ينظم FOXO التعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات ويعزز بلعمة الخلايا الدموية في مناعة الروبيان المضادة للبكتيريا
Aug 31, 2023
خلاصة
تعتمد اللافقاريات على المناعة الفطرية، بما في ذلك المناعة الخلطية والخلوية، لمقاومة العدوى المسببة للأمراض. أظهرت الدراسات السابقة أن عامل نسخ صندوق الشوكة O (FOXO) يشارك في الاستجابات المناعية المخاطية للثدييات وتنظيم المناعة الخلطية المعوية لللافقاريات. ومع ذلك، ما إذا كان FOXO متورطًا في تنظيم المناعة الجهازية والخلوية في اللافقاريات لا يزال غير معروف. في الدراسة الحالية، حددنا FOXO من الجمبري (Marsupenaeus japonicus) ووجدنا أنه تم التعبير عنه بمستويات قاعدية نسبيًا في الجمبري العادي، ولكن تم تنظيمه بشكل كبير في الجمبري الذي يتحدى Vibrio anguillarum. لعب FOXO دورًا حاسمًا في الحفاظ على توازن الدملمف والميكروبات المعوية من خلال تعزيز التعبير عن Relish، وهو عامل النسخ لمسار نقص المناعة (IMD) للتعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) في الجمبري. لقد وجدنا أيضًا أن العدوى المسببة للأمراض قامت بتنشيط FOXO وتسببت في إزاحتها النووية عن طريق تقليل نشاط سيرين / ثريونين كيناز AKT. في النواة، ينظم FOXO المنشط بشكل مباشر التعبير عن جينات Amp وRelish المستهدفة ضد العدوى البكتيرية. علاوة على ذلك، تم التعرف على FOXO على أنه متورط في المناعة الخلوية من خلال تعزيز بلعمة الخلايا الدموية من خلال تنظيم التعبير عن مستقبل زبال البلعمة C (Src)، واثنين من GTPases الصغيرة، Rab5 وRab7، المرتبطين بتهريب الجسيم البلعمي إلى الليزوزوم. في السيتوبلازم. مجتمعة، أشارت نتائجنا إلى أن FOXO يمارس آثاره على توازن الدملمف والميكروبات المعوية عن طريق تنشيط مسار IMD في الجمبري الطبيعي، وتعزيز تعبير AMP بشكل مباشر أو غير مباشر وتعزيز البلعمة للخلايا الدموية ضد مسببات الأمراض في الروبيان المصاب بالبكتيريا. كشفت هذه الدراسة عن وظائف FOXO المختلفة في المناعة المخاطية (المحلية) والجهازية المضادة للبكتيريا لدى اللافقاريات.
فوائد ملحق cistanche-كيفية تقوية جهاز المناعة
انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity
【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
مقدمة
تشارك بروتينات عائلة عامل نسخ صندوق الشوكة O (FOXOs) في العديد من العمليات البيولوجية الحرجة للكائنات الحية، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية، وإصلاح الحمض النووي التالف، والمناعة المضادة للسرطان، وتنظيم مدى الحياة [1،2]. تحتوي الثدييات على أربعة بروتينات فوكسو مختلفة (FOXO1، FOXO3، FOXO4، وFOXO6)؛ ومع ذلك، فإن اللافقاريات تحتوي على FOXO واحد فقط، والذي يُعرف أيضًا باسم Daf-16 في Caenorhabditis elegans [3]. يتم تنظيم نشاط النسخ لـ FOXO من خلال عدة أنواع من تعديلات ما بعد الترجمة، مثل الفسفرة، والأستلة، والميثيل، والتواجد في كل مكان [4]. تؤثر هذه التعديلات على الإزاحة النووية لـ FOXO أو الخروج من النواة، وتفاعلها مع المثبطين المشاركين والمنشطين المشاركين، والتي يمكن أن تعزز أو تقلل من نشاط FOXO وتتوسط وظائفها البيولوجية المختلفة [5،6]. بعد التنشيط، يشارك FOXO في العديد من الوظائف الفسيولوجية من خلال تنظيم نسخ مجموعة متنوعة من الجينات المستهدفة [7]. يتم تنشيط FOXOs بواسطة محفزات مختلفة خارج الخلية، بما في ذلك عوامل النمو والسيتوكينات والهرمونات [8]. تتفاعل إشارات النمو، مثل الأنسولين أو عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1)، مع مستقبلات مسار الأنسولين وتنشط إشارات فسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)، مما يؤدي إلى فسفرة FOXO بواسطة سيرين / ثريونين كيناز، بروتين كيناز ب (AKT) [9]. ينتقل FOXO المفسفر من النواة إلى العصارة الخلوية، أو يمنع انتقاله من العصارة الخلوية إلى النواة، حيث يصبح منتشرًا في كل مكان، مما يؤدي إلى تدهوره بواسطة البروتيازوم [10]. على النقيض من ذلك، في غياب إشارات النمو الخارجية، يكون مسار إشارات PI3K-AKT غير نشط، وينتقل FOXO غير المفسفر إلى النواة لتعزيز نسخ الجينات المستهدفة [11]. يشارك FOXO أيضًا في الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للبكتيريا والفيروسات لدى اللافقاريات [12،13]. يؤدي التنشيط المزمن لـ FOXO في أمعاء ذبابة الفاكهة المتقادمة إلى قمع التعبير عن بروتين التعرف على الببتيدوغليكان SC2 (منظم سلبي لمسار نقص المناعة (IMD)) ويكسر التوازن المناعي المعوي [14]. ينظم FOXO بشكل مباشر جينات الببتيد المضادة للميكروبات (AMP) في الأنسجة الظهارية لذبابة الفاكهة غير المصابة استجابةً لضغط الجوع، وهو مستقل عن مسارات المناعة الفطرية المستجيبة للعوامل الممرضة [15]. ومع ذلك، يمكن للعدوى المسببة للأمراض أيضًا أن تحفز الخلية المعوية FOXO على دخول النواة من السيتوبلازم مباشرة في أمعاء ذبابة الفاكهة [12]. يحدث تنظيم AMPs المعتمد على FOXO أيضًا في الأنسجة الظهارية للثدييات، مما يشير إلى أن هذا محفوظ تطوريًا في الحيوانات [16]. أظهرت العديد من الدراسات أن FOXOs يتم تنشيطها بواسطة مسببات الأمراض أو تحفيز السيتوكينات في الاستجابات المناعية المخاطية [17]. يتم تحفيز انتقالها إلى النواة وارتباطها بمروجين الجينات المستهدفة عن طريق مسار كيناز البروتين المنشط للميتوجين (MAP) ويتم تثبيته بواسطة مسار PI3K/AKT. تشمل الجينات المستهدفة لـ FOXOs جزيئات الإشارة المؤيدة للالتهابات، وجزيئات الالتصاق، ومستقبلات الكيموكين [17]. ما إذا كانت FOXOs متورطة في الاستجابات المناعية الجهازية ضد مسببات الأمراض لا تزال غير واضحة. يعد تعزيز التعبير عن AMPs ضد مسببات الأمراض آلية مهمة للمناعة الفطرية الخلطية في اللافقاريات [18]. في المناعة الفطرية لذبابة الفاكهة، تشارك مسارات Toll وIMD في تنظيم تعبير AMP، وتلعب AMPs أدوارًا مهمة في القضاء على مسببات الأمراض الغازية [19-21]. على غرار مناعة الحشرات، تشارك مسارات Toll وIMD وJanus kinase (JAK)/محول الإشارة ومنشط النسخ (STAT) في تنظيم تعبير AMP في القشريات [22،23]. ما إذا كان بإمكان FOXO تنظيم التعبير عن AMPs بشكل مستقل عن مسارات Toll و IMD و JAK / STAT ضد عدوى مسببات الأمراض في القشريات يتطلب توضيحًا. بالإضافة إلى المناعة الخلطية، تعتمد اللافقاريات أيضًا على المناعة الخلوية لأداء وظائف المناعة الفطرية ضد عدوى مسببات الأمراض. تعد البلعمة بواسطة الخلايا الدموية إحدى الآليات المهمة للمناعة الخلوية ضد عدوى مسببات الأمراض [24]. لقد وجدت الدراسات السابقة أن الالتهام الذاتي بوساطة FOXO1- ضروري لتطوير الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) [25]. علاوة على ذلك، يشارك FOXO في تعزيز البلعمة البكتيرية بواسطة العدلات [26]. على الرغم من عدم وجود خلايا مناعية متخصصة في القشريات، مثل خلايا NK أو العدلات، إلا أن الخلايا الدموية في الجمبري يمكنها ممارسة مناعة فطرية جهازية ضد عدوى البكتيريا المسببة للأمراض عن طريق البلعمة [27]. ومع ذلك، ما إذا كان FOXO يشارك في البلعمة المسببة للأمراض من الكريات الدموية في الجمبري غير واضح. تعتبر تربية الجمبري واحدة من أسرع الصناعات نموا في العالم لإنتاج البروتينات الحيوانية وقد ساهمت بشكل كبير في تلبية الطلب المتزايد في جميع أنحاء العالم على البروتينات الحيوانية. يبلغ الإنتاج العالمي من الجمبري حاليًا حوالي 4.88 مليون طن بقيمة تبلغ حوالي 39 مليار دولار أمريكي [28]. ومع ذلك، فإن تربية أعداد كبيرة من الحيوانات معًا تؤدي إلى إجهاد حيواني كبير، مما يسهل مسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات، والتكاثر والأمراض السريرية، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية كبيرة للصناعة [29]. يمكن لدراسات آليات مناعة الجمبري أن توفر استراتيجيات جديدة للوقاية من الأمراض ومكافحتها [30]. في الدراسة الحالية، حددنا FOXO في جمبري كوروما (Marsupenaeus japonicus). بعد ضربة قاضية لتعبير Foxo، وتحدي Vibrio anguillarum، وجدنا أن قدرة إزالة البكتيريا ومعدل بقاء الروبيان انخفض بشكل ملحوظ. أشارت دراسة أخرى إلى أن FOXO عزز التعبير عن AMPs بشكل مباشر أو غير مباشر، وعزز بلعمة البكتيريا في الجمبري. تم تحليل الآليات المحتملة لتأثيرات FOXO ضد العدوى المسببة للأمراض في الجمبري.
cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي
نتائج
يتم التعبير عن FOXO بمستويات قاعدية في الجمبري غير المتحد ويتم تنظيمه في الجمبري المتحدى بـ V. anguillarum
من تسلسل نسخة الكريات الدموية لـ M. japonicus، حصلنا على تسلسل [كدنا] كامل الطول لـ Foxo (رقم وصول GenBank: MW080526). أظهرت مقارنة المجال أن بروتين FOXO المتوقع له مجال Forkhead (FH)، والذي يشبه Homosapiens FOXOs بما في ذلك FOXO1 وFOXO3 وFOXO4 وFOXO6، ويحمل فسفرة AKT مماثلة (الشكل S1A). أظهرت نتائج التحليل التطوري أن FOXOs تم تقسيمها إلى مجموعتين بما في ذلك FOXOs الفقارية واللافقارية، وتم تجميع الروبيان FOXO في فرع اللافقاريات في شجرة التطور (S1B الشكل). على غرار FOXOs البشرية [31]، يحتوي الروبيان FOXO على مواقع تعديل فسفرة الكيناز (ERK) الخاضعة للتنظيم خارج الخلية ومواقع تعديل أسيتيل بروتين CREB Binding Protein (CBP)، ولكن لا يحتوي على مواقع تعديل نزع الأسيتيل Sir tuin 1 (SIRT1) ومحطة c-JUN N مواقع تعديل الفسفرة كيناز (JNK) (S2 الشكل). تم تحضير الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تتعرف على الروبيان FOXO باستخدام مجال FH المؤتلف لـ FOXO المعبر عنه في الإشريكية القولونية (الشكل 1A). كشف تحليل توزيع أنسجة FOXO على مستويات الرنا المرسال والبروتين أنه تم التعبير عنه في جميع الأنسجة التي تم اختبارها (الشكل 1 ب). تم تحليل المسار الزمني لتعبير FOXO في الخلايا الدموية وأمعاء الروبيان التي تحدىها V. anguillarum باستخدام qPCR والنشاف الغربي. أظهرت النتائج أن FOXO تم تنظيمه في الخلايا الدموية والأمعاء على مستوى الرنا المرسال (الشكل 1C و1D) وعلى مستوى البروتين (الشكل 1E و1F). تشير هذه النتائج إلى أن FOXO متورط في الاستجابة لعدوى V. anguillarum ودفعتنا إلى استكشاف وظيفة FOXO في مناعة الجمبري.
تشارك FOXO في تنظيم التوازن للدملمف والبكتيريا المعوية في الجمبري الصحي
لاستكشاف وظيفة FOXO في توازن الدملمف والبكتيريا المعوية في الجمبري، تم إجراء تدخل الحمض النووي الريبي (RNA) وتم تحليل الحمل البكتيري. أظهرت النتائج أن التعبير عن Foxo انخفض بشكل ملحوظ في جمبري Foxo-RNAi (الشكل 2A و2B). تم أيضًا تحليل التأثيرات غير المستهدفة لـ Foxo RNAi من خلال الكشف عن تعبير جينات عائلة Fox الأخرى (بما في ذلك Foxk2 وFoxn3). أظهرت النتائج أن ضربة قاضية Foxo لم تقلل من مستويات التعبير عن Foxk2 أو Foxn3 (S3A – S3C Fig). باستخدام النشاف الغربي ومقايسات الكيمياء المناعية الفلورية، لاحظنا أيضًا التوزيع تحت الخلوي لـ FOXO في الأمعاء وخلايا الدم في الروبيان التي تتحدى البكتيريا بعد إسكات Foxo. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع مجموعة dsGfp، انخفض مستوى FOXO في النواة بشكل ملحوظ في جمبري Foxo-RNAi، حتى لو كان الجمبري مصابًا بـ V. anguillarum (S3D – S4E 'Figs). تشير جميع النتائج المذكورة أعلاه إلى أن اختبار Foxo RNAi الخاص بنا يمكن أن يُسكت Foxo على وجه التحديد في الخلايا الدموية والأمعاء (بما في ذلك السيتوبلازم والنواة). بعد ذلك، قمنا بتحليل الحمل البكتيري في الدملمف والأمعاء بعد ضربة قاضية للفوكسو في الجمبري في الظروف العادية (بدون تحدي بكتيري). أظهرت النتائج أن عدد البكتيريا في الدملمف والأمعاء زاد بشكل ملحوظ بعد القضاء على تعبير Foxo بنجاح (الشكل 2C و2D). قمنا أيضًا بتحليل معدل بقاء جمبري Foxo-RNAi دون تحدي بكتيري، وأظهرت النتائج أن معدل بقاء جمبري Foxo-knockdown انخفض بشكل ملحوظ مقارنةً بمعدل التحكم (الشكل 2E). لمزيد من التحقق من هذه النتائج، قمنا بتحليل معدل البقاء على قيد الحياة للروبيان Foxo-RNAi المعالج بالمضادات الحيوية وأظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع مجموعة dsGfp، لم ينخفض معدل البقاء على قيد الحياة للروبيان الخالي من الجراثيم بشكل ملحوظ (الشكل 2F). تشير جميع النتائج إلى أن FOXO يلعب دورًا في توازن الكائنات الحية الدقيقة في الجسم الحي (بما في ذلك الدملمف والميكروبات المعوية) في الروبيان في الظروف العادية.
فوائد مكملات cistanche - زيادة المناعة
تشارك FOXO في تنظيم توازن الدملمف والبكتيريا المعوية من خلال تعزيز تعبير Relish وAmp في الروبيان الصحي
أظهرت الدراسات السابقة أن الجمبري الصحي يحتوي على أعداد منخفضة ولكن ثابتة من البكتيريا في الدملمف الدموي، وكميات عالية وإن كانت ثابتة من البكتيريا في الجهاز الهضمي، والمؤثرات المناعية، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) التي ينظمها العامل النووي كابا ب (NF). -κB) يلعب المسار وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي ينظمها مسار الأكسيداز المزدوج (DUOX) دورًا أساسيًا في الدملمف المتوازن والميكروبات المعوية [32-34]. لاستكشاف آلية مشاركة FOXO في تنظيم توازن الدملمف والبكتيريا المعوية في ظل الظروف العادية، اكتشفنا أولاً التوزيع تحت الخلوي لـ FOXO في خلايا الدم والأمعاء في ظل الظروف العادية. أظهرت النتائج إشارة ضعيفة لـ FOXO في نوى خلايا الدم الروبيان وخلايا الأمعاء في ظل الظروف العادية (الشكل 3A و3B)، مما يشير إلى أنه تم تنشيط القليل من FOXO بواسطة الكائنات الحية الدقيقة في الجسم الحي في الروبيان في الظروف العادية. يتم تنظيم تعبير AMP بواسطة مسار IMD في أمعاء ذبابة الفاكهة [35]. لذلك، افترضنا أن عامل النسخ Relish قد يكون الجين المستهدف لـ FOXO. لقد اكتشفنا تعبير mRNA لـ Relish، وهو عامل النسخ لمسار IMD، في خلايا الدم الحمراء والأمعاء بعد القضاء على Foxo. أظهرت النتائج أن تعبير Relish انخفض بشكل ملحوظ في جمبري Foxo-knockdown (الشكل 3C و3D)، وتم الحصول على نتائج مماثلة على مستوى البروتين (الشكل 3E و3E'). تشير النتائج إلى أن FOXO يمكن أن يعزز التعبير عن المذاق وينشط مسار IMD. للتأكد من مشاركة FOXO في توازن الدم الليمفاوي والجهاز الهضمي من خلال إشارات IMD، تم الحصول على جمبري خالٍ من الجراثيم (الشكل 3F) وتم اكتشاف تنشيط RELISH وتعبير AMP. بالمقارنة مع تلك الموجودة في السيطرة، انخفضت كمية FOXO وRELISH في نوى الخلايا المعوية والخلايا الدموية بشكل ملحوظ (الشكل 3G و3H). وفي الوقت نفسه، تم فحص التعبير عن AMPs، بما في ذلك Crustins (CrusI-2 إلى 5) والعوامل المضادة للسكاريد الدهني (Alf A1 وB1 وC1 وD1 وE1)، والتي ربما يتم تنظيمها بواسطة FOXO و/أو RELISH في الجرثومة - خالي من الروبيان، وأظهرت النتائج أن تعبير CrusI -3 و Alf-B1 و Alf-C1 انخفض بشكل ملحوظ في خلايا الدم والأمعاء في الجمبري (الشكل 3I و3J). بالنظر إلى أن التعبير عن Alf-B1 و Alf C1 تم تنظيمه بواسطة مسار IMD [36]، تشير هذه النتائج إلى أن FOXO يشارك في تنظيم توازن الدملمف والجهاز الهضمي في ظل الظروف العادية من خلال مسار IMD لتعزيز التعبير عن أمبير.
الشكل 1. تم تنظيم FOXO في الروبيان الذي تحدىه V. anguillarum. (أ) التعبير المؤتلف عن مجال FH لـ FOXO في E. coli والنشاف الغربي للكشف عن FOXO باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد FOXO المحضرة في الأرانب. الخط 1، إجمالي بروتينات الإشريكية القولونية مع Foxo-pGEX4T-1. الخط 2، البروتينات الكلية للبكتيريا بعد تحريض IPTG. الخط 3، FOXO المؤتلف المنقى. تم اكتشاف الخط 4، FOXO في أمعاء الجمبري غير المعالج باستخدام النشاف الغربي. M، علامات الكتلة الجزيئية للبروتين. (ب) تم الكشف عن توزيع أنسجة Foxo عند مستويات mRNA (اللوحة العلوية) والبروتين (اللوحة السفلية) بواسطة RT-PCR والنشاف الغربي، على التوالي. ACTB هو اختصار لـ -actin. (C، D) تم تحليل أنماط التعبير mRNA لـ Foxo في الخلايا الدموية (C) والأمعاء (D) بواسطة qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin وEf -1 كجينات تحكم داخلية. (E، F) تم الكشف عن أنماط التعبير البروتيني لـ FOXO في الخلايا الدموية (E) والأمعاء (F) بواسطة النشاف الغربي. تم عرض نتائج التحليل الإحصائي لثلاث مكررات في اللوحات السفلية. تمت ترقيم النطاقات الموجودة على اللطخة الغربية باستخدام برنامج ImageJ عن طريق مسح النطاقات من ثلاث مكررات مستقلة. تم التعبير عن مستويات التعبير النسبي لـ FOXO / -actin على أنها متوسط ± SD، وتم تعيين قيمة روبيان التحكم كواحد. تشير أشرطة الخطأ في الشكل إلى SDs (ثلاث مكررات).
يتم تنشيط FOXO في الجمبري بواسطة تحدي V. anguillarum ويشارك في إزالة مسببات الأمراض من الدملمف والأمعاء
يُذكر أنه يمكن تنشيط FOXO عن طريق التحفيز البكتيري أو السيتوكيني ويتم نقله إلى النواة لتنظيم التعبير عن بعض الجينات المستهدفة في الثدييات [17]. لاكتشاف ما إذا كان قد تم تنشيط FOXO في الروبيان الذي تتحدى البكتيريا، تم تحليل التوزيع دون الخلوي لـ FOXO في أمعاء الروبيان باستخدام النشاف الغربي. أظهرت النتائج أن كمية FOXO في سيتوبلازم الخلايا المعوية انخفضت تدريجياً من 2 إلى 4 ساعات بعد تحدي V. anguillarum (الشكل 4A). في المقابل، زادت كمية FOXO في نواة خلايا الأمعاء بشكل ملحوظ بعد الإصابة بـ V. anguillarum (الشكل 4B). لتحليل دور FOXO في المناعة الجهازية، تم استخدام اختبار كيميائي مناعي فلوري لمراقبة الانتقال النووي لـ FOXO في خلايا الدم من الروبيان بعد ساعتين من تحفيز اللاروم السنوي. لقد وجدنا أن انتقال FOXO الناجم عن التحدي البكتيري إلى النواة زاد بشكل ملحوظ ولكن لم يكن هناك تغيير واضح في الروبيان الذي يتحدى PBS (الشكل 4C و4C'). لاستكشاف ما إذا كان FOXO المنقول نوويًا متورطًا في إزالة مسببات الأمراض، قمنا بتحليل الحمل البكتيري في الدملمف والأمعاء في جمبري Foxo-knockdown عند 6 ساعات بعد التحدي البكتيري. لقد وجدنا أنه بعد القضاء على Foxo، زاد حمل البكتيريا في الدملمف والأمعاء بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في مجموعات التحكم (الشكل 4D). علاوة على ذلك، انخفض معدل البقاء على قيد الحياة للجمبري Foxo-knockdown المصاب بـ V. anguillarum بشكل ملحوظ مقارنةً بمعدل التحكم (الشكل 4E). أشارت هذه النتائج إلى تنشيط FOXO في الخلايا المعوية والخلايا الدموية، واقترحت أن FOXO يشارك في الاستجابات المناعية المحلية والجهازية ضد العدوى البكتيرية.
الشكل 2. يشارك FOXO في الاستجابات المناعية المعوية (المحلية) والجهازية المضادة للبكتيريا. (A، B) كفاءة Foxo-RNAi في الخلايا الدموية (A) والأمعاء (B) من الجمبري، على النحو المحدد باستخدام qPCR (A) والنشاف الغربي (B). تحليل تاريخ qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin وEf -1 كجينات تحكم داخلية. تظهر أشرطة الخطأ SD. (ج) الكشف عن بكتيريا الدملمف في جمبري فوكسو ضربة قاضية بواسطة ثقافة LB الصلبة (ثلاث مرات)؛ تم استخدام حقن dsGfp كعنصر تحكم. وكانت نسبة التخفيف 1:10. (د). عدد البكتيريا في الدملمف والأمعاء في الروبيان ضربة قاضية Foxo والروبيان حقن dsGfp دون التحدي البكتيري. (هـ). معدل بقاء جمبري Foxo-RNAi دون تحدي بكتيري. تم استخدام حقن dsGfp كعنصر تحكم. (F). معدل بقاء الروبيان Foxo-RNAi المعالج بالمضادات الحيوية. تم استخدام حقن dsGfp كعنصر تحكم. طبيعي: الجمبري من النوع البري لا يعالج بالمضادات الحيوية.
الشكل 3. تنتقل الكمية الأساسية من FOXO إلى نوى الخلايا الدموية وخلايا الأمعاء لتعزيز تعبير Relish ومن ثم تنشيط مسار IMD لتنظيم الدملمف وتوازن الكائنات الحية الدقيقة المعوية في ظل الظروف العادية. (أ) تم استخدام الكيمياء المناعية للكشف عن توزيع FOXO تحت الخلوي في خلايا الدم في الجمبري الطبيعي. شريط النطاق=20 ميكرومتر. قبرصي: السيتوبلازم. نو: النواة. (ب) تم استخدام النشاف الغربي للكشف عن توزيع FOXO تحت الخلوي في خلايا الأمعاء من الجمبري الطبيعي والروبيان المصاب بـ V. anguillarum. ( C ) تم اكتشاف تعبير Relish على مستوى mRNA في خلايا الدم من الروبيان بعد ضربة قاضية لـ Foxo بواسطة qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin و Ef -1 كجينات تحكم داخلية. ( D ) تم اكتشاف تعبير Relish على مستوى mRNA في أمعاء الجمبري بعد ضربة قاضية لـ Foxo بواسطة qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin و Ef -1 كجينات تحكم داخلية. (E) تم اكتشاف مستوى RELISH باستخدام النشاف الغربي في الجمبري بعد ضربة قاضية لـ Foxo. (E') تم ترقيم ثلاث مكررات من اللوحة E باستخدام برنامج ImageJ. (F) الحمولة البكتيرية من الدملمف والأمعاء في الروبيان 24 ساعة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. (G) تم اكتشاف FOXO في النواة باستخدام النشاف الغربي في الخلايا الدموية وأمعاء الروبيان على مدار 24 ساعة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. (H) تم اكتشاف RELISH في النواة باستخدام النشاف الغربي في خلايا الدم الروبيان والأمعاء عند 24 ساعة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. (I، J) تم تحديد تعبير Amps في الخلايا الدموية (I) والأمعاء (J) للروبيان الخالي من الجراثيم بواسطة qPCR باستخدام -actin وEf -1 كجينات مرجعية داخلية. تم استخدام الجمبري الطبيعي (حقن H2O) كعنصر تحكم.
أشارت الدراسات السابقة إلى أن نشاط النسخ FOXO يتم تنظيمه عن طريق تعديل الفسفرة وأن سيرين / ثريونين كيناز AKT ينظم نشاط عوامل نسخ Forkhead عن طريق الفسفرة وتثبيط إزاحتها غير الواضحة [9،37]. لمعرفة ما إذا كانت زيادة FOXO في النواة بعد الإصابة بالبكتيريا المسببة للأمراض تتأثر بـ AKT، اكتشفنا أولاً محتوى FOXO في السيتوبلازم والنواة عن طريق النشاف الغربي بعد ضربة قاضية لـ Akt من الروبيان. أظهرت النتائج أن كمية FOXO في نواة الخلايا الدموية والخلايا المعوية زادت بشكل ملحوظ بعد ضربة قاضية لتعبير Akt (الشكل 5A و5B) في الروبيان بعد ساعتين من الإصابة بـ V. anguillarum (الشكل 5C و5C'). للتحقق من النتائج التجريبية، استخدمنا أيضًا اختبار الكيمياء المناعية لمراقبة التوزيع دون الخلوي لـ FOXO في خلايا الدم في الجمبري بعد ضربة قاضية لـ Akt. أظهرت النتائج أن FOXO زاد بشكل ملحوظ في نواة الخلايا الدموية عندما أسقط Akt ساعتين بعد الإصابة بـ V. anguillarum (الشكل 5D و5D'). لاستكشاف ما إذا كانت عدوى العامل الممرض تؤثر على نشاط AKT، اكتشفنا تغير الفسفرة في AKT بعد الإصابة بالعامل الممرض باستخدام الجسم المضاد p-AKT (Ser473) البشري (موقع الفسفرة في الروبيان AKT هو Ser486) ووجدنا أن مستوى AKT المفسفر انخفض بشكل ملحوظ في الخلايا الدموية وأمعاء الجمبري بعد 30 دقيقة من الإصابة بالـ V. anguillarum (الشكل 5E و5F). تشير هذه النتائج إلى أن العدوى المسببة للأمراض يمكن أن تقلل من مستوى AKT المفسفر، مما يثبط نشاط الإنزيم ويقلل من قدرة AKT على فسفرة FOXO. يدخل FOXO غير المفسفرة إلى النواة ويحث على التعبير عن الجينات المستهدفة. يشير الشكل إلى SD.
مستخلص سيستانش
تقلل عدوى العوامل المسببة للأمراض من نشاط AKT وتحفز الإزاحة النووية لـ FOXO
يمارس FOXO دفاعًا مناعيًا ضد البكتيريا الغازية عن طريق تنظيم التعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات في الجمبري المصاب بالبكتيريا
لاستكشاف الآلية التي يؤثر بها FOXO على الاستجابة ضد العدوى البكتيرية في الجمبري، حددنا أولاً جينات المستجيب المناعي التي ينظمها FOXO. بعد الضربة القاضية الناجحة لـ Foxo في الخلايا الدموية وأمعاء الجمبري مع أو بدون تحدي V. anguillarum، انخفضت مستويات التعبير عن CrusI-3 وAlf-B1 وAlf-C1 وAlf-E1 بشكل ملحوظ في الجمبري الصامت مقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 6A و6B). لمزيد من التحقق من النتائج، اكتشفنا أيضًا تعبير أربعة AMP بعد ضربة قاضية لـ Akt. وأظهرت النتائج أن التعبير عن AMPs الأربعة زاد بشكل ملحوظ 6 ساعات بعد الإصابة بـ V. anguil larum مقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 6C و 6D). بالمقارنة مع AMPs المنتظمة (بما في ذلك Alf-B1 وAlf-C1) في ظل الحالة الطبيعية (الشكل 3I و3J)، تم أيضًا تنظيم الجين الإضافي لـ AMPs (CrusI-3، Alf-E1) في الجمبري المصاب بـ V anguillarum (الشكل 6A و6B). أشارت دراستنا السابقة إلى أن RELISH عزز تعبير Alf-B1 وAlf-C1 في الجمبري [36]. تشير هذه النتائج إلى أن FOXO قد ينظم تعبير AMP بشكل مباشر، مثل CrusI-3 وAlf-E1، بشكل مستقل عن طريقة مسار إشارات IMD. لتأكيد الفرضية، تم إجراء اختبار ChIP لاكتشاف ما إذا كان FOXO يمكنه الارتباط بمروج Alf-E1. تم الحصول على تسلسل المروج لـ Alf-E1 (الشكل S4) وتم التنبؤ بمواقع ربط FOXO (الشكل 6E). أظهرت نتيجة ChIP أن FOXO يمكن أن يرتبط بمروج Alf-E1 (الشكل 6F). تشير هذه النتائج إلى أن FOXO يشارك أيضًا في المناعة المضادة للبكتيريا من خلال التنظيم المباشر للتعبير عن AMPs في الجمبري.
الشكل 4. تم نقل FOXO إلى النواة في الجمبري الذي يتحدى V. anguillarum. (أ، ب) أنماط توزيع FOXO في السيتوبلازم (A) والنواة (B) لخلايا الأمعاء من الروبيان التي تتحدى البكتيريا، كما تم تحليلها باستخدام النشاف الغربي (الألواح السفلية من A و B). تمت ترقيم نطاقات النشاف الغربي باستخدام برنامج ImageJ عن طريق مسح النطاقات من ثلاث مكررات. تم التعبير عن مستويات التعبير النسبي لـ FOXO/-actin أو FOXO/Histone 3 على أنها متوسط ± SD، وتم تعيين قيمة روبيان التحكم كواحد. (C) الإزاحة النووية لـ FOXO في خلايا الدم من الروبيان لمدة ساعتين بعد V. تم الكشف عن تحدي anguillarum باستخدام المقايسات الكيميائية المناعية الفلورية. تم استخدام حقن PBS كعنصر تحكم. شريط النطاق=20 ميكرومتر. (C') التحليل الإحصائي للوحة C تم تحليل التوطين المشترك للنواة الملطخة بـ FOXO و DAPI في الخلايا الدموية بواسطة برنامج WCIF ImageJ. (د) عدد البكتيريا في الدملمف والأمعاء من الروبيان ضربة قاضية فوكسو يتبع حقن أنغيلاروم؛ تم استخدام حقن dsGfp في الروبيان بعد الحقن البكتيري كعنصر تحكم. (E) معدل بقاء جمبري Foxo-RNAi المصاب بـ V. anguillarum. تم استخدام حقن dsGfp كعنصر تحكم.
يعزز FOXO البلعمة للخلايا الدموية ضد البكتيريا من خلال تعزيز تعبير SRC
أفادت الدراسات السابقة أن FOXO يتفاعل مباشرة مع مناطق المروج لـ CXCR2 وCD11b لتنظيم بلعمة العدلات في الثدييات [26]. لاختبار ما إذا كان FOXO مرتبطًا ببلعمة الكريات الدموية في مناعة الروبيان المضادة للبكتيريا، قمنا بفحص معدل البلعمة بعد التداخل مع Foxo باستخدام طرق مختلفة. بعد ضربة قاضية Foxo، كان معدل البلعمة ومؤشر البلعمة لمجموعة ضربة قاضية Foxo أقل بكثير من تلك الخاصة بمجموعة التحكم (dsGfp) (الشكل 7A و7A'). استخدمنا أيضًا قياس التدفق الخلوي لتحديد معدل البلعمة للخلايا الدموية بعد إسكات Foxo. أظهرت النتائج أن معدل الإصابة بالخلايا الملتهمة لمجموعة Foxo-RNAi انخفض أيضًا بشكل ملحوظ مقارنةً بمجموعة dsGfp (الشكل 7B و7B'). لمزيد من التحقق من صحة هذه النتائج، قمنا أيضًا بفحص معدل البلعمة بعد ضربة قاضية لـ Akt. وأظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع تلك الخاصة بالمجموعة الضابطة، زاد معدل البلعمة ومؤشر البلعمة بشكل ملحوظ (الشكل 7C و7C'). تشير هذه النتائج إلى أن FOXO يعزز البلعمة للخلايا الدموية في الجمبري. لاستكشاف كيفية تعزيز FOXO لبلعمة الكريات الدموية في الجمبري، اكتشفنا التعبير عن الجينات المُبلغ عنها مسبقًا والمشتركة في بلعمة الجمبري. تم الإبلاغ عن تورط فئة مستقبلات الزبال B (SRB) والفئة C (SRC) في بلعمة الكريات الدموية [38،39]. لقد وجدنا أن مستوى تعبير mRNA لـ Src، بدلاً من Srb، انخفض بشكل ملحوظ بعد إسكات Foxo في الخلايا الدموية والأمعاء (الشكل 7D و7E)، في حين زاد تعبير Src بشكل ملحوظ بعد ضربة قاضية Akt في الروبيان (الشكل 7F). وتم الحصول على نتائج مماثلة على مستوى البروتين (الشكل 7G و7G'). تشير هذه النتائج إلى أن FOXO يعزز بلعمة الخلايا الدموية لمسببات الأمراض في الجمبري من خلال تعزيز تعبير SRC.
يعزز FOXO التعبير عن RAB5 وRAB7 أثناء البلعمة في الجمبري
أظهرت الدراسات السابقة أن GTPases الصغيرة، RAB5 وRAB7، هي المنظمات الرئيسية لنقل الحويصلات الملقحة حديثًا إلى الإندوسومات المبكرة والمتأخرة [40]. يعد RAB5 منظمًا رئيسيًا لأحداث الاندماج الأولية وهو علامة على الإندوسومات المبكرة [41،42]. هناك حاجة إلى RAB7 من أجل اندماج البلعوم والليزوسوم المتأخر وهو علامة على الإندوسومات المتأخرة [43]. لاستكشاف ما إذا كان RAB5 وRAB7 متورطين في إزالة مسببات الأمراض في الجمبري، قمنا أولاً بتحليل أنماط التعبير عن Rab5 وRab7 ووجدنا أن اثنين من GTPases الصغيرين تم تنظيمهما في الروبيان المتحدي بالبكتيريا (الشكل S5A – S5D). قمنا أيضًا بتحليل معدل البقاء على قيد الحياة لروبيان Rab5- RNAi وRab7- RNAi بعد التحدي البكتيري، وأظهرت النتائج أن معدل البقاء على قيد الحياة لروبيان Rab5 وRab7 انخفض بشكل ملحوظ مقارنةً بمعدل التحكم ( S5E وS5F الشكل). تشير هذه النتائج إلى أن RAB5 وRAB7 يلعبان وظائف مهمة في المقاومة ضد مسببات الأمراض البكتيرية. لاستكشاف ما إذا كان RAB5 وRAB7 متورطين في البلعمة بوساطة FOXO، قمنا بفحص مستويات التعبير mRNA لـ Rab5 وRab7 بعد التداخل مع تعبير Foxo في الجمبري. أظهرت النتائج أن مستويات التعبير عن Rab5 وRab7 انخفضت بشكل ملحوظ في الخلايا الدموية والأمعاء (الشكل 8A وS6A). في حين زاد التعبير عن Rab5 وRab7 بشكل ملحوظ بعد ضربة قاضية Akt في الروبيان (الشكل 8B). ولتأكيد النتائج المذكورة أعلاه بشكل أكبر، تم أيضًا اكتشاف مستويات البروتين لـ RAB5 وRAB7 في جمبري Foxo أو Akt. بالمقارنة مع مجموعة حقن dsGfp، انخفضت مستويات RAB5 وRAB7 أيضًا بشكل ملحوظ في الخلايا الدموية والأمعاء في جمبري Foxo-knockdown لكنها زادت بشكل ملحوظ في جمبري Akt-knockdown عند ساعتين بعد التحفيز بواسطة V. anguillarum (الأشكال 8C – 8D'؛ S6B). وS6B'). تشير هذه النتائج إلى أن RAB5 وRAB7 يشاركان في داء الخلايا الملتهمة بوساطة FOXO للخلايا الدموية في الجمبري. اكتشفنا أيضًا أن RAB5 وRAB7 تم توطينهما بشكل مشترك مع V. anguillarum في خلايا الدم في الجمبري (الشكل 9). مجتمعة، تشير النتائج إلى أن RAB5 وRAB7 متورطان في البلعمة بوساطة FOXO في الجمبري.
الشكل 5. أدت العدوى المسببة للأمراض إلى انخفاض نشاط AKT، مما عزز الإزاحة النووية لـ FOXO في الخلايا الدموية والخلايا المعوية للروبيان. (A، B) كفاءة Akt-RNAi في الخلايا الدموية وأمعاء الجمبري، على النحو الذي يحدده qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin وEf-1 كجينات تحكم داخلية (A) والنشاف الغربي (B). (C) تم تحليل كمية FOXO في السيتوبلازم ونواة الأمعاء من جمبري Akt-knockdown بواسطة النشاف الغربي. تم استخدام dsGfp كعنصر تحكم. (ج') التحليل الإحصائي للوحة (ج). تم استخدام برنامج ImageJ لتحويل النطاقات إلى صيغة رقمية عن طريق مسح الصور ثلاثية التكرارات. (D) تم الكشف عن الإزاحة النووية لـ FOXO في خلايا الدم من جمبري Akt-knockdown بعد ساعتين من تحدي V. anguillarum باستخدام اختبار كيميائي مناعي فلوري. تم استخدام dsGfp كعنصر تحكم. شريط النطاق=20 ميكرومتر. (د') التحليل الإحصائي ل(د). تم استخدام برنامج WCIF ImageJ لتحليل التوطين المشترك من خلال نسبة شدة التألق لمضاد FOXO (الأخضر) والنواة الملطخة DAPI (الأزرق) في الخلايا الدموية بعد تحديد قيمة التعرض. (E، F) تغيير محتوى AKT المفسفر (p-AKT) في الخلايا الدموية (E) والأمعاء (F) من الروبيان الذي يتحدىه V. anguillarum. اللوحات السفلية عبارة عن أرقام رقمية (E) و (F) استنادًا إلى نطاقات النشاف الغربي والتحليل الإحصائي، على التوالي.
شاي سيستانش
مناقشة
FOXO، باعتباره عامل نسخ مهم جدًا، يشارك في العديد من الوظائف الفسيولوجية والتمثيل الغذائي [44،45]. في هذه الدراسة، حددنا FOXO من الجمبري (M. japonicus) ووجدنا أنه يشارك في تنظيم توازن الدملمف والميكروبات المعوية من خلال تنظيم تعبير AMP في الظروف العادية. يمكن تنشيط FOXO عن طريق العدوى البكتيرية في الجمبري وانتقاله إلى النواة، حيث ينظم بشكل مباشر وغير مباشر (عن طريق مسار IMD) التعبير عن AMPs. تعبير FOXO المنتظم عن الجينات المرتبطة بالبلعمة، مثل SRC وGTPases الصغيرة، RAB5 وRAB7، لتعزيز البلعمة الكريات الدموية ضد مسببات الأمراض. لذلك، يلعب الروبيان FOXO أدوارًا مختلفة في الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية (المعوية) ضد مسببات الأمراض (الشكل 10). بالمقارنة مع FOXOs البشرية، يحتوي الروبيان FOXO على تسلسل حمض أميني محفوظ نسبيًا ومواقع فسفرة AKT؛ ومع ذلك، فإن موقع الفسفرة AKT الثاني للروبيان FOXO هو ثريونين بدلاً من سيرين. يتحكم فسفرة AKT لـ FOXO في النقل النووي والسيتوبلازمي لـ FOXO [9]. في هذه الدراسة، وجدنا أن AKT مرتبط بالتحكم في دخول FOXO النووي. بعد الإصابة بـ V. anguillarum، انخفض مستوى AKT المفسفر بشكل كبير، مما يشير إلى انخفاض نشاط AKT في الجمبري المصاب بمولدات المرض، وبالتالي زيادة الاحتفاظ النووي أو الإزاحة النووية لـ FOXO، وبالتالي تحفيز التعبير عن الجينات المستهدفة، مثل Relish وAmp، لمقاومة العدوى المسببة للأمراض. لقد وجدت الدراسات السابقة أن FOXO يشارك في توازن البكتيريا المعوية لذبابة الفاكهة عن طريق قمع التعبير عن بروتين التعرف على الببتيدوغليكان SC2 (المنظم السلبي لمسار IMD) لتنشيط المسار للتعبير AMP [14]. تم الإبلاغ عن RELISH باعتباره الجين المستهدف الرئيسي لـ FOXO في السيطرة على تحمل نقص الأكسجة في ذبابة الفاكهة [46]. مثل الحيوانات الأخرى، يحتوي الجهاز الهضمي للروبيان على نسبة عالية وثابتة من الكائنات الحية الدقيقة. تكشف الأدلة المتزايدة أيضًا أن الدملمف لبعض اللافقاريات المائية الصحية، بما في ذلك الجمبري، يؤوي أيضًا كميات ثابتة من البكتيريا [47]. وجدت دراستنا السابقة أن لكتين من النوع C يشارك في تنظيم التوازن للميكروبات الحيوية للدملمف من خلال الحفاظ على تعبير AMPs [34]، لكننا لا نعرف ما هي مسارات الإشارة المشاركة في تنظيم تعبير AMP. هنا، تشير نتائجنا إلى أن FOXO متورط في تنظيم توازن الدملمف والبكتيريا المعوية من خلال إشارات IMD في الظروف العادية. في الجمبري غير المصاب، أدى القضاء على Foxo إلى انخفاض كبير في التعبير عن المذاق، وانخفض معدل بقاء الجمبري بشكل ملحوظ، حتى بدون عدوى بكتيرية. كما وجدنا أيضًا كمية صغيرة من FOXO في نواة خلايا الجمبري الطبيعية. لذلك، نعتقد أن FOXO تشارك في تنظيم التوازن للدملمف والنباتات المعوية في ظل الظروف العادية من خلال تعزيز تعبير Relish ومن ثم تعزيز تعبير AMP بواسطة مسار IMD. تشير هذه النتائج إلى أن FOXO يشارك في المناعة المحلية والجهازية لتعزيز توازن الكائنات الحية الدقيقة في الدملمف والجهاز الهضمي في الروبيان. تلعب المناعة الخلطية دورًا حاسمًا في مقاومة العدوى المسببة للأمراض بمعدلات عكسية من خلال إنتاج بطارية AMPs [21،48]. تشتمل الاستجابة الخلطية على التوليف المحفز وإفراز AMPs، والتي يتم إطلاقها في الدملمف كاستجابة جهازية، أو يتم إطلاقها على سطح البشرة أو تجويف الجهاز الهضمي كاستجابة محلية [19]. يتم تنظيم تعبير AMP بشكل أساسي من خلال مسارات إشارات Toll/Dif وIMD/Relish في ذباب الفاكهة [49]. حاليًا، تم تحديد العديد من عائلات AMPs في الجمبري، بما في ذلك القشرة، والعوامل المضادة للسكاريد الدهني (Alfs)، والبينايدينات [50]. أظهرت الدراسة الحالية أن FOXO يمكنها بشكل مباشر أو غير مباشر (من خلال إشارات IMD/Relish) تنظيم التعبير عن AMPs، بما في ذلك CrusI-3 وAlf-B1 وAlf-C1 وAlf-E1. لقد اعتقدنا أن التنشيط المنخفض لـ FOXO في الخلايا الدموية وأمعاء الجمبري في الظروف العادية يمكن أن ينظم الجين الرئيسي المستهدف لـ Foxo، أي Relish، للحفاظ على توازن الكائنات الحية الدقيقة في الجسم الحي. أثناء العدوى، تقوم مسببات الأمراض الغازية بتنشيط FOXO، الذي ينتقل معظمه إلى النواة، حيث ينظم المزيد من الجينات المستهدفة، بما في ذلك بعض AMPs، مثل Alf-E1 وCrusI-3، بالإضافة إلى Relish. مجتمعة، تشارك FOXO في تنظيم توازن الدملمف والميكروبات المعوية في الجمبري الصحي من خلال تنشيط المستوى القاعدي لإشارات IMD في الدملمف والجهاز الهضمي. تعمل عدوى العامل الممرض على تنشيط FOXO عن طريق تقليل نشاط AKT وتعزز التعبير عن AMPs بشكل مباشر وغير مباشر في المناعة الجهازية والمناعة المحلية (المعوية). البلعمة هي ظاهرة تعتمد على المستقبلات وتعتمد على الأكتين والـ ATP، وتنجم عن ارتباط الجزيئات أو مسببات الأمراض بمستقبلات غشائية خلوية محددة، وتمثل عملية مناعية مهمة يمكن للمضيف من خلالها حماية نفسه من مسببات الأمراض [24]. تشارك GTPases الصغيرة، مثل RAB5 وRAB7، في إعادة تشكيل الغشاء المستمر وحركة الحويصلات في البلعمة. ذكرت دراستنا السابقة أن مستقبلات الزبال SRB وSRC متورطة في البلعمة الكريات الدموية كمستقبلات في الروبيان [38،39]. في هذه الدراسة، وجدنا أنه بعد ضربة قاضية لـ Foxo، انخفض تعبير Src بشكل ملحوظ، وانخفض معدل البلعمة الكريات الدموية بشكل ملحوظ، مما يشير إلى أن Src هو جين مستهدف لـ FOXO وأن FOXO متورط في البلعمة بوساطة SRC للبكتيريا المسببة للأمراض. يمكن لـ FOXO أيضًا تعزيز التعبير عن اثنين من GTPases الصغيرة، RAB5 وRAB7. تشارك هذه GTPases الصغيرة في النقل المتسلسل وهي المحددات الرئيسية للبلعمات المبكرة والمتأخرة [51]. تهاجر الجسيمات البلعمية من محيط الخلية إلى المنطقة داخل الخلايا، مع استبدال RAB5 بـ RAB7 أثناء النقل، ويتم نقل البضائع النهائية إلى الليزوزوم لتحللها [52،53]. لقد وجدنا أيضًا أن RAB5 وRAB7 يمكن أن يشتركا في التوطين مع مسببات الأمراض في الخلايا الدموية، مما يشير إلى أن مسببات الأمراض تم بلعمتها بواسطة الخلايا الدموية في الروبيان عن طريق المرور عبر البلغومات المبكرة والمتأخرة قبل أن تتحلل أخيرًا في الليزوزومات. لذلك، يشارك FOXO في الاستجابة المناعية الخلوية من خلال تعزيز البلعمة للخلايا الدموية. في الختام، تشير نتائجنا إلى أن FOXO لا يشارك فقط في تنظيم توازن الكائنات الحية الدقيقة في الظروف العادية ولكن أيضًا في إزالة البكتيريا المسببة للأمراض في الروبيان المصاب من خلال تعزيز التعبير عن AMPs وبلعمة الخلايا الدموية.
الشكل 6. يؤدي FOXO أدواره المضادة للبكتيريا في الجمبري عن طريق تنظيم التعبير عن AMPs. (A، B) التعبير عن Amps في الخلايا الدموية (A) والأمعاء (B) من جمبري Foxo-knockdown، على النحو الذي يحدده qPCR باستخدام التعبير الهندسي المتوسط لـ -actin وEf-1 كجينات تحكم داخلية؛ تم استخدام حقن dsGfp في الروبيان كعنصر تحكم. وقد تم تحليل البيانات إحصائيا باستخدام اختبار مان-ويتني يو. (C، D) تم تحليل تعبير Amps في الخلايا الدموية (C) والأمعاء (D) من جمبري ضربة قاضية Akt بواسطة qPCR باستخدام تعبير متوسط هندسي لـ -actin وEf -1 كجينات تحكم داخلية؛ تم استخدام حقن dsGfp في الروبيان كعنصر تحكم. تم تحليل فروق ذات دلالة إحصائية باستخدام ANOVA في اتجاه واحد. (E) رسم تخطيطي لمواقع الربط المتوقعة لـ FOXO على مروج Alf-E1. (F) تم استخدام ChIP وRT-PCR للكشف عن ارتباط FOXO بتسلسل مروج Alf-E1 باستخدام الاشعال (Alf-E1-F وAlf-E1-R، الجدول 1). تم استخدام RT-PCR أيضًا لتضخيم منطقة ترميز Alf-E1 باستخدام بادئات RT-PCR (Alf-E1-RT-F وAlf-E1-RT-R. الجدول 1) باستخدام ChIP الحصول على الحمض النووي كقالب. تم استخدام الأجسام المضادة IgG كعنصر تحكم، وتم استخدام جزء تضخيم الحمض النووي الجينومي الطبيعي لتأكيد النطاق المستهدف.
الشكل 7. FOXO يعزز البلعمة الكريات الدموية لمسببات الأمراض في الجمبري من خلال تعزيز التعبير SRC. (أ) البلعمة الكريات الدموية من V. anguillarum لوحظ باستخدام مقايسة كيميائية مناعية فلوري تحت مجهر مضان. تمت تسمية V. anguillarum بـ FITC (الأخضر) وكانت نواة الخلية ملطخة بـ DAPI (الأزرق). يشير السهم الأحمر إلى الكريات الدموية البلعمية. شريط النطاق=20 ميكرومتر. (أ') التحليل الإحصائي لمعدل البلعمة ومؤشر البلعمة في الروبيان ضربة قاضية فوكسو. تم استخدام مجموعة حقن dsGfp كعنصر تحكم. تم حساب خمسمائة خلية دموية تحت المجهر الفلوري في كل تجربة. وقد تم تحليل البيانات إحصائيا باستخدام اختبار الطالب. (ب) البلعمة البكتيرية بواسطة الخلايا الدموية التي تم تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم فصل الخلايا الدموية المبتلعة التي تحتوي على البكتيريا (R2) عن الخلايا الدموية غير المبتلعة (R3) استنادًا إلى إشارة مضان للبكتيريا الموسومة في الخلايا الدموية باستخدام برنامج IDEAS Application v6.0. (ب') معدل البلعمة للخلايا الدموية استنادا إلى بيانات التدفق الخلوي. تم حساب ثلاثة آلاف خلية دموية لكل تحليل وتم تنفيذ ثلاثة تكرارات. تم استخدام مجموعة dsGfp كعنصر تحكم. (C) البلعمة الكريات الدموية من V. anguillarum في الجمبري ضربة قاضية Akt مراقبة تحت المجهر الفلوري. شريط النطاق=10 ميكرومتر. (ج') التحليل الإحصائي لمعدل البلعمة ومؤشر البلعمة استنادا إلى البيانات الموجودة في اللوحة (ج). ( D ) مستوى تعبير mRNA لـ Srb و Src في الخلايا الدموية من جمبري ضربة قاضية Foxo الذي تم تحليله بواسطة qPCR باستخدام تعبير متوسط هندسي لـ -actin و Ef -1 كجينات تحكم داخلية. تم استخدام حقن dsGfp كعنصر تحكم. ( E ) تعبير mRNA لـ Srb و Src في أمعاء جمبري Foxo-RNAi الذي تم تحليله بواسطة qPCR باستخدام تعبير متوسط هندسي لـ -actin و Ef -1 كجينات تحكم داخلية. ( F ) تعبير mRNA لـ Src في خلايا الدم من جمبري Akt-RNAi الذي تم تحليله بواسطة qPCR باستخدام تعبير متوسط هندسي لـ -actin و Ef -1 كجينات تحكم داخلية. (G) مستوى بروتين SRC في خلايا الدم من جمبري Foxo-RNAi أو Akt-RNAi، كما تم تحليله باستخدام النشاف الغربي. حقن dsGfp يستخدم كعنصر تحكم. (G') التحليل الإحصائي بناءً على بيانات ثلاث مكررات من اللوحة (G).
المواد والأساليب
بيان الأخلاق
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للتوجيهات الوطنية الصينية (GB 14922.2–2011 وGB 14925–2010). تم إجراء تجارب الأرانب لإعداد الأجسام المضادة في الدراسة وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية ورعاية الحيوان في كلية علوم الحياة بجامعة شاندونغ (SYDWLL -2021-54). لم تكن الموافقة وفقًا للوائح استخدام الجمبري في دراستنا ضرورية لأن بحثنا استخدم عددًا محدودًا من الجمبري الشائع الذي يستهلكه المجتمع الأوسع بشكل متكرر.
الحيوانات
تم الحصول على الجمبري الصحي (Marsupenaeus japonicus)، الذي يزن كل منه حوالي 6-10 جرام، من سوق المنتجات المائية في تشينغداو، مقاطعة شاندونغ، الصين. قبل التجربة، تم استزراع الجمبري لمدة يوم واحد على الأقل في نظام استزراع الجمبري بمياه بحر مهوية عند درجة حرارة 23-25 درجة مئوية للتأقلم مع البيئة الجديدة.
الشكل 8. RAB5 وRAB7 متورطان في البلعمة بوساطة FOXO للكريات الدموية في الجمبري. (A، B) تم استخدام qPCR لتحليل مستويات التعبير mRNA لـ Rab5 وRab7 في خلايا الدم من جمبري Foxo-knockdown (A) وروبيان Akt-knockdown (B) مع أو بدون عدوى بكتيرية. استخدم qPCR تعبيرًا هندسيًا متوسطًا لـ -actin وEf -1 كجينات تحكم داخلية. (C) مستويات البروتين من RAB5 وRAB7 في الخلايا الدموية من الروبيان ضربة قاضية Foxo في 2 ساعة بعد V. التحدي anguillarum تحديد باستخدام النشاف الغربي. (ج') التحليل الإحصائي استنادا إلى بيانات ثلاث مكررات من اللوحة (ج). (د) مستويات البروتين في RAB5 وRAB7 في خلايا الدم من جمبري Akt-knockdown عند ساعتين بعد تحدي V. anguillarum الذي تم تحديده باستخدام النشاف الغربي. (د') التحليل الإحصائي استنادا إلى بيانات ثلاث مكررات من اللوحة (د).
تحليل المعلومات الحيوية
تم الحصول على تسلسل [كدنا] كامل الطول لـ Foxo من تسلسل الخلايا الدموية والنسخة المعوية لـ M. japonicus (BGI ، Shenzhen ، الصين). تم تضخيم إطار القراءة المفتوح (ORF) الخاص بـ Foxo باستخدام زوج من الاشعال (Foxo-EX-F وFoxo-EX-R؛ الجدول 1) لتأكيد التسلسل. تمت ترجمة [كدنا] المقابلة من الناحية النظرية للحصول على تسلسل البروتين المستخرج باستخدام أداة ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). تم إجراء تحليل التشابه باستخدام BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)، وتم إجراء التنبؤ بهندسة المجال باستخدام SMART (//smart.emblheidelberg.de). تم إنشاء شجرة النشوء والتطور من FOXOs من أنواع مختلفة باستخدام برنامج MEGA 6.0 [54].
الشكل 9. RAB5 وRAB7 يشتركان في التوطين مع V. anguillarum. التوطين المشترك لـ RAB5 وRAB7 مع FITC المسمى-V. anguillarum في هيموسيتيس الجمبري، كما تم تحليلها باستخدام مقايسة كيميائية مناعية الفلورسنت. تم تمييز البكتيريا بـ FITC (الأخضر) وحقنها في الجمبري. تم جمع الخلايا الدموية من خمسة جمبري في 30 دقيقة وساعة واحدة بعد الحقن البكتيري وحضنت بالأجسام المضادة لـ RAB5 أو الأجسام المضادة لـ RAB7. كان الجسم المضاد الثانوي هو antirabbit IgG Alexa -546 (أحمر). كانت النوى ملطخة بـ DAPI (الأزرق). تتم الإشارة إلى التوطين المشترك في الخلايا الدموية بواسطة الأسهم البيضاء. شريط النطاق=10 ميكرومتر.
الشكل 10. تمثيل تخطيطي لمشاركة FOXO في المناعة الفطرية المحلية والجهازية في الجمبري. (أ) في الظروف غير المصابة، يحافظ FOXO على توازن الدملمف والميكروبات المعوية من خلال تعزيز تعبير Relish وبالتالي تعبير AMP. (ب) في الظروف المصابة، يتم تقليل الفسفرة AKT عن طريق العدوى المسببة للأمراض، مما يؤدي إلى زيادة محتوى FOXO في النواة. تعمل FOXO على الترويج بشكل مباشر للتعبير عن Relish وAMPs للقضاء على مسببات الأمراض الغازية؛ من ناحية أخرى، FOXO يعزز البلعمة من مسببات الأمراض من خلال مسار البلعمة بوساطة SRC.
التحدي البكتيري وجمع العينات
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) تم الحصول عليها من الكلية البحرية بجامعة شاندونغ (وي هاي، الصين) وتم حفظها الآن في مختبرنا. تم استزراع V. anguillarum طوال الليل عند درجة حرارة 37 مئوية في وسط LB وأعيد استزراعه لمدة 4 ساعات عند تلقيح 1:100 في اليوم الثاني. تم جمع البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وغسلها مرتين بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS: 10 ملي مولار Na2HPO4، 140 ملي كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي كلوريد كلوريد، و 1.8 ملي مولار KH2PO4، الرقم الهيدروجيني 7.4). V. anguillarum معلق في محلول ملحي بالفوسفات لتحدي الروبيان. تم حقن ما يقرب من 2 × 107 وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) / جمبري في بطن كل جمبري باستخدام حقنة دقيقة. تم حقن المجموعة الضابطة بنفس الحجم من برنامج تلفزيوني. تم جمع الخلايا الدموية والقلب والكبد والبنكرياس والخياشيم والمعدة والأمعاء من ثلاثة جمبري على الأقل لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين. لجمع الكريات الدموية، تم استخراج الدملمف من الجيب البطني باستخدام محقنة مملوءة مسبقًا بـ 0.8 مل من المخزن المؤقت المضاد للتخثر (10٪ سيترات الصوديوم)، ثم تم طرده سريعًا عند 700 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية لعزل الكريات الدموية.
استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين، وتوليف [كدنا].
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من الخلايا الدموية وأعضاء الروبيان المختلفة باستخدام TRIzol (ET101، Transgen، Beijing، China). تم استخلاص البروتينات من الأعضاء المختلفة باستخدام مقايسة الهطول المناعي الإشعاعي (RIPA) Lysis Buffer (P0013B، Beyotime، Jiangsu، China). تم إجراء أول توليف [كدنا] باستخدام مجموعة تخليق [كدنا] (5x All-in-One RT MasterMix؛ Applied Biological Materials-abm، Vancouver، Canada)، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
الجدول 1. تسلسل الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة.
ماسترميكس; المواد البيولوجية التطبيقية-ABM، فانكوفر، كندا)، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
التعبير المؤتلف وإعداد الأجسام المضادة
تم تضخيم تسلسل [كدنا] من Foxo عن طريق تفاعل سلسلة البلمرة النسخ العكسي (RT-PCR) باستخدام الاشعال Foxo-EX-F وFoxo-EX-R (الجدول 1). تم بعد ذلك هضم منتجات PCR المنقى باستخدام إنزيمات التقييد وربطها في البلازميد pGEX -4 T -1 (GE Healthcare، Piscataway، NJ، USA). وتم تحويل البلازميدات المبنية إلى خلايا Escher ichia coli Rosseta (DE3). تم تحفيز التعبير البروتيني باستخدام 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل - - D-thio galactopyranoside عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تعرضت البروتينات المؤتلفة إلى تحليل كروماتوجرافي متقارب باستخدام راتنج الجلوتاثيون (GST) (C600031، BBI، شنغهاي، الصين)، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تحضير الأمصال المضادة للأرنب ضد FOXO وفقًا للطريقة الموصوفة مسبقًا [55].
النشاف الغربي
تم فصل البروتينات المستخرجة من أعضاء أو خلايا دموية مختلفة باستخدام 1 0٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE). تم نقل البروتينات الموجودة في المواد الهلامية SDS-PAGE إلى غشاء نترات السليلوز باستخدام عازلة النقل (25 ملي مولار تريس – حمض الهيدروكلوريك، 2 0 ملي جلايسين، 0.037٪ ملي مولار SDS، و 20٪ إيثانول) وحضنت في 5٪ حليب خالي الدسم أو 3٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في محلول ملحي تريس (TBS: 150 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك، الرقم الهيدروجيني 8.0) لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك تحضين الأغشية باستخدام المصل المضاد الأولي: مضاد FOXO عند تخفيف 1:100، مضاد RAB5 عند 1:25، مضاد Rab7 عند 1:25، مضاد بيتا أكتين (ACTB) عند 1:250 (تم إعداده في مختبرنا). ); هيستون -3 الأجسام المضادة متعددة النسيلة (A2348، ABClonal، ووهان، الصين، 1: 2500)؛ الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للفسفورية (p) -AKT (WLP001a، Wanleibio، Shenyang، China، 1: 500) واهتزت بلطف طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام TBST (إضافة 0.1% Tween-20 إلى TBS)، تم تحضين الأغشية الذاكرية بجسم مضاد ثانوي (ZB2308 ZSGB-Bio، بكين، الصين، 1:5، 000) أو ( ZB2301 ZSGB-Bio، بكين، الصين، 1:5، 000) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. تم تطوير نطاقات البروتين المناعية باستخدام محلول كلوريد النيتروترازوليوم الأزرق (A610379، BBI) وملح P-toluidine (A610072، BBI) في ظل ظروف مظلمة أو باستخدام اللمعان الكيميائي المعزز (ECL). تم استخدام -actin أو Histone-3 كمرجعs.
أنماط توزيع الأنسجة والتعبير في الروبيان تتحدى البكتيريا
تم تحليل توزيع أنسجة Foxo / FOXO في الخلايا الدموية والقلب والخياشيم والبلغم والمعدة والأمعاء باستخدام RT-PCR مع الاشعال Foxo-F و Foxo-R (الجدول 1) ومن خلال النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة لـ FOXO. على التوالى. يتكون إجراء PCR من حضانة أولية عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ تليها 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تم تحليل منتجات PCR باستخدام الاغاروز الكهربائي (1.5٪ الاغاروز). تم استخدام الجين -actin ( -actin-F و -actin-R؛ الجدول 1) كعنصر تحكم داخلي. تم تحليل أنماط التعبير عن الدورة الزمنية لـ Foxo / FOXO في مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين في الروبيان التي تم تحديها بواسطة V. anguillarum باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) في دورة حرارية (qTOWER3، ANALYTIK JENA AG، Jena، Germany) وبواسطة النشاف الغربي، على التوالي. يتألف إجراء qPCR من: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ و60 درجة مئوية لمدة 50 ثانية؛ ومن ثم فترة ذوبان من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية. تم إنتاج ملفات التعبير الاحترافية لـ Foxo باستخدام طريقة 2-ΔΔCT [56] باستخدام المتوسط الهندسي لجينات التحكم الداخلي لـ -actin وEf -1 للتطبيع. تم تحليل كفاءة الزوج التمهيدي في qPCR باتباع طريقة MIQE [57] مع التخفيف اللوغاريتمي 10- أضعاف لخليط [كدنا] لإنشاء منحنى قياسي خطي.
عزل البروتينات النووية والسيتوبلازمية
تم تشريح أنسجة الأمعاء من الجمبري وغسلها في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. تم إجراء استخلاص البروتين باستخدام مجموعة استخراج البروتين النووي والسيتوبلازمي (R0050، Solarbio، Beijing، China) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم استخدام ثلاثة جمبري على الأقل لاستخلاص البروتين لإزالة الفروق الفردية.
فحص تدخل الحمض النووي الريبي
لتحليل وظيفة الجينات، أجرينا فحوصات تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi). عدة أزواج من الاشعال تحتوي على تسلسل المروج T7 (Foxo-RI-F و Foxo-RI-R؛ Rab 5- RI-F و Rab 5 - RI-R؛ Rab 7- RI- تم تصميم F وRab7 - RI-R؛ Akt-RI-F وAkt-RI-R. الجدول 1) لتضخيم القوالب الخاصة بتخليق الرنا المزدوج الجديلة. باستخدام بوليميريز T7 RNA (EP0111، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) وقالب cDNA، قمنا بتركيب أجزاء الرنا المزدوج الجديلة. كان البروتين الفلوري الأخضر المزدوج dsGfp RNA بمثابة عنصر التحكم، والذي تم تضخيمه باستخدام Gfp-RI-F وGfp -RI-R (الجدول 1) كبادئات لتوليف dsGfp. بعد ذلك، تم حقن أجزاء الرنا المزدوج الجديلة (50 ميكروغرام/كل منها) في الجزء البطني من M. japonicus باستخدام حقنة دقيقة وتم إجراء حقنة ثانية بعد 12 ساعة باستخدام نفس الجرعة. تم تحليل كفاءة تدخل الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام النسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR، الذي يشتمل على النسخ العكسي للحمض النووي الريبي (RNA) لتشكيل [كدنا] (cDNA)، والذي تم استخدامه بعد ذلك كقالب في اختبار qPCR) أو النشاف الغربي بعد الحقن الثاني لمدة 24 ساعة. -actin تم استخدامه كمرجع داخلي.
مراجع
1. كالنان DR، برونيت أ. كود FoxO. الجين الورمي. 2008; 27(16):2276-2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. تران إتش، برونيت إيه، جرينير جيه إم، داتا إس آر، فورنيس إيه جيه، ديستيفانو بي إس، وآخرون. تحفيز مسار إصلاح الحمض النووي بواسطة عامل نسخ الشوكة FOXO3a من خلال بروتين Gadd45. علوم. 2002; 296 (5567):530-534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R، Lithgow GJ، Link W. تحيا FOXO: كشف دور بروتينات FOXO في الشيخوخة والعمر الطويل. خلية الشيخوخة. 2016; 15(2):196-207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 بميد: 26643314.
4. Vogt PK، Jiang H، Aoki M. فسفرة التحكم في الطبقة الثلاثية، أستلة وتواجد بروتينات FOXO. دورة الخلية. 2005; 4(7):908-913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H، Sakamaki J، Fukamizu A. تنظيم عوامل نسخ FoxO عن طريق أستلة وتفاعلات البروتين البروتيني. Bba-Mol الخلية الدقة. 2011; 1813 (11): 1954-1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. وانغ واي، تشو واي إم، جريفز دي تي. عوامل النسخ FOXO: أهميتها السريرية وتنظيمها. بيوميد الدقة كثافة العمليات. 2014; 2014: 1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 بميد: 24864265.
7. مورفي سي تي، مكارول إس إيه، بارجمان سي آي، فريزر أ، كاماث آر إس، أهرينغر جي، وآخرون. الجينات التي تعمل أسفل مجرى DAF-16 للتأثير على عمر Caenorhabditis elegans. طبيعة. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. سيرجي سي، شين إف، ليو إس إم. مسارات الأنسولين / IGF -1 R و SIRT1 و FOXOs - نموذج تفاعل مثير للاهتمام للعظام والساركوما العظمية. الغدد الصماء الأمامية (لوزان). 2019; 10: 93-103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 بميد: 30881341.
9. برونيت أ، بوني أ، زيجموند إم جي، لين إم زد، جوو بي، هو جين إس، وآخرون. يعزز Akt بقاء الخلية عن طريق الفسفرة وتثبيط عامل نسخ الشوكة. خلية. 1999; 96(6):857-868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. هوانغ إتش، ريجان كم، وانغ إف، وانغ دي بي، سميث دي، فان دورسن جما، وآخرون. يمنع Skp2 FOX01 في قمع الورم من خلال التحلل بوساطة اليوبيكويتين. P Natl Acad Sci الولايات المتحدة الأمريكية. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. أوج إس، باراديس إس، جوتليب إس، باترسون جي آي، لي إل، تيسنبوم إتش إيه، وآخرون. يقوم عامل نسخ رأس الشوكة DAF-16 بنقل الإشارات الأيضية وطول العمر الشبيهة بالأنسولين في C. elegans. طبيعة. 1997; 389 (6654):994-999. https://doi.org/10.1038/40194 بميد: 9353126.
12. Fink C، Hoffmann J، Knop M، Li Y، Isermann K، Roeder T. مطلوب إشارات FoxO المعوية للبقاء على قيد الحياة عن طريق الفم في ذبابة الفاكهة. المناعي المخاطي. 2016; 9(4):927-936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 بميد: 26627459.
13. سبيلبيرج إم جي، مار إم تي. ينظم FOXO تدخل الحمض النووي الريبي (RNA) في ذبابة الفاكهة ويحمي من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي (RNA). P Natl Acad Sci الولايات المتحدة الأمريكية. 2015؛ 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 بميد: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 يعزز التوازن المناعي للأمعاء للحد من خلل التنسج المختلط وإطالة العمر. خلية. 2014; 156(1-2):109-122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 بميد: 24439372.
15. بيكر تي، لوخ جي، باير إم، زينكي آي، أشنبرينر إيه سي، كاريرا بي، وآخرون. التنظيم المعتمد على FOXO للتوازن المناعي الفطري. طبيعة. 2010؛ 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ Nature08698 PMID: 20090753.
16. سيلر إف، هيلبرج جي، ليبر بي إم، كاميتشنيكوف إيه، هير سي، بيشوف إم، وآخرون. تنظم عوامل النسخ FOXO آليات المناعة الفطرية في الخلايا الظهارية التنفسية. ي إيمونول. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. جريفز دي تي، ميلوفانوفا تينيسي. المناعة المخاطية وعوامل النسخ FOXO1. الجبهة المناعية. 2019; 10:2530-2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P، Stocklin R، Menin L. الببتيدات المضادة للميكروبات: من اللافقاريات إلى الفقاريات. القس إيمونول. 2004؛ 198:169-184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N، Silverman N، Cherry S. المناعة في ذبابة الفاكهة السوداء - من التعرف على الميكروبات إلى فسيولوجيا الكائن الحي بالكامل. نات القس إيمونول. 2014; 14(12):796-810. https://doi.org/10.1038/nri3763 بميد: 25421701.
20. هوفمان جيه إيه، رايخارت جيه إم. المناعة الفطرية لذبابة الفاكهة: منظور تطوري. نات إيمونول. 2002; 3(2):121-126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. هولتمارك د. مناعة ذبابة الفاكهة: المسارات والأنماط. العملة Opin Immunol. 2003; 15(1):12-19. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. لي إف إتش، شيانغ جي إتش. التطورات الحديثة في الأبحاث المتعلقة بالمناعة الفطرية للروبيان في الصين. ديف شركات Immunol. 2013; 39(1-2):11-26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. صن جي جي، لان جي إف، تشاو إكس إف، فاستا جي آر، وانغ جي إكس. يؤدي ربط مجال الملف اللولبي للليكتين من النوع C بمستقبل Domeless إلى تنشيط مسار JAK/STAT مباشرة في الاستجابة المناعية للجمبري للعدوى البكتيرية. باثوج بلوس. 2017; 13(9):هـ1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. جوردون س. البلعمة: عملية بيولوجية مناعية. حصانة. 2016; 44(3):463-475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. وانغ إس، شيا بي واي، هوانغ جي إل، تشو بي بي، ليو جي، يي بي كيو، وآخرون. الالتهام الذاتي بوساطة FoxO1- مطلوب لتطوير الخلايا القاتلة الطبيعية والمناعة الفطرية. نات كومون. 2016; 7:11023-11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. دونغ جي، سونغ إل، تيان سي، وانغ واي، مياو إف، تشنغ جي، وآخرون. ينظم FOXO1 نشاط العدلات الناجم عن البكتيريا. الجبهة المناعية. 2017; 8: 1088-1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. وانغ إكس دبليو، تشاو إكس إف، وانغ جي إكس. يرتبط الليكتين من النوع C ببيتا إنتغرين لتعزيز البلعمة الدموية في اللافقاريات. ي بيول كيم. 2014; 289(4):2405-2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 بميد: 24324258.
28. Norouzitallab P، Baruah K، Vanrompay D، Bossier P. تعليم الجمبري الدفاع عن النفس لمكافحة العدوى. اتجاهات التكنولوجيا الحيوية. 2019; 37(1):16-19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. فليجل تي دبليو. الظهور التاريخي والتأثير والوضع الحالي لمسببات أمراض الجمبري في آسيا. ي اللافقاريات باثول. 2012; 110(2):166-173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. وانغ بي إتش، هوانغ تي زد، تشانغ إكس بي، هي جي جي. الدفاع المضاد للفيروسات في الروبيان: من المناعة الفطرية إلى العدوى الفيروسية. برامج مكافحة الفيروسات الدقة. 2014; 108:129-141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T، Obsilova V. العلاقات الهيكلية / الوظيفية الكامنة وراء تنظيم عوامل النسخ FOXO. الجين الورمي. 2008; 27(16):2263-2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 بميد: 18391969.
