CAE‑ Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata). تم إجراء استخراج Soxhlet عند 65 درجة لمدة 10-12 ساعة. تم إجراء النقع البارد عن طريق الاهتزاز المستمر ؛ حيث تم حفظ خليط مسحوق النبات والميثانول على شاكر دوار (REMI CIS ‑ 24 PLUS) وتم ضبطه عند 100 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة. تم ترشيح المستخلصات باستخدام ورق ترشيح Whatman رقم. 1 ، ثم تبخرت مواد الترشيح تحت ضغط مخفض وتجفيفها باستخدام مبخر دوار (R ‑ 205 ، Buchi Laboratory Equipment ، Flawil ، سويسرا) مضبوطًا على 50 درجة. تم تخزين المستخلصات المجففة عند 4 درجات ، في زجاجات ذات علامات ومعقمة ومغطاة حتى استخدامها مرة أخرى.

التحليل الكيميائي النباتي الأولي للمستخلصات

تم إخضاع المستخلصات كما هو مذكور أعلاه لاختبارات كيميائية نباتية نوعية مختلفة لتحديد المكونات الكيميائية الموجودة في المادة النباتية وفقًا للطرق الموصوفة. [11]

تحديد محتوى الفينول الكلي

تم تحديد إجمالي محتوى الفينول (TPC) باستخدام كاشف Folin - Ciocalteu باستخدام الطريقة المحددة. إلى 0. تمت إضافة 5 مل من كل عينة ، 2.5 مل 1:10 تخفيف من كاشف Folin - Ciocalteau و 2 مل من Na2CO3 (7.5 بالمائة وزن / حجم) واحتضانها عند 765 نانومتر باستخدام مقياس طيف ضوئي مرئي فوق بنفسجي. تم التعبير عن النتائج كميكروجرام من مكافئ حمض الجاليك لكل مجم من المستخلص (ميكروغرام من خلاصة GAE / mg).

تحديد محتوى الفلافونويد الكلي

تم قياس محتوى الفلافونويد الكلي (TFC) بمقايسة قياس الألوان AlCl3.

تمت إضافة قسامة (1 مل) من المستخلصات أو المحاليل القياسية من الكيرسيتين (2 0 ، 4 0 ، 60 ، 80 ، 100 ميكروغرام / مل) إلى دورق حجمي سعة 10 مل يحتوي على 4 مل من ماء مقطرة. إلى الدورق ، تمت إضافة 0.30 مل من 5 بالمائة NaNO2 وبعد 5 دقائق ، تمت إضافة 0.3 مل من 10 بالمائة AlCl3. بعد 5 دقائق ، تمت إضافة 2 مل من 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم وجعل الحجم يصل إلى 10 مل بالماء المقطر. تم خلط المحلول وتم قياس الامتصاصية مقابل الفراغ عند 510 نانومتر. تم التعبير عن TFC كميكروجرام من مكافئ كيرسيتين لكل ملليجرام من المستخلص (ميكرو جرام من مستخلص QE / ملليجرام).

فحوصات مضادات الأكسدة

1 ، 1- ثنائي فينيل -2- بيكريلهيدرازيل فحص الجذور الحرة

تم تقييم نشاط كاسح الجذور الحرة بطريقة معينة مع بعض التعديلات. تم تقييم نشاط كاسح الجذور الحرة بطريقة معينة مع بعض التعديلات. تم خلط حجم 1 مل من التركيزات المختلفة (1 0 0-800 ميكروغرام / مل) من عينات الاختبار مع 200 ميكرولتر من محلول ميثانول DPPH (0.36 مجم / مل). بعد الرج ، تم تحضين الخليط في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم تم قياس الامتصاصية عند 517 نانومتر. تم استخدام حمض الأسكوربيك كعنصر تحكم إيجابي.

مقايسة كسح أنيون فينازين ميثوسلفات- NADHsystem superoxide anion

تم تقييم نشاط الكسح الفائق بأسلوب معين. عازلة Tris HCl (3 مل ، 16 ملم ، درجة الحموضة 8. 0) تحتوي على 0. 75 مل من محلول NBT (5 0 ميكرومتر) ، 0. 75 مل NADH ( تم خلط محلول 78 ميكرومتر و 0 3 مل من محلول العينة (50-350 ميكروجرام / مل) في ميثانول. بدأ التفاعل عند إضافة 0.75 مل من محلول PMS (10 ميكرومتر) إلى الخليط. تم تحضين خليط التفاعل عند 25 درجة لمدة 5 دقائق ، وتمت قراءة الامتصاص عند 560 نانومتر مقابل العينات الفارغة المقابلة. تم استخدام حمض الأسكوربيك كمعيار.

2، 2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) مقايسة الكسح الجذري

يتم إجراء الفحص وفقًا للطريقة المحددة. [16] تم إنتاج الكاتيونات الجذرية ABTS عن طريق تفاعل ABTS و APS واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 16 ساعة. باختصار ، احتوى حجم التفاعل الإجمالي على 1 0 ملي مولار من PBS pH 7.4 (تحكم إيجابي أو حلول اختبار) من تركيزات مختلفة. تمت إضافة محلول ABTS الجذري إلى تركيز نهائي قدره 0.219 ملي مولار. تم خلط خليط التفاعل وقراءته على الفور عند 734 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (VERSA max ، Molecular devices ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تفاعل تحكم بدون عينة الاختبار. تم استخدام حمض الجاليك كعنصر تحكم إيجابي.

تم حساب قدرة المقتطفات على البحث عن جذور DPPH و PMS-NADH والجذور الحرة ABTS بالصيغة التالية:

نشاط الكسح الجذري (نسبة مئوية)=([عبس التحكم - عبس العينة] / عبس التحكم) × 100 ، حيث Abs هو الامتصاص عند الطول الموجي المذكور في وجود أو عدم وجود مقتطفات الاختبار.

مقايسة قدرة امتصاص الأكسجين الجذري

تم إجراء هذا الاختبار وفقًا للطريقة الموضحة. [17] خليط مسبق من 140 ميكرولتر يحتوي على - 20 ميكرولتر من محلول الاختبار أو TROLOX بتركيزات مختلفة. عازلة فوسفات الصوديوم 75 ملي ، درجة الحموضة 7.4 ؛ 120 ميكرولتر من فلورسين الصوديوم (117 نانومتر) مختلطة ومحتضنة عند 37 درجة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة المسبقة ، تمت إضافة 60 ميكرولتر من AAPH (40 ملي مولار) وخلطها لمدة 15 ثانية. تم إجراء التفاعل لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة. تم أخذ قياسات التألق عند إثارة 485 نانومتر و 520 نانومتر من مرشحات الانبعاث.

فحوصات الإنزيم

مقايسة أنتي كولاجيناز

تم إجراء مقايسة تثبيط الكولاجين بالطريقة الموصوفة سابقًا ، [18] والتي تعتمد على التحلل المائي لـ FALGPA بواسطة كولاجيناز لإنتاج FA Leu و Gly Pro ‑ Ala. تم إجراء الاختبار في محلول Tricine سعة 5 0 ملي مولار (4 0 0 ملي مول كلوريد الصوديوم و 10 ملي مول كلوريد الكالسيوم ، ودرجة الحموضة 7.5). تم إذابة ChC في المخزن المؤقت للاستخدام بتركيز أولي قدره 0.8 وحدة / مل. تم إذابة الركيزة الاصطناعية ، FALGPA ، في المخزن المؤقت Tricine إلى 2 مم. تم تحضين مستخلصات العينة مع الإنزيم في المخزن المؤقت لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الركيزة لبدء التفاعل. يحتوي خليط التفاعل النهائي (الحجم الكلي 75 ميكرولتر) على 25 ميكرولتر من محلول Tricine سعة 50 ملي مولار ، و 25 ميكرولتر من مستخلص الاختبار (250-4000 ميكروغرام / مل) ، و 25 ميكرولتر من 0.1 وحدة من إنزيم ChC. تم إجراء الضوابط باستخدام محلول Tricine سعة 50 ملي مولار حيث تم إذابة مستخلصات الاختبار في Tricine buffer (50 ملي مولار) ، بينما تم استخدام الكاتشين كعنصر تحكم إيجابي. بعد إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة FALGPA 2 ملي مولار ، تم قياس نشاط كولاجيناز على الفور عند 340 نانومتر لمدة 20 دقيقة باستخدام قارئ لوحة ميكروية 96 بئر (Bio ‑ Tek M Quant، FLX 800).

مقايسة مكافحة الإيلاستاز

اعتمد الاختبار المستخدم على طرق من الأدبيات. تم إجراء هذا الاختبار في المخزن المؤقت 0. 2 ملي تريس ‑ HCL (الرقم الهيدروجيني 8. 0). تم إذابة الإيلاستاز البنكرياس الخنازير (PE - EC 3.4.21.36) لعمل محلول مخزون 1 مجم / مل في {{1 {12}}}}. 2 ملي مولار من Tris ‑ HCL. تم إذابة الركيزة N ‑ Succinyl ‑ Ala Ala Ala ‑ p nitroanilide (SANA) في المخزن المؤقت عند 0 .8 ملي مولار. تم تحضين مستخلصات الاختبار (0.156-10 مجم / مل) مع الإنزيم لمدة 20 دقيقة قبل إضافة الركيزة لبدء التفاعل. يحتوي خليط التفاعل النهائي (الإجمالي 250 ميكرولتر) على 50 ميكرولتر من مستخلص نباتي ، 160 ميكرولتر عازلة ، 20 ميكرولتر إنزيم ، و 20 ميكرولتر ركيزة. تم استخدام كاتشين كعنصر تحكم إيجابي. تم إجراء الضوابط السلبية باستخدام المخزن المؤقت Tris ‑ HCL. تم قياس الامتصاصية على الفور عند 410 نانومتر ثم بشكل مستمر لمدة 20 دقيقة باستخدام قارئ لوحة ميكروية 96 بئر (Bio Tek M Quant، FLX 800). يتم حساب النسبة المئوية للتثبيط لكلا هذين الاختبارين من خلال: نشاط تثبيط الإنزيم (النسبة المئوية)=(1− [B / A]) × 100

حيث ،=نشاط إنزيم بدون عينة ،=نشاط في وجود عينة.

كروماتوغرافيا الغاز ‑ تحليل مطياف الكتلة

تم اعتماد الشروط التالية لتحليل كروماتوغرافيا الغاز ‑ مطياف الكتلة (GC-MS). [2 0] تم تحديد المكون باستخدام Agilent 7890 A كروماتوجراف غاز مقترن بكاشف انتقائي جماعي خامل 5975 درجة مئوية (MSD) مع كاشف المحور الثلاثي. تم حقن العينات بواسطة Agilent 7693 جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي في Agilent 19091S ‑ 433: HP 5MS عمود (30 م × 250 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر). تم استخدام الهيليوم كغاز حامل (1 مل / دقيقة). تم الحفاظ على درجة حرارة الحاقن والكاشف عند 250 درجة. تمت برمجة درجة حرارة العمود عند 60 درجة لمدة 3 دقائق ثم تم رفعها إلى 160 درجة لمدة دقيقتين عند 10 درجة / دقيقة. تم رفع درجة الحرارة الإضافية إلى 300 درجة (عند 15 درجة / دقيقة). تم الحصول على أطياف الكتلة على مدى 40-500 amu في وضع EI. تم التعرف على المركبات التي تم إلقاؤها من خلال مقارنة البيانات الطيفية الكتلية مع البيانات القياسية المتاحة في مكتبة المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا. تم تحديد المكونات الرئيسية من مستخلص Soxhlet الميثانولي من قشر C. reticulata Blanco peel (CR HAE) من خلال تحليل GC-MS.

تحليل احصائي

تم التعبير عن قيم EC5 0 على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري ، وتم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق تحليل التباين الفردي متبوعًا باختبار توكي للمقارنة المتعددة (P <0. 05)="" حيث="" ،="" جميع="" العينات="" ،="" أي="" مقتطفات="" الاختبار="" والمعيار="" الإيجابي="" تم="" مقارنتهما="" مع="" بعضهما="" البعض.="" تم="" إجراء="" جميع="" الحسابات="" باستخدام="" graphpad="" prism="" (الإصدار="" 5.0="" ،="" برنامج="" graphpad="" ،="" الولايات="" المتحدة="">

النتائج والمناقشة

التحليل الكيميائي النباتي الأولي للمستخلصات

يشير التحليل الكيميائي النباتي الأولي للمستخلصات الميثانية من C. reticulata Blanco إلى وجود الكربوهيدرات والأحماض الأمينية والفلافونويدات والعفص ومشتقات الفينول والمنشطات وما إلى ذلك ، [الجدول 1].

الجدول 1: التحليل الكيميائي النباتي الأولي للمستخلصات الميثانولية لقشر الحمضيات الشبكية بلانكو

FeCl3: كلوريد الحديديك ؛ CR HAE: مستخلص كحولي ساخن من الحمضيات الشبكية بلانكو ؛ CR CAE: مستخلص كحولي بارد من الحمضيات الشبكية البيضاء

تحديد محتوى الفينول الكلي

تُظهر الفينولات ، وخاصة البوليفينول ، مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية المفيدة في الثدييات ، بما في ذلك مضادات الفيروسات ، ومضادات الجراثيم ، والمناعة ، ومضادات الحساسية ، ومضادات ارتفاع ضغط الدم ، ومضادات نقص التروية ، ومضادات عدم انتظام ضربات القلب ، ومضادات التخثر ، ونقص الكولسترول ، ومضاد الأكسدة الشحمية ، وقائية للكبد ، ومضادة للالتهابات ، ومضادة للسرطان. [21،22] أظهرت العديد من الدراسات أن مركبات الفلافونويد تعمل كقمامة لأنيونات الأكسيد الفائق ، والأكسجين المفرد ، وجذور الهيدروكسيل ، وجذور البيروكسيل الدهنية. [23،24] TPC و TFC تم تحديدها لكل من المقتطفات باستخدام المنحنيات القياسية [الشكل 1]. أظهر CR HAE محتوى فينول أعلى ، أي 187.93 ± 4.69 ميكروغرام من مستخلص GAE / mg من خلاصة CR CAE ، أي 58.66 ± 2.40 ميكروغرام GAE / mg. تم العثور على TFCs لـ CR HAE و CR CAE لتكون متشابهة تقريبًا ، أي 171.72 ± 4.13 ميكروغرام من مستخلص QE / mg و 169.88 ± 9.79 ميكروغرام من مستخلص QE / mg ، على التوالي.

تحديد محتوى الفلافونويد الكلي

لا ينبغي استنتاج نشاط مضادات الأكسدة على أساس واحدمضادات الأكسدةنموذج الاختبار. في الممارسة العملية ، يتم تنفيذ العديد من إجراءات الاختبار في المختبر للتقييممضادات الأكسدةالأنشطة مع عينات الفائدة. [25] في هذه الدراسة ، قمنا بتقييممضادات الأكسدةإمكانات CR HAE و CR CAE بمختلفمضادات الأكسدةالمقايسات بما في ذلك مقايسة الكسح الجذور الحرة DPPH ، ومقايسة الكسح لأنيون الفائق ، ومقايسة الكسح الجذري ABTS ، ومقايسة قدرة امتصاص جذور الأكسجين (ORAC).

فحوصات مضادات الأكسدة

1 ، 1- ثنائي فينيل -2- بيكريلهيدرازيل فحص الجذور الحرة

تعد مقايسة المسح الجذري الخالي من DPPH أحد الاختبارات الأكثر استخدامًا لاختبار نشاط المسح الجذري الأولي للمستخلصات النباتية. المضادات الأكسدةيرجع نشاط المستخلصات النباتية التي تحتوي على مكونات البوليفينول إلى قدرتها على التبرع بذرات الهيدروجين أو الإلكترونات وتنظيف الجذور الحرة. وبالتالي ، سيتم تقليل اللون الأرجواني لـ DPPH إلى - diphenyl‑picrylhydrazine (أصفر). تشير النتائج إلى أن CR HAE و CR CAE أظهروا ما يصل إلى 85 بالمائة من إزالة الجذور الحرة لـDPPH [الشكل 2]. تم استخدام حمض الأسكوربيك كعنصر تحكم إيجابي وأظهر نشاط الكسح بنسبة تصل إلى 92 بالمائة. أظهر CR HAE أعلى قليلاًمضادات الأكسدةالنشاط من CR CAE. تم التعبير عن قيم EC50 (ميكروغرام / مل) في الجدول 2.

مقايسة كسح أنيون الفينازين ميثوسولفات - NADH على الرغم من أن أنيون فائق الأكسيد هو عامل مؤكسد ضعيف ، إلا أنه ينتج في النهاية

الجدول 2: قيمة EC للمستخلصات الميثانولية من Citrus reticulata Blanco Peel لـ DPPH ، والأكسيد الفائق ، و ABTS ، ومضاد كولاجيناز ، ومقايسات مضادات الإيلاستاز

جذور الهيدروكسيل القوية والخطيرة بالإضافة إلى الأكسجين المفرد ، وكلاهما يساهم في الإجهاد التأكسدي. جذور الأكسيد الفائق المتولدة من الأكسجين المذاب بواسطة اقتران PMS-NADH ويمكن قياسها من خلال قدرتها على تقليل NBT. يشير الانخفاض في الامتصاص عند 56 0 نانومتر مع مستخلص النبات إلى قدرتها على إخماد جذور الأكسيد الفائق في خليط التفاعل. أظهر CR HAE نشاط تنظيف قوي للأكسيد الفائق من CR CAE [الشكل 3]. تم استخدام حمض الأسكوربيك كعنصر تحكم إيجابي ويقوم بإزالة الأكسيد الفائق بنسبة تصل إلى 52 في المائة. تم حساب قيم التركيز الفعال 50 (ميكروغرام / مل) والتعبير عنها في الجدول 2. وجد أن CR HAE أكثر فعالية (P <0.05) من="" cr="" cae="" حيث="" أظهر="" قيمة="" ec50="" أقل="" (ميكروغرام="" مل)="">مضادات الأكسدةنشاط.

2، 2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) مقايسة الكسح الجذري

يعتمد اختبار ABTS على مسح الضوء بواسطة جذور ABTS. انمضادات الأكسدةمع القدرة على التبرع بذرة الهيدروجين سيخمد الجذور الحرة المستقرة ، وهي عملية مرتبطة بتغيير في الامتصاص ، والتي يمكن اتباعها بطريقة القياس الطيفي. تم قياس نشاط ABTS من حيث النسبة المئوية لتثبيط الجذور الحرة ABTS بواسطةمضادات الأكسدةفي كل عينة. تم عرض قيم ABTS لـ CR HAE و CR CAE وحمض الغاليك في الجدول 2. أظهر CR HAE و CR CAE نشاط الكسح الجذري ABTS بطريقة تعتمد على التركيز وتم ملاحظته حتى 59 بالمائة. أظهر حمض الغاليك ما يصل إلى 79 في المئة من قدرة الكسح ABTS [الشكل 4]. تشير قيم EC5 0 (ميكروغرام / مل) التي تم الحصول عليها لـ CR HAE و CR CAE إلى عدم وجود فرق كبير (P <0.05) واقترحت="" أن="" كلا="" المستخلصين="" لهما="" إمكانات="" كسح="" abts="" متشابهة="">

مقايسة قدرة امتصاص الأكسجين الجذري

يعتبر اختبار ORAC أكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية من طرق القياس الأخرىمضادات الأكسدةالفاعلية لأنها تقيس تفاعلات نقل ذرة الهيدروجين وتحاكي في الجسم الحيمضادات الأكسدةالعمل. [29] يقيس أيضًا مدى جودة المكونات القابلة للذوبان في الماء والذوبان في الدهون من مادة طبيعية في حماية هدف معياري من الأكسدة بواسطة نيتريت البيروكسيل ، وجذور الهيدروكسيل ، وأنيون الأكسيد الفائق ، و

القميص الأكسجين ، ويولد درجة بناءً على المقارنة معمضادات الأكسدة[30] في هذه الدراسة ، قمنا بقياس قيم أوراكل لـ CR HAE و CR CAE والمعبر عنها من حيث TROLOX (مليمول TROLOX مكافئ / غرام من المادة) [الشكل 5]. أظهر CR HAE قيمة ORAC أعلى (1243 ملمول من مكافئ TROLOX / غرام من المادة) من CR CAE (1063 ميكرو مول من مكافئ TROLOX / غرام من المادة) [الجدول 2].

فحوصات الإنزيم

مقايسة أنتي كولاجيناز

المصفوفة المعدنية البروتينات (MMPs) هي عائلة من الإنزيمات المحللة للبروتين التي تحلل مكونات مختلفة من ECM. الكولاجيناز هو أحد أعضاء عائلة MMP وهو مسؤول عن تدهور الكولاجين. إن كولاجيناز من بكتيريا C. histolyticum (ChC) (C 3.4.24.3) هو أحد البروتينات القليلة القادرة على تحطيم المنطقة الحلزونية الثلاثية للكولاجين الأصلي في ظل الظروف الفسيولوجية وفي الظروف المختبرية باستخدام الببتيدات الاصطناعية كركائز. يمكن دراسة التأثير الوقائي للمستخلصات النباتية ضد إنزيم الكولاجيناز باستخدام ChC والركيزة الاصطناعية FALGPA. في هذه الدراسة ، تم تقييم نشاط تثبيط الكولاجيناز لـ CR HAE و CR CAE. تم استخدام كاتشين كعنصر تحكم إيجابي. أظهرت النتائج أن مستخلص CR HAE كان أكثر فعالية في تثبيط إنزيم الكولاجيناز من CR CAE وأظهر تثبيطًا يصل إلى 76 بالمائة [الشكل 6]. تم قياس الفعالية من حيث قيمة EC50 (ميكروغرام / مل) وتم التعبير عنها في الجدول 2.

مقايسة مكافحة الإيلاستاز

الإيلاستاز هو الإنزيم الوحيد القادر على تحطيم الإيلاستين. يمكن أن يؤدي تثبيط إنزيم الإيلاستاز إلى الاحتفاظ بمرونة الجلد وليونة. من ناحيةمكافحة الشيخوخة، يمكن أن يكون العثور على مثبطات إنزيمات الإيلاستاز مفيدًا

لمنع فقدان مرونة الجلد وبالتالي ترهل الجلد. في مقايسة مضادات الإيلاستاز ، تم اختبار إيلاستاز البنكرياس الخنازير بطريقة طيفية باستخدام [N ‑ Succ‑ (Ala) 3 p nitroanilide] كركيزة ، وتم تحديد كمية p ‑ nitroaniline عن طريق قياس الامتصاصية عند 41 {{ 6}} نانومتر. تم التحقيق في التأثيرات المثبطة لـ CR HAE و CR CAE على نشاط الإيلاستاز. تم استخدام كاتشين كعنصر تحكم إيجابي. أظهر CR HAE نشاطًا قويًا لتثبيط الإيلاستاز في المائة مقارنة بـ CR CAE ولوحظ تثبيط يصل إلى 80 في المائة [الشكل 7]. تم التعبير عن قيم EC50 (ملغ / مل) في الجدول 2 ولوحظ أن CR HAE كان أكثر فعالية من CR CAE (P <0.05). تم="" العثور="" على="" قيمة="" ec50="" التي="" تم="" الحصول="" عليها="" من="" الكاتشين="" لتكون="" أقل="" بكثير="" مما="" يشير="" إلى="" نشاطه="" القوي="" في="" مكافحة="" الإيلاستاز="" ودوره="" كعامل="">مكافحة الشيخوخةمكون. أظهر Kim et al.، 2004 أن الكاتشين و epigallocatechin gallate المعزولين من الشاي الأخضر (Camellia sinensis) كانا من مثبطات مضادات الإيلاستاز القوية.

كروماتوغرافيا الغاز ‑ تحليل مطياف الكتلة

أظهر CR HAE أعلىمضادات الأكسدةوقدرات مقاومة الشيخوخة مقارنة بـ CR CAE ؛ وبالتالي ، تم إجراء تحليل GC-MS لـCR HAE لفهم المكونات الموجودة فيه. تم تحديد ما مجموعه 20 مركبًا مختلفًا وعرضها في الجدول 3. وأظهر الرسم البياني اللوني 20 قمة في وقت الاستبقاء تراوحت من 2.95 دقيقة إلى 44.45 دقيقة [الشكل 8]. تم تحديد أعلى ذروة عند 44.11 دقيقة بمساحة 44.37 في المائة على أنها حمض بوتيل فوسفونيك ، بنتيل 4 (2 ‑ فينيل بروب 2 ‑ يل) استر فينيل. زاب وآخرون ، 2012 [33] ذكر أنمضادات الأكسدةوالنشاط المضاد للورم لحمض بوتيل الفوسفونيك ، البنتيل 4 (2 ‑ phenylprop 2 ‑ yl) فينيل استر الموجود في المستخلص الإيثانولي من C.reticulata. dihydro) أو 4 ‑ Chromanone (مساحة 21.43 بالمائة) وهو نوع من

فلافانون. قام دي ماجو وآخرون ، 2005 [34] بعزل مركبات الفلافانون من الحمضيات وأظهروا أنها تعتمد على التركيب.مضادات الأكسدةنشاط. المركبات الأخرى 3 '، 4' ، 5 ، 7 ، 8 Pentamethoxyflavone و 4 '، 5 ، 7 ، 8 Tetramethoxyflavone هي أنواع من polymethoxyflavone (PMF). يعرض PMF مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية. في الآونة الأخيرة ، قام Ho وآخرون ، 2012 [35] بعزل وتحديد PMFs الهيدروكسيل من قشور الحمضيات والتحقيق في أنشطتها البيولوجية ، بما في ذلك الخصائص المضادة للالتهابات والوقاية الكيميائية للسرطان. المركبات الأخرى التي تم تحديدها تشمل D - Limonene (مساحة 1.46 بالمائة) ، 4H ، Pyran ، 4 one ، 2 ، 3 dihydro ‑ 3 ، 5 dihydroxy ‑ 6 methyl (مساحة 1.46٪) ، 2 ‑ Methoxy 4 vinylphenol ( 1.67 في المائة) ، و n ‑ Hexadecanoic acid (2.51٪ area) ويمكن أن تكون مرتبطة بـمكافحة الشيخوخةإمكانات قشر C. reticulata Blanco. تم عرض هياكل جميع المركبات المحددة في الشكل 9.

استنتاج

تم تقييم مستخلصات C. reticulata Blanco ضد شيخوخة الجلد في المختبرمضادات الأكسدةومقايسات مضادات كولاجيناز ومضادة للإيلاستاز. أظهرت الدراسة أن المستخلص الميثانولي (Soxhlation) أظهر نتائج واعدةمضادات الأكسدةوالنشاط المضاد للأنزيمات ويمكن استخدامه كعنصر قويمكافحة تجعدوكيل فيمكافحة الشيخوخةتركيبات العناية بالبشرة.

إعتراف

المؤلفون ممتنون لمختبر Underwriters Lab (UL) ، بنغالور ، الهند ، لتحليل GC-MS والعلاجات الطبيعية ، بنغالور ، الهند ، لتحليل ORAC.

الدعم المالي والرعاية

لا شيء.

تضارب المصالح

لا يوجد هناك أي تضارب للمصالح.