الجسيمات الدقيقة 2.5 ينظم تكوين الميلانين في خلايا الورم الميلانيني البشري A375
Jul 19, 2023
إلى المحرر: أظهرت الدراسات الوبائية أن التعرض للجسيمات الدقيقة 2.5 (PM2.5) يزيد من خطر فرط تصبغ الجلد. أثبتت دراسة حديثة أن PM2.5 يمكن أن يحفز تكوين الميلانين من خلال تنظيم التيروزيناز (TYR) ، وتعبير البروتين المرتبط بالتيروزيناز 1 (TYRP1) و 2 (TYRP2) عبر مستقبلات هيدروكربون أريل (AhR) / تنشيط إشارة بروتين كيناز المنشط للميتوجين. [ 2] ينتشر AhR على نطاق واسع في خلايا الجلد ويتحكم ربطه في الأكسدة / مضادات الأكسدة ، ووظيفة حاجز البشرة ، والاستجابة الناتجة عن الصور ، والمناعة الفطرية ، وتكوين الميلانين. يمكن تنشيطه بالديوكسين والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (مكونات PM2.5) ويؤدي تنشيطه إلى نسخ الجينات التي تشفر كلاً من إنزيمات التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية للمرحلة الأولى والمرحلة الثانية (السيتوكرومات P450 [CYP] 1A1 ، CYP1A2 ، و CYP1B1). [3،4] تعمل BaP والديوكسينات الخطرة على تنشيط AhR مع توليد أنواع الأكسجين التفاعلية القوية (ROS) ، والذي يتم التوسط فيه جزئيًا على الأقل بواسطة CYP1A1. علاوة على ذلك ، فإن الإجهاد التأكسدي الوسيط CYP1A 1- مسؤول عن إنتاج السيتوكينات المسببة للالتهابات ، مثل إنترلوكين (IL) -1 ، و IL -6 ، و IL -8 في البيئة الخلايا الكيراتينية البشرية المعالجة بالملوثات [3،5] ومع ذلك ، هناك عدد قليل جدًا من الدراسات حول التأثيرات السامة لـ PM2.5 على الخلايا الميلانينية. هنا ، قمنا بمعالجة خلايا سرطان الجلد البشري A375 بتركيزات مختلفة من PM2.5 للتحقق مما إذا كان PM2.5 يمكن أن يعزز تكوين الميلانين ، وعلاقته بإشارات AhR ، والإجهاد التأكسدي ، والاستجابة الالتهابية.
يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ولديه القدرة على البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.
انقر فوق ملحق Cistanche Tubulosa
【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】
تم جمع PM2.5 خلال فصل الشتاء (من ديسمبر إلى يناير) في بكين. تم استخدام جهاز أخذ العينات HY -1000 الذكي ذو التدفق الكبير للجسيمات المعلقة (TSP) (قاطع PM2.5 اختياري ، Qingdao Hengyuan Technology Development Co.، Ltd. ، تشينغداو ، الصين) لأخذ عينات من مرشح الكوارتز. تم غمر غشاء الكوارتز في 75 بالمائة من الإيثانول متبوعًا بالاهتزاز بالموجات فوق الصوتية. تم استخدام الماء المعقم لتحضير محلول مخزون عالي التركيز. تمت زراعة خلايا الورم الميلانيني البشري A375 في 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen Co.، Ltd. ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) التي تحتوي على مصل بقري جنيني (Gibco ، Life Technologies ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم علاج خلايا A375 بتركيزات مختلفة من PM2.5 (0 ، 1 0 0 ، 200 ، و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، وتم استخدام الخلايا للدراسات التالية. تم استخدام اختبار t للطالب غير المقيد وتحليل التباين أحادي الاتجاه للتحليل الإحصائي ، واعتبر P <0.05 ذو دلالة إحصائية.
للتحقيق في تأثير PM2.5 على خلايا A375 ، تم اكتشاف تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة CCK -8 (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) ، وتم اكتشاف موت الخلايا المبرمج باستخدام Annexin V fluorescein isothiocyanate / بروبيديوم يوديد (FITC / PI) مجموعة موت الخلايا المبرمج (Multisciences ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، بناءً على تعليمات الشركة المصنعة. أشارت النتائج إلى أن PM2.5 أظهر سمية خلوية تعتمد على التركيز لخلايا A375 ، لكنها لم تؤثر على موت الخلايا المبرمج [الشكل التكميلي 1 ، http://links.lww.com/ CM9 / A917].
تم استخدام طريقة هيدروكسيد الصوديوم لتحديد محتوى الميلانين. تم غسل خلايا PM2. 5- المعالجة A375 بمحلول ملحي فوسفاتي (PBS) ومحلول بالماء. تم الطرد المركزي للمحللات عند 12 ، 000 دورة / دقيقة لمدة 5 دقائق ، وغسلها بنسبة 1 0 في المائة من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (5 0 0 مل) (سيجما ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 75 في المائة من الإيثانول (500 مل) ، ثم توضيحها مرة أخرى. بعد ذلك ، تمت إضافة 50 مل من 1 مول / لتر NaOH المحتوي على 10 بالمائة ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى الحبيبات لمدة ساعة واحدة عند 80 درجة. تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر (OD 490) باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. نظرًا لأن TYR هو أهم إنزيم الميلانيني ، فقد اكتشفنا بعد ذلك نشاط TYR باستخدام اختبار ليفودوبا (L-DOPA). تم زرع ألواح Sixwell (Corning ، الولايات المتحدة الأمريكية) بخلايا A375 بكثافة 3105 خلية / بئر. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وحلها بنسبة 0.5 في المائة من ديوكسيكولات الصوديوم (سيغما). تم تقسيم المحللة إلى ثلاث مجموعات ، وأضيف 0.1 بالمائة L-DOPA (Sigma) إلى كل عينة. بعد 5 دقائق ، تم قياس OD 490 واستخدام 0.1 بالمائة L-DOPA كمعيار. قمنا أيضًا بقياس مستويات تعبير الرنا المرسال والبروتين في TYR. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RNeasy المصغرة (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO ، اليابان). بعد ذلك ، تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT- PCR) على Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO ، اليابان). يتم عرض الاشعال من Invitrogen في الجدول التكميلي 1 ، http: // links. lww.com/CM9/A917 ، وتم حساب مستوى التعبير لكل mRNA باستخدام طريقة 2 * DDCT. تم تحليل مستويات التعبير عن البروتين بواسطة النشاف الغربي. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وتم فصلها في محلول RIPA (بيوتايم ، الصين) يحتوي على فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (مزيج مثبط البروتياز ، 20: 1 ، سيجما ألدريتش). تم قياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (بيوتايم ، الصين). تم غلي البروتين الكلي عند 70 درجة لمدة 10 دقائق ، وفصله في 4٪ -12٪ هلام عند 200 فولت لمدة 40 دقيقة ، ثم نقله إلى غشاء عند 4 درجات باستخدام 120 مللي أمبير لمدة 75-100 دقيقة ، ثم حضنه بنسبة 5٪ حليب خالي الدسم لمدة ساعة. ثم تم فحص الأغشية باستخدام الأجسام المضادة لـ TYR ، ومضادات AhR ، ومضادة CYP1A1 ، والأجسام المضادة لـ CYP1B1 (Abcam) طوال الليل عند 4 درجات. تم استخدام الجسم المضاد IgG المترافق مع بيروكسيداز الفجل (Proteintech ، الولايات المتحدة الأمريكية) كجسم مضاد ثانوي. أشارت النتائج إلى أن PM2.5 زاد محتوى الميلانين ونشاط TYR بطريقة تعتمد على الجرعة. تم تنظيم مستويات التعبير عن كل من الرنا المرسال والبروتين في TYR [الشكل التكميلي 2 A-D ، http://links.lww.com/CM9/A917].
يمكن لـ PM2.5 تنظيم نشاط TYR عن طريق تنشيط مسار AhR. لتحديد ما إذا كان PM2.5 يؤثر على إشارات AhR ، اكتشفنا مستويات النسخ لـ AhR وجيناتها الكلاسيكية المصب CYP1A1 و CYP1B1 بواسطة qRT-PCR والنشاف الغربي. أظهرت النتائج أن PM2.5 نظم مستويات تعبير mRNA لـ AhR و CYP1A1 ، بالإضافة إلى تعبير البروتين لـ CYP1A1 [الشكل التكميلي 2 E-G ، http://links.lww.com/ CM9 / A917].
يؤدي تنشيط AhR إلى توليد ROS ، والذي يمكن أن يزيد أيضًا من نشاط TYR. [5] ومن ثم ، قمنا بتقييم إنتاج ROS باستخدام 2 0 ، 70 - ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلورسين (DCFHDA) وقياس التدفق الخلوي. بعد 24 ساعة من العلاج باستخدام PM2.5 ، تم تحضين خلايا A375 باستخدام DCFH-DA (5 مليمول / لتر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة في الظلام. تم غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني ، وتم قياس التألق بواسطة مقياس التدفق الخلوي. تم قياس شدة الفلورة المتوسطة باستخدام برنامج FACS Diva 6.0 (BD Bioscience ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). نظرًا لأنه يُعتقد أن إنتاج CYP1A 1- المستحث لـ ROS مسؤول عن الاستجابة الالتهابية ، [5] مستويات تعبير mRNA للسيتوكينات المسببة للالتهابات (IL -1 a ، IL -6 ، IL { تم قياس {19}} ، وعامل نخر الورم [TNF] -a). لقد وجد أن PM2.5 زاد من إنتاج ROS ، بالإضافة إلى مستويات IL -1 a و IL -6 و IL -8 mRNA في خلايا A375 [الشكل التكميلي 2 H و I ، http : // الروابط. lww.com/CM9/A917].
أشارت نتائج هذه الدراسة إلى أن PM2.5 عزز تكوين الميلانين ، وزاد من نشاط وتعبير TYR في خلايا A375. علاوة على ذلك ، يمكن لـ PM2.5 تنشيط إشارات AhR ، والحث على الإجهاد التأكسدي والاستجابة الالتهابية ، والتي قد تكون سلسلة إشارات صباغية مسؤولة عن فرط التصبغ.
شكر وتقدير
نعرب عن خالص امتناننا لما يلي: الأستاذ الدكتور ماسوتاكا فوريو والبروفيسور الدكتور تسوجي جاكو من مستشفى جامعة كيوشو الذين قاموا بتحسين المخطوطة وساعدوا في المعلومات المتعلقة بـ AhR. نحن ممتنون أيضًا للتحرير باللغة الإنجليزية الذي قدمه الأستاذ الدكتور روبرت شوارتز من كلية الطب روتجرز نيو جيرسي.
التمويل
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 2101000271).
تضارب المصالح
لا أحد.
مراجع
Peng F ، Xue CH ، Hwang SK ، Li WH ، Chen Z ، Zhang JZ. التعرض للجسيمات الدقيقة المرتبطة بالشيخوخة عند النساء الصينيات: دراسة مقطعية. J يور أكاد ديرماتول فينيرول 2016 ؛ 31: 355-360. دوى: 10.1111 / jdv.13834.
شي Y و Zeng Z و Liu J و Pi Z و Zou P و Deng Q وآخرون. تعزز المادة الجسيمية فرط التصبغ عن طريق تنشيط إشارات AhR / MAPK وعن طريق زيادة مستويات paracrine a-MSH في الخلايا الكيراتينية. إنفيرون بولوت 2021 ؛ 278: 116850. دوى: 10.1016 / j.envpol.2021. 116850.
Peng F، Tsuji G، Zhang JZ، Chen Z، Furue M. الدور المحتمل لـ PM2.5 في تكوين الميلانين. إنفيرون إنت 2019 ؛ 132: 105063. دوى 10.1016 / ي. envint.2019.105063.
Napolitano M، Patruno C. مستقبل الهيدروكربونات (AhR) هدف محتمل لعلاج الأمراض الجلدية. فرضيات ميد 2018 ؛ 116: 96-100. دوى: 10.1016 / j.mehy.2018.05.001.
ديجكوف إم ، دراسلر ب ، كاراكوجاك BB ، بيتري فينك أ ، فالاتشي جي ، إيمان إم ، وآخرون. تأثير الجسيمات المحمولة جواً على الجلد: مراجعة منهجية من علم الأوبئة إلى الدراسات المختبرية. جزء الألياف توكسيكول 2020 ؛ 17:35. دوى 10.1186 / ثانية 12989-020-00366- ذ.
【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】
