يخفف Echinacoside Rb1 ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالعمر عن طريق تعديل مسار الغاز 6

خلاصة

سياق:إشيناكوسايديمارس Rb1 (Rb1) العديد من التأثيرات المفيدة ويحمي من أمراض القلب والأوعية الدموية.

الهدف: التحقيق فيما إذا كان Rb1 يمكن أن يخفف من ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالعمر وتحديد الآلية. المواد والطرق: الفئران الإناث C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 2 و 18 شهرًا ، تم تعيينهم عشوائيًا لمجموعة Young ، Young 20 مجم / كجم Rb1 ، السيارة القديمة ، القديمة 10 مجم / كجم Rb1 والقديمة 20 مجم / كجم مجموعات Rb1 ، كانت يوميًا حقن داخل الصفاق مع مركبة أو Rb1 لمدة 3 أشهر. تم استخدام مقاطع الشريان الأورطي الصدري لفحص التوسيع الوعائي المعتمد على البطانة. تم جمع أنسجة الشريان الأورطي الصدري الأيسر لتحليل التعبير النسيجي أو الجزيئي ، بما في ذلك البروتينات المرتبطة بالشيخوخة ، والعلامات ذات الصلة بالتكلس والتليف ، والتعبير عن Gas6 / Axl.

النتائج: وجدنا أنه في مجموعة المركبات القديمة ، زاد التعبير عن بروتينات الشيخوخة وجزيئات الالتصاق الخلوي بشكل كبير ، مع استرخاء الأبهر الصدري المعتمد على البطانة الأسوأ (58.35 بالمائة ± 2.50 بالمائة) مقارنة بالمجموعة الصغيرة (88.84 بالمائة ± 1.20 بالمائة). ). ومع ذلك ، قلل علاج Rb1 بشكل كبير من مستويات التعبير عن هذه البروتينات وحافظ على الاسترخاء المعتمد على البطانة في الفئران المسنة. علاوة على ذلك ، قلل علاج Rb1 أيضًا من ترسب الكالسيوم وترسب الكولاجين ومستويات تعبير البروتين للكولاجين 1 والكولاجين 3 في الفئران المسنة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن تقليل تنظيم التعبير عن بروتين Gas6 بنسبة 41.72 في المائة وتعبير الرنا المرسال بنسبة 52.73 في المائة في الفئران المسنة مقارنة بالفئران الصغيرة قد تم إلغاؤه بواسطة علاج Rb1. لكن لم يكن هناك فرق كبير في تعبير Axl بين المجموعات.

الاستنتاجات: تؤكد دراستنا أن Rb1 يمكن أن يخفف من إصابة الأوعية الدموية ، مما يشير إلى أن Rb1 قد يكون محتملاً.عامل ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالشيخوخة.

شراء Cistanche الغنية في Echinacoside

مقدمة

على مدار الثلاثين عامًا القادمة في الصين ، هناك زيادة تقديرية من 12.6٪ إلى 26٪ من البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 65 عامًا وما فوق (Zhou and Walker 2021). على الرغم من أن عمر الإنسان آخذ في الازدياد ، إلا أن الأمراض المرتبطة بالعمر لا تزال موضع قلق.أمراض القلب والأوعية الدمويةهيالأمراض الأكثر شيوعًاالتي تؤثر على كبار السن.شيخوخة الأوعية الدمويةمصحوبة بتغيرات هيكلية ووظيفية في الأوعية الدموية هي عامل خطر مستقل مهمأمراض القلب والأوعية الدموية(لاكاتا وليفي 2003). أظهرت الدراسات الاستقصائية الوبائية أن 82 في المائة من المرضى الذين يموتون بسبب أمراض القلب والأوعية الدموية يبلغون من العمر 65 عامًا أو أكثر (Moslehi وآخرون ، 2012). لذلك ، فإن استكشاف آلية ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالعمر وإيجاد العوامل التي يمكن أن تحمي وظيفة الأوعية الدموية من التدهور المرتبط بالعمر قد يلعبان أدوارًا مهمة في الحد من حدوث وانتشار اضطرابات القلب والأوعية الدموية المرتبطة بالعمر لدى الأفراد المسنين.

تتورط شيخوخة الشرايين في التسبب في اختلال وظائف الأوعية الدموية وأمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة وهي سمة مميزة للشيخوخة (Minamino and Komuro 2007). تتنوع التغيرات الوعائية الناتجة عن الشيخوخة وتشمل الخلل البطاني ، وتضخم خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والتوسع الشرياني ، وإعادة تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتكلس الأوعية الدموية ، وزيادة نسبة الكولاجين إلى الإيلاستين مع التجزئة. وتيبس الأوعية الدموية (Tolle et al. 2015). برانديس وآخرون. (2005) أن الخلل البطاني المرتبط بالعمر يتميز بشكل شائع باختلال التوازن في عوامل الانقباض المشتقة من البطانة. مزيد من الدراسة بواسطة Herrera et al. (2010) أظهر أيضًا أن الخلل البطاني يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالانخفاض التدريجي في توسع الأوعية المعتمد على البطانة. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تؤثر الشيخوخة على توسع الأوعية أو تسبب اختلالات في العوامل ذات الصلة وتؤدي في النهاية إلى اختلال وظيفي في الأوعية الدموية. أكوستا وآخرون (2008) أن الخلايا الوعائية التي تخضع للشيخوخة يمكن أن تنتج جزيئات الالتصاق ، بما في ذلك مثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI -1) ، وبروتين التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM -1) ، وجزيء التصاق الخلايا بين الخلايا {{ 14}} (ICAM -1). كان يُعتقد أن كل جزيئات الالتصاق هذه تلعب أدوارًا مهمة في تجنيد الخلايا الأحادية في مواقع تصلب الشرايين ثم الشروع في إعادة تشكيل الأوعية الدموية ، مما أدى في النهاية إلى تقليل الامتثال وزيادة الصلابة (Acosta et al. 2008 ؛ Kovacic et al. 2011). تصلب الأوعية الدموية هو أهم مظاهر شيخوخة الأوعية الدموية. يُعزى إلى إعادة تشكيل ECM ويساهم في انخفاض توسع الأوعية. أظهرت الدراسات السابقة أن تصلب الأوعية الدموية والشيخوخة VSMC تُعزى إلى التكلس الإنسي وترسب الكولاجين (Mauriello وآخرون. ). لذلك ، قد ينتج ضعف توسع الأوعية عن التكلس والتليف. قد يؤدي تقليل ترسب الكالسيوم أو الكولاجين إلى تأخير ضعف الشرايين المرتبط بالشيخوخة.

إشيناكوسايدRb1 (Rb1) هو أحد المكونات النشطة الموجودة في الجينسنغ. أفادت الأبحاث أن Rb1 يمارس العديد من التأثيرات المضادة للشيخوخة المفيدة ومضادات موت الخلايا المبرمج ، لا سيما في حماية عضلة القلب والبطانة (Zheng et al. 2017 ؛ Zhou et al. 2017 ؛ Zheng et al. 2020). أظهرت الدراسات الحديثة أن Rb1 يمكن أن يقلل من تكلس الأوعية الدموية المرتبط بأمراض الكلى المزمنة والتعبير عن الكولاجين من النوع الأول في الفئران (Zhou et al. 2019b). أشارت النتائج أيضًا إلى أن Rb1 يقلل من تعبير الكولاجين من النوع الأول (Kwok et al. 2012). ومع ذلك ، لم يتم التحقيق في آثار Rb1 على ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالعمر.

تم الإبلاغ عن أن Rb1 يثبط تكلس الأوعية الدموية من خلال معاملات الجين 6 (Gas6) الخاص بوقف النمو في المختبر (Nanao-Hamai et al. 2019). يعتبر غاز 6 ، وهو عضو في عائلة البروتين المعتمدة على فيتامين K ، متورطًا في تنظيم الوظائف الخلوية المتعددة بعد الارتباط بمستقبله Axl ، وهو مستقبل غشائي التيروزين كيناز (ناكانو وآخرون 1997 ؛ فريدل وآخرون 1998 ؛ Yanagita et al. 2001). أشارت بعض الدراسات إلى أن مسار Gas6 / Axl يلعب دورًا محوريًا في بيولوجيا الأوعية الدموية وأمراض مثل تكلس الأوعية الدموية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية وتصلب الشرايين (Korshunov et al. 2006 ؛ Hurtado et al. 2010 ؛ Son et al. 2010). نفترض أن Rb1 يمكن أن يخفف من ضعف الأوعية الدموية المرتبط بالعمر عن طريق قمع التكلس والتليف ، والذي من المحتمل أن يكون مرتبطًا بتنظيم مسار Gas6 / Axl.

المواد والأساليب

الكواشف التجريبية

تم الحصول على Rb1 (نقاء أكبر من 98 بالمائة) من Victory (Sichuan ، الصين). تم شراء الأجسام المضادة ضد p21Cip1 (ab188224) و p16INK4a (ab51243) و ICAM -1 (ab179707) و VCAM -1 (ab134047) و PAI -1 (ab222754) و GAPDH (ab181603) من Abcam (ماجستير ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة ضد الكولاجين I (14695) ، والكولاجين الثالث (22734) ، و Axl (13196) من مجموعة Proteintech Group (MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة ضد Gas6 (A8545) و p16INK4a (A0262) من ABclonal Technology (Hubei ، الصين). تم شراء عازلة Krebs-Henseleit (KH) المعدلة ، فينيليفرين (مضيق للأوعية قوي) وأسيتيل كولين (Ach ، مانح NO يعتمد على البطانة) من Sigma-Aldrich (MO ، الولايات المتحدة الأمريكية). وكانت جميع الكواشف الأخرى المستخدمة من الصف التحليلية.

الحيوانات والإدارة

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) بجامعة صن يات سين. أظهرت معظم دراسات طول العمر آثارًا على الإناث (Hsu et al. 2018 ؛ Qin et al. 2018) ؛ وبالتالي ، أجرينا دراستنا طويلة المدى باستخدام الفئران الإناث. تم الحصول على فئران C57BL / 6J تتراوح أعمارهن بين 2 و 18 شهرًا من مركز الحيوانات التجريبية بجامعة صن يات سين. تم تغذية الفئران بنظام غذائي طبيعي وإيوائها في ظل ظروف خاضعة للرقابة (24 ± 2 درجة مئوية و 50 ± 5 في المائة من الرطوبة) مع فترات ضوئية داكنة / فاتحة لمدة 12 ساعة في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. تم تعيين 40 أنثى شابة من الفئران C57BL / 6J في عمر شهرين بشكل عشوائي لمجموعات Young and Young 20 مجم / كجم Rb1 (Young Rb 1-20) (n ¼ 20 لكل منهما). عولجت هذه الفئران بحقنة يومية داخل الصفاق للمركبة (محلول ملحي معقم) أو 20 مجم / كجم من Rb1 مذاب في السيارة لمدة 3 أشهر قبل القتل الرحيم عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون في عمر 5 أشهر. تم تعيين 60 أنثى من الفئران البالغة من العمر C57BL / 6J بعمر 18 شهرًا بشكل عشوائي للمركبة القديمة ، القديمة 10 مجم / كجم Rb1 (قديم Rb 1-10) و قديم 20 مجم / كجم Rb1 (قديم Rb 1-20) مجموعات (ن ¼ 20 لكل مجموعة). تلقت الفئران التي نجت حتى نهاية هذه التجربة حقنًا يومية داخل الصفاق للمركبة وحدها أو Rb1 (10 أو 20 مجم / كجم) لمدة 3 أشهر ، وبعد ذلك تم قتل الفئران في سن 21 شهرًا. تكررت التجارب ثلاث مرات على الأقل مع 4-5 من الفئران لكل مجموعة.

المواد والطرق الكواشف التجريبية

تم الحصول على Rb1 (نقاء أكبر من 98 بالمائة) من Victory (Sichuan ، الصين). تم شراء الأجسام المضادة ضد p21Cip1 (ab188224) و p16INK4a (ab51243) و ICAM -1 (ab179707) و VCAM -1 (ab134047) و PAI -1 (ab222754) و GAPDH (ab181603) من Abcam (ماجستير ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة ضد الكولاجين الأول (14695) والكولاجين الثالث (22734) و أكسل (13196) من مجموعة Proteintech Group (MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة ضد Gas6 (A8545) و p16INK4a (A0262) من ABclonal Technology (Hubei ، الصين). تم شراء عازلة Krebs-Henseleit (KH) المعدلة ، فينيليفرين (مضيق للأوعية قوي) وأسيتيل كولين (Ach ، مانح NO يعتمد على البطانة) من Sigma-Aldrich (MO ، الولايات المتحدة الأمريكية). وكانت جميع الكواشف الأخرى المستخدمة من الصف التحليلية.

الحيوانات والإدارة

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) بجامعة صن يات سين. أظهرت معظم دراسات طول العمر آثارًا على الإناث (Hsu et al. 2018 ؛ Qin et al. 2018) ؛ وبالتالي ، أجرينا دراستنا طويلة المدى باستخدام الفئران الإناث. تم الحصول على فئران C57BL / 6J تتراوح أعمارهن بين 2 و 18 شهرًا من مركز الحيوانات التجريبية بجامعة صن يات سين. تم تغذية الفئران بنظام غذائي طبيعي وإيوائها في ظل ظروف خاضعة للرقابة (24 ± 2 درجة مئوية و 50 ± 5 في المائة من الرطوبة) مع فترات ضوئية داكنة / فاتحة لمدة 12 ساعة في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. تم تعيين 40 أنثى شابة من الفئران C57BL / 6J في عمر شهرين بشكل عشوائي لمجموعات Young and Young 20 مجم / كجم Rb1 (Young Rb 1-20) (n ¼ 20 لكل منهما). عولجت هذه الفئران بحقنة يومية داخل الصفاق للمركبة (محلول ملحي معقم) أو 20 مجم / كجم من Rb1 مذاب في السيارة لمدة 3 أشهر قبل القتل الرحيم عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون في عمر 5 أشهر. تم تعيين 60 أنثى من الفئران البالغة من العمر C57BL / 6J بعمر 18 شهرًا بشكل عشوائي للمركبة القديمة ، القديمة 10 مجم / كجم Rb1 (قديم Rb 1-10) و قديم 20 مجم / كجم Rb1 (قديم Rb 1-20) مجموعات (ن ¼ 20 لكل مجموعة). تلقت الفئران التي نجت حتى نهاية هذه التجربة حقنًا يومية داخل الصفاق للمركبة وحدها أو Rb1 (10 أو 20 مجم / كجم) لمدة 3 أشهر ، وبعد ذلك تم قتل الفئران في سن 21 شهرًا. تكررت التجارب ثلاث مرات على الأقل مع 4-5 من الفئران لكل مجموعة.

تحديد توسع الأوعية في حلقات الأبهر الصدري

بعد الموت الرحيم للحيوانات ، تمت إزالة الحلقات الأبهرية الصدرية بسرعة ووضعها في محلول منظم KH بارد (118 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 4.75 مليمول / لتر بوكل ، 25 مليمول / لتر NaHCO3 ، 1.18 ، مليمول / لتر MgSO 4 1. 18 مليمول / لتر KH2PO4 ، 2.54 مليمول / لتر CaCl2 ، و 11.1 مليمول / لتر جلوكوز) ، وتم تنقية الدهون والأنسجة المحيطة بعناية. كان طول حلقات الأبهر حوالي 3 مم. تم تعليق الأجزاء الأبهرية على خطافات فولاذية مقاومة للصدأ ، ويتم تهويتها في محلول KH ، وتزويدها بالأكسجين باستمرار بنسبة 95 بالمائة من O2 عند 37 درجة مئوية. ثم تم توصيل الحلقات الأبهر بـ FORT -10 محولات الطاقة للحصول على بيانات MacLab. تم ضبط التوتر السلبي الأولي في الحلقات الأبهرية على 3 ملي نيوتن لمدة 30 دقيقة لتحقيق استقرار حلقة الوعاء قبل إجراء مزيد من التجارب. تم استبدال المخزن المؤقت KH كل 10 دقائق. تمت إضافة فينيليفرين إلى حمام الأنسجة بتركيز 10 5 مول / لتر للحث على تضيق الأوعية. بعد تحقيق ثبات حلقة الوعاء ، تمت إضافة الوعاء الدموي Ach (10 9-10 5 مول / لتر) إلى حمام الأنسجة في تتابع فوري للحصول على منحنى الاستجابة للجرعة. تم قياس الاسترخاء عند كل تركيز وتم التعبير عنه كنسبة مئوية من القوة الناتجة استجابة لفينيليفرين.

الكيمياء المناعية

تم تثبيت أنسجة الشريان الأورطي الصدري في الفورمالين ، وتجفيفها ، ودمجها في البارافين ، وتقطيعها إلى مقاطع عرضية 4 مليمتر. تم تحضين هذه الأقسام في محلول السترات (درجة الحموضة 6. 0) وتم تسخينها في الميكروويف لمدة 10 دقائق مرتين بعد خضوعها لإزالة الكافيين وإعادة التميؤ. تم استخدام مصل الماعز (10 بالمائة) (Gibco ، BRL ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمنع الارتباط غير المحدد لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، متبوعًا بحضانة ليلية مع الأجسام المضادة الأولية ضد p21Cip1 (1: 1000) و p16INK4a (1: 200) ) عند 4 درجة مئوية في صندوق رطب. بعد ثلاث غسلات في PBS ، تمت إضافة الأجسام المضادة الثانوية المقترنة (Abcam) من الفجل الحار (HRP) واحتضانها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، يليها تلطيخ ديامينوبنزيدين (1: 100 ، Abcam). تم تطبيق الهيماتوكسيلين لمقاومة نواة الخلية. كانت المقاطع مغطاة بصمغ محايد وتم تصويرها تحت مجهر زايس.

تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE)

تم تلوين أقسام الشريان الأورطي الصدري المضمنة بالبارافين بواسطة الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين. بعد الغسيل والمعالجة باستخدام كحول حمضي بنسبة 1 في المائة ، تمت معالجة الأقسام بتلطيخ يوزين لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، تم غسل المقاطع وتجفيفها ومعالجتها بالزيلين قبل الملاحظة المجهرية. تم تصوير أقسام الشريان الأورطي الصدري تحت مجهر زايس.

تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان

تم تلطيخ أقسام الشريان الأورطي الصدري المضمنة بالبارافين في الهيماتوكسيلين الحديدي لـ Weigert لمدة 10 دقائق بعد خضوعها لإزالة الكافيين وإعادة التميؤ ثم تم غسلها باستخدام PBS لمدة 5 دقائق. تم تلطيخ الأنسجة بعد ذلك في محلول Biebrich Scarlet-acid fuchsin لمدة 5 دقائق وغسلها في ماء مقطر. ثم خضعت المقاطع للتمايز والجفاف في 75 في المائة و 90 في المائة كحول عدة مرات ، ثم شطفها في ماء الصنبور. أخيرًا ، تم تنظيف المقاطع بالزيلين وتثبيتها بوسط تثبيت. تم تصور المقاطع بالمجهر. تمت الإشارة إلى ترسب الكولاجين الخلالي عن طريق تلطيخ اللون الأزرق والأخضر.

تلطيخ Alizarin red S.

من أجل تلطيخ التكلس الأبهري ، تم تلوين أقسام الشريان الأورطي الصدري بمحلول 2 في المائة من Alizarin red S لمدة 10 دقائق وغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك ، تم نقع المقاطع في أسيتون لا مائي لمدة 30 ثانية ، محلول مختلط من الأسيتون اللامائي والزيلين (نسبة الحجم ¼ 1: 1) لمدة 15 ثانية ، والزيلين اللامائي لمدة دقيقة واحدة. تمت الإشارة إلى أملاح فوسفات الكالسيوم الخلالي بالتلوين الأحمر.

النشاف الغربي

تم وضع الأبهر الصدري في محلول تحلل RIPA (HaiGene ، Haerbin ، الصين) مكملًا بمثبط البروتياز (MedChemExpress ، Monmouth Junction ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) ثم تجانسه بالموجات فوق الصوتية على الجليد. تم طرد محللة الأنسجة عند 12 ، 000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم جمع المادة الطافية في أنبوب جديد. بعد ذلك ، تم تحديد تركيز البروتين في المادة الطافية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية ، جيانغسو ، الصين). تم إجراء SDS PAGE بكميات متساوية من البروتين من كل عينة كما هو موضح سابقًا (Zheng et al. 2020) ، ثم تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF (EMD Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الأغشية عند 4 درجات مئوية طوال الليل بأحد الأجسام المضادة الأولية التالية بعد حجبها بنسبة 5 في المائة من ألبومين مصل البقر (Gibco) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة: p21Cip1 (1: 1000) ، p16INK4a (1: 1000) ، ICAM { {16}} (1: 1000) ، VCAM -1 (1: 5000) ، PAI -1 (1: 1000) ، كولاجين 1 (1: 1000) ، كولاجين 3 (1: 300) ، غاز 6 (1: 1000) ، Axl (1: 500) و GAPDH (1: 1000). بعد غسلها ، تم تحضين الأغشية بجسم مضاد ثانوي مترافق مع HRP (بوستر ، ووهان ، الصين) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تقييم ارتباط الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة ECL (EMD Millipore) ، وتم تحليل شدة النطاقات باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.41 ؛ المعاهد الوطنية للصحة ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام تعبير GAPDH كعنصر تحكم داخلي.

الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR (qPCR)

أولاً ، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الشريان الأورطي الصدري باستخدام مجموعة TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (9767 ، TaKaRa) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم بعد ذلك قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام DS -11 مقياس الطيف الضوئي FX (DeNovix). بعد ذلك ، تم نسخ الحمض النووي الريبي المستخرج (1 0 00 نانوغرام لكل نظام تفاعل 20 مل) إلى cDNA باستخدام PrimeScript TM RT Master Mix (RR360A ، TaKaRa) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة في نظام ProFlex PCR (Thermo Scientific ). أخيرًا ، تم استخدام منتجات النسخ العكسي كقوالب لمزيد من تضخيم PCR باستخدام SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). تم استخدام تسلسلات التمهيدي التالية: Gapdh: forward 50 - CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC -30 وعكس 50 - TGGTCCAGGGTTCTTAC TC -30؛ و Axl: توجيه 50 - GGAACCCAGGGAATATCACAGG - 30 وعكس 50 - AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG -30 ؛ و Gas6 إلى الأمام 50 - TGCTGCTTCCGAGTCTTC -30 وعكس 50 - CGGGGTCGTTCTCGAACAC -30. كل رد فعل في 96- صفيحة نقية جيدًا (Thermo Scientific) تحتوي على 0.4 pmol / lL بادئات أمامية وعكسية ، 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A ، TaKaRa) و 10 نانوغرام من cDNA. كان حجم التفاعل النهائي 20 مل ، وتم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ. تم إجراء تضخيم (كدنا) على النحو التالي: تمسخ ما قبل التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، متبوعًا بـ 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية في QuantStudio5 (Thermo Scientific). تم استخدام طريقة 2-DDCT للتحليل الكمي النسبي للبيانات التي تم جمعها. تم الحصول على مستوى تعبير mRNA النسبي للجينات المستهدفة من خلال مقارنة البيانات من المجموعة التجريبية مع تلك الخاصة بالمجموعة الضابطة بالإشارة إلى Gapdh.

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950