ترسب مصل الأميلويد P هو ميزة حساسة ومحددة لاعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع ترسبات IgG Kappa المقنعة

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

كريستوفر ب.

الكلمات الدالة:التهاب كبيبات الكلى. رواسب مقنعة قياس الطيف الكتلي؛ اعتلال الكبيبات الغشائي. رواسب تحت الظهارة

يمكن أن يحسن القسطرة وظائف الكلى

اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa المقنعة (MGMID) هو نمط تم وصفه مؤخرًا من التهاب كبيبات الكلى مع تشريح فريد من نوعه. يتميز النمط بطبقة تحت الظهارة و / أو ميسانجيلمنيعالرواسب "المقنعة" ، لتلطيخ الغلوبولين المناعي عن طريق التألق المناعي الروتيني ولكنها تلطخ بشدة لسلسلة الضوء IgG و kappa بعد هضم البروتياز. المرضى الذين يعانون من هذا النمط من التهاب كبيبات الكلى هم الأكثر شيوعًا من الإناث الشابات اللائي يعانين من بروتينية وتاريخ غامض لأمراض المناعة الذاتية مثل الأجسام المضادة للنواة منخفضة العيار. قمنا هنا بمقارنة ملف قياس الطيف الكتلي للكبيبات المصغرة بالليزر من تسع خزعات كلوية MGMID مع ثماني خزعات تظهر أنماطًا أخرى من اعتلال الكبيبات الغشائي. كان البروتين الأكثر زيادة بشكل ملحوظ في MGMID هو أميلويد المصل P. أظهر التلقيح المناعي أن الأميلويد P مصل مع IgG في الكبيبات من MGMID ولكن ليس مع اعتلال الكبيبات الغشائي المرتبط بـ PLA2R. كان الأميلويد المصل P إيجابيًا في الكبيبات لجميع خزعات MGMID البالغ عددها 32 ولكنه سلبيًا في خزعات الأنواع الأخرى من اعتلال الكبيبات الغشائي مثل تلك المرتبطة بـ PLA2R و THSD7A. كانت هناك أربع خزعات مع تلطيخ أميلويد مصل الدم الكبيبي من بين 173 خزعة لا تفي بمعايير MGMID أو الداء النشواني. كل هذه الخزعات الأربع مع تلطيخ الأميلويد P في المصل كان لها نمط غشائي من اعتلال الكبيبات مع رواسب IgG كابا التي تختلف فقط عن MGMID بسبب عدم وجود "إخفاء". وبالتالي ، فإن التلوين الإيجابي داخل الرواسب الكبيبية للمصل النشواني يحدد شكلاً فريدًا من التهاب كبيبات الكلى من المحتمل أن يشترك في آلية فسيولوجية مرضية مشتركة للمرض.

اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa المقنعة (MGMID) هو نمط مرضي من التهاب كبيبات الكلى تم وصفه في عام 2014 ، والذي كان أول وصف لما يسمى الرواسب الكبيبية المقنعة. الودائع مع قيود IgG kappa. من الغريب أنه على الرغم من أن تلطيخ المكون التكميلي 3 (C3) غالبًا ما يكون واضحًا من خلال التألق المناعي الروتيني على الأنسجة المجمدة ، فإن تلطيخ Ig غالبًا ما يخفي ، مما يعني أنه يظهر تلطيخًا سلبيًا كاذبًا عن طريق التألق المناعي الروتيني ولكن تلطيخًا إيجابيًا عند تكراره على الأنسجة المضمنة بالبارافين بعد هضم البروتياز. وبالتالي ، ما لم يحافظ اختصاصي علم الأمراض على مؤشر شك مرتفع لهذا الكيان ، فقد يتم تشخيصه خطأ على أنه اعتلال كبيبات C3. الكيانات الأخرى التي تم وصفها لإظهار هذه الظاهرة الاختبارية في الرواسب الكبيبية تشمل التهاب كبيبات الكلى التكاثر الغشائي مع رواسب Ig أحادية النمط المقنعة والتهاب كبيبات الكلى القري.

المرضى الذين وجد أن لديهم MGMID في الخزعة هم الأكثر شيوعًا من الإناث<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95٪) كانت سلبية بالنسبة للـ Igs وحيدة النسيلة بواسطة الرحلان الكهربائي لبروتين المصل ، ولم تُلاحظ أي حالات مرتبطة بورم خبيث دموي أساسي.

تم الافتراض بأن النتائج الإكلينيكية المشتركة بين مرضى MGMID قد تكون مؤشرا على آلية فسيولوجية مرضية جزيئية شائعة تؤدي إلى مرضهم. كان هدفنا في الإبلاغ الأول عن هذا الكيان هو تحديد مجموعة لمزيد من التحليل .1 وصفنا هنا وجود مكون بروتين أميلويد مصل البروتين (SAP) الموجود بشكل فريد في ترسبات الكبيبات MGMID. يعتبر التحلل المناعي لـ SAP في الرواسب الكبيبية تقنية حساسة ومحددة لتشخيص MGMID الذي يوفر أيضًا رؤية مسببة للأمراض.

الشكل 1|يتم إثراء مصل الأميلويد P (SAP) بشكل ملحوظ في الكبيبات المجهرية من المرضى الذين يعانون من اعتلال الكبيبات الغشائي مع ترسبات IgG kappa المقنعة. تم استخدام القيم الكمية المطلقة المستندة إلى الكثافة الطبيعية من MaxQuant (معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية ، بلانيج ، ألمانيا) للتحليل الإحصائي. تصور الخطوط المتقطعة عمليات قطع إرشادية لتغيير الطية وقيمة P. (أ) مخطط بركان يقارن 3 مستقبلات فوسفوليباز A2 (PLA2R) - حالات غشائية موجبة مع الآخرين يحدد بروتينين واضحين في الربع الأيمن العلوي. (ب) مخطط البركان الذي يقارن 2 ثرومبوسبوندين من النوع 1 يحتوي على 7A (THSD7A) - حالات غشائية موجبة مع الآخرين يحدد بروتينين واضحين مع THSD7A يظهران أكبر تغيير في الطية. (ج) مخطط بركان يقارن عينات من اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa المقنعة مع جميع الأنواع الأخرى من الحالات الغشائية يحدد 6 بروتينات واضحة القيم المتطرفة في الربع الأيمن العلوي. C6 ، مكمل مكون 6 ؛ C7 ، مكمل المكون 7 ؛ CFHR1 ، بروتين مكمل مرتبط بعامل H 1 ؛ HP1BP3 ، بروتين رابط 1 بروتين هيتروكروماتين 3 ؛ HPRT1 ، هيبوكسانثين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز 1 ؛ IGHG3 ، Ig ثقيل ثابت جاما 3.

النتائج

قياس الطيف الكتلي للكبيبات التي يتم تشريحها بالليزر

تمت مقارنة تحليل قياس الطيف الكتلي للكبيبات المشقوقة بالليزر المأخوذة من 9 حالات من MGMID مع 8 حالات من اعتلال الكبيبات الغشائي (MG) بما في ذلك 3 حالات من مستقبلات الفوسفوليباز A2 (PLA2R) - MG الإيجابي ، حالتان من الثرومبوسبوندين من النوع 1 يحتوي على المجال 7A ( THSD7A) MG إيجابية ، و 3 حالات من الذئبة MG. تم تحديد ما مجموعه 1695 بروتينًا في هذا التحليل. تم إجراء تحليل إثبات المبدأ من أجل اختبار ما إذا كان يمكن الكشف عن البروتينات المتورطة في التسبب في مرض MG عن طريق قياس الطيف الكتلي. لكل نوع غشائي معروف ، تمت مقارنة وفرة البروتين التفاضلية مقابل المجموعات المتبقية باستخدام قيم القياس الكمي المطلق المعتمد على الكثافة (iBAQ). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ويلش ، وتم تصور النتائج على قطعة أرض بركان. كان PLA2R أكثر وفرة بشكل ملحوظ في حالات MG المرتبط بـ PLA2R وأظهر أقوى تغيير في الطية (الشكل 1 أ). عرض THSD7A أقوى تغييرات أضعاف في MG المرتبط بـ THSD7A ، وإن كان ذلك مع قيمة P أكبر بسبب حجم العينة المنخفض في هذه المجموعة (n ¼ 2 ؛ الشكل 1 ب). بشكل عام ، أكد تحليل إثبات المبدأ هذا أن قياس الطيف الكتلي للكبيبات المتشكلة بالليزر يمكن أن يحدد البروتينات التي لها أهمية في التسبب في المرض في اعتلال الكبيبات الغشائي.

سعينا بعد ذلك لتحديد البروتينات التي يحتمل أن تشارك في التسبب في MGMID باستخدام هذا النهج. كان ما مجموعه 6 مراهقين محترفين أكثر وفرة بشكل ملحوظ في عينات MGMID بالنسبة للمجموعات الأخرى (الجدول 1). كان البروتين ذو التغيير الأعلى هو SAP (الشكل 1 ج). تتكون البروتينات المتبقية من IgG Kappa ، 3 بروتينات مكملة ، وبروتين هيتروكروماتين 1 – بروتين رابط 3 (HP1BP3). تم اعتبار SAP هو المرشح الأعلى حيث تم اكتشافه في جميع عينات MGMID وأظهر الفرق الأكبر في الوفرة بالنسبة للعينات غير MGMID. يتم عرض جميع Igs التي تم تحديدها عن طريق قياس الطيف الكتلي في الكبيبات التي يتم التقاطها بالليزر من حالات اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa في الجدول التكميلي S1. التعداد الطيفي عن طريق أخذ عينات من جميع البروتينات التي أظهرت زيادة قدرها $ 1 log2 في الوفرة في عينات MGMID وقيمة P # 0. 1 موضحة في الجدول التكميلي S2.

سيستانشيستطيع التحسنالكلىوظيفة

تلطيخ العصارة في حالات اعتلال الكبيبات الغشائي

أظهر جسم مضاد للأرنب متعدد النسيلة ضد بروتين SAP (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA) تلطيخًا إيجابيًا قويًا على طول الأغشية القاعدية الكبيبية للحالات التي تحتوي على MGMID التي تم تحديد موقعها مع IgG عن طريق تحليل متحد البؤر. لم يُظهر SAP التوحيد مع IgG في الكبيبات من MG المرتبط بـ PLA2R (الشكل 2). تم اختبار جسم مضاد للأرنب متعدد الأضلاع ضد HP1BP3 في 4 خزعات باستخدام MGMID وأظهر تلطيخًا سلبيًا في الرواسب الكبيبية لجميع الحالات الأربع.

تم إجراء تلطيخ SAP على ما مجموعه 211الكلىالخزعاتمع التهاب كبيبات الكلى (الجدول 2). ما مجموعه 36 حالة بها رواسب من النوع المناعي ملطخة إيجابية لـ SAP. تشترك جميع الحالات التي تلطخ بالإيجابية في بعض السمات النسيجية المرضية بما في ذلك وجود رواسب مسراق وتحت الظهارية مع تقييد IgG كابا ولا توجد تغييرات في التكاثر الداخلي أو التكاثر الغشائي بواسطة الفحص المجهري الضوئي. كان SAP سلبيًا في جميع الحالات ، مع ترسبات مقنعة لم تكن MGMID ، بما في ذلك 3 حالات من التهاب كبيبات الكلى و 3 حالات من التهاب كبيبات الكلى التكاثر الغشائي المقنع. كانت سلبية أيضًا في جميع حالات التهاب كبيبات الكلى الـ 19 مع رواسب Ig أحادية النسيلة (PGNMID) ، بما في ذلك حالات IgG1 kappa (4 حالات) و IgG2 lambda (حالة واحدة) و IgG 3 kappa (8 حالات) و IgG3 lambda (6 حالات) ). كانت جميع حالات اعتلال الكبيبات الغشائية متعددة النسيلة (PLA2R و THSD7A والذئبة والقطعية) سلبية بالنسبة لـ SAP. كما تمت دراسة أشكال إضافية من التهاب كبيبات الكلى وكانت سلبية. من بين التهاب كبيبات الكلى المصاحب للعدوى ، كان هناك 7 إيجابية لتلطيخ IgG و 6 كان لديها دليل على ترسبات سنام تحت الظهارة. كما هو متوقع ، أظهرت جميع حالات الداء النشواني الست تلطيخًا إيجابيًا في رواسب الأميلويد. ومع ذلك ، كان النمط الملطخ للترسب في تناقض صارخ مع تلطيخ الحبيبات الموجود في حالات MGMID. يظهر الشكل التكميلي S1 الصور المجهرية التمثيلية للكبيبات على صبغة SAP من مجموعة متنوعة من أمراض الكلى المختلفة.

كانت جميع الحالات الـ 32 التي تم تحديدها سابقًا على أنها MGMID إيجابية بالنسبة لـ SAP. بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك تلطيخ إيجابي لـ SAP في الكبيبات من 4 من 25 حالة من حالات اعتلال الكبيبات الغشائي مع ترسب IgG أحادي النمط الذي لم يخف بالروتين

التألق المناعي ، بما في ذلك 4 من 13 حالة مع IgG1 kappa ، 0 من حالتين مع IgG1 lambda ، 0 من 5 حالات مع IgG2 kappa ، 0 من 4 حالات مع IgG3 kappa ، و {{ 12}} من حالة واحدة تحتوي على IgG4 kappa. بشكل عام ، تم إخفاء 32 من 36 (89 بالمائة) من اعتلال الكبيبات الإيجابي لـ SAP وتم إخفاؤها في فئة MGMID ، في حين تم الكشف عن 4 من 36 (11 بالمائة) وتم تشخيصهم على أنهم MG مع رواسب IgG1 كابا. المرضى الذين يعانون من اعتلال الكبيبات الغشائي أحادي النمط الذي لم يخفوا ولكن كانوا إيجابيين بالنسبة لـ SAP كان متوسط ​​أعمارهم 33 عامًا ، مع نسبة إناث إلى ذكر 4: 0. كان متوسط ​​العمر لحالات اعتلال الكبيبات الغشائي أحادي النمط الذي لم يخف ولكنها كانت سلبية بالنسبة لـ SAP 59.3 سنة مع نسبة الإناث إلى الذكور 15: 4.

الجدول 1|زيادة البروتينات بشكل ملحوظ في الكبيبات من المرضىاعتلال الكبيبات الغشائيمع رواسب IgG kappa المقنعة، كما يتضح من قياس الطيف الكتلي

تفاعل المصل مع SAP

تم اختبار الأمصال من 22 مريضًا مصابًا بـ MGMID ، و 12 مصابًا بالاعتلال الكبيبي الغشائي الإيجابي PLA2R ، و 6 عناصر تحكم عادية لتفاعل IgG مع SAP بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). على الرغم من وجود بعض التباين بين المرضى في كل مجموعة ، لم يكن هناك فرق كبير في تفاعل IgG تجاه SAP بين المجموعات (الشكل التكميلي S2).

الشكل 2|كولوكلأيشن من IgG والمصل اميلويد P- المكون (SAP). (أ - ج) تجارب التألق المناعي التي أجريت على عينة خزعة كلوية من مريض تم تشخيصه بمرض اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع ترسبات IgG كابا المقنعة تظهر تلطيخ الغشاء القاعدي الكبيبي من أجل (أ) SAP و (ب) IgG. (ج) يوجد ارتباط قوي بين SAP و IgG في رواسب الغشاء القاعدي الكبيبي. (د - و) تجارب التألق المناعي التي أجريت على عينة خزعة كلوية من مريض لديه 3 فسفوليباز A2 إيجابية مستقبلات الكبيبات تظهر (د) تلطيخ الغشاء القاعدي الكبيبي السلبي لـ SAP و (هـ) تلطيخ الغشاء القاعدي الكبيبي الحبيبي الإيجابي لـ IgG. (و) هناك نقص في التلوين في هذا المريض مع اعتلال الكبيبات الغشائي المرتبط بمستقبلات الفوسفوليباز 3 A2. لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الموجودة على الإنترنت من هذه المقالة في الجدول 2|نتائج تلطيخ مكون مصل الأميلويد p (SAP) في الخزعات الكلوية

AA ، أميلويد أ ؛ AL ، سلسلة خفيفة أميلويد ؛ C3 ، المكون التكميلي 3 ؛ GBM ، الغشاء القاعدي الكبيبي ؛ MG ، اعتلال الكبيبات الغشائي. MGMID ، اعتلال كبيبات يشبه الغشاء مع رواسب IgG kappa المقنعة ؛ MPGN ، التكاثر الغشائي ؛ التهاب كبيبات الكلى. PGMNID ، التهاب كبيبات الكلى التكاثري مع رواسب IgG كابا أحادية النسيلة ؛ PLA2R ، مستقبلات الفوسفوليباز A2 ؛ THSD7A ، نوع ثرومبوسبوندين من النوع 1 يحتوي على 7A.

نقاش

MGMID هو نمط فريد من نوعه تم وصفه مؤخرًا من اعتلال الكبيبات يتميز برواسب تحت الظهارة والمسراق التي تلطخ لـ IgG كابا بواسطة البارافين IF (الشكل 3). المرضى الذين يعانون من هذا النمط من اعتلال الكبيبات يميلون إلى أن يكونوا شابات (عمر<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP هو 25- بروتين خماسي كيلو دالتون داخل عائلة البنتراكسين يتم ترميزه بواسطة جين APCS وهو متوفر بكثرة في مصل الدم وكمكون من مكونات الغشاء القاعدي الكبيبي .5 على الرغم من أن الوظيفة الدقيقة لـ SAP غير واضحة ، إلا أنها معروفة للتفاعل في البلازما مع مجموعة واسعة من البروتينات ، بما في ذلك المكونات التكميلية ، والبروتينات الدهنية ، ومنظمات التخثر وتحلل البروتينات. يعمل SAP كجزيء قابل للذوبان للتعرف على الأنماط يشارك في الاستجابة المناعية الفطرية ، ويتعرف على مجموعة متنوعة من الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض والأضرار ، بما في ذلك المكونات الميكروبية وحطام الخلايا المبرمج. تعزز الأنماط التصفية التكميلية بوساطة حطام الخلايا المبرمج عن طريق الارتباط المباشر للمكون التكميلي 1q (C1q) وتفعيل المسار التكميلي الكلاسيكي. على الرغم من التنشيط التكميلي ، من المعروف أن SAP ينقل التنظيم المناعي ، ويقلل من العدلاتاشتعالداخل الأنسجة من خلال تقليل الالتصاق البطاني ، 8 انخفاض وظيفة الإيلاستاز ، 9 وتقليل الانتقال إلى الأنسجة .10 من المعروف أيضًا أن SAP هو البروتين الرابط الرئيسي للحمض النووي والكروماتين داخل البلازما.

في المرض ، يُعرف SAP بكونه جزءًا من رواسب الداء النشواني. على الرغم من عدم دراستها جيدًا ، إلا أن هناك أيضًا دليلًا على أنه يمكن أن يلعب دورًا في النماذج البشرية والحيوانية لأمراض المناعة الذاتية. تم التعرف على الأجسام المضادة لـ SAP في المرضى الذين يعانون منالمناعة الذاتيةالأمراض، وقد ثبت أن تعبير SAP المنخفض يعمل على الترويجالمناعة الذاتيةفي نماذج الفئران. تم تحديد الأجسام المضادة ضد SAP في 44 في المائة من المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية ، مع عيار الأجسام المضادة المرتبطة بنشاط المرض. الفئران المعرضة 129 / Sv عند عبورها مع الفئران C57BL / 6 (129 / Sv x C57BL / 6 F2) 13 ولكن ليس في سلالة 129 / Sv وحدها ، مما يشير إلى أن القابلية الوراثية الكامنة قد تكون مطلوبة لنقص SAP للحث على المناعة الذاتية. تُظهر الفئران إنتاج الأجسام المضادة للنواة ، والحمض النووي المضاد أحادي السلسلة ، والأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج الشريطة ، والعوامل الروماتيزمية. يطورون التكاثريةمنيعالتهاب كبيبات الكلى المعقد ، في كثير من الأحيان عند الإناث .13 في نموذج الفئران لالتهاب الكلية الذئبي حيث يحدث التهاب كبيبات الكلى عن طريق حقن الحمض النووي الذاتي المنشط في المصل ، قلل العلاج الجيني SAP بواسطة ناقل بلازميد من إنتاج الأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج الشريطة. ، الترسب المعقد المناعي ، والتهاب الكلى ، ومنع ظهور التهاب الكلية الذئبي.

الشكل 3|خزعة الكلى في تضخم الكبيبات الغشائي مع رواسب IgG kappa المقنعة. تظهر الصور المجهرية من الخزعة الموضحة في الشكل 2 هنا. (أ) توجد ارتفاعات قطاعية على طول الأغشية القاعدية الكبيبية ، بواسطة صبغة جونز ميثينامين الفضية (التكبير الأصلي × 400). (ب) يكشف الفحص المجهري الإلكتروني عن رواسب تحت الظهارة موجودة على طول الغشاء القاعدي الكبيبي (التكبير الأصلي × 12 ، 000). (ج) بقعة الكبيبات سلبية لـ IgG عن طريق التألق المناعي الروتيني على الأنسجة الطازجة (التألق المناعي المباشر ؛ التكبير الأصلي × 400). (د) صبغة الكبيبات من نفس الحالة إيجابية على الأنسجة المضمنة بالبارافين بعد هضم البروتياز (التألق المناعي المباشر ؛ التكبير الأصلي × 400). (هـ) تظهر الكبيبات تلطيخًا لكابا و (و) ليس لامدا على الأنسجة المضمنة بالبرافين المهضوم بالبروتياز (التألق المناعي المباشر ؛ التكبير الأصلي × 400). لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الموجودة على الإنترنت من هذه المقالة على www.الكلى-international.org.

على الرغم من تقييد السلسلة الخفيفة الذي شوهد في الخزعة ، لا يوجد حاليًا دليل على ارتباط هذا الكيان باضطرابات التكاثر اللمفاوي أو Igs المنتشرة وحيدة النسيلة. زمن. دور الأجسام المضادة الذاتية لـ SAP غير مؤكد أيضًا. على عكس الأشكال الأخرى من اعتلال الكبيبات الغشائي ببروتين موجود على وجه التحديد في الرواسب المناعية ، مثل المرض المرتبط بـ PLA2R ، لا يبدو أن 16 MGMID مدفوعة بأجسام مضادة ذاتية موجهة ضد SAP ، لأننا فشلنا في اكتشاف تفاعل الأجسام المضادة في المصل ضد SAP في مرضى MGMID . التفسير البديل هو أن IgG kappa موجود نتيجة للتفاعل الطبيعي بين هذين البروتينين بدلاً من تفاعل المناعة الذاتية مع الأجسام المضادة ، حيث من المعروف أن سلسلة Ig kappa جزء من التفاعل الطبيعي لمصل SAP. على الرغم من أنه مفيد لتشخيص الأنسجة لهذا الكيان ، إلا أن اختبار الأجسام المضادة لـ SAP في المصل لا يعمل كتشخيص غير موسع في هذا الوقت ، ولا يزال المحرك الأساسي لهذا المرض لغزا.

النتائج السريرية في MGMID متغيرة للغاية ، وتتراوح من مغفرة عفوية إلى التقدم إلى المرحلة النهائيةالكلىمرضمع تكرار الزرع. فشل التحليل بأثر رجعي في إظهار أي ارتباط بين العلاج المستخدم والنتيجة السريرية. 4 من المحتمل أن يكون لاكتشاف مشاركة SAP في هذا المرض آثارًا على العلاج. أظهرت العلاجات التي تستهدف SAP بشكل مباشر نتائج واعدة مبكرة في علاج الداء النشواني. في MGMID الكبيبات ذات الصلة. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد المؤشرات الحيوية للنشاط لهذا المرض ، وكذلك العلاجات.

لا يزال سبب إخفاء الرواسب المناعية في خزعات MGMID على التألق المناعي الروتيني لغزا. يثير وجود SAP في الودائع تفسيرات جديدة محتملة لهذه الظاهرة في حالات MGMID. على سبيل المثال ، من المعروف أن تفاعلات بروتين SAP تعتمد بشكل كبير على Ca2þ ، والعديد من وسائط النقل والمخازن المؤقتة المستخدمة في معالجة نسيج خزعة الكلى من أجل التألق المناعي خالية من Ca. يمكن أن يؤدي هذا الغياب في المختبر لـ Ca2þ إلى تعطيل الترسبات المناعية بحيث لم تعد متاحة للكشف عن طريق التألق المناعي على الأنسجة المجمدة. ستبقى الرواسب المعقدة المناعية متاحة للكشف في الأنسجة الثابتة بالفورمالين ، على الرغم من ذلك ، كنتيجة للروابط الكيميائية التساهمية التي يسببها الفورمالين بين البروتينات في الأنسجة.

نصف هنا ، لأول مرة ، الوجود الفريد لـ SAP في الرواسب الكبيبية لـ MGMID. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن تلطيخالكلىالخزعاتبالنسبة لـ SAP يحدد الحالات ذات السمات الإكلينيكية المشابهة لتلك الموجودة في MGMID ، دون إخفاء ، عن طريق التألق المناعي الروتيني. بالنظر إلى هذه النتائج ، نعتقد أن التلوين الإيجابي داخل الرواسب الكبيبية لـ SAP يحدد شكلاً فريدًا من التهاب كبيبات الكلى الذي يشترك في آلية فسيولوجية مرضية مشتركة للمرض. حتى الوصف الأخير لـ MGMID ، تم تشخيص هذه الحالات في العديد من الفئات المتباينة التي تتراوح من اعتلال كبيبات الكلى C3 إلى التهاب كبيبات الكلى المرتبط بالعدوى إلى اعتلال الكبيبات الغشائي غير النمطي .1 التطور السريع لمعايير التشخيص وفهمنا لهذا الشكل من التهاب كبيبات الكلى يبرز قوة الكتلة قياس الطيف لتوفير رؤية فسيولوجية مرضية في التهاب كبيبات الكلى المناعي بوساطة المناعة.

طُرق

تقنيات معالجة خزعة الكلى

تم استخدام تقنيات معالجة الخزعة الكلوية القياسية ، بما في ذلك الضوء ، والتألق المناعي ، والفحص المجهري الإلكتروني .19،20 جميع عينات الفحص المجهري للضوء كانت ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين ، الفضة ميثينامين جونز ، ماسون ترايكروم ، وكاشف حمض شيف الدوري. تم قطع جميع أقسام التألق المناعي المباشر عند 4 مم وتفاعلت مع الأجسام المضادة للأرانب متعددة النسيلة التي تحمل علامات flfluorescein إلى سلاسل IgG و IgA و IgM و C3 و C1q و fibrinogen و k- و l-light (Dako ، Carpenteria ، CA) لمدة ساعة واحدة ، وشطفها ؛ تم تطبيق ساترة باستخدام وسائط تركيب مائية. تم تلوين الحالات المحددة للأجسام المضادة للإنسان متعددة النسيلة التي تحمل علامات flfluorescein لـ IgG1 و IgG2 و IgG3 و IgG4 (Sigma-Aldrich ، St Louis ، MO). تم إجراء تألق مناعي البارافين بعد هضم البروتياز كما هو موصوف سابقًا. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للحلول وتوافق مع إعلان مبادئ هلسنكي.

يمكن Cistancheنغمةالكلى

قياس الطيف الكتلي للكبيبات التي يتم تشريحها بالليزر

تم قطع نسيج الخزعة الكلوية من الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين بسمك 1 0 مم على شرائح إطار غشاء لايكا PET (لايكا ، ويتزلار ، ألمانيا). تم تلطيخ هذه الشرائح بعد ذلك بالهيماتوكسيلين. تم تشريح الكبيبات بشكل دقيق إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة باستخدام مجهر Leica DM6 0 {{2 0}} 0 ب. تم تحلل الكبيبات المجهرية في 2 في المائة من كبريتات دوديسيل الصوديوم و 0.1 مولار ديثيوثريتول عند 99 درجة لمدة ساعة واحدة ومعالجتها عن طريق تحضير العينة بمساعدة المرشح (FASP). تم نقل المحللة الموضحة إلى مركزات Vivacon 500 (MWCO من 30 كيلو دالتون ؛ سارتوريوس ، جوتنجن ، ألمانيا). تمت إزالة كبريتات دوديسيل الصوديوم عن طريق تكرار الغسل باستخدام 8 مولار من اليوريا في 0.1 مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) -امين ميثان / كلوريد ، ودرجة الحموضة 8.5 ؛ تم بعد ذلك ألكلة العينات باستخدام 0.05 مولار من iodoacetamide. تمت إزالة Iodoacetamide بواسطة 3 غسالات مع 8 M يوريا / 0.1 M تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينوميثان / كلوريد ، درجة الحموضة 8.5 ، تليها 3 غسالات مع 0.05 مولار من بيكربونات الأمونيوم. تم هضم البروتينات باستخدام التربسين (درجة التسلسل ، Promega ، Madison ، WI) بنسبة 40: 1 وزن / وزن عند 37 درجة لمدة 16 ساعة. تم جمع الببتيدات عن طريق الطرد المركزي وتحليتها على أطراف المرحلة C 18- (Thermo Scientific ، Waltham ، MA).

تم تحليل الببتيدات المهضومة بواسطة مطياف الكتلة NanoLC-tandem باستخدام مطياف الكتلة Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). تم تحميل الببتيدات على عمود مصيدة طور عكسي (Integra-frit ، New Objective ، Woburn ، MA) يحتوي على 2.5 مم Waters XSelect (Waters Corp. ، Milford ، MA) راتنجات هجينة سطحية مشحونة مقترنة بـ 15 0 مم X 0. 0 عمود تحليلي 75 مم يحتوي على راتنج الطور العكسي نفسه المستخدم في المصيدة. تم بعد ذلك استخدام نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء nanoAcquity (Waters Corp.) لإنشاء تدرج لوني 60- من 98: 2 إلى 6 0: نسبة 40 A: B (المخزن المؤقت A ¼ 0.1٪ حمض الفورميك ، 0.5 في المائة أسيتونيتريل ؛ المخزن المؤقت ب ¼ 0.1 في المائة حمض الفورميك ، 99.9 في المائة أسيتونيتريل).

تمت إزالة الببتيدات من العمود برأس رش متكامل (Picofrit ، New Objective) وتأين بواسطة الرش الكهربائي (2. 0 كيلو فولت) متبوعًا بتحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي باستخدام التفكك الناتج عن تصادم الطاقة العالي (HCD). تم إجراء مسح ضوئي لسلائف الببتيد بدقة 240K (عند 400 م / ض) مع هدف 5 × 10 أيون. تم إجراء قياس الطيف الكتلي الترادفي عن طريق العزل عند 1.6 ث باستخدام رباعي القطب ، وتفتيت HCD مع طاقة تصادم طبيعية تبلغ 30 ، وتحليل مطياف الكتلة بالمسح السريع في مصيدة الأيونات. تم البحث في بيانات قياس الطيف الكتلي الترادفي التي تم الحصول عليها مقابل أحدث قاعدة بيانات بشرية Uniprot التي تحتوي على كل من Swiss Prot و TREMBLE إدخالات باستخدام

MaxQuant (معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية ، بلانيج ، ألمانيا). تم تصور البيانات باستخدام Scaffold v4.6 (Proteome Software ، Portland ، OR). تم تعيين معدل الاكتشاف الخاطئ عند 1 في المائة لمطابقات الببتيد إلى الطيف. تم استخدام قيم iBAQ الطبيعية من MaxQuant للتقدير الكمي. تم تعديل توزيعات iBAQ لكل عينة على الوسيط للتحكم في الاختلافات في التحميل. تمت إزالة قيم iBAQ التي تساوي الصفر من مجموعة البيانات. لاختبار الفرضيات الإحصائية ، تم إجراء 2- عينة من اختبار ويلش لكل بروتين باستخدام قيم iBAQ الطبيعية للمجموعتين. إذا تم اكتشاف بروتين في مجموعة واحدة فقط ، فقد تم إجراء 1- عينة من اختبار ويلش باستخدام أصغر قيمة iBAQ تم اكتشافها باعتبارها فرضية العدم.

تلطيخ SAP

تم إزالة المقاطع المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين ، المقطوعة عند 3 مم ، وتم إجراء استرجاع المستضد عند 99 درجة. تم تفاعل المقاطع مع جسم مضاد متعدد الأضلاع مضاد لـ SAP للأرنب (1: 400 ؛ ThermoFisher ، Waltham ، MA) متبوعًا بمضاد الأرانب الماعز الأحمر المترافق مع Rhodamine باللون الأحمر والذي تم امتصاصه في المرحلة الصلبة لضمان الحد الأدنى من التفاعل المتبادل مع الإنسان. مفتش IgG (1: 100 ؛ مختبرات Jackson ImmunoResearch ، ويست جروف ، بنسلفانيا). تم تشغيل كل حالة مع الضوابط الإيجابية والسلبية. تم تقييم البقعة بواسطة الفحص المجهري المعياري للوميض المناعي. تم الحكم على أنه إيجابي إذا كان هناك تلطيخ دائري حبيبي موجب في الكبيبات ، وسلبي إذا لم يكن هناك حلقة شعرية

تلطيخ في الكبيبات. تم فحص كولوكلونيزيون IgG و SAP في الأغشية القاعدية الكبيبية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر Zeiss LSM 880 (زايس ميكروسكوب ، جينا ، ألمانيا). من أجل هذا التحليل ، تم رد فعل مضاد IgG للأرنب متعدد النسيلة (flfluorescein isothiocyanate- مترافق) (1:40 ؛ Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) مع الأنسجة المسترجعة بالحرارة بعد تلطيخ SAP كما هو موضح أعلاه. تم إجراء الضوابط السلبية لضمان خصوصية الجسم المضاد عن طريق حذف الأجسام المضادة الأولية. تم اختبار أربع حالات من MGMID لوجود HP1BP3 (1: 100 ؛ Thermo Fisher ، Waltham ، MA) عن طريق تلطيخ مناعي.

اختبار الأجسام المضادة لـ SAP في الدم

تم تخفيف بروتين SAP (R & D Systems ، Minneapolis ، MN ؛ {{0}} SAB -050) إلى 3 نانوغرام / مل في محلول كربونات-بيكربونات (درجة الحموضة 9.6) وطُلي على {{ 6}} لوحة Immulon H2 (Thermo Scientific) بين عشية وضحاها عند 4 درجات. تم غسل الألواح بمعدل 3 مرات باستخدام 2 0 0 مل من محلول الغسيل (1 × محلول ملحي مخزّن بالفوسفات و 0.05 بالمائة بين) وتم حظره لمدة ساعتين باستخدام محلول مانع للتسرب (1 × محلول ملحي مخزّن بالفوسفات ، 0.05 بالمائة توين ، 1 في المائة من جيلاتين السمك). تم بعد ذلك غسل الألواح × 3 مع 200 مل من محلول الغسيل. تمت إضافة عشرين ميكرولتر من المصل المخفف (1: 100 في محلول الغسيل) لكل بئر وحضنت لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم غسل الألواح × 7 مع 200 مل من محلول الغسيل متبوعًا بإضافة الجسم المضاد للكشف ، مضاد IgG-HRP البشري (Jackson ImmunoResearchLaboratories ؛ 309-035-003). تم غسل الأطباق × 7 بـ 200 مل من محلول الغسيل. بعد ذلك ، تم خلط الركيزة 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine peroxidase ، وركيزة بيروكسيديز Sol B بنسبة 1: 1 ، وتمت إضافة 100 مل إلى اللوحة. تم إيقاف التفاعل بإضافة 100 مل من 2 مولار H2SO4 ، وترك على المنضدة لمدة 20 دقيقة قبل القراءة عند 450 نانومتر. للتحكم للتأكد من أن بروتين SAP مرتبط باللوحة ، استخدمنا مضاد الأرانب (Invitrogen، Carlsbad، CA؛ PA 1-28361) في تخفيف متسلسل متبوعًا بمضاد الأرانب IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ؛ 111-035-144). أظهر التحكم وجود علاقة جيدة بين تخفيف الجسم المضاد والامتصاص ، بمتوسط ​​قيمة R التربيعية 0.95.

Cistanche للتحسينالكلىوظيفة

إفشاء

أعلنت جميع المؤلفين لا المصالح المتنافسة.

تكميلي

الملف التكميلي المادي (PDF)

الشكل S1. صور تمثيلية لتلطيخ الكبيبات من مجموعة متنوعة من أمراض الكلى.

الشكل S2. دراسات نشاط المصل المضاد لـ SAP عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم.

الجدول S1. تم تحديد جميع Igs عن طريق قياس الطيف الكتلي في الكبيبات التي يتم التقاطها بالليزر من حالات اعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa.

الجدول S2. أظهرت التعدادات الطيفية بأخذ عينات من جميع البروتينات زيادة قدرها $ 1 log2 في الوفرة في عينات MGMID وقيمة P # 0. 1.

المراجع

1. لارسن سي بي ، أمبروز جم ، بونسيب سم ، وآخرون. اعتلال الكبيبات الغشائي مع رواسب IgG kappa المقنعة.الكلىكثافة العمليات 2014 ؛ 86: 154–161.

2. ميسياس ، نورث كارولاينا ، ووكر بي دي ، لارسن سي بي. الفلورة المناعية للبارافين في مختبر أمراض الكلى: أكثر من مجرد تقنية إنقاذ. وزارة الدفاع باتول. 2015 ؛ 28: 854 - 860.

3. لارسن سي بي ، ميسياس ، نورث كارولاينا ، ووكر بي دي ، وآخرون. التهاب كبيبات الكلى التكاثري الغشائي مع رواسب الغلوبولين المناعي الأحادية المقنعة. الكلى Int. 2015 ؛ 88: 867 - 873.

4. لارسن سي بي ، بويلز سي إل ، كوسسي إل إن ، إت آل. المظاهر السريرية المرضية لاعتلال الكبيبات الشبيه بالغشاء مع رواسب IgG kappa المقنعة. مندوب الكلى الدولي .2016 ؛ 1: 299-305.

5. Emsley J ، White HE ، O'Hara BP ، وآخرون. هيكل المكون الخماسي من الأميلويد في مصل الدم البشري. طبيعة سجية. 1994 ؛ 367: 338-345.

6. بولسن إت ، بيدرسن كو ، مارزيدا آم وآخرون. يتفاعل مكون مصل الأميلويد P (SAP) في البلازما البشرية التي تحتوي على مستويات الكالسيوم الفسيولوجية. الكيمياء الحيوية. 2017 ؛ 56: 896-902.

7. Agrawal A، Singh PP، Bottazzi B، et al. التعرف على الأنماط بواسطة البنتراكسينات. أدف إكس ميد بيول. 2009 ؛ 653: 98-116.

8. Bottazzi B و Inforzato A و Messa M et al. البنتراكسين PTX3 و SAP في المناعة الفطرية ، وتنظيم الالتهاب وإعادة تشكيل الأنسجة. J هيباتول. 2016 ؛ 64: 1416-1427.

9. لي جي جي ، ماك آدم كي بي. مكون الأميلويد P البشري: مثبط الإيلاستاز. سكاند جي إمونول. 1984 ؛ 20: 219-226.

10. كوكس إن ، بيلينج د ، جومر آر إتش. مصل الأميلويد P: منظم جهازي للاستجابة المناعية الفطرية. ي لوكوك بيول. 2014 ؛ 96: 739-743.

11. كرافيتز إم إس ، بيتاشني إم ، شوينفيلد واي. وأجسامهم المضادة الذاتية: الانتشار والأهمية السريرية في المناعة الذاتية. ياء نوتر إمونول. 2005 ؛ 25: 582-591.

12. Zandman-Goddard G ، Blank M ، Langevitz P ، et al. ترتبط الأجسام المضادة لمكون الأميلويد P في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية بنشاط المرض. آن ريوم ديس. 2005 ؛ 64: 1698-1702.

13. بيكرستاف إم سي ، بوتو إم ، هاتشينسون دبليو إل ، وآخرون. يتحكم مكون مصل الأميلويد P في تدهور الكروماتين ويمنع المناعة الذاتية المضادة للنواة. نات ميد. 1999 ؛ 5: 694-697.

14. Gillmore JD ، Hutchinson WL ، Herbert J ، et al. المناعة الذاتية والتهاب كبيبات الكلى في الفئران مع الحذف المستهدف لجين مكون الأميلويد P في الدم: خلل SAP أم تركيبة سلالة؟ علم المناعة. 2004 ؛ 112: 255-264.

15. Zhang W ، Wu J ، Qiao B ، et al. يختلف تحسين التهاب الكلية الذئبي عن طريق العلاج الجيني لمكون الأميلويد P بآليات متميزة من مراحل مختلفة من المرض. بلوس واحد. 2011 ؛ 6: e22659.

16. Beck LH ، Bonegio RG ، Lambeau G ، وآخرون. مستقبلات فوسفوليباز A2 من النوع M كمستضد مستهدف في اعتلال الكلية الغشائي مجهول السبب. إن إنجل جي ميد. 2009 ؛ 361: 11-21.

17. ريتشاردز دي بي ، كوكسون إل إم ، بيرجيس إيه سي ، وآخرون. التصفية العلاجية للأميلويد بواسطة الأجسام المضادة لمكون الأميلويد P. إن إنجل جي ميد. 2015 ؛ 373: 1106-1114.

18. ريتشاردز دي بي ، كوكسون إل إم ، بارتون إس في ، وآخرون. تكرر الجرعات من الجسم المضاد لمكون الأميلويد P في الدم لإزالة رواسب الأميلويد في المرضى الذين يعانون من الداء النشواني الجهازي. Sci Transl Med. 2018 ؛ 10.

19. ووكر بي دي ، كافالو تي ، بونسيب سم. إرشادات الممارسة لخزعة الكلى. وزارة الدفاع باتول. 2004 ؛ 17: 1555-1563.

20. ووكر PD. خزعة الكلى. قوس باثول لاب ميد. 2009 ؛ 133: 181-188.

21. Wisniewski JR ، Zougman A ، Nagaraj N ، وآخرون. طريقة تحضير العينة الشاملة لتحليل البروتينات. طرق نات. 2009 ؛ 6: 359-362.