مثبط Farnesyltransferase LNK-754 يخفف من الحثل المحوري ويقلل من أمراض الأميلويد في الفئران الجزء 2

التصوير الحي للخلايا العصبية

بالنسبة لتجارب التصوير المباشر، تم إعداد الخلايا العصبية على النحو الوارد أعلاه ومطلية بأطباق زجاجية سفلية مقاس 35 مم (MatTek # P35G -1.5-14C) لمدة 7 أيام في الثقافة. تمت بعد ذلك إضافة 10nM LNK-754 أو lonafarnib إلى الوسائط المكيفة، وتم التعامل مع ثقافات التحكم باستخدام DMSO كوسيلة. بعد 48 ساعة من العلاج، تم استبدال الوسائط بوسائل مكيفة من صفائح متوازية غير معالجة من الخلايا العصبية. تمت إضافة 25 نانومتر من LysoTracker-Green DND -26 (#L7526، Invitrogen) إلى الوسائط المكيفة، وتم تحضين الخلايا العصبية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة.

تعد الخلايا العصبية جزءًا مهمًا من الجهاز العصبي، فهي قادرة على استقبال المعلومات ومعالجتها ونقلها، وهي الأساس المادي لذكاء الإنسان وسلوكه. تعتبر المناعة ضمانة مهمة لجسم الإنسان لمقاومة المرض. يمكنه تحديد وتدمير مسببات الأمراض والخلايا غير الطبيعية والحفاظ على صحة الجسم.

تظهر الأبحاث أن هناك علاقة قوية بين الخلايا العصبية وجهاز المناعة. يمكن أن تؤثر الخلايا العصبية على الجهاز المناعي عن طريق إطلاق مجموعة متنوعة من الناقلات العصبية، مثل النورإبينفرين والإبينفرين وما إلى ذلك. يمكن لهذه الناقلات العصبية تغيير نشاط الخلايا المناعية، وتعزيز تكاثر الخلايا المناعية ووظيفتها، وتحسين مناعة الجسم. وفي الوقت نفسه، يمكن لجهاز المناعة أيضًا أن يؤثر على وظيفة الخلايا العصبية من خلال مسارات مختلفة. يمكن للخلايا المناعية أن تفرز مجموعة متنوعة من السيتوكينات والهرمونات، مما يؤثر على نمو وتطور ووظيفة الخلايا العصبية من خلال المسارات المناعية.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن للعوامل النفسية والاجتماعية أن تؤثر على المناعة ووظيفة الخلايا العصبية. يمكن أن تؤثر المشاعر السلبية مثل التوتر والقلق والاكتئاب سلبًا على جهاز المناعة والخلايا العصبية، مما يقلل من مناعة الجسم. المشاعر الإيجابية والعلاقات الاجتماعية الإيجابية ونمط الحياة الصحي يمكن أن تعزز التطور الصحي للمناعة والخلايا العصبية.

خلاصة القول، هناك علاقة تفاعلية ومتبادلة الدعم بين الخلايا العصبية والمناعة. إن الحفاظ على الصحة العقلية ومواجهة الحياة بإيجابية واعتماد عادات معيشية جيدة يمكن أن يعزز مناعة الجسم والنمو الصحي للخلايا العصبية. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير، لأن Cistanche deserticola يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو. هذه المواد مهمة جدًا للذاكرة والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للحوم أيضًا تحسين تدفق الدم وتعزيز توصيل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على ما يكفي من العناصر الغذائية والطاقة، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.

انقر فوق معرفة طرق تحسين وظائف المخ

تم إجراء تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية باستخدام مجهر Ti2 Widefield. يبدأ التصوير على الفور بعد 30 دقيقة ويستمر لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. تم التقاط تعريضات 1- كل دقيقة، وتم تصوير 20-30 منطقة منفصلة لكل طبق خلال 30 دقيقة. تم إجراء قياسات المسافة والسرعة لجزيئات LysoTracker وتحليلات الكيموغراف باستخدام برنامج NIS Elements وتم وصفها بالتفصيل أدناه. في تجارب منفصلة، ​​تمت إضافة 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535، Invitrogen) إلى الوسائط المكيفة، وتم التقاط الصور الملتقطة للخلايا العصبية الحية لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة باستخدام مجهر متحد البؤر Nikon A1 بهدف 60X (NA 1.4) وبرنامج NIS Elements.

التصوير الحي لأنسجة المخ

{{0}} تم حقن فئران 5XFAD عمرها شهرًا يوميًا لمدة 3 أسابيع وعند اكتمال العلاج، تم تخدير الفئران وإرواءها بمحلول يحتوي على 1M KCl، 1M MgCl2، 0.1mM كينورينات ، 0.01 ملم DL-2-حمض أميني-5- فوسفونوبنتانويك، 5 ملم جلوتاثيون، 25 ملم جلوكوز، 125 ملم كلوريد الصوديوم، 1.4 ملم NaH2PO4 و25 ملم NaHCO3.

تم بعد ذلك تشريح العقول بسرعة في ACSF المؤكسج البارد المثلج الذي يحتوي على 2.5 ملي مول كلوريد كلوريد الصوديوم، 85 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.25 ملي مولار NaH2PO4، 25 ملي مولار NaHCO3، {{10}}.5 ملي مولار CaCl2، 4 ملي مولار 4 ملغ كلوريد 2، 75 ملي مولار سكروز، 25 ملي مولار جلوكوز، 50uM C6H7NaO6، 0.1mM كينورينات، 0.01mM DL-2-Amino-5-حمض الفوسفونوبنتانويك و5mM الجلوتاثيون. تم الحصول على شرائح إكليلية بحجم 300 ميكرومتر باستخدام مشراح اهتزازي Compresstome VF -200 (أدوات دقيقة) وتم السماح لها بالراحة لمدة 30 دقيقة للتعافي عند 32 درجة في محلول ACSF مؤكسد يحتوي على 2.5 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 85 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.25 ملي مولار NaH2PO4، 25 مم NaHCO3، 0.5 مم CaCl2، 4 مم 4 MgCl2، 75 مم سكروز، 25 مم جلوكوز، 50 مم C6H7NaO6، 0.1 مم كينورينات، 0.01 مم DL2-Amino-5-حمض الفوسفونوبنتانويك، و5 مم الجلوتاثيون.

تم بعد ذلك نقل الشرائح إلى أطباق زجاجية سفلية مقاس 35 مم (MatTek # P35G-1.5-14C) تحتوي على ACSF المؤكسج مع 25 نانومتر LysoTracker-Green وتخفيف 1:10,000 بمقدار 1 ملغ/ مل Tiazine Red (#S570435، Sigma Aldrich) والذي كان مطابقًا لـ ACSF المستخدم خلال فترة الاسترداد. تم تأكيد صلاحية الشريحة باستخدام تصوير الأنسجة بالفاصل الزمني. تم تحضين الشرائح باستخدام LysoTracker-Green وTiazine Red لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ثم تم تصوير مناطق الدماغ القشرية على الفور في نفس المحلول عند 32 درجة على مجهر متحد البؤر Nikon A1 بهدف 60X (NA 1.4) وبرنامج NIS Elements لـ لا تزيد عن 30 دقيقة.

استخراج الدماغ والتطعيم المناعي

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الزيلازين (15 مجم / كجم) والكيتامين (1 0 0 مجم / كجم) ، مملوء بمحلول ملحي بالفوسفات (1XPBS) مع فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (20 ميكروجرام / مل) ، ليوبيبتين (0.5 ميكروغرام / مل)، أورثوفانادات الصوديوم (20 ميكرومتر)، وديثيوثريتول (0.1 مم)، تليها إزالة الدماغ. تحتوي جميع المخازن المؤقتة المستخدمة لاستخراج البروتين على كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني III (#535140، ميليبور) ومثبط هالت الفوسفاتيز (#78420، Thermo Fisher Scientific). تم وزن أنسجة نصف الدماغ وتجانسها يدويًا باستخدام جهاز الخالط 1:10 (وزن/حجم) في 1XPBS.

بعد التجانس، تم الطرد المركزي للسائل عند 20،8{{10}}0 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات. تمت إزالة الجزء القابل للذوبان (طاف)، وتم إعادة تعليق الحبيبة عن طريق الأنابيب في محلول مقايسة الهطول المناعي الإشعاعي (RIPA) [50 مللي مولار تريس، 0.15 مولار كلوريد الصوديوم، 1% أوكتيل فينوكسي بولي إيثوكسي إيثانول (IGEPAL)، 1 مللي مولار EDTA، 1 مللي مولار EGTA، 0.1% SDS، و 0.5 ٪ ديوكسيتشولات الصوديوم عند درجة الحموضة 8] لاحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

تم صوتنة العينات (Misonix XL {{0}}) لمدة 20 ثانية على الجليد ثم تم طردها بالطرد المركزي عند 20800 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات. تمت إزالة جزء RIPA القابل للذوبان (الطاف)، وتم إعادة تعليق الحبيبة في 5 م جوانيدين (درجة الحموضة 8.0) لتحليل البروتينات غير القابلة للذوبان. تم صوتنة كل عينة لمدة 20 ثانية على الجليد، وتم تدويرها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تم طردها بالطرد المركزي عند 20800 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات. تم استخدام اختبار حمض البيكينكونيك (BCA) (#23225، Thermo Fisher Scientific) لقياس تركيز البروتين في كل عينة.

بالنسبة للبقع الغربية، تم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على 4-12٪ من المواد الهلامية NuPAGE (Invitrogen) وفصلها باستخدام عازلة MOPS في ظل ظروف مخفضة ومشوهة. تم نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين وتم تطويرها باستخدام Pierce ECL (التألق الكيميائي المعزز؛ Thermo Fisher Scientific). تم تصور الإشارات المطورة باستخدام ProteinSimple FCR (FluorChem R) وتم قياس كمية إشارات التألق الكيميائي اللاحقة باستخدام برنامج AlphaView (ProteinSimple). تم تحليل جميع البقع باستخدام أداة تصحيح الخلفية المحلية باستثناء لطخة HDJ -2، والتي تم تحليلها باستخدام أداة رابط الخلفية بالتزامن مع تصحيح الخلفية متعدد المناطق (برنامج AlphaView).

إليسا 42

لقياس A 42 في متجانسات نصف الدماغ من فئران 5XFAD، تم استخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (Thermo Fisher Scientific، KHB3441) المتوفرة تجاريًا باتباع إرشادات الشركة المصنعة لتحليل الجوانيدين وA 42 القابل للذوبان في PBS في نصف الدماغ. لقياس A 42 في أدمغة الفئران hAPP/PS1، تم استخدام ELISA المتوفر تجاريًا (h amyloid 42 ELISA عالي الحساسية، شركة Te Genetics، زيورخ، سويسرا). تم إجراء ELISA وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

التألق المناعي لأنسجة دماغ الفأر

بعد التروية، تم استخراج العقول وتثبيت نصف الدماغ في 10٪ من الفورمالين متبوعًا بالحفظ بالتبريد في محلول سكروز بنسبة 30٪ في 1XPBS. تم استخدام مشراح منزلق متجمد لحصد 30- ميكرومتر من المقاطع الإكليلية أو السهمية. تم وضع المقاطع بشكل متسلسل في 12- لوحة بئر في محلول واقي من التبريد (1xPBS، 30% سكروز، و30% إيثيلين جلايكول) وتخزينها عند درجة حرارة -20 درجة حتى الاستخدام. تم إجراء تلطيخ المناعي عن طريق أقسام الغسيل الأولى ثلاث مرات في 1XTBS ثم احتضان الأقسام في 16 ملي جليكاين في 1XTBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد 3 عمليات غسل إضافية في 1XTBS، تم حظر المقاطع في مصل الماعز بنسبة 5% في 0.25% Triton X-100 في 1XTBS لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

تم بعد ذلك تحضين المقاطع طوال الليل في الأجسام المضادة الأولية في محلول 0.25% Triton X-100، و1% ألبومين المصل البقري، و1XTBS عند 4 درجات. تم بعد ذلك إجراء الصبغ المناعي الثانوي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة AlexaFluor الحمير بتركيز 1: 1000 (Thermo Fisher Scientific). تم استخدام ProLong Gold (#P36934، Thermo Fisher Scientific) لتركيب المقاطع قبل تصويرها على مجهر واسع المجال Ti2 أو مجهر متحد البؤر مسح ليزر Nikon A1 لتحديد كمية الصورة باستخدام برنامج Nikon NIS Elements للحصول عليها.

ظلت جميع إعدادات الاستحواذ كما هي بين الأنماط الجينية وتم الحصول على جميع الصور خلال نفس فترة التصوير للتجارب الفردية (مركز جامعة نورث وسترن للفحص المجهري المتقدم ومركز تصوير نيكون).

الكمي الصورة

أدمغة الفئران

تم إجراء القياس المناعي للتلطيخ المناعي لأنسجة دماغ الفأر على 3-5 أقسام لكل حيوان، من إحداثيات Bregma تقريبًا -0.94 إلى .52.55 مم، والتي تم تصويرها باستخدام هدف 10X على مجهر واسع المجال Ti2. تم إجراء التحليلات الكمية، بما في ذلك عتبات الحجم والكثافة، باستخدام برنامج Nikon NIS-Elements (مركز التصوير بجامعة نورث وسترن في نيكون).

اعتمادًا على الإشارة، تم تعيين العتبات باستخدام أداة التحليل العام استنادًا إلى حجم الكائن وشكله وتباينه، ثم تم إنشاء أقنعة ثنائية لكل قناة ومنطقة محل اهتمام. تم تنفيذ العتبة بشكل منفصل على كل قناة لعزل الإشارات محل الاهتمام عن طريق تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وإزالة إشارات الخلفية غير المحددة. لحساب المنطقة المغطاة LAMP1 أو BACE1 أو LysoTracker-Green، بالإضافة إلى قياسات كثافة مضان LAMP1 وLysosensor في الخلايا العصبية الأولية، تم تتبع المناطق ذات الاهتمام يدويًا باستخدام عناصر NIS وتم إنشاء طبقة ثنائية لكل منطقة ذات اهتمام.

لحساب نسبة LAMP1 إلى A 42، تم تطبيع مساحة LAMP1 في الخلايا العصبية التصنعية إلى منطقة A 42 على أساس اللوحة الفردية وتم قياس متوسط ​​النسب لكل فأر بين مجموعات العلاج. تم إجراء تحليل معامل ارتباط بيرسون لـ BACE1 وLAMP1 باستخدام عناصر NIS على أساس كل لوحة على إسقاطات أقصى شدة لصور Z-stack بحجم 30 ميكرومتر تم التقاطها باستخدام مجهر متحد البؤر مسح ليزر Nikon A1 بحجم خطوة 1 ميكرومتر.

لحساب نسبة LysoTrackerGreen إلى Tiazine red، تم تطبيع مساحة LysoTracker-Green في الخلايا العصبية الضمور إلى منطقة Tiazine Red على أساس لوحة فردية وتم قياس متوسط ​​النسبة لكل فأر بين مجموعات العلاج. تم استخدام أربعة أقسام إكليلية من إحداثيات Bregma تقريبًا من .71.70 إلى .52.55 مم لحساب مساحة أو شدة كل إشارة في كل منطقة دماغية لكل فأر. تم إجراء تحليل للمنطقة المغطاة باللوحة وحجم اللوحة باستخدام متوسط ​​خمسة أقسام لكل فأرة من إحداثيات Bregma التي تبلغ حوالي .90.94 إلى .52.55 مم. تم إجراء اختيار القسم، والحصول على الصور، وتتبع الصور، والقياس الكمي من قبل شخص أعمى لمجموعات العلاج والأنماط الجينية.

الخلايا العصبية الأولية

من أجل القياس الكمي لتلطيخ المناعة LAMP1 في الخلايا العصبية الأولية للماوس الثابت، تم تتبع somas يدويًا استنادًا إلى التشكل باستخدام عناصر NIS، وتم إنشاء قناع ثنائي لكل منطقة ذات أهمية وقناة. تم استخدام العتبة لتحسين إشارات LAMP1 وتمييز LAMP1 في الخلايا العصبية، بما في ذلك كل من التشعبات والمحاور العصبية، عن طريق عزل بكسلات LAMP1 الإيجابية لبيكسلات توبولين.

تم استبعاد إشارات خلية LAMP1 من إجمالي مساحة LAMP1 لتحليل حويصلات LAMP1 في الخلايا العصبية. لتحليل حركية LysoTracker-Green في الخلايا العصبية، تم قياس الصور باستخدام NISElements. تم تتبع سرعة ومسافة إجمالي جزيئات LysoTrackerGreen في كل إطار باستخدام ميزة تتبع الحركة الآلية في NIS-Elements. تم تعيين عتبة وتطبيقها على جميع الأفلام بناءً على حجم وكثافة مضان جزيئات LysoTracker-Green للتخلص من ضوضاء الخلفية.

من أجل توليد الكيموجراف، تم إجراء التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المفردة على مجهر متحد البؤر 60X وتم تحديد المحاور شكلياً. تم قياس النسبة المئوية لتكرار الجسيمات المتحركة في اتجاه تقدمي أو رجعي، أو ثابتة، عن طريق قسمة عدد الجزيئات لكل مجموعة على العدد الإجمالي للجزيئات. بالنسبة لتحليلات الكيموجراف، تم تعريف الجسيمات المتحركة على أنها ذات سرعة أعلى من 0.1 ميكرومتر/ثانية.

تحليل احصائي

تم استخدام برنامج GraphPad Prism v8 لإجراء التحليلات الإحصائية، بما في ذلك تحليل التباين (ANOVA) مع اختبارات ما بعد المخصصة عند مقارنة أكثر من عينتين واختبارات t غير المقترنة عند مقارنة عينتين فقط. تم ذكر تفاصيل الاختبار المحددة بما في ذلك عدد التكرارات ونوع الاختبارات اللاحقة وقيم P في وسائل إيضاح الشكل. يتم رسم كافة القياسات الكمية في المتوسط ​​±SEM. تم الانتهاء من الأهمية عندما كانت قيمة P أقل من 0.05، المشار إليها بواسطة *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com